CN115637257B - 一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞筛选领域，具体涉及一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法。该筛选方法包括如下步骤：将血液样品进行离心处理，得到含有白细胞和循环肿瘤细胞的检测液；检测液流入惯性聚焦微流控芯片，利用流体力学实现了不同细胞在惯性聚焦微流控芯片内连续并同时分离，从而完成对循环肿瘤细胞的筛选。本发明可以实现多种循环肿瘤细胞的分离；样品不需要复杂的前处理，操作简便；实现了高通量筛选，回收率高；而且分离后循环肿瘤细胞活性不受影响，保证了后续相关检测结果的准确性。

Description

一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法

技术领域

本发明属于细胞筛选领域，具体涉及一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的最恶性疾病之一，且全球癌症发病率和死亡率正在迅速上升，复发或转移是导致恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的存在被认为与肿瘤的复发和转移相关。循环肿瘤细胞是从原发性肿瘤或其转移瘤脱落释放在外周血循环中的癌细胞，通过血液循环进行迁移，在迁移过程中大多数CTCs经过失巢凋亡或受到血流剪切应力机械损伤以及机体免疫细胞消除作用，最终仅有少量具有高转移潜能的CTCs可以存活，发生远处转移，在远处器官中形成新肿瘤。

CTCs的检测和分析可用于癌症的早期筛查、疗效评估和预后的判断，并且可以实时监测癌症的进展。目前有多种方法来分离患者血液中的CTC，基于原理大致可分为两大类，即阳性富集法和阴性富集法，阳性富集法一般基于抗原-抗体原理，特异性捕获目标CTC，例如美国CellSearch系统，是少数由美国FDA批准的用于CTC提取的系统之一，根据使用靶向上皮细胞粘附的抗体分子（EpCAM）来特异性识别CTC，该种方法提取的细胞通常活性较差，极大限制了后期实验。阴性富集法原理与阳性富集法相反，采取各种手段去除全血中的背景细胞收集剩余细胞即为CTC，例如目前广泛使用的密度梯度离心法进行CTC分离，基于血细胞之间密度的差异，去除全血中红细胞，血小板，白细胞等背景细胞得到CTC，该方法操作步骤多、提取率及纯度均较低，因为血液样本中一些体积与CTC近似的背景细胞例如白细胞等残留细胞无法精准分离，将会影响续CTC的培养及药敏实验等研究。

随着近年来微流控技术的高速发展，其精确操控、微量快速的技术优势为新型循环肿瘤细胞快速检测技术的革新提供了新途径。惯性微流控技术是一种主要利用流体力学的纯物理方法来实现聚焦和分选的技术，随着微米粒子研究的不断深入，惯性微流控技术取得了长足进步，在生物医疗行业的细胞分选环节中得到大量应用并发挥着重要作用，与之相应的惯性微流控芯片也发展迅速。然而，目前惯性微流控芯片在可实现并行操作的前提下，却无法满足同时实现高速聚焦和分选。

发明内容

本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，利用精准、微量的微流控技术优势，实现了快速、高通量的分离出循环肿瘤细胞。

本发明提供以下技术方案：

一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，包括如下步骤：将血液样品进行离心，离心后体系至少分为四层，其中最下层为待测血液中的红细胞，自上而下的第二层为白细胞和循环肿瘤细胞，将第二层与其他层分离并取出，得到检测液；将检测液流入惯性聚焦微流控芯片，经过细胞分离，再分别流出白细胞、循环肿瘤细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的筛选；其中所述检测液流入惯性聚焦微流控芯片的流速为0.3-0.4mL/min，分离时间为20-30min。

其中惯性聚焦微流控芯片包括载玻片，所述载玻片上设置有输入通道、流体通道和输出通道，所述流体通道由S形通道、多个直形通道、第一圆形通道和第二圆形通道组成，所述输入通道与S形通道的一端连通，所述S形通道的另一端与第一圆形通道的一端通过直形通道连通，所述第一圆形通道的另一端与第二圆形通道的一端通过直形通道连通，所述第二圆形通道的另一端与输出通道通过直形通道连通。

进一步地，连通所述S形通道和第一圆形通道的直形通道的直径与S形通道的直径相同；连通所述第一圆形通道和第二圆形通道的直形通道的直径与第一圆形通道的直径相同；连通所述第二圆形通道和输出通道的直形通道的直径与第二圆形通道的直径相同。

进一步地，所述第二圆形通道的直径大于第一圆形通道的直径；其中第一圆形通道与第二圆形通道以直形通道的长度轴线为对称轴对称设置。

进一步地，所述输出通道由第一输出管道、第二输出管道和第三输出管道组成，所述第一输出管道与直形通道位于同一水平线上，所述第二输出管道和第三输出管道分别与位于第一输出管道的两侧；所述第一输出管道、第二输出管道、第三输出管道的直径不同。

进一步地，所述S形通道的直径为0.05-0.10mm；所述第一圆形通道的直径为0.9-1.2mm，第二圆形通道的直径为1.3-1.6mm。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供的一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，利用惯性聚焦微流控芯片中的流体通道加速微米粒子的聚焦，由于在微流通道内不同大小的细胞、颗粒所受的惯性升力和Dean拽力的平衡，占有各自不同的平衡位置，从而实现了不同尺寸的细胞、颗粒的分离。通过设计流体通道的结构，在S形通道和直形通道的基础上增加了直径较大的第一圆形通道和第二圆形通道，在惯性升力的基础上引入迪恩力，在惯性聚焦引起的迁移行为过程中，样品中的微粒在经历较短路程后实现良好的聚焦效果，并根据自身的尺寸差别在流体通道中发生差异表现，聚焦在通道中不同的位置，实现了高通量的聚焦和筛选操作；流体通道直径的变大，使原有的通道壁效应力消失，流向通道两侧，而白细胞保持原有的平衡位置，使得循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置被放大；同时限定了第二圆形通道的直径大于第一圆形通道的直径，当样品流经第二圆形通道时，可以使循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置再次被放大，能够提高循环肿瘤细胞的分离率。

本发明利用流体力学实现了循环肿瘤细胞在惯性聚焦微流控芯片内连续并同时分离，并且可以实现多种循环肿瘤细胞的分离；样品不需要复杂的前处理，操作简便；实现了高通量筛选，回收率高；而且分离后循环肿瘤细胞活性不受影响，保证了后续相关检测结果的准确性。

附图说明

图1不同种类癌症细胞分离后在各个出口中的纯度结果图；

图2不同种类癌症细胞分离后的回收率结果图；

图3不同种类癌症细胞分离后的细胞活性结果图；

图4为惯性聚焦微流控芯片的结构示意图。

图中：1、输入通道；2、S形通道；3、直形通道；4、第一圆形通道；5、第二圆形通道；6、输出通道；7、载玻片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例提供了一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，包括如下步骤：

以人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞RKO作为循环肿瘤细胞进行筛选实验。将1000个人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞RKO使用DiI进行染色，再分别加入到不同的健康志愿者贡献的血液中，用于模拟从癌症患者体内采集到的血液样本。

分别将上述含癌细胞的血液样品采用密度梯度离心法进行离心，离心后体系至少分为四层，其中最下层为待测血液中的红细胞，自上而下的第二层为白细胞和循环肿瘤细胞，将第二层与其他层分离并取出，得到不同癌细胞的细胞悬浮液，使细胞悬浮液的最终体积为2mL，使肿瘤细胞系的浓度为500个/mL，该细胞悬浮液分别为MCF-7检测液、A549检测液和RKO检测液。

将1mL的MCF-7检测液、A549检测液或RKO检测液，分别以0.4mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min的流速流入惯性聚焦微流控芯片，经过细胞分离，分离时间为20-30min，再分别流出白细胞、循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO），从而完成了对不同种类循环肿瘤细胞的筛选。

MCF-7检测液、A549检测液或RKO检测液中的细胞在惯性聚焦微流控芯片的流体通道内，利用了流体在微米尺度下的性质，不同大小的细胞在层流中因惯性升力和Dean拽力的平衡，占有各自不同的平衡位置，循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）占据靠近通道外侧的平衡位置，而白细胞占据通道中心线附近的平衡位置。流体进入圆形通道时，又在迪恩力的作用下，实现良好了聚焦效果，当流经直径较大的第二圆形通道时，循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置再次被放大，能够使所有的白细胞从第一输出管道流出，使循环肿瘤细胞从两侧的第二输出管道、第三输出管道流出。

对各个输出管道流出的细胞中循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）的纯度如图1所示，以a表示第一输出管道流出的细胞，b表示第二输出管道流出的细胞，c表示第三输出管道流出的细胞，其中从第一输出管道流出的细胞均为白细胞，从第二输出管道、第三输出管道流出的循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）均具有较高的纯度，达到了较好的分离效果。对分离后的循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）进行细胞计数，循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）的回收率如图2所示，各循环肿瘤细胞筛选后均达到了较高的回收率（80%以上），其中人肺癌细胞A549的回收率要高于人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞RKO。对分离后的循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）分别进行细胞培养，并在第2天、第4天、第6天进行测试细胞活性，结果如图3所示，经过惯性聚焦微流控芯片分离的循环肿瘤细胞（MCF-7、A549、RKO）在培养时间内仍然保持较高的活性，说明本发明提供的基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，流过芯片后的细胞活性不受影响，可以得到完整的细胞，保证了后续相关检测结果的准确性。

本发明所使用的惯性聚焦微流控芯片的结构如图4所示，惯性聚焦微流控芯片包括载玻片7，载玻片7上设置有输入通道1、流体通道和输出通道6；其中流体通道由S形通道2、多个直形通道3、第一圆形通道4和第二圆形通道5组成；其中输入通道1与S形通道2的一端连通；S形通道2的另一端与第一圆形通道4的一端通过直形通道3连通；第一圆形通道4的另一端与第二圆形通道5的一端通过直形通道3连通；第二圆形通道5的另一端与输出通道6通过直形通道3连通。

其中连通S形通道2和第一圆形通道4的直形通道3的直径与S形通道2的直径相同；连通第一圆形通道4和第二圆形通道5的直形通道3的直径与第一圆形通道4的直径相同；连通第二圆形通道5和输出通道6的直形通道3的直径与第二圆形通道5的直径相同。

其中第二圆形通道5的直径大于第一圆形通道4的直径；第一圆形通道4与第二圆形通道5以直形通道3的长度轴线为对称轴对称设置。

其中输出通道6由第一输出管道、第二输出管道和第三输出管道组成，所述第一输出管道与直形通道3位于同一水平线上，所述第二输出管道和第三输出管道分别与位于第一输出管道的两侧；第一输出管道、第二输出管道、第三输出管道的直径不同。

其中S形通道2的直径为0.05-0.10mm；所述第一圆形通道4的直径为0.9-1.2mm，第二圆形通道5的直径为1.3-1.6mm。

本发明所使用的惯性聚焦微流控芯片利用微纳技术实现微流控芯片的加工，采用微纳光刻技术和PDMS翻模方法加工微流体通道，并借助于氧等离子体键合技术将微流体通道与载玻片进行粘合，加工过程包括如下步骤：

S1、在硅衬底上旋涂光刻胶，将设计如图4所示微流体通道形状的掩膜板置于旋涂有光刻胶的硅衬底上，并进行紫外曝光；

S2、将曝光后的掩膜板经过后烘、显影和高温固化后，得到微流体通道模具；

S3、将混合有固化剂的PDMS倾倒在微流体通道模具上，经高温固化后，获得微流体通道，并且用打孔器在微流体通道入口和出口处打孔；

S4、通过氧等离子体键合的方法，将微流体通道和载玻片粘合，即完成加工，得到惯性聚焦微流控芯片。

本发明提供的基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法只需要对血液样本进行简单的离心处理，即能得到含有白细胞和循环肿瘤细胞的检测液，检测液从输入通道1流入惯性聚焦微流控芯片，在流经直径为0.05-0.10mm的S形通道2和直形通道3后，微粒聚焦成粒子束，由于在微流通道内不同大小的细胞、颗粒所受的惯性升力和Dean拽力的平衡，占有各自不同的平衡位置，循环肿瘤细胞占据靠近通道外侧的平衡位置，而白细胞占据通道中心线附近的平衡位置。当流入直径（0.9-1.2mm）变大的第一圆形通道4和直形通道3时，在惯性升力的基础上引入迪恩力，在惯性聚焦引起的迁移行为过程中，样品中的微粒在经历较短路程后实现良好的聚焦效果，并根据自身的尺寸差别在流体通道中发生差异表现，聚焦在通道中不同的位置；流体通道直径的变大，使原有的通道壁效应力消失，流向通道两侧，而白细胞保持原有的平衡位置，使得循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置被放大。当流入直径（1.3-1.6mm）更大的第二圆形通道5和直形通道3时，会使得循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置再次被放大，提高了循环肿瘤细胞和白细胞的分离效果，从而使所有的白细胞从输出通道6中的第一输出管道流出，循环肿瘤细胞能够从输出通道6中的第二输出管道和第三输出管道流出，实现了不同尺寸的循环肿瘤细胞的高通量的聚焦和筛选操作。

需要说明的是，本发明提供的一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，用于循环肿瘤细胞的筛选与培养，而非疾病诊断目的。在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：将血液样品进行离心，离心后体系至少分为四层，其中最下层为待测血液中的红细胞，自上而下的第二层为白细胞和循环肿瘤细胞，将第二层与其他层分离并取出，得到检测液；将检测液流入惯性聚焦微流控芯片，经过细胞分离，再分别流出白细胞、循环肿瘤细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的筛选；所述循环肿瘤细胞为人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549或人结肠癌细胞RKO；

所述惯性聚焦微流控芯片包括载玻片（7），所述载玻片（7）上设置有输入通道（1）、流体通道和输出通道（6），所述流体通道由S形通道（2）、多个直形通道（3）、第一圆形通道（4）和第二圆形通道（5）组成，所述输入通道（1）与S形通道（2）的一端连通，所述S形通道（2）的另一端与第一圆形通道（4）的一端通过直形通道（3）连通，所述第一圆形通道（4）的另一端与第二圆形通道（5）的一端通过直形通道（3）连通，所述第二圆形通道（5）的另一端与输出通道（6）通过直形通道（3）连通；

所述第二圆形通道（5）的直径大于第一圆形通道（4）的直径，连通所述S形通道（2）和第一圆形通道（4）的直形通道（3）的直径与S形通道（2）的直径相同，连通所述第一圆形通道（4）和第二圆形通道（5）的直形通道（3）的直径与第一圆形通道（4）的直径相同，连通所述第二圆形通道（5）和输出通道（6）的直形通道（3）的直径与第二圆形通道（5）的直径相同；

所述S形通道（2）的直径为0.05-0.10mm；所述第一圆形通道（4）的直径为0.9-1.2mm，第二圆形通道（5）的直径为1.3-1.6mm。

2.根据权利要求1所述一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，其特征在于，所述输出通道（6）由第一输出管道、第二输出管道和第三输出管道组成，所述第一输出管道与直形通道（3）位于同一水平线上，所述第二输出管道和第三输出管道分别位于第一输出管道的两侧。

3.根据权利要求2所述一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，其特征在于，所述第一输出管道、第二输出管道、第三输出管道的直径不同。

4.根据权利要求1所述一种基于惯性聚焦微流控的循环肿瘤细胞筛选方法，其特征在于，所述检测液流入惯性聚焦微流控芯片的流速为0.3-0.4mL/min，分离时间为20-30min。

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