JP6982327B2 - マイクロ流体アッセイのための方法、組成物およびシステム - Google Patents
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- G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
Description
本願は、2013年7月5日に出願された米国仮出願番号第61/843,252号および2013年10月23日に出願された米国仮出願番号第61/894,788号の利益を主張しており、これら出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたCA147831の下で政府支援とともになされた。政府は本発明において特定の権利を有している。
循環腫瘍細胞(CTC)は、原発腫瘍から血流に流され、癌転移の重要な側面である。CTCは、乳、肺、前立腺、および膵臓癌等の多くの異なる種類の癌で検出されてきた。CTCの数は、転移患者における臨床転機と直接相関し、臨床診療を管理するために役立ち得る、貴重な予後情報を提供する。
本明細書では、粒子を単離して分析し、検定(アッセイ)を行うための方法、装置、システム、およびデバイスが説明される。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法であって、
a.放射線源を使用して、第1のタグから信号を検出するステップであって、前記第1のタグは、前記被分析物上の第1のマーカーに結合する第1の構造に取り付けられる、ステップと、
b.前記第1のタグの存在に基づいて前記被分析物を分割するステップと、
c.前記第1のタグの前記信号の強度を低減させるステップと、
d.前記被分析物を、第2のマーカーに結合する第2の構造と接触させるステップであって、前記第2の構造は、第2のタグに取り付けられる、ステップと、
e.前記第2のタグを検出するステップと、
を含む、方法。
(項目2)
ステップ(b)の前記分割は、前記第1のタグおよび第3のタグの存在に基づく、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(b)の前記分割は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる、項目1〜2のいずれか1項に記載の方法。
(項目4)
ステップ(b)の前記分割およびステップ(b)またはステップ(e)のうちの少なくとも1つにおける前記検出は、同一のマイクロ流体デバイス内で起こる、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するための方法であって、
前記被分析物を第1のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第1のマーカーを含み、前記第1のタグは、前記第1のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第1のタグによって発せられる第1の信号を検出するステップであって、前記第1の信号の存在は、前記第1のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第1の信号の存在に基づいて、前記被分析物を含む流体を分割するステップと、
前記第1の信号の強度を低減させるステップと、
前記被分析物を第2のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第2のマーカーを含み、前記第2のタグは、前記第2のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第2のタグによって発せられる第2の信号を検出するステップであって、前記第2の信号の存在は、前記第2のマーカーの存在を示す、ステップと、
を含む、方法。
(項目6)
前記第1のタグの前記信号は、50%超低減させられる、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記流体を分割するステップは、前記第1の信号および第3の信号の存在に基づく、項目5〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記第1の信号を検出するステップ、前記第2の信号を検出するステップ、前記流体を分割するステップ、またはそれらの組み合わせは、マイクロ流体デバイスを使用して行われる、項目5〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記被分析物は、細胞である、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記細胞は、癌細胞である、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記癌細胞は、希少細胞である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記被分析物は、循環腫瘍細胞である、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記細胞は、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である、項目9に記載の方法。
(項目14)
前記細胞は、前記流体中の全細胞集団の1%未満を占める、希少細胞である、項目9に記載の方法。
(項目15)
前記流体は、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記流体は、全血である、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記流体は、分画全血である、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記第1のタグは、フルオロフォアである、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記第1のタグは、抗体である、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記第1のタグは、核酸を含むプローブである、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記信号の前記強度を低減させるステップは、放射線を前記被分析物に印加することによって達成される、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
白色光が、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
レーザが、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
発光ダイオードが、前記信号の前記強度を低減させるために使用される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記信号の前記強度を低減させるステップは、化学物質を前記第1のタグに適用することによって達成される、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記化学物質は、還元剤である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記還元剤は、ジチオスレイトールである、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記第1のタグおよび前記第2のタグから前記信号を撮像するステップをさらに含む、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記被分析物は、流体中に存在し、前記流体は、より大きい体積の流体のアリコートである、項目1〜28のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記分割は、半自動的または自動的に行われる、項目1〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記分割は、アンサンブル決定アリコートランク付けによって行われる、項目1〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記被分析物は、複数のマーカーを含む、項目1〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記複数のマーカーのそれぞれは、バイオマーカーである、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記被分析物は、発現プロファイルを含み、前記発現プロファイルは、前記複数のマーカーによって定義される、項目32〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記被分析物を緩衝剤と接触させるステップをさらに含む、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記緩衝剤は、固定剤を含有する、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記緩衝剤は、透過化剤を含有する、項目35〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記緩衝剤は、洗浄緩衝剤である、項目35に記載の方法。
(項目39)
フローサイトメータが、前記被分析物を分割するために使用されない、項目1〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記被分析物は、解離細胞である、項目1〜39のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記第1のタグによって発せられる前記第1の信号を検出するステップは、複数の被分析物上で同時に行われる、項目5〜40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
第1の細胞型および第2の細胞型を含むサンプルから細胞を単離する方法であって、
a.一式の管類を介して前記サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、前記マイクロ流体チップは、(i)前記一式の管類に流体によって接続される少なくとも1つのチャネルと、(ii)前記少なくとも1つのチャネル内の細胞の信号を検出するように構成される検出器と、(iii)前記少なくとも1つのチャネルに流体によって接続される少なくとも1つのチャンバとを備える、ステップと、
b.前記検出器を通り過ぎて前記サンプルの一部分を流動させるステップと、
c.前記サンプルの前記一部分内の前記第1の細胞型の存在または非存在を検出するために、前記検出器を使用するステップと、
d.前記第1の細胞型が前記サンプルの前記一部分内で検出される場合、前記サンプルのアリコートを前記チャンバの中へ指向するステップであって、前記アリコートは、前記第1の細胞型を含む、ステップと、
e.ステップ(b)、(c)、および(d)を繰り返し、それによって、前記チャンバが、前記サンプル内の第1の細胞型の総数の80%超、および前記サンプル内の第2の細胞型の総数の5%未満を含むように、前記チャンバ中の複数のアリコートを単離するステップと、
を含む、方法。
(項目43)
サンプルから細胞を単離する方法であって、
a.前記サンプルをマイクロ流体チップに導入するステップであって、前記サンプルは、第1の細胞型と、第2の細胞型とを含み、前記マイクロ流体チップは、
チャネルと、
前記チャネル内で発せられる信号を検出するように構成される検出器と、
前記チャネルと流体連通しているチャンバと、
を備える、ステップと、
b.前記チャネルを通して前記サンプルの一部分を流動させるステップであって、前記一部分は、複数の前記第1の細胞型、複数の前記第2の細胞型、またはそれらの組み合わせを含む、ステップと、
c.前記検出器を使用して、前記一部分内の前記第1の細胞型の存在または非存在を検出するステップと、
d.前記第1の細胞型が前記一部分内に存在する場合、前記一部分を前記チャンバの中へ指向するステップと、
e.前記チャンバが、前記サンプル内に存在する前記第1の細胞型の総数の80%超、および前記サンプル内に存在する前記第2の細胞型の総数の5%未満を含むように、十分な回数で(b)、(c)、および(d)を繰り返すステップと、
を含む、方法。
(項目44)
前記第1の細胞型および前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、癌細胞である、項目42〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記癌細胞は、希少細胞である、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記第1の細胞型および前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、循環腫瘍細胞である、項目42〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記第1の細胞型および前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または幹細胞である、項目42〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
前記第1の細胞型および前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、前記サンプル中の全細胞集団の1%未満を占める、希少細胞である、項目42〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記サンプルは、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、および尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、項目42〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記サンプルは、全血である、項目42〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記サンプルは、分画全血である、項目42〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
前記チャンバは、前記マイクロ流体チップの外部にある、項目42〜51のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
前記チャンバは、バイアル、微小遠心管、またはウェルプレート内のウェルである、項目42〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記チャンバは、管類を介して前記チャンバと流体連通している、項目42〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記チャンバは、毛細管を介して前記チャネルと流体連通している、項目42〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目56)
流体に由来するサンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割するための装置であって、
a.前記装置は、少なくとも1つのチャネル、およびチャンバを有する、マイクロ流体チップに接続される一式の管類を備え、
b.前記装置は、前記チャンバ中の前記細胞を単離することが可能であり、単離後、前記チャンバは、前記特定のバイオマーカープロファイルを発現する前記サンプル中の細胞の全集団の80%超を含み、単離後、前記チャンバは、異なるバイオマーカープロファイルを発現する前記サンプル中の細胞の全集団の5%未満を含む、装置。
(項目57)
特定のバイオマーカープロファイルを発現する前記細胞の前記単離は、20分未満で起こる、項目56に記載の装置。
(項目58)
前記特定のバイオマーカープロファイルは、前記流体のサンプル中の前記細胞の5%未満上に存在する、項目56〜57のいずれか1項に記載の装置。
(項目59)
前記流体は、血液である、項目56〜58のいずれか1項に記載の装置。
(項目60)
前記流体は、分画全血である、項目56〜58のいずれか1項に記載の装置。
(項目61)
前記流体は、全血の有核細胞分画である、項目56〜58のいずれか1項に記載の装置。
(項目62)
被分析物上に存在する複数のマーカーを識別するための方法であって、
a.複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板上で複数の被分析物を流動させることによって、前記複数の被分析物を分割するステップであって、微小空洞またはマイクロパッチの大部分は、多くても1つの被分析物を含有することが可能であり、前記微小空洞またはマイクロパッチは、マイクロ流体デバイスの中に位置する、ステップと、
b.前記微小空洞またはマイクロパッチの中で、各被分析物を、第1のマーカーに結合することが可能である第1の構造と接触させるステップであって、前記第1の構造は、第1のタグに接続される、ステップと、
c.前記第1のタグから信号を検出するステップと、
d.前記第1のタグの前記信号のレベルを低減させるステップと、
e.前記被分析物を、第2のマーカーに結合する第2の構造と接触させるステップであって、前記第2の構造は、第2のタグに接続される、ステップと、
f.前記第2のタグを検出するステップと、
を含む、方法。
(項目63)
ステップbの前記接触は、前記微小空洞またはマイクロパッチと流体連通しているチャネルを通して、前記第1の構造を備える流体を流動させることによって達成される、項目62に記載の方法。
(項目64)
ステップbの前記接触させるステップに続いて、前記方法はさらに、前記被分析物を洗浄緩衝剤と接触させるステップを含む、項目62〜63のいずれか1項に記載の方法。
(項目65)
被分析物上に存在する複数のマーカーを検出するための方法であって、
微小空洞またはマイクロパッチを備える基板上で流体を流動させることによって、前記微小空洞中または前記マイクロパッチ中の被分析物を単離するステップであって、前記流体は、前記被分析物を含む、ステップと、
前記被分析物を第1のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第1のマーカーを含み、前記第1のタグは、前記第1のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第1のタグによって発せられる第1の信号を検出するステップであって、前記第1の信号の存在は、前記第1のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第1の信号の強度を低減させるステップと、
前記被分析物を第2のタグと接触させるステップであって、前記被分析物は、第2のマーカーを含み、前記第2のタグは、前記第2のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記第2のタグによって発せられる第2の信号を検出するステップであって、前記第2の信号の存在は、前記第2のマーカーの存在を示す、ステップと、
を含む、方法。
(項目66)
前記方法は、複数の微小空洞またはマイクロパッチ内で単離される複数の被分析物に対して行われる、項目63に記載の方法。
(項目67)
前記第1のタグの前記信号は、50%超低減させられる、項目62〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目68)
少なくとも1つの被分析物は、細胞である、項目62〜67のいずれか1項に記載の方法。
(項目69)
被分析物は、流体流動によって生成される力、重力、または接着力によって、前記微小空洞内の固定位置で保持される、項目62〜68のいずれか1項に記載の方法。
(項目70)
被分析物は、分子相互作用を通して微小空洞またはマイクロパッチに接続される、項目62〜69のいずれか1項に記載の方法。
(項目71)
被分析物は、非共有結合によって微小空洞に接続される、項目62〜70のいずれか1項に記載の方法。
(項目72)
前記非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である、項目71に記載の方法。
(項目73)
流体サンプル中の粒子を検出するためのシステムであって、
入力チャネル、第1の出力チャネル、第2の出力チャネル、および指向性流チャネルを備える、マイクロ流体チップと、
弁であって、前記弁は、前記マイクロ流体チップから分離可能であり、
前記弁は、前記指向性流チャネル中の第1の流体の流動を調節し、
前記指向性流チャネル中の前記第1の流体の流動は、前記入力チャネルから前記第1の出力チャネル、前記第2の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ第2の流体の流動を指向する、弁と、
前記入力チャネル中の前記第2の流体の一部分から発せられる信号を検出するように構成される、検出器と、
前記信号に基づいて値を前記一部分に割り当て、前記弁を操作するように構成される、プロセッサと、
を備える、システム。
(項目74)
前記弁は、電子作動型弁である、項目73に記載のシステム。
(項目75)
流体サンプル中の粒子を検出するためのシステムであって、
a.少なくとも1つのサンプル入力チャネル、少なくとも1つの指向性流チャネル、および少なくとも2つの出力チャネルを備える、マイクロ流体チップであって、前記少なくとも1つの指向性流チャネルは、前記サンプル入力チャネルに交差する、マイクロ流体チップと、
b.前記マイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する、電子作動型弁であって、前記電子作動型弁は、少なくとも1つの指向性流チャネルまたは前記少なくとも2つの出力チャネルのうちの少なくとも1つに交差する入力チャネルを制御することによって、流体の流動を制御する、電子作動型弁と、
c.前記流体サンプルのアリコート中の1つまたはそれを上回る被分析物を検出することが可能な少なくとも1つの検出器と、
d.前記アリコート中の被分析物の存在、非存在、識別、組成、または量に基づいて、値を前記アリコートに割り当てることが可能なプロセッサであって、前記プロセッサは、前記検出器および前記電子作動型弁と通信している、プロセッサと、
を備える、システム。
(項目76)
前記電子作動型弁は、ソレノイド弁である、項目74〜75のいずれか1項に記載のシステム。
(項目77)
前記電子作動型弁は、少なくとも1つの指向性流チャネル中の前記流体の前記流動を制御する、項目75〜76のいずれか1項に記載のシステム。
(項目78)
前記電子作動型弁は、常時閉であり、前記電子作動型弁は、前記プロセッサから信号を受信した後に開放する、項目74〜77のいずれか1項に記載のシステム。
(項目79)
前記電子作動型弁は、常時開であり、前記電子作動型弁は、前記プロセッサから信号を受信した後に閉鎖する、項目74〜77のいずれか1項に記載のシステム。
(項目80)
少なくとも1つの指向性流チャネルは、少なくとも2つのポートを備え、前記電子作動型弁は、前記ポートのうちの1つを通る前記流体の流動を制御する、項目74〜79のいずれか1項に記載のシステム。
(項目81)
前記電子作動型弁は、少なくとも1つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目74〜80のいずれか1項に記載のシステム。
(項目82)
前記電子作動型弁は、少なくとも1つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、項目74〜81のいずれか1項に記載のシステム。
(項目83)
前記電子作動型弁は、1つだけの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目74〜82のいずれか1項に記載のシステム。
(項目84)
前記電子作動型弁は、出力チャネル中の流体の流動を直接制御する、項目74〜82のいずれか1項に記載のシステム。
(項目85)
前記電子作動型弁は、出力チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、項目74〜82のいずれか1項に記載のシステム。
(項目86)
前記電子作動型弁は、圧電弁である、項目74〜85のいずれか1項に記載のシステム。
(項目87)
指向性流チャネルは、合流点で出力チャネルに交差する、項目73〜86のいずれか1項に記載のシステム。
(項目88)
前記検出器は、出力チャネルではない、少なくとも1つのチャネルの上に位置する、項目73〜87のいずれか1項に記載のシステム。
(項目89)
前記デバイスは、確認レーザを備える、項目73〜88のいずれか1項に記載のシステム。
(項目90)
前記確認レーザは、入力チャネルではない、少なくとも1つのチャネル上に位置する、項目89に記載のシステム。
(項目91)
前記システムは、第2の検出器を備える、項目73〜80のいずれか1項に記載のシステム。
(項目92)
少なくとも1つのチャネルは、フィルタと流体連通している、項目73〜81のいずれか1項に記載のシステム。
(項目93)
マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するための方法であって、前記アリコートは、希少粒子を含み、
a.前記アリコート中の前記希少粒子の存在または非存在を検出するステップと、
b.前記希少粒子の存在または非存在に基づいて、値を前記アリコートに割り当てるステップと、
c.電子作動型弁を開放することによって、前記割り当てられた値に基づいて前記アリコートの流動を指向するステップであって、前記電子作動型弁は、前記マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップと、
を含む、方法。
(項目94)
前記マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも2つの出力チャネルと、少なくとも1つの指向性流チャネルとを備え、前記電子作動型弁は、前記指向性流チャネル内の流体の流動を制御する、項目93に記載の方法。
(項目95)
流体サンプル中の希少粒子を検出するためのデバイスであって、
入力チャネルと、
第1の出力チャネルと、
第2の出力チャネルと、
前記流体サンプルの一部分中の粒子の存在または非存在を検出するように構成される、検出器と、
前記粒子の存在または非存在に基づいて、前記入力チャネルから前記第1の出力チャネル、前記第2の出力チャネル、またはそれらの組み合わせへ前記一部分の流動を指向するための機構と、
前記第1の出力チャネルと流体連通しているフィルタと、
を備える、デバイス。
(項目96)
前記フィルタは、開口のアレイを備える、項目95に記載のデバイス。
(項目97)
前記アレイ内の各開口の最小寸法は、前記粒子の最小寸法より小さい、項目96に記載のデバイス。
(項目98)
流体サンプル中の希少粒子を検出するためのデバイスであって、
a.少なくとも1つのサンプル入力チャネルと、
b.少なくとも2つの出力チャネルであって、前記2つの出力チャネルのうちの少なくとも1つは、開口のアレイと流体連通している、出力チャネルと、
c.前記流体サンプルのアリコート中の1つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも1つの検出器と、
d.第1の出力チャネルを通して、前記1つまたはそれを上回る希少粒子を含有するアリコートの流動を指向することによって、前記1つまたはそれを上回る希少粒子を選別するための機構と、
を備える、デバイス。
(項目99)
第1の出力チャネルと、第2の出力チャネルとを備える、項目98に記載のデバイス。
(項目100)
前記機構は、前記アリコートが希少粒子を含有しない場合、前記アリコートの前記流動を前記第2の出力チャネルの中へ指向する、項目99に記載のデバイス。
(項目101)
前記開口のアレイは、入力チャネルと出力チャネルとの間に配置される、項目96〜100のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目102)
前記開口のアレイは、入力チャネルおよび出力チャネルと同一の平面内にある、項目96〜100のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目103)
前記開口のアレイは、前記第1の出力チャネル内に配置される、項目96〜100のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目104)
前記開口のアレイは、前記第1の出力チャネルと流体連通しているチャンバの中に配置される、項目96〜100のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目105)
前記開口のアレイは、前記希少粒子が前記開口を通過することができないが、少なくとも1つの他の粒子が前記開口を通過することが可能であるように構成される、項目98〜104のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目106)
前記開口のアレイは、前記希少粒子が前記開口を通過することが可能であるが、少なくとも1つの他の粒子が前記開口を通過することができないように構成される、項目98〜104のいずれか1項に記載のデバイス。
(項目107)
前記開口のアレイは、1000個超の開口を備える、項目96〜106いずれか1項に記載のデバイス。
(項目108)
前記選別のための機構は、電極、磁気要素、音響要素、または電子作動型要素を備える、項目95〜107いずれか1項に記載のデバイス。
(項目109)
前記検出器は、カメラ、電子倍増管、電荷結合素子(CCD)画像センサ、光電子倍増管(PMT)、アバランシェフォトダイオード(APD)、単光子アバランシェダイオード(SPAD)、シリコン光電子倍増管(SiPM)、および相補型金属酸化膜半導体(CMOS)画像センサから成る群から選択される、項目95〜108いずれか1項に記載のデバイス。
(項目110)
検定を行うための統合システムであって、
粒子を含む流体サンプルであって、前記粒子は、マーカーを含む、流体サンプルと、
入力チャネルと、
第1の出力チャネルと、
第2の出力チャネルと、
前記流体サンプルの一部分中の前記粒子の存在または非存在を検出するように構成される、第1の検出器であって、前記一部分は、前記入力チャネル内に配置される、第1の検出器と、
前記粒子の存在または非存在に基づいて、前記入力チャネルから前記第1の出力チャネルへ前記一部分の流動を指向するための機構と、
前記第1の出力チャネルと流体連通し、前記粒子を閉じ込めるように構成される、微小空洞と、
前記微小空洞中の前記マーカーの存在または非存在を検出するように構成される、第2の検出器と、
を備える、システム。
本明細書で記述される全ての出版物、特許、および特許出願は、各個別出版物、特許、または特許出願が、参照することにより組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
本開示は、多くの場合、マイクロ流体装置の使用とともに、流体サンプル(例えば、血液)中の粒子(例えば、細胞)を検出、分離、および分析するための方法、システム、およびデバイスを提供する。粒子は、希少粒子(例えば、希少細胞)であり得る。本明細書で提供されるマイクロ流体装置の多くは、アンサンブル決定アリコートランク付け(eDAR)を流体サンプルに行うために使用することができ、これは、流体サンプルがアリコートに分割された後に流体サンプルの分析を可能にする。
本開示で説明される方法は、流体サンプルからの被分析物の単離および検出に使用することができる。いくつかの側面では、本方法は、第1のタグまたはタグの第1のセットを使用した被分析物上の分子の検出、タグによって発せられる信号の低減、および第2のタグまたはタグの第2のセットを使用した被分析物上の別の分子のセットの検出を含むことができる。いくつかの側面では、本方法は、サンプルから分離される被分析物を使用して行うことができる。いくつかの側面では、本方法は、マイクロ流体デバイスと組み合わせることができる。マイクロ流体デバイスは、サンプルから被分析物を単離するために使用することができる。いくつかの側面では、免疫染色および退色と称される本方法は、サンプルから被分析物を単離するために使用されるマイクロ流体デバイスに行うことができる。
マイクロ流体チップは、効率的かつ能動的選別方式および後続の精製(例えば、精製チャンバ)方式を提供するように加工することができる。マイクロ流体チップは、シリコンマスタ上の2つの層から成ることができ、かつポリジメチルシロキサン(PDMS)への1段階複製成形で加工することができる。マイクロ流体チップは、ガラス基板への結合で仕上げることができる。
本明細書で提供される本開示は、流体サンプル中の被分析物(例えば、希少粒子)を検出するための装置を説明し、本装置は、(a)少なくとも第1の入力チャネルと、(b)少なくとも2つの出口チャネルと、(c)生物学的流体のアリコート中の1つまたはそれを上回る希少粒子を検出することが可能な少なくとも1つの検出器と、(d)アリコートの流動を指向するための機構と、(e)アリコート中の希少粒子の存在、非存在、識別、組成、または数量に基づいて、値をアリコートに割り当てることが可能なランク付けデバイスとを備え、デジタルプロセッサ(例えば、コンピュータ)は、検出器およびアリコートの流動を指向するための機構と通信している。
本明細書で提供されるeDAR装置はさらに、フィルタ要素を備えることができる。いくつかの側面では、フィルタ要素は、微小支柱、微小障壁、微小衝突体、微小篩、生体粒子より小さい開口を伴うチャネル、生体粒子が開口に進入することを防止することができるが、開口(「1Dチャネル」)を通って生体粒子の周囲で流体を流動し続けさせることができるような開口を伴うチャネル、マイクロビーズ、多孔質膜、壁からの突出部、接着コーティング、羊毛の織物または不織繊維(布またはメッシュ等)、金属(例えば、ステンレス鋼またはモネル)、ガラス、紙、または合成物質(例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、パリレン、およびポリエステル)、焼結ステンレス鋼または他の金属、あるいはアルミナ、シリカ等の多孔質無機材料の形態であり得る。
eDARプラットフォームの特徴および性能に寄与する、2つの主要な要因は、(1)効率的かつ能動的選別方式、および(2)後続の効率的な精製(例えば、精製チャンバ)方式である。マイクロ流体チップおよび流体力学的切替機構の分析性能は、特定の回収効率(例えば、95%)、特定の偽陽性率(例えば、0)、および特定のスループット(例えば、1時間につき4.8mLの全血)のために最適化することができる。
eDAR装置は、流体の流動および流体力学的選別方式を制御するようにソレノイドを含む。いくつかの側面では、ソレノイドは、ピストンであり得る。例えば、ソレノイドピストンは、電子作動型ソレノイド弁の副次構成要素である。いくつかの側面では、電子作動型ソレノイド弁は、圧電弁であり得る。いくつかの側面では、ソレノイドピストンは、成形によって装置に組み込むことができる。いくつかの側面では、ソレノイドは、弁であり得る。例えば、組み込みソレノイドピストンは、管類を介して流体連通しているソレノイド弁によって置換されてもよい。
被分析物(例えば、希少細胞または循環腫瘍細胞(CTC))は、第1の検出窓から第2の検出窓へ流動することができる。第1の窓での決定APDピークの記録と確認信号の検出との間で経過し得る時間は、被分析物を選別するための経過時間であり得る。いくつかの側面では、経過時間は、変動し得る。いくつかの側面では、線形流速が、経過時間に影響を及ぼし得る。いくつかの側面では、マイクロチャネルの層流が、経過時間に影響を及ぼし得る。いくつかの側面では、体積流速を40μL/分に設定することができる(図9b)。いくつかの側面では、体積流速は、約1μL/分、2μL/分、3μL/分、4μL/分、5μL/分、6μL/分、7μL/分、8μL/分、9μL/分、10μL/分、11μL/分、12μL/分、13μL/分、14μL/分、15μL/分、16μL/分、17μL/分、18μL/分、19μL/分、20μL/分、21μL/分、22μL/分、23μL/分、24μL/分、25μL/分、30μL/分、35μL/分、40μL/分、45μL/分、50μL/分、55μL/分、60μL/分、65μL/分、70μL/分、75μL/分、80μL/分、85μL/分、90μL/分、95μL/分、100μL/分、または200μL/分であり得る。
本開示は、検出システムを装備することができるマイクロ流体チップを使用する、eDAR用の装置を提供する。いくつかの側面では、検出システムは、線共焦点検出方式を含むことができる。線共焦点検出方式では、2つのレーザ源(例えば、488および633nm)は、一連のダイクロイックミラー、円柱レンズ、およびビームスプリッタを使用して、(例えば、2つの)検出窓を形成する。第1の検出窓は、同時に重複する2つのレーザビームを有することができ、かつ標識希少細胞(例えば、CTC)から蛍光信号を検出するために使用することができる。第2の検出窓は、選別されたアリコート中で、希少細胞の識別または希少細胞の欠如を確認するために使用することができる。第2の検出窓はさらに、選別効率を監視するために使用することができる。
本開示は、検出デバイスまたは撮像デバイスと、ランク付けデバイス(例えば、コンピュータ)とを含むことができる、eDAR用の装置を提供する。いくつかの側面では、レーザ(または1つより多くのレーザ)が、調査デバイスとしての機能を果たすことができる。フォトダイオード、光電子倍増管、またはカメラを伴う倒立顕微鏡を、検出デバイスとして使用することができる。マスクをチャネルと検出デバイスとの間の経路に配置することができる。
本開示はさらに、eDARの「二重捕捉」バージョン用の装置を提供する。二重捕捉装置は、混合流体の同一のサンプルから、希少細胞の2つの異なる亜集団を分離することができる。これは、単一のマイクロ流体チップ上で同時に行うことができる。2つの亜集団はさらに、マイクロ流体チップ上の2つの異なる領域上で別々に閉じ込めることができる。
本開示は、マイクロ流体デバイスを使用する、逐次免疫染色および退色方法のための方式を提供する。本方法は、第PCT WO 2010/120818号で引用されるeDAR装置、本明細書で提供される装置、または当技術分野で公知である他の装置を使用することができる。いくつかの側面では、本方式は、eDARと併用することができる。いくつかの側面では、本方式は、死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、希少細胞を単離し、染色し、および退色させるプロセスを自動化するように、インライン染色および洗浄システムと併用することができる。
免疫染色および光退色の方法は、閉じ込められた被分析物(例えば、粒子)上に位置するバイオマーカーを識別するためのタグまたは標識の使用を含むことができる。いくつかの側面では、タグは、本明細書で説明されるeDAR装置、または当業者に公知であるタグの検出のために構成される他の装置を使用して、検出することができる。いくつかの側面では、タグは、本明細書で説明される装置の構成要素を使用して、または当業者に公知である光退色デバイスを使用して、光退色させることができる。いくつかの側面では、タグは、粒子に損傷を引き起こし得る装置を使用して、光退色させることができる。他の場合においては、タグを光退色させることができない。
本方法は、被分析物(例えば、閉じ込められた粒子)によって発現する、その上に位置する、またはその付近に位置することができる、複数のバイオマーカーを提供する。本開示によって検出することができる複数のバイオマーカーは、閉じ込められた粒子に行うことができる、数回の免疫染色および光退色を受ける。各回の免疫染色は、0個のタグ、1個のタグ、2個のタグ、3個のタグ、4個のタグ、5個のタグ、6個のタグ、7個のタグ、8個のタグ、9個のタグ、または10個のタグを含むことができる。各回の免疫染色のためのタグの範囲は、1〜10個のタグ(例えば、4つ)を含むことができる。
本方法は、免疫染色後に光退色を提供する。光退色は、被分析物からタグの検出可能部分によって発せられる信号の強度を除去するか、または低減させるための光の使用を伴うことができる。タグは、タグまたは標識が発する信号を消光することによって除去することができる。いくつかの側面では、光退色は、1回の免疫染色後に、または逐次的な回数の免疫染色後に起こることができる。
本明細書で提供される本開示では、サンプルは、流体サンプルを含むことができる。流体サンプルは、種々の発生源を起源とすることができる。いくつかの側面では、発生源は、ヒト、哺乳類、動物、微生物、細菌、真菌、酵母、ウイルス、齧歯類、昆虫、両生類、および魚類であってもよい。
本開示はさらに、分析を行うことができる方法を提供する。いくつかの側面では、分析は、アリコートを調査するための発生源を含むことができる。アリコートが化学発光または生物発酵を本質的に呈することができる被分析物(例えば、希少粒子)を含有する、他の場合において、本装置は、アリコートを調査するための発生源を必要としなくてもよい。
本開示は、液相から単一被分析物を捕捉するための方法および装置を提供する。いくつかの側面では、被分析物は、粒子であり得る。他の場合において、被分析物は、細胞であり得る。被分析物は、チャンバの中に閉じ込めることができる。他の場合において、被分析物は、ウェルの中に閉じ込めることができる。他の場合において、被分析物は、パッチ上に閉じ込めることができる。いくつかの側面では、チャンバまたはウェルは、線形形式で配列することができる。他の場合において、チャンバまたはウェルは、アレイ形式で配列することができる。
本開示は、種々の用途で使用される方法を提供する。いくつかの側面では、本方法は、流体サンプル、例えば、血液サンプル等の生物学的流体中の希少粒子の存在と関連付けられる条件の診断または予後を対象に提供することができる。
いくつかの側面では、本方法を使用して単離される被分析物(例えば、細胞)はさらに、標的治療を開発するように(例えば、遺伝子型または表現型に従って)亜集団分析を受けることができる。例えば、単離された細胞(例えば、腫瘍細胞)は、薬剤標的の発現の存在または程度を判定するように、特定のバイオマーカー(例えば、薬剤標的)に結合するタグ(例えば、蛍光抗体)とともに培養することができる。いったん薬剤標的の発現が確認されると、特定の薬剤標的の発現を標的にするように特異的に開発される薬剤を治療のために選択することができる。一実施例では、単離された腫瘍細胞は、CTCを流す乳房腫瘍がHer2陽性であるかどうかを判定するように、Her2受容体に特異的に結合する蛍光抗体とともに培養することができる。単離された腫瘍細胞が高いHer2発現を呈する場合、Herceptin(トラスツズマブ)が、HER2タンパク質過剰発現の機能を標的にして遮断するように設計されているため、この薬剤を治療として使用することができる。BCR−ABLまたはPDGFR(薬剤Gleevecによって標的にされる)、ERBB2(Herceptinによって標的にされる)、EFGR(Iressa、Tarcevaによって標的にされる)、RARアルファ(ATRAによって標的にされる)、エストロゲン受容体(タモキシフェンによって標的にされる)、アロマターゼ(レトロゾールによって標的にされる)、アンドロゲン受容体(フルタミド、ビカルタミドによって標的にされる)、CD20(リツキシマブによって標的にされる)、VEGF受容体(Avastinによって標的にされる)を含む、他の既知の薬剤標的もまた、適切な化学療法計画を処方する前に単離された腫瘍細胞から同様に選抜することができる。
本開示は、流体中の被分析物の存在と関連付けられる疾患または症状の予後のための方法を提供する。いくつかの側面では、被分析物は、生物学的粒子であり得る。いくつかの側面では、流体は、生物学的流体であり得る。いくつかの側面では、本方法は、(a)対象からのサンプルのアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、(b)被分析物の存在または非存在に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、(c)割り当てられた値に基づいてアリコートの流動または収集を指向するステップと、(d)被分析物がサンプル中で検出されない場合に良好な予後、または被分析物がサンプル中で検出される場合に不良な予後のいずれかを提供するステップとを含む。
本開示は、疾患の進行または治療への応答を監視するための方法を提供する。いくつかの側面では、本方法は、流体サンプル中の被分析物を検出するステップを含むことができる。いくつかの側面では、本方法は、(a)第1の時間に対象から採取された第1の生物学的サンプルの複数のアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、(b)希少粒子の存在、非存在、数量、または識別に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、(c)第1のサンプルからの全てのアリコートの合計値を判定するステップと、(d)第2の時間に対象から採取された第2の生物学的サンプルの複数のアリコート中の被分析物の存在または非存在を検出するステップと、(e)被分析物の存在、非存在、数量、または識別に基づいて、値をアリコートに割り当てるステップと、(f)第2のサンプルからの全てのアリコートの合計値を判定するステップと、(g)第1のサンプルに割り当てられた合計値を第2のサンプルに割り当てられた合計値と比較するステップとを含み、第1のサンプルと比較して、第2のサンプルに割り当てられた増加値は、疾患の進行および/または治療への不良な応答と相関し、および/または第1のサンプルと比較して、第2のサンプルに割り当てられた減少値は、疾患の退行および/または治療への良好な応答と相関する。いくつかの側面では、アリコートはさらに、収集、さらなる濃縮、またはさらなる分析のために割り当てられた値に基づいて、特定のチャネルまたはチャンバ(チャネル付き)の中へ指向することができる。
Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)等の当業者に公知である辞書から取られるべきである。
(実施例1)
循環腫瘍細胞の大容量閉じ込めのためのマイクロ流体構成要素に基づくアンサンブル決定アリコートランク付け
本実施例で使用されるマイクロ流体チップは、同一の設計で統合される2つの機能的領域、すなわち、eDAR選別領域およびスリット構造に基づく濾過ユニットを有していた。選別合流点に血液を導入した、選別ユニット内の主要チャネルは、50μmの高さおよび150μmの幅を有し、全ての他の4つのチャネルは、高さ50μmおよび幅200μmであった。スリットフィルタは、高さ5μmおよび幅5μmであった。試験されたスリットの最大数は、20,000であった。
3つの乳癌細胞株、すなわち、SKBr−3、MCF−7、およびMDA−MB−231細胞(American Type Culture Collection (ATCC)(Manassas, VA))が、eDARシステムを特性評価して最適化するために使用された。SKBr−3細胞は、マッコイ5培地で培養され、MCF−7は、イーグル最小必須培地(EMEM)で培養され、MDA−MB−231は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(ATCC(Manassas,VA))で培養された。全ての細胞培地はまた、2mM L−グルタミン、10%ウシ胎仔血清(FBS)(ATCC(Manassas,VA))、および50μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン(ATCC(Manassas,VA))も含有していた。培養は、加湿環境内で5%CO2を伴って37℃で行われた。MDA−MB−231−GFP細胞株は、タフツ大学(Tuffs University)のGail Sonenshein教授によって提供され、10%FBSおよび1μg/mLピューロマイシン(Life Technologies(Carlsbad, CA))を伴うDMEM培地で培養された。健康なドナーからの対照血液が、Plasma International Lab(Everett, WA)から購入され、皮膚細胞からの任意の起こり得る汚染を防止するように、採血の第1の管が廃棄された。全血サンプルが、Fred Hutchinson Cancer Research Centerの施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、転移膵臓癌がある患者から採取された。患者サンプルが、抗凝固剤としてEDTAを含有するVacutainer管(BD(Franklin Lakes, NJ))を使用して、Seattle Cancer Care Alliance(SCCA)で収集され、4℃で貯蔵され、4時間以内に分析された。
別様に特定されない限り、Isoton(Beckman Coulter Inc.(Chino, CA))が全ての実験用の緩衝剤として使用された。典型的なeDAR実験については、1mLの全血サンプルが、暗室にて室温で30分間、フィコエリトリン(PE)(ロット番号515776、Abnova(Walnut, CA))と共役した抗EpCAMで標識された。全ての標識パラメータが最適化されている。標識サンプルは、14mLまで希釈され、次いで、遊離抗体を除去するように遠心分離された。最終体積は、初期体積と同一であるように調整された。調製されたサンプルは、次に、シリンジポンプを使用してマイクロ流体チップに注入された。ファイバ連結アバランシェフォトダイオード(APD)(Excelitas Technologies(Waltham, MA))からのトレースが、PCIデータ取得カード(PCI 6602、National Instruments(Austin, TX))によって収集された。eDARの選別プロセスは、施設で書かれたLabVIEW(National Instruments(Austin, TX))スクリプトおよび施設内で構築されたフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)デバイスを使用して、自動的に制御された。選別されたアリコートを収集した流体力学的切替は、Lee Company(Westbrook, CT)から購入されたソレノイド(INKA1226212H)によって制御された。
以前に、eDARは、電気浸透流またはゾル・ゲル変換等の他の報告された切替機構と比較して、高速(約2ミリ秒の応答時間)かつ堅調であった、能動的選別ステップを制御する機械弁を有していた。有望であるが、この機械弁方式のいくつかの設計要因は、eDARの潜在的用途を潜在的に制約した。マイクロ流体チップ上で機械弁を形成するために、3つの個々の構造層、すなわち、ソレノイド、そのPDMSスレッド、および150μmPDMSフィルム上のマイクロチャネルが必要とされた。これは、マイクロ流体チップの製作を複雑で時間がかかるものにするであろう。別の欠点は、CTCの損失または損傷のリスクを潜在的に増加させた、捕捉された血液アリコートと機械弁との間の直接接触であった。本実施例では、ソレノイドは、常時閉であるが、5VDC電圧が印加されるときに2〜3ミリ秒で開放することができる、オフチップモデルと置換された。このインラインソレノイドがマイクロ流体チップの一部ではなかったため、マイクロ流体デバイスの製作は、有意に簡略化された。ソレノイドは、流体力学的選別方式を試験するように、任意のマイクロチャネルと容易に接続することができる。8つの異なる方式が、流体切替を駆動するように設計および試験された(図6)。この種類のソレノイドの構造、およびPDMSの弾性的性質により、流体性能が変動し(表1)、各方式が最良性能のために特性評価された。
本実施例のさらに別の側面は、PDMSで作製することができ、付加的な層を必要としない場合がある、オンチップ濾過ベースのマイクロスリット構造の新しい方式を含むことができる(図10a)。図10aは、いかなる赤血球(RBC)も保持することなくCTCを捕捉するために使用された、これらのマイクロスリットの実施例の基本構造を示す。スリットのサイズは、いかなる小さいCTCの損失も回避するために、高さ5μmおよび幅5μm(図10b)であるように最適化された。濾過に基づくCTC方法の大部分で使用されるものより小さい、このサイズのフィルタを使用して、多くの白血球が捕捉されなかった。マイクロフィルタがPDMSで作製され、カバースリップ片と結合されたため、完全に透明ではなく、散乱および収差を生成し得る、ポリカーボネートフィルタと比較して、画質が有意に向上させられた(図10cおよび10D)。また、細胞をスリットのアレイに沿って捕捉することのみできたため、それらを容易に参照して追跡することができ、多くの他の方法では、細胞は、表面上に無作為に分配される。スリットに沿ったこの閉じ込めは、撮像手技をより高速にし、計数の結果をより正確にした。スリットはまた、閉じ込められたCTCに二次標識を行うことをより高速かつ効率的にした。図10eは、抗EpCAM−PEで標識された2つの癌細胞がマイクロスリット上に閉じ込められたことを示す。抗サイトケラチン−Alexa488、抗Her2−Alexa647、およびHoechstを使用して、細胞が固定、透過化、および標識された。蛍光画像は、これら2つの細胞上のこれらのマーカーの発現を明確に示し、明視野像もまた、それらの形態を確認した。2つの細胞はまた、陰性対照マーカーとして抗CD45−Alexa700で標識され、カラーチャネルからのいかなる信号も、このタグに対応しなかった。
能動的選別ステップの効率が、リアルタイムで監視された。図9は、膵臓癌患者サンプルからのAPDデータのごく一部分を示す。「決定APDトレース」は、アリコートをランク付けし、選別を制御した第1の検出窓に由来した。978および1298ミリ秒における2つのピークは、アリコート選別をトリガした、抗EpCAM−PEで標識された2つのCTCを表した。「確認APDトレース」の2つのピークは、2つの癌細胞が収集チャネル上に位置する第2の検出窓を通って流動したことを示し、2つの陽性アリコートが実際に選別されたことを確認する。第2の検出器からの背景変化(図9a)がまた、血液のごく一部分のみがeDARによって収集され、CTCの高い濃縮比(典型的な臨床サンプルについて最大100万倍)に寄与したことも確認したことを指摘する価値がある。
本方法の偽陽性率を評価するために、15人の健康なドナーからの血液サンプルが使用され、それらのうちのいずれでもCTCが見出されなかった。26個の血液サンプルが、膵臓癌がある患者から収集された。第1世代のeDARを使用して、それらのうちの16個が分析され、より新しいeDARプラットフォームを使用して、他の10個のサンプルが分析された。図25は、3つのデータセット、すなわち、現在の方法によって分析された対照血液、第1世代のeDARによって分析された膵臓癌サンプル、および現在の方法によって分析された膵臓癌サンプルの分布を示す。これらの臨床サンプルの未加工データが、表3(以下)内にある。
逐次免疫染色および光退色による、捕捉された希少細胞中の複数のバイオマーカーの撮像
本実施例では、逐次免疫染色および光退色プロセスのための好ましい方式が開示される。好ましい実施例では、死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、プロセスを自動化するために、インライン染色および洗浄システムがeDARと併用される。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体チップは、以前に説明された方法を使用して加工された。簡潔には、本特徴は、AutoCAD(AutoDesk(San
Rafael, CA))を使用して設計され、次いで、Fineline Imaging(Colorado Springs, CO)によって透明マスク上に書き込まれた。微小特徴が、陰性フォトレジストとしてSU−8−3050(Micro−Chem Corp.(Newton, MA))を使用してシリコンウエハ上で加工され、特徴の高さは、50μmであるように制御された。いったん特徴が開発されると、未硬化PDMSがシリコンマスタ上に注がれ、75℃で2時間培養され、剥離され、次いで、プラズマ酸化方法を使用してガラスカバースリップに結合された。
別様に特定されない限り、Isoton(Beckman Coulter Inc.(Chino, CA))が全ての実験用の緩衝剤として使用された。乳癌細胞株、すなわち、MCF−7、SKBr−3、およびMDA−MB−231(American Type Culture Collection (ATCC)(Manassas,VA))が、本システムを特性評価するために使用された。細胞培養が、ベンダによって推奨される条件下で行われ、週に1回収穫された。MCF−7は、イーグル最小必須培地(EMEM)で培養され、SKBr−3細胞は、マッコイ5培地で培養され、MDA−MB−231は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(ATCC(Manassas,VA))で培養された。全ての細胞培地はまた、2mM L−グルタミン、10%ウシ胎仔血清(FBS)(ATCC(Manassas,VA))、および50μg/mLペニシリン/ストレプトマイシンも含有していた。健康なドナーから採取されたヒト全血が、Plasma International Lab(Everett, WA)から購入され、到着時に4℃で貯蔵された。各20mL採血は、抗凝固剤としてEDTAでコーティングされた4本の5mL Vacutainer管で入荷した。皮膚細胞からの潜在的な汚染を回避するように、各採血の第1の管が廃棄された。
eDARによって単離された細胞を洗浄した後、インライン弁をオフにすることによって、主要、側方、および廃棄物チャネルが閉鎖された。細胞固定緩衝剤(BioLegend(San Diego, CA))の400μLアリコートが、15μL/分の流速で蠕動ポンプポンプ(Fisher Scientific(Pittsburgh, PA))によってマイクロ流体チップに導入された。緩衝剤で同一の流速にて5分間洗浄した後、250μLの2.5%surfynol 465界面活性剤(Air Products and Chemicals Inc(Allentown, PA))を15分間流動させることによって、細胞が透過化された。本ステップ後、細胞の4回の免疫染色および光退色が行われた。各回の染色について、4つの異なる蛍光色素に共役した4つのバイオマーカーを伴う220μLの染色溶液が調製された。各回で使用される抗体および核染色についての詳細が、表2に要約される。凝集体を除去する遠心分離ステップ(5分にわたって14,000rpm)後、200μLの上清が染色緩衝剤として収集された。上清は、20μL/分の流速でマイクロ流体チップに注入された。抗体溶液が濾過領域全体を充填したとき、流動が停止された。培養は、全ての閉じ込められた細胞が抗体に効率的に接触したことを確実にするように、暗室で20分間行われた。本ステップ後、細胞は、任意の遊離抗体を除去し、蛍光背景を最小限化するように、10分間洗浄された。光源としてキセノンアーク灯(Sutter instrument(Novato, CA))を使用して、光退色が行われた。各退色ステップは、15分かかった。20倍対物レンズが、落射蛍光撮像および光退色に使用された。蛍光画像が、4つの異なる発光チャネル、すなわち、黄色(PEの場合、555nm〜605nm)、青色(Hoechstの場合、435nm〜485nm)、緑色(FITCまたはAlexa 488の場合、510nm〜540nm)、および赤色(Alexa 647またはAPCの場合、665nm〜695nm)から、光退色ステップの前および後に収集された。
光退色試験を実行するときの安全性を確保するために、最高出力が10mWにロックされた。サンプルが光源に暴露されるときに、保護眼鏡を装着すること、または黒い箱で光退色領域を覆うこと等のある保護方法が考慮されるべきである。
全血サンプルが、フルオロフォアに共役した抗体で事前標識され、次いで、マイクロ流体チップに導入された。多くの用途で、EpCAMが、陽性選択のためのバイオマーカーとして使用された。しかしながら、本方法は、異なる、またはより複雑な選択論理を使用することにおいて便宜的であり得る。
死容積を最小限化し、使用される抗体の量を減少させ、気泡を導入することを回避し、プロセスを自動化するために、インライン染色および洗浄システムが開発され、eDARと併用された。図13Aに示されるように、灌流標識および洗浄ステップを行うように、マイクロ流体チップ上の2つのポートが開かれたままにされた一方で、他の3つ全てのポートは完全に閉鎖された。蠕動ポンプが、洗浄緩衝剤および標識試薬をマイクロ流体チップに送達し、6方向弁を介して加圧緩衝剤源と連結された。この弁の上の他の3つのポートは、任意の起こり得る漏出または汚染を防止するように完全に遮断された。eDAR実験を実行するとき、6方向弁は、流体力学的切替の安定した制御を提供するように、加圧緩衝剤側に旋回させられた。これは、いかなる気泡も導入することなく、正確な量の試薬をマイクロ流体チップに注入するように、蠕動ポンプ側に旋回させられた。本方式を使用して、数ナノグラムの抗体が、5分未満で閉じ込められた細胞に導入され、典型的な培養ステップは、20分未満かかった(図13B)。
光退色ステップの効率を判定することができる、2つの重要な要因、すなわち、細胞が潜在的な加熱によって損傷されないことを確実にしながら、効率およびスループットを向上させるように特性評価および最適化された暴露強度および時間があった。異なる暴露強度下の光退色曲線が、最初に研究された(図15A)。MCF−7細胞が、抗EpCAM−PEで標識され、2番のカバースリップ上に配置された。標識単細胞は、3つの異なる強度設定で退色させられた。退色曲線は、暴露強度が2mWより高かったときに95%超の退色効率を得るように、暴露時間を10分を下回って制御できることを示す。
逐次免疫染色および撮像のための単一被分析物閉じ込め
本実施例は、逐次免疫染色および撮像の方法と併用される、単一被分析物閉じ込め装置を説明する。
二重捕捉eDAR
本実施例は、本開示の側面による、eDARの「二重捕捉」バージョンを説明する。二重捕捉eDARは、同一のマイクロ流体デバイス上の同一のヒト血液サンプルからCTCの2つの異なる亜集団を同時に分離することができる。これら2つの亜集団は、それぞれ、高い回収率および純度で、マイクロ流体チップ上の2つの異なる領域上に別々に閉じ込めることができる。
本明細書では、(1)具体的には、被分析物上の少なくとも各マーカーにタグを使用し、各タグによって発せられる信号を除去することに先立って、各タグによって発せられる信号を検出し、信号を検出して低減させるプロセスを繰り返すことによって、流体内の被分析物上に存在する複数のマーカーを識別し、(2)具体的には、一式の管類および少なくとも1つのチャンバに流体的に接続された少なくとも1つのチャネルを備える、マイクロ流体チップにサンプルを導入することによって、細胞の第1および第2のサブタイプの混合物を含むサンプルから細胞を単離し、(3)具体的には、少なくとも1つのチャネルを有するマイクロ流体チップに接続された一式の管類を備える装置を使用して、流体サンプルから特定のバイオマーカープロファイルを発現する細胞を分割し、(4)具体的には、各微小空洞またはマイクロパッチにわずか1つの被分析物を含有するよう、複数の微小空洞またはマイクロパッチを備える基板を使用して、複数の被分析物を分割することによって、被分析物上に存在する複数のマーカーを識別し、(5)具体的には、少なくとも1つのサンプル入力チャネル、少なくとも1つの指向性流チャネル、および少なくとも2つの出力チャネルを伴うマイクロ流体チップ、およびマイクロ流体チップの一部ではないデバイス上に位置する電子作動型弁を使用することによって、流体サンプル中の粒子を検出し、(6)具体的には、希少粒子の存在または非存在に基づいて値をアリコートに割り当て、マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する電子作動型弁を開放することにより、割り当てられた値に基づいてアリコートの流動を指向することによって、マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離し、(7)少なくとも2つの出力チャネルを伴う、具体的には、微小開口のアレイと流体的に接続される2つの出力チャネルのうちの少なくとも1つを伴うデバイスを使用して、および1つまたはそれを上回る希少粒子を選別するためにデバイスを使用して、流体サンプル中の希少粒子を検出するために、粒子、具体的には、粒子が被分析物であり、被分析物が細胞である、流体サンプルのアリコート中の粒子を分析するための方法および装置が説明される。
さらなる側面では、各被分析物は、非共有結合を通して微小空洞に接続される。なおもさらなる側面では、非共有結合は、ファン・デル・ワールス相互作用、静電結合、疎水結合、または非特異的吸着である。
Claims (29)
- 流体サンプル中の第1の細胞型を検出するための装置であって、前記第1の細胞型は、第1のタグに取り付けられた第1の構造で標識され、前記第1の細胞型は、第1のマーカーを含み、前記第1の構造は、前記第1のマーカーに対する親和性を有し、前記流体サンプルは、前記第1の細胞型と第2の細胞型とを含み、前記装置は、
マイクロ流体チップであって、前記マイクロ流体チップは、入力チャネルと、第1の出力チャネルと、第2の出力チャネルと、前記第1の出力チャネルと流体連通している取り囲まれたチャンバと、指向性流チャネルとを備え、前記指向性流チャネルは、前記入力チャネルと前記第1の出力チャネルと前記第2の出力チャネルとに合流点で交差する、マイクロ流体チップと、
前記指向性流チャネルおよび溶液を含む容器と選択的に流体連通しているポンプであって、前記溶液は、前記第1のマーカーとは異なる第2のマーカーに対する親和性を有する第2の構造を含み、前記ポンプは、前記第1の出力チャネルに流体的に接続された前記取り囲まれたチャンバの中に前記溶液を流動させるように構成されており、前記第2の構造は、第2のタグに結合されており、前記ポンプは、前記容器と前記指向性流チャネルとの間に配置されている、ポンプと、
弁であって、前記弁は、前記マイクロ流体チップから分離可能であり、前記弁は、第1の流体が前記指向性流チャネル中を流動するか否かを調節し、前記流体サンプルは、前記入力チャネル中にあり、前記入力チャネルから前記第2の出力チャネルに流動し、前記指向性流チャネル中の前記第1の流体の流動は、前記流体サンプルを前記入力チャネルから前記第1の出力チャネルに押動する、弁と、
前記入力チャネル中の前記流体サンプルの一部分から発せられる信号を検出するように構成された検出器と、
プロセッサと
を備え、
前記プロセッサは、
前記一部分中の前記第1の細胞型の存在または不存在を検出することであって、前記一部分中の前記第1の細胞型の存在または不存在を検出することは、放射線源を使用して前記第1のタグによって発せられる第1の信号を検出することを含み、前記第1の信号は、前記第1のマーカーの存在を示す、ことと、
前記信号に基づいて値を前記一部分に割り当てることと、
前記弁を動作させることによって、前記割り当てられた値に基づいて前記一部分の流動を指向することであって、前記一部分の流動を指向することは、前記第1のタグの存在に基づいて前記第1の細胞型を分割することを含む、ことと、
前記放射線源を使用して前記第1の信号の強度を低減させることと、
前記ポンプを使用して、前記第1の細胞型を前記第2の構造に接触させることと、
前記第2のタグによって発せられる第2の信号を検出することであって、前記第2の信号は、前記第1の信号に重複する、ことと
を行うように構成されており、
前記流体サンプルは、生物学的流体と懸濁液とを含む、装置。 - 前記第1の細胞型は、希少細胞である、請求項1に記載の装置。
- 前記一部分は、アリコートであり、前記アリコートは、3次元空間を通して無作為に分布された複数の細胞を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記第1の出力チャネルと流体連通しているフィルタをさらに備える、請求項1に記載の装置。
- 一式の管類をさらに備え、前記マイクロ流体チップは、前記一式の管類に流体的に接続された少なくとも1つのチャネルを備える、請求項1に記載の装置。
- 前記フィルタは、開口のアレイを備える、請求項4に記載の装置。
- 前記取り囲まれたチャンバは、管類を介して前記第1の出力チャネルと流体連通している、請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記フィルタは、希少細胞が前記フィルタを通過することができないように構成されている、請求項4または請求項6のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記取り囲まれたチャンバは、バイアル、微小遠心管、または、ウェルプレート内のウェルである、請求項1〜8のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記第1の細胞型から発せられる信号を低減させるように構成された放射線源をさらに備える、請求項1〜5のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記弁は、前記アリコートに割り当てられた前記値に依存して、前記第1の出力チャネルまたは前記第2の出力チャネルへ前記アリコートの流動を指向する、請求項3に記載の装置。
- マイクロ流体チップ内の流体サンプルのアリコートを単離するための方法であって、前記マイクロ流体チップは、第1の出力チャネルと流体連通している取り囲まれたチャンバを備え、前記アリコートは、3次元空間を通して無作為に分布された複数の細胞の中の第1の細胞型を含み、前記複数の細胞は、前記第1の細胞型と第2の細胞型とを含み、前記方法は、
前記第1の細胞型を第1のタグに結合された第1の構造に接触させるステップであって、前記第1の細胞型は、第1のマーカーを含み、前記第1の構造は、前記第1のマーカーに対する親和性を有する、ステップと、
前記アリコート中の前記第1の細胞型の存在または非存在を検出するステップであって、前記アリコート中の前記第1の細胞型の存在または非存在を検出するステップは、放射線源を使用して前記第1のタグによって発せられる第1の信号を検出することを含み、前記第1の信号は、前記第1のマーカーの存在を示す、ステップと、
前記第1の細胞型の存在または非存在に基づいて、値を前記アリコートに割り当てるステップと、
電子作動型弁を開放することによって、前記割り当てられた値に基づいて前記アリコートの流動を指向するステップであって、前記アリコートの流動を指向するステップは、前記第1のタグの存在に基づいて前記第1の細胞型を分割することを含み、前記電子作動型弁は、前記マイクロ流体チップの外部にあるデバイス上に位置する、ステップと、
前記第1の信号の強度を低減させるステップと、
前記第1の細胞型を、前記第1のマーカーとは異なる第2のマーカーに対する親和性を有する第2の構造に接触させるステップであって、前記第2の構造は、第2のタグに結合されており、前記第1の細胞型を前記第2の構造に接触させることは、前記第2の構造を含む溶液を、前記溶液と選択的に流体連通しているポンプを使用して前記第1の細胞型を介して流動させることを含み、前記ポンプは、前記溶液を含む容器と前記マイクロ流体チップ内に含まれる指向性流チャネルとの間に配置されている、ステップと、
前記第2のタグによって発せられる第2の信号を検出するステップであって、前記第2の信号は、前記第1の信号に重複する、ステップと
を含み、
前記流体サンプルは、生物学的流体と懸濁液とを含む、方法。 - (a)前記サンプルを前記マイクロ流体チップに導入することと、
(b)入力チャネルを通して前記サンプルの一部分を流動させることであって、前記一部分は、複数の前記第1の細胞型、複数の前記第2の細胞型、または、それらの組み合わせを含む、ことと、
(c)検出器を使用して、前記一部分内の前記第1の細胞型の存在または非存在を検出することと、
(d)前記第1の細胞型が前記一部分内に存在する場合、前記一部分を前記取り囲まれたチャンバの中へ指向することと、
(e)前記取り囲まれたチャンバが、前記サンプル内に存在する前記第1の細胞型の総数の80%超を含み、かつ、前記サンプル内に存在する前記第2の細胞型の総数の5%未満を含むように、(b)、(c)、(d)を十分な回数繰り返すことと
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 前記マイクロ流体チップは、サンプル入力チャネルと、少なくとも2つの出力チャネルと、少なくとも1つの指向性流チャネルとを備え、前記電子作動型弁は、前記指向性流チャネル内の流体の流動を制御する、請求項12〜13のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの出力チャネルのうちの少なくとも1つと流体連通しているフィルタを使用して前記第1の細胞型を捕捉することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記フィルタは、開口のアレイを備える、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の細胞型は、希少細胞であり、前記フィルタは、前記希少細胞が前記フィルタを通過することができないように構成されている、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の細胞型または前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、癌細胞である、請求項12〜17のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記希少細胞は、癌細胞である、請求項17または18のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型または前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、循環腫瘍細胞である、請求項12〜19のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型または前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、細菌細胞、免疫細胞、胎児細胞、治療後に残留する疾患を示す細胞、または、幹細胞である、請求項12〜20のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型または前記第2の細胞型のうちの少なくとも1つは、前記サンプル中の全細胞集団の1%未満を含む希少細胞である、請求項12〜21のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、分画血液、血清、血漿、汗、涙、耳内流動物、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣内流動物、糞便、経頸管洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心膜外液、ならびに呼吸器、腸管、尿生殖路の分泌物から成る群から選択される、請求項12〜22のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記弁は、電子作動型弁であり、前記電子作動型弁は、少なくとも1つの指向性流チャネル中の前記流体の前記流動を制御するソレノイド弁である、請求項1〜11のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 少なくとも1つの指向性流チャネルは、少なくとも2つのポートを備え、前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、前記ポートのうちの1つを通る前記流体の流動を制御する、請求項1〜11または24のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、少なくとも1つの指向性流チャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項1〜11または24〜25のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、少なくとも1つの指向性流チャネルに流れ込むチャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項1〜11または24〜26のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記弁は、電子作動型弁であり、前記弁は、出力チャネル中の流体の流動を直接制御する、請求項1〜11または24〜27のうちのいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出器は、出力チャネルではない少なくとも1つのチャネルの上に位置している、請求項1〜11または24〜28のうちのいずれか1項に記載の装置。
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