CN115916277A - 用于分离细胞外基质体的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于分离细胞外基质体的装置、方法和系统。更具体地，本发明公开了用于从生物样品中分离细胞外基质体以用于受试者的诊断和预后的装置、方法和系统。装置可以具有用于分离细胞外基质体的限制通道和用于精确压力测量的均匀流动通道。

Description

用于分离细胞外基质体的装置和方法
技术领域
本发明涉及用于分离细胞外基质体(extracellular matrix body)的装置、方法和系统。更具体地，本发明公开了用于从生物样品中分离细胞外基质体以用于受试者的诊断和预后的装置、方法和系统。
背景技术
用于疾病诊断和预后的常规方法可能需要分析或分离极小级分的生物样品。对来自极小级分的组分的相应分析可用于疾病的诊断和预后。例如，可以检测和分析个体细胞，甚至个体核酸分子。然而，这类常规方法的一个缺点是依赖于非常少量的生物材料和相应的小信号来进行决策。有用的信号可能会在其他未测量的生物材料中丢失。
用于疾病诊断和预后的常规方法经常需要获取待获得的生物样品和需要从样品中分离出的众所周知的结构以供进一步分析。例如，可以分离和表征完整的器官组织、全细胞、外体和其他众所周知的结构。这类方法的缺点包括当众所周知的结构不容易反映疾病状态时，就无法检测或表征疾病。
用于疾病诊断和预后的常规方法的其他缺点包括使用仅与受试者生物样品的特定众所周知的结构元素相关的生物标志物，例如外体。在这些方法中，生物标志物经常因与感兴趣的病理学不直接相关而受到固有的限制。常规方法经常试图考虑一些可能与疾病有偏远或部分关联的生物标志物，希望统计数据能够提供诊断答案。通常需要生物标志物的组合，并且结果高度不可预测。
常规装置的其他缺点包括无法精确测量含有生物组分的复杂流体中的流量和压力。由于生物组分与执行测量的装置的相互作用，含有生物组分的流体可能导致流量和压力的变化。
需要用于从生物样品中分离颗粒以用于诊断目的的装置和系统，其可以提供增加的与特定生物学相关的样品分离物。更具体地，需要用于从生物样品中分离重要组分以用于疾病的诊断和预后的装置、方法和系统。
迫切需要用于从生物样品中分离颗粒的方法和装置，这些方法和装置可以分离更紧密地对应于疾病状态的生物材料的相关级分，并测量相关流体中的差压和流量。
发明内容
本发明提供适用于各种疾病和病况的用于从生物样品中分离颗粒的装置和系统。提供了用于从生物样品中分离颗粒的方法和系统，其可以增加与生物学相关的样品分离物。本发明的装置和方法可用于从生物样品中分离重要组分，用于疾病的诊断和预后。
在一些实施方案中，本发明的用于从生物样品中分离颗粒的方法和装置可用于各种生物样品，包括体液、组织和细胞。在某些实施方案中，本公开的方法可以分离与疾病状态密切对应的生物材料的相关级分。
本公开的方法和装置可用于分离生物样品的重要级分，分析其与疾病的诊断和预后相关的组分。在一些实施方案中，可以获得显著量的生物材料和相应改善的信号水平以用于决策制定。本发明的方面包括保存细胞外基质体(EMB)的组合物和性质作为疾病指标。
在一些方面，本发明提供增强的使用细胞外基质体检测或表征疾病的能力，这可以更容易地反映疾病状态。
在另外的方面，本公开的装置和方法可以为相关生物标志物提供增加的信号，这些生物标志物将特定生物级分与疾病状态相关联。本公开的生物标志物可以与疾病相关联并提供诊断工具。
本公开的装置可以通过在装置中保持连续且大量的流动来提供包含生物组分的流体的流量和压力的精确测量，使得传感器可以精确地测量差压和流量。本文公开的装置和系统可以通过保持连续且大量的流动的通道的布置来提供改进的包含生物组分的流体的流量和压力的测量。在一些实施方案中，本公开的装置可具有一个或多个通道，这些通道不显著限制流体的流动，从而在系统中维持连续且大量的流动。
本公开的装置和系统可以分离生物样品的独特亚群或子集级分。在一些实施方案中，生物样品的独特子集级分可与疾病相关。在某些实施方案中，生物样品的独特子集级分可基本上由细胞外基质体组成。
在进一步的方面，本公开提供了用于分离、检测和/或分析含有生物材料或分子的流体的超微结构组分的装置和方法。在某些实施方案中，超微结构组分可与疾病有关。
本发明的实施方案可用于分离、提取和利用作为多种特定疾病生物标志物来源的细胞外基质体(EMB)。
本发明包括用于分离、检测和分析细胞外基质体、生物颗粒和复合物的装置，以用于各种用途。
在某些方面，细胞外基质体可以通过其形态学特征作为生物标志物。在进一步的方面，细胞外基质体可以通过包含可能存在于疾病途径中的分离的生化标志物来起作用。
本发明的方面可以进一步提供诊断系统，包括用于通过疾病相关的细胞外基质体(EMB)和/或生物颗粒或复合物来检测和测量生物标志物的装置。
在进一步的实施方案中，本公开描述了用于制备和分析生物材料样品的方法和装置。
生物材料样品可以包括体液、组织和细胞。
本发明的实施方案包括以下内容：
一种用于分离生物样品级分的装置，其包括：
一个或多个限制通道，其具有入口端和出口端，其中入口端和出口端通过通道流体连通；
多个间隔开的障碍物，其位于限制通道中以提供流动阻力，其中障碍物之间的间隔在从入口端到出口端的方向上变小；以及
用于容纳流体的入口贮液器，其中入口流体贮液器与限制通道的入口端流体连通；
一个或多个具有入口端和出口端的均匀流动通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通，其中入口端与入口贮液器流体连通。
上述装置还包括压力源，所述压力源用于对入口贮液器中的流体施加压力；和/或与入口贮液器流体连通的流量传感器，其用于测量入口贮液器处的流体的流速和压力。
该装置还可包括与限制通道和均匀流动通道的出口端流体连通的出口贮液器。
上述装置，其中限制通道包括具有至少约1微米、或至少约2微米、或至少约4微米、或至少约10微米、或至少约25微米、或至少约50微米、或至少约100微米、或至少约200微米、或至少约500微米开窗的屏障带(barrier band)。
上述装置，其中限制通道包括约1-4微米、或约1-15微米、或约4-35微米、或约4-100微米、或约4-200微米的开窗。
上述装置，其中装置中1-90％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-75％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-50％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-25％的流量在均匀流动通道内。
限制通道和均匀流动通道可以与同一芯片或基板集成。限制通道和均匀流动通道可以位于不同的芯片或基板中。限制通道可以是微流体通道。
上述装置还包括用于分析通道中的生物样品的器具(means)。
上述装置还包括用于分析通道中生物样品的蛋白质组学组成、脂质组学组成、转录组学组成或碳水化合物组成的器具。
上述装置还包括用于测量通道内样品的分离级分的水平的器具。
上述装置还包括用于测量通道内样品的分离级分中的生物标志物水平的器具。
上述装置，其中多个障碍物包括与通道集成的立柱。
上述装置，其中多个障碍物包括以下一项或多项：人或动物葡萄膜网状结构(uveal meshwork)的一部分、人或动物角膜巩膜网状结构(corneoscleral meshwork)的一部分或人或动物小管旁网状结构(juxtacanalicular meshwork)的一部分。
多个障碍物可包括玻璃珠、磁珠、凝胶颗粒、葡聚糖颗粒或聚合物颗粒。
生物样品可以由人或动物体液、血液、组织或细胞组成。生物样品包含运载流体(carrier fluid)。
上述装置，其中生物样品包含一种或多种试剂。
上述装置，其中限制通道还包括用于结合样品的生物标志物或生物分子的结合部分。
生物样品可以来自于正在经历诊断或预后的受试者。
上述装置还包括在限制通道中的弯曲流体混合区域。上述装置，其中限制通道或连续流动通道具有氟化涂层。
本发明还涉及通过使生物样品从权利要求1的装置的入口端流向出口端；并逆转流体流动的方向为朝向装置的入口端而从生物样品中提取细胞外基质体的方法。
一种用于分离生物样品的级分的微流体系统，该系统包括：
微流体装置，其包括
一个或多个具有入口端和出口端的限制通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通；
多个间隔开的障碍物，其位于限制通道中以提供流动阻力，其中障碍物之间的间隔在从入口端到出口端的方向上变小；以及
用于容纳流体的入口贮液器，其中流体贮液器与限制通道的入口端流体连通；以及
一个或多个具有入口端和出口端的均匀流动通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通，其中入口端与入口贮液器流体连通；
包括压力源的驱动单元；
包括流体源的源单元，其中压力源与流体源和微流体装置的入口贮液器流体连通；
传感器单元，其包括与入口贮液器流体连通的传感器，用于测量入口贮液器处流体的流速和压力，并将流量和压力数据发送到处理器；和
片上分析器单元，其包括一个或多个用于分析微流体装置中的分离级分并将分析数据发送到处理器的器具；和
用于接收和显示流速、压力和分析的处理器。
一种组合物，其包含从本公开的装置中提取的生物样品的级分。该组合物可用于治疗人体或动物体。该组合物可用于受试者的诊断或预后。
一种用于制备生物样品的方法，该方法包括从生物样品中分离细胞外基质体。细胞外基质体的尺寸可以为0.5至5,000微米，或1至1,000微米，或1至200微米，或4至100微米。分离细胞外基质体可以通过超滤或离心来进行。分离细胞外基质体可通过本公开的装置进行。
上述方法进一步包括使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联将细胞外基质体固定在玻璃表面上。
一种使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联将细胞外基质体固定在玻璃表面而制备细胞外基质体的生物样品的方法。
附图简要说明
图1显示本发明的微流体芯片实施方案的俯视图。以这种形式，硅晶片母版101印刷有三个微流体通道芯片图案103。硅晶片101可以用作基板。可将光致抗蚀剂倒在基板上并暴露于紫外光，其形成微流体芯片103的图案。晶片和光致抗蚀剂一起形成一个模具，可以将PDMS倒在该模具上。一旦凝固，PDMS就可以从模具上剥离下来，每个晶片可以给出三个微流体芯片的铸件。这些铸件可以粘附到载玻片上以形成最终的微流体芯片。
图2显示了本发明装置的一个实施方案中的微流体芯片插入物的俯视图。该芯片具有两个限制通道203，在本示例中每个通道宽2500um和长25,000um。限制通道203包括不同直径和间隔的立柱，如圆圈所示。该芯片具有第三均匀流动通道205，其具有不显著限制流动的各种尺寸和间隔的立柱。该芯片具有入口贮液器201和出口贮液器207，它们也包含较大的立柱。虚线箭头显示从入口贮液器朝向出口贮液器的流动方向。
图3显示对应于图2的俯视图。图3显示了由圆圈表示的各种尺寸的PDMS聚合物立柱301。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
图4显示对应于图2的入口贮液器的俯视图。图4显示了用圆圈表示的立柱401。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
图5显示对应于图2的入口贮液器区域的俯视图。图5显示用圆圈表示的立柱501。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
图6显示对应于图2的通道区域的俯视图。图6显示了由圆圈表示的立柱601。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。本发明的微流体通道装置可以具有用于产生湍流或限制流的不同尺寸和/或间隔的立柱或障碍物的区域。
图7显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图7显示了用圆圈表示的立柱701。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。此视图显示了从立柱之间的50um间隙到限制通道中的25um间隙的过渡。
图8显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图8显示用圆圈表示的立柱801。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。此视图显示了限制通道中立柱之间从较大间隙到较小间隙的过渡。
图9显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图9显示了用圆圈表示的立柱901。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。
图10显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图10表示用圆圈表示的立柱1001。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。该视图显示具有钝立柱障碍物1001的区域的通道，其可产生湍流。
图11显示对应于图2的出口贮液器1107的放大俯视图。图11显示了各种尺寸的立柱1101、1103和1105。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。在该实施方案中，每个外部限制通道包含由非常小且间隔紧密的立柱形成的屏障1102。
图12显示对应于图2的入口贮液器1201的放大俯视图。图12显示了各种尺寸的立柱1203。外部限制通道1207包括不同尺寸和间隔的立柱。均匀流动通道1205包括均匀尺寸和间隔的立柱。虚线箭头显示生物流体通过外部通道的流动方向。
图13显示本发明装置的一个实施方案中的微流体芯片的俯视图。显示了三个微流体插入物。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图14显示本发明的限制流动具有钝立柱障碍物1401的微流体通道装置的一个实施方案的透视图。图14是图15的扩大。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图15显示本发明的微流体通道装置的一个实施方案的透视图。图15显示对应于图2的通道区域的视图。图15显示限制通道中不同间隔的钝立柱障碍物1501。在该实施方案中，限制通道可以具有立柱障碍物1501，其组织成立柱之间的不同间隔的带。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图16显示了本发明的微流体芯片实施方案的立面侧视图。入口贮液器1605与流体管线1601流体连通，用于将生物流体和/或其他流体引入贮液器中。流体管线1601经过探针1602、探针适配器1603和玻璃盖玻片中限定的孔1604。生物流体经过入口贮液器1605到达微流体通道1606。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图17显示对应于图2的入口区域以及图16的探针1602位置的放大俯视图。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图18显示本发明的微流体芯片1614实施方案的立面侧视图。入口贮液器与流体管线1601流体连通，用于将生物流体引入贮液器中。流体管线1601经过探针1602、探针适配器1603和玻璃盖玻片1613中限定的孔1604。生物流体经过入口贮液器到达微流体通道1606并流向出口贮液器1607。可以提供探针调节器1612来调节探针1602的高度以与探针适配器1603和孔1604形成良好的密封。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图19显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图19显示了用圆圈表示的立柱1701。对于该实施方案，外部通道中立柱带区域的一些代表性长度以微米显示。
图20显示对应于图2的通道区域的放大俯视图的显微照片。图20将立柱显示为点。对于该实施方案，外部通道中立柱带区域的一些代表性长度以微米显示。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图21显示对应于图2的微流体装置的一个实施方案的俯视图。生物流体可以用输送探针2201引入到入口区域贮液器2202。虚线箭头显示生物流体流向出口贮液器区域2203的方向。该实施方案的放大视图显示了外部通道中立柱带区域的一些代表性长度，以微米为单位。对于该实施方案，放大视图中的点线显示障碍物之间生物流体可能的曲折路径。
图22显示具有处理器、流体驱动单元、流体源单元、传感器单元、片上单元和片外单元的本发明微流体系统的一个实施方案。
图23显示来自原发性开角型青光眼患者的房水增加了微流体装置中的压力。图23显示当注入从重度原发性开角型青光眼患者获得的人房水时，在微流体通道中由立柱形成的人工小梁网内的相对压力(mm Hg)变化量。流体流速保持恒定在每分钟2μl，并使用外部压力传感器测量基线系统压力。在箭头和字母“a.”表示的时间点注射人房水样品。压力在27分钟时稳步上升到约41mm Hg的最大值。图23显示来自被诊断患有POAG青光眼的患者的房水增加了装置中的压力。
图24(上图)显示了从原发性开角型青光眼患者的人房水中捕获EMB后微流体芯片的共聚焦显微照片。EMB的蛋白用荧光标记物羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，用箭头标示)标记。圆圈是限制通道中的立柱。图24(下图)显示了在立柱周围的微流体通道中分离的EMB。
图25图示了使用尺寸排阻过滤器从生物流体中分离细胞外基质体。牛玻璃体液先用5μm醋酸纤维素针筒式过滤器(syringe filter)过滤，然后用1μm针尖式过滤器(syringe-tip filter)过滤，然后用0.45um针尖式过滤器过滤，然后用0.22μm过滤器过滤。每个级分都使用宽视野显微镜术进行表征。图25显示未经富集的牛玻璃体液4301被吸入具有22g针头的1mL注射器4305中并通过5μm针尖式过滤器4309挤出。收集滤液并通过1μm针尖式过滤器4311过滤。收集滤液并通过0.45μm针尖式过滤器4313过滤。收集滤液并通过0.22μm针尖式过滤器4315挤出。在每个过滤步骤后收集生物流体级分用于光学显微镜术。显微镜图像显示，随着滤液依次通过较小尺寸的过滤器，较大体减少。
图26显示了通过尺寸排阻过滤器分离EMB的代表性透射电子显微镜(TEM)图像。图26a和图26b显示存在于牛玻璃体液的天然生物流体中的细胞外基质体的存在。为了从复杂的生物流体中分离和回收细胞外基质体，使用孔径从5μm到0.22μm的纤维素过滤器进行序列的基于注射器的过滤。细胞外基质体用阿尔新蓝染色剂染色。图26c显示通过5μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26d显示了通过1μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26e显示通过0.45μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26f显示通过0.22μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图像显示，当滤液序列通过较小的过滤器尺寸时，较大的ECM体相对减少。
图27图示了使用离心从生物流体中分离细胞外基质体。通过序列离心获得四个沉淀物9705、9713、9721和9729。将牛玻璃体重新悬浮9701并置于1ml管中并在4℃下以350g离心(Sorvall Legend RT)10分钟以形成沉淀物1 9705。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液1 9709，将剩余的上清液转移到新管中并在4℃下以2000g离心(Eppendorf，5417R系列，F45-30-11Eppendorf转子)10分钟形成沉淀物2 9713。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液2 9717，将剩余的上清液转移到新管中。然后将上清液在4℃下以10,000g离心10分钟以形成沉淀物3 9721。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液3 9725，并将剩余的上清液转移到新管中。然后将上清液在4℃下以20,000g离心10分钟，得到沉淀物4 9729。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液4，将剩余的上清液转移到新管中。
图28显示了通过序列离心分离EMB的代表性透射电子显微镜(TEM)图像。图28a显示存在于牛玻璃体液中的细胞外基质体。在图28b中，在450g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。同样，在图28c中，在2,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。在图28d中，在10,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。在图28e中，在20,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。
图29显示化合物比伐卢定(bivalirudin)TFA对牛玻璃体液中眼内压(IOP)的剂量-反应行为。用本发明的微流体装置测量差压。
图30显示化合物硫酸黏菌素(colistin sulfate)对牛玻璃体液中眼内压(IOP)的剂量-反应行为。用本发明的微流体装置测量差压。
图31显示化合物硫酸多黏菌素B(polymyxin B sulfate)对牛玻璃体液青光眼模型中眼内压(IOP)的剂量-反应行为。用本发明的微流体装置测量差压。
图32显示在本公开的微流体装置的限制通道中分离和提取细胞外基质体。图32a和图32a显示用牛玻璃体液的生物流体灌注的微流体芯片的代表性显微照片。字母“p”标记了通道中的一根立柱。灌注后，细胞外基质体在立柱之间和立柱周围分离。图32c和图32d显示了提取细胞外基质体后通道的代表性显微照片。从芯片上移走细胞外基质体，其显示提取后明显更少的细胞外基质体。
图33显示通过LC/MS对分离和提取的牛细胞外基质体进行片外蛋白质组学分析。检测到针对细胞外基质体的生物标志物。
图34显示了本公开的微流体装置的限制通道中细胞外基质体的分离及其随后的提取。图像比例尺为50μm。图34a显示了用悬浮在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中的牛玻璃体液灌注并用阿尔新蓝对透明质酸进行复染的微流体装置的代表性宽视野显微照片(灰色信号，亮视野)。图34a显示来自捕获在装置的立柱(p)之间的细胞外基质体(箭头)的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。灌注后，聚集体被分离在立柱之间，以团块样形成物被观察到。小于细胞外基质体物质的物质已经通过出口端口排出。图34b显示从微流体装置的限制通道提取细胞外基质体。该装置用温和去污剂0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)灌注，并逆转流动方向为从出口到入口。图34b显示洗脱后通道中存在的细胞外基质体明显更少，并表明细胞外基质体已被提取。图34c显示灌注后捕获在立柱(p)之间的细胞外基质体(箭头)的更高倍率图像。图34d显示了用去污剂和反向流进行的提取，再次表明提取后通道中的细胞外基质体明显更少。
图35显示本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。微流体装置注入含有悬浮在生物流体中的均质化牛玻璃体的流体。在将流体灌注到装置中之后，流体流过入口并经由出口流出。较大的细胞外基质体(箭头)被捕获在立柱(标记为Lp)之间。用封闭溶液灌注芯片以防止抗体染色前的非特异性抗体结合。接下来，通过注入抗纤连蛋白一抗、将样品温育2小时并洗涤来标记蛋白纤连蛋白，这是一种已知的细胞外基质组分和整合素结合蛋白。然后，将山羊抗兔FITC二抗温育1小时并洗涤。然后在宽视野荧光和亮视野显微镜术下对微流体芯片进行成像。图35显示代表性的宽视野荧光显微照片。此图像显示微流体通道中的细胞外基质体。大的立柱(Lp)之间的距离为约100μm。细胞外基质体内的点状信号代表纤连蛋白染色(抗纤连蛋白Ab，具有Alexa 488、FITC的山羊抗兔二抗，白色信号)。
图36显示本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图36a显示通道中染色的细胞外基质体(箭头)的代表性显微照片亮视野图像。图像比例尺为20μm。对照图像没有荧光信号，这表明图36a中的信号对纤连蛋白特异。图36b再次显示通道中染色的细胞外基质体(箭头)。图像比例尺为50μm。再次地，对照图像没有荧光信号，这表明图36b中的信号对纤连蛋白特异。
图37显示本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图37显示在含有细胞外基质体的生物流体中，串珠蛋白聚糖蛋白的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片，串珠蛋白聚糖蛋白是软骨细胞外基质的一种组分，是一种已知的癌症生物标志物。微流体芯片注入含有悬浮在生物流体中的均质化牛玻璃体的流体。在将生物流体灌注到装置中后，样品流过入口并通过出口流出。较大的细胞外基质体(箭头)被捕获在立柱(标记为“p”)之间。用封闭溶液灌注芯片以防止抗体染色前的非特异性抗体结合。串珠蛋白聚糖通过注入抗串珠蛋白聚糖一抗、将样品温育2小时并洗涤来标记。然后，将山羊抗兔TRITC二抗温育1小时并洗涤。然后在宽视野荧光和亮视野显微镜术下对微流体芯片进行成像。图37显示立柱(p)之间的微流体通道中的细胞外基质体。点状信号代表串珠蛋白聚糖染色(白色信号)。对照图像没有荧光信号，这表明图37中的信号对串珠蛋白聚糖特异。
图38显示本公开的装置通道中的细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图38a显示串珠蛋白聚糖的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片亮视野图像。对照图像没有荧光信号，这表明图38a中的信号对串珠蛋白聚糖特异。图像比例尺为10μm。图38b显示串珠蛋白聚糖的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片亮视野图像。对照图像没有荧光信号，这表明图38b中的信号对串珠蛋白聚糖特异。图像比例尺为10μm。图38还表明透明质酸的标记物阿尔新蓝可用作EMB的染色剂。
图39显示使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联并使用天狼星红染料对胶原蛋白进行染色可视化了玻璃表面上的细胞外基质体。图39显示细胞外基质体的信号(暗染色)，其显示EDC交联将细胞外基质体保留在表面上。
图40显示使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联并使用天狼星红染料对胶原蛋白进行染色可视化了玻璃表面上的细胞外基质体。图40显示细胞外基质体内胶原蛋白链的信号(暗染色)，其显示EDC交联将细胞外基质体保留在表面上。图40还显示天狼星红染色剂可用于染色EMB。
图41显示使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联和使用赫斯特染料(Hoechst dye)对DNA进行染色可视化了玻璃表面上细胞外基质体的片外分析。图41显示细胞外基质体中的DNA信号(赫斯特染料、DAPI滤光片、白色信号、DNA)。
图42显示细胞外基质体的片上分离和检测。图42显示了灌注有牛玻璃体液的微流体芯片的代表性显微照片，牛玻璃体液悬浮在pH7.0的磷酸盐缓冲盐水中，并用阿尔新蓝对透明质酸进行复染，暗染色，亮视野。图42显示来自捕获在装置的大立柱(圆圈)附近的细胞外基质体的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。观察到簇状形成物的细胞外基质体。图像比例尺为50μm。
图43显示微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。图43显示了灌注牛玻璃体液细胞外基质体后通道的代表性低倍率荧光显微照片，该牛玻璃体液细胞外基质体用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对蛋白质进行复染。微流体芯片注入含有均质化牛玻璃体的流体。在将流体灌注到装置中之后，流体流过入口并经由出口流出。较大的细胞外基质体被捕获在立柱(标记为“p”)附近。图像比例尺为25μm。
图44显示微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。图44显示了灌注有牛玻璃体液的微流体芯片的代表性显微照片，牛玻璃体液悬浮在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中，并用天狼星红对胶原蛋白进行复染，暗染色，亮视野。图44a显示了来自装置的立柱(标记为“p”)之间的细胞外基质体的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。图44b显示了带有荧光滤光片的相同图像，并显示用天狼星红(浅灰色信号)检测到胶原蛋白。图像比例尺为50μm。图44c和图44d以更高的倍率显示相似的图像。图像比例尺为10μm。
图45显示来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图45显示了0-200μm2范围内的细胞外基质体的计数。
图46显示了来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图46显示了201-1000μm2范围内的细胞外基质体的计数。
图47显示来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图47显示了1001-67,000μm2范围内的细胞外基质体的计数。
图48显示了从本发明的微流体装置中分离和提取的牛玻璃体细胞外基质体的大小分布。从本发明的微流体装置分离和提取后牛玻璃体液生物流体中的细胞外基质体。芯片用生物流体灌注至少60分钟。灌注60分钟后，ECM体被分离在限制通道立柱附近。接下来，用去污剂(0.1％十二烷基硫酸钠，SDS)处理芯片，并通过反向流从芯片中提取样品，这使细胞外基质体从入口端口流出。以10分钟的间隔收集洗脱液的级分，总共收集80分钟。将样品固定在载玻片上并用阿尔新蓝染色，并用宽视野显微镜术成像。使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)可达约16×103μm2。图48显示了每个洗脱液级分中细胞外基质体的计数，其随时间而增加。该实验表明，本发明的微流体装置可用于分离和提取各种大小的细胞外基质体。
图49显示细胞外基质体的片外分析可以通过用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)交联进行保留来完成。图49a显示了来自用EDC交联获得的天然牛玻璃体液的细胞外基质体的代表性TEM图像。用EDC固定观察细胞外基质体。图49b显示了在没有EDC交联的情况下拍摄的类似图像。没有EDC固定，没有观察到细胞外基质体。
图50显示与健康对照相比，从患有早期胰腺导管腺癌(PDAC)的患者的人血浆样品中分离细胞外基质体。图50a显示PDAC样品的代表性宽视野荧光显微照片图像。图50a显示停留在微流体通道中的细胞外基质体。图50a进一步显示较大的细胞外基质体(箭头)停留在立柱(标记为“p”)之间。立柱之间的宽度为约100μm。来自停留的细胞外基质体的点状信号代表纤连蛋白染色(抗纤连蛋白Ab，带有Alexa 488、FITC的山羊抗兔二级Ab，白色信号)。染色显示在EMB内有丰富的信号和点状染色(图50a，箭头)。图50b显示年龄匹配的健康对照人血浆样品的类似获得的荧光显微照片。图50b显示纤连蛋白信号的量明显减少(图50b，灰色信号，箭头)。在相同条件下处理时，健康对照信号远小于疾病信号。图像比例尺为20μm。
发明详述
本发明公开了通过分离和使用生物体、材料和/或分子从适用于各种疾病和病况的生物样品中分离颗粒的装置和系统。用于从生物样品中分离颗粒的装置和系统可用于提高与感兴趣的生物学相关的样品分离物水平。本发明的装置和方法可用于从生物样品中分离重要组分，用于疾病的诊断和预后。
本发明的用于从生物样品中分离颗粒的装置可用于各种生物材料和样品，包括体液、血液、组织、细胞和肿瘤。在某些实施方案中，本公开的方法可以分离对应于疾病状态的生物材料的相关级分。
本公开提供了可用于分离生物样品的重要级分、分析其与疾病的诊断和预后相关的组分的装置。在一些实施方案中，可以获得显著量的生物材料和相应提高的信号水平。
本发明的方面包括从生物流体或材料中分离和保存细胞外基质体(EMB)的组成和性质。通过保存从生物样品、流体或材料中分离或提取的细胞外基质体(EMB)的组成和性质，EMB可用于疾病的诊断或指示，或用于监测化学或生物过程或样品材料的变化。
在一些方面，本发明提供增强的检测或表征细胞外基质体的能力，这可以更容易地反映疾病状态。
在另外的方面，本公开的装置和方法可以为相关生物标志物提供增加的信号，这些生物标志物将特定生物级分与疾病状态相关联。本公开的生物标志物可以与疾病相关联并提供诊断工具。
本公开的装置可以通过在装置中保持连续且大量的流动来提供改进的对包含生物组分的流体中的流量和/或压力的测量。在一些实施方案中，当维持大量的流动时，传感器可以精确地测量差压和流量。本文公开的装置和系统可以通过保持连续且大量的流动的通道布置来提供改进的包含生物组分的流体的流量和压力测量。在一些实施方案中，本公开的装置可具有一个或多个通道，这些通道基本上不限制流体的流动，从而在系统中维持连续且大量的流动。
除了限制通道之外，本文公开的装置还可以通过使用一个或多个保持连续且大量的流动的均匀流动通道来提供改进的包含生物组分的流体的流量和压力测量。
在某些实施方案中，本发明的装置将具有1-90％的来自均匀流动通道的流量，或1-75％的来自均匀流动通道的流量，或1-50％的来自均匀流动通道的流量，或1-25％的来自均匀流动通道的流量。
在某些实施方案中，本发明的装置将具有至少25％的来自均匀流动通道的流量，或至少50％的来自均匀流动通道的流量，或至少75％的来自均匀流动通道的流量，或至少90％的来自均匀流动通道的流量。
在一些实施方案中，直径大小为约0.5至约5,000微米或更大的细胞外基质体可停留在微流体通道中，或可导致通道中的阻塞，从而增加压力。
在另外的实施方案中，直径大小为约1至约200微米或更大的细胞外基质体可停留在微流体通道中，或可导致通道中的阻塞，从而增加压力。
在进一步的方面，本公开提供了用于分离、检测和/或分析含有生物材料或分子的流体的超微结构组分的装置和方法。在某些实施方案中，超微结构组分可与疾病有关。
本发明的实施方案可用于分离、提取和利用细胞外基质体(EMB)，它们是多种特定生物标志物的来源。
本发明包括用于各种用途的用于分离、检测和分析细胞外基质体、生物颗粒和复合物的组成的装置。
在某些方面，细胞外基质体可以通过其形态学特征作为生物标志物。在进一步的方面，细胞外基质体可以通过包含分离的可能存在于疾病途径中的生化标志物来起作用。
本发明的方面可以进一步提供诊断系统，其包括用于通过疾病相关的细胞外基质体(EMB)和/或生物颗粒或复合物来检测和测量生物标志物的装置。
在进一步的实施方案中，本公开描述了用于制备和分析生物材料样品的方法和装置。
细胞外基质体(EMB)可以是复合物，并且可以由蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸分子、生物颗粒、小囊泡如细胞外囊泡或外体及其组合组成。
生物材料的样品可以包括体液、组织和细胞。
体液样品的示例包括任何体液，包括全血、血浆、血液组分、CSF、尿液、精液、滑液、胸膜液、阴道液、胃液、心包液、腹膜液、羊水、唾液、鼻液、耳液、母乳和任何其他体液，以及它们的组合。
在进一步的方面，本发明的微流体装置和系统可用于从样品中分离和提取生物颗粒。
本发明的微流体装置和系统可用于纯化或分离直径大于约0.5微米的细胞外基质体或复合物直至直径约5,000微米的颗粒，或直径大于约2微米的细胞外基质体或复合物直至直径约700微米的颗粒。
在进一步的方面，本发明的微流体装置和系统可用于测量生物和临床流体的相对粘度和流动性质。
在某些方面，本发明的微流体装置和系统可用于从样品中分离和提取与疾病相关的生物颗粒。
在一些方面，本发明的微流体装置和系统可用于测量眼液中的眼内压。
装置和系统
本发明提供用于测量流体中的压力和/或流量的微流体装置和系统。
本发明通过提供连续的且大的流速和流动体积改进了流体的流量和压力的测量，从而可以精确地测量差压和/或流量。
在进一步的方面，本发明的微流体装置和系统可用于检测、分离和提取生物材料或流体的生物颗粒或其他组分。
本发明的微流体装置和系统可用于测量生物流体和临床流体的相对粘度和流动性质。
本发明的微流体装置和系统可以包括可以保持在基板中的微流体芯片。
在一些方面，本发明的微流体装置可以具有带障碍物的通道。障碍物可以影响和/或限制流体在通道中的流动。
在一些方面，本发明的微流体装置可以具有带有障碍物带的通道。障碍物带可以横跨通道的宽度，使得障碍物带将影响流体沿通道的流动和通量。
在一些实施方案中，障碍物之间的间隔在带中可以是恒定的。通道中障碍物之间的间隔可用于控制通道中用于流体流动的开窗尺寸。
在另外的实施方案中，本发明的微流体装置可以具有带有多个连续障碍物带的通道。在某些实施方案中，带中障碍物之间的间隔可以在多个带中沿着通道的长度在一个方向上减小。因此，带中障碍物之间的间隔可以在多个带中沿着通道的长度在相反方向上增加。
例如，本发明的微流体装置可以具有限制通道，其中在一个方向上顺序排列的多个带在障碍物之间具有1,000微米的间隔，其与间隔为500微米的带相邻，该间隔为500微米的带与间隔为200微米的带相邻，该间隔为200微米的带与间隔为100微米的带相邻，该间隔为100微米的带与间隔为50微米的带相邻，该间隔为50微米的带与间隔为25微米的带相邻，该间隔为25微米的带与间隔为10微米的带相邻，该间隔为10微米的带与间隔为4微米的带相邻。
在进一步的方面，本发明的微流体装置可以具有带有障碍物带的通道，其中一个带中的障碍物之间的间隔最小。障碍物之间的间隔最小的带可以是屏障带。
在另外的方面，本发明的微流体装置可以具有限制通道，其中屏障带具有至少1微米、或至少2、或至少4、或至少5、或至少10、或至少50、或至少100、或至少200微米的障碍物之间的间隔。
在某些方面，本发明的微流体装置可以是高度为7至25微米的芯片。
在操作中，本发明的微流体装置和系统可用于分离、提取和/或纯化生物颗粒。在某些实施方案中，限制通道可具有障碍物之间的间隔逐渐减小的带，其中一个带是屏障带。本发明的方法可以使用这样的带布置，通过使包含颗粒的流体从入口沿着间隔逐渐减小的方向流向通道的出口，而使较大的颗粒与较小的颗粒和流体分离。在这些方法中，较大的颗粒可以沿通道分离和保留，而较小的颗粒和流体在出口处离开通道。通过逆转提取流体的流动方向以从入口提取较大的颗粒，可以在入口处从通道中提取较大的颗粒。
在操作中，本发明的微流体装置和系统可用于分离、提取和/或纯化在出口处从通道中提取的生物颗粒。
在一些实施方案中，较大的颗粒可以在出口处通过添加去污剂以破碎较大的颗粒而从通道中提取。
图1显示本发明的微流体芯片实施方案的俯视图。在这种形式中，硅晶片母版101印刷有三个微流体通道芯片图案103。硅晶片101可以用作基板。可将光致抗蚀剂倒在基板上并暴露于UV光，其形成微流体芯片103的图案。晶片和光致抗蚀剂一起形成一个模具，可以将PDMS倒在该模具上。一旦凝固，PDMS就可以从模具上剥离下来，每个晶片可以给出三个微流体芯片的铸件。这些铸件可以粘附到载玻片上以形成最终的微流体芯片。
本发明的微流体芯片可以具有用于限制流体流动的通道，以及用于流体流动的入口和出口。泵可用于在入口处施加流体的压头压力(head pressure)。在一些实施方案中，可以在出口处使用减压或真空压力来调节流量。
图2显示了本发明装置的一个实施方案中的微流体芯片插入物的俯视图。该芯片具有两个限制通道203，在本示例中每个通道宽2,500um和长25,000um。限制通道203包括不同直径和间隔的立柱，如圆圈所示。该芯片具有第三均匀流动通道205，其具有不显著限制流动的均匀尺寸和间距的立柱。该芯片具有入口贮液器201和出口贮液器207，它们也包含较大的立柱。虚线箭头显示从入口贮液器流向出口贮液器的流动方向。限制通道可以具有最大限制流动的点，其是限制流动的屏障202。屏障202可以限制流动并改变通道和系统中的压力，使得差压和/或流量可以与流体的组成相关。
本发明的微流体芯片可以具有一个或多个用于限制流体流动的通道，以及一个或多个均匀或连续流动通道。在一些实施方案中，均匀流动通道不限制通道中的流体流动。均匀的连续流动通道可包括用于产生湍流的钝障碍物和/或用于使流体流动的曲折路径。
图3显示对应于图2的俯视图。图3显示了由圆圈表示的各种尺寸的PDMS聚合物立柱301。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
在某些实施方案中，可以在限制流体通道中提供钝的或非钝的障碍物，以在某些区域中产生曲折或涡流模式的流动。可以作为圆形或其他形状的立柱形成通道中的障碍物。
在某些实施方案中，限制通道的障碍物可提供大于500、或大于1000、或大于10,000、或更大的雷诺数(Reynold number)。
在另外的实施方案中，连续的均匀流动通道可以位于各种限制通道之间。在某些实施方案中，均匀流动通道和限制通道可以具有任何排列顺序并以任何数量使用。
图4显示对应于图2的入口贮液器的俯视图。图4显示了用圆圈表示的立柱401。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
图5显示对应于图2的入口贮液器区域的俯视图。图5显示用圆圈表示的立柱501。虚线箭头显示生物流体通过三个通道的流动。
图6显示对应于图2的通道区域的俯视图。图6显示由圆圈表示的立柱601。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。本发明的微流体通道装置具有不同间隔和/或尺寸的立柱或障碍物的区域，产生湍流或限制流。
在某些实施方案中，本公开的微流体通道装置可具有模拟眼小梁网的区域。
本发明的装置可包括含有细胞外基质体或复合物的网状结构组合物。可以从青光眼眼液中提取或纯化用于网状结构组合物的细胞外基质体或复合物。眼液可以来自动物或临床来源。
在进一步的实施方案中，本发明的微流体芯片可具有一个或多个用于限制流体流动的通道和一个或多个均匀流动通道。均匀流动通道可包括用于产生湍流的钝障碍物和/或用于使流体流动的曲折路径。
在进一步的实施方案中，本发明的微流体芯片可以具有1-20个用于限制流体流动的通道和1-10个均匀流动通道，其以任何顺序排列在基板上。均匀流动通道可以相对于限制流动通道以任何方式分布。
在某些实施方案中，均匀流动通道可以相对于限制流动通道在共线或平行位置交替。在另外的实施方案中，均匀流动通道可以在限制流动通道之上或之下。在一些实施方案中，均匀流动通道可以布置在与包含限制流动通道的芯片分开的基板中。
在进一步的实施方案中，均匀流动通道可以提供从入口贮液器到出口贮液器的流体连通。在某些实施方案中，均匀流动通道可以提供从出口贮液器到进入入口贮液器的流体源的流体连通。
在某些实施方案中，均匀流动通道的总横截面积可以大于或小于本发明的微流体装置中限制流动通道的总横截面积。在各种实施方案中，均匀流动通道可以不包括障碍物并且可以不具有曲折的流体流动。在此类实施方案中，均匀流动通道可具有层流或湍流流体流动。
本发明的微流体芯片可以具有一个或多个用于限制流体流动的限制通道。限制流动可归因于通道中钝或非钝障碍物或立柱的各种布置。在一些实施方案中，立柱可呈现流动流体的形状，例如圆形、球形、三角形、正方形、多边形、菱形、鳍状及其组合。
图7显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图7显示了用圆圈表示的立柱701。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。此视图显示了从立柱之间的50um间隙到限制通道中的25um间隙的过渡。
图8显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图8显示用圆圈表示的立柱801。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。此视图显示了限制通道中立柱之间从较大间隙到较小间隙的过渡。
图9显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图9显示用圆圈表示的立柱901。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。
在进一步的实施方案中，通道中的限制流动可能归因于通道中钝的或非钝的障碍物或立柱的各种布置，其中障碍物的尺寸和间隔随着沿着通道的距离而变化。
在某些实施方案中，限制通道中钝的或非钝的障碍物或立柱的尺寸和/或间隔可随着沿着通道的距离而改变。钝的或非钝的障碍物的尺寸和/或间隔可随着沿着通道的距离而减小。在限制通道中的某些位置，钝的或非钝的障碍物的尺寸和/或间隔可以减小到提供最大流动限制或屏障的水平。
图10显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图10显示用圆圈表示的立柱1001。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。该视图显示具有钝立柱障碍物1001区域的通道，其可产生湍流。
图11显示对应于图2的出口贮液器1107的放大俯视图。图11显示各种尺寸的立柱1101、1103和1105。虚线箭头显示生物流体通过通道的流动。在该实施方案中，每个外部限制通道均包括由非常小且紧密间隔的立柱形成的屏障1102。
在进一步的实施方案中，可以使用限制通道中钝的或非钝的障碍物或立柱的各种布置将流动限制到任何水平。可以在限制通道中使用宽范围的钝的和/或非钝的障碍物的间隔和/或样式。流体可在限制流动通道中具有曲折路径。限制通道中障碍物的间隔和/或流体路径的曲折度可以在流动方向上随着沿通道的距离而增加。
来自本发明微流体芯片通道的流体流出物可以收集在通道出口端的出口贮液器中。流体流入或插入本发明的微流体芯片的通道可以通过通道入口端的贮液器来实现。
图12显示对应于图2的入口贮液器1201的放大俯视图。图12显示了各种尺寸的立柱1203。外部限制通道1207包括不同尺寸和间隔的立柱。均匀流动通道1205包括均匀尺寸和间隔的立柱。虚线箭头显示生物流体流动通过外部通道的方向。
图13显示本发明装置的实施方案中的微流体芯片的俯视图。显示了三个微流体插入物。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图14显示本发明的具有限制流动的钝立柱障碍物1401的微流体通道装置的一个实施方案的透视图。图14是图15的放大图。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图15显示本发明的微流体通道装置的一个实施方案的透视图。图15显示对应于图2的通道区域的视图。图15显示限制通道中不同间隔的立柱障碍物1501。在该实施方案中，限制通道可以具有立柱障碍物1501，其组织成立柱之间的不同间隔的带。虚线箭头显示生物流体的流动方向。连续均匀流动通道1517可与限制通道1515分开布置。
图16显示了本发明的微流体芯片实施方案的立面侧视图。入口贮液器1605与流体管线1601流体连通，用于将生物流体和/或其他流体引入贮液器中。流体管线1601经过探针1602、探针适配器1603和玻璃盖玻片中限定的孔1604。生物流体经过入口贮液器1605到达微流体通道1606。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图17显示对应于图2的入口区域以及图16的探针1602位置的放大俯视图。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图18显示了本发明的微流体芯片1614实施方案的立面侧视图。入口贮液器与流体管线1601流体连通，用于将生物流体引入贮液器中。流体管线1601经过探针1602、探针适配器1603和玻璃盖玻片1613中限定的孔1604。生物流体经过入口贮液器到达微流体通道1606并流向出口贮液器1607。可以提供探针调节器1612来调节探针1602的高度以与探针适配器1603和孔1604形成良好的密封。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图19显示对应于图2的通道区域的放大俯视图。图19显示用圆圈表示的立柱1701。对于该实施方案，通道中立柱带区域的一些代表性长度以微米显示。
图20显示对应于图2的通道区域的放大俯视图的显微照片。图20将立柱显示为点。对于该实施方案，通道中带中的立柱的一些代表性间隔以微米显示。虚线箭头显示生物流体的流动方向。
图21显示对应于图2的微流体装置的一个实施方案的俯视图。图21显示生物流体可以用输送探针2201引入到入口区贮液器2202。虚线箭头显示生物流体流向出口贮液器区2203的方向由。该实施方案的放大视图显示了通道中的带中立柱的一些代表性间隔，以微米为单位。对于该实施方案，放大视图中的点线显示障碍物之间生物流体可能的曲折路径。
图22显示了本发明的微流体系统的一个实施方案。处理器102可以发送控制信号和/或接收来自流体驱动单元101的信号，流体驱动单元101向流体源单元103提供驱动流体，例如压缩气体。流体源单元103可以包含感兴趣的流体、生物流体、载体和/或试剂。感兴趣的流体、生物流体、载体和/或试剂可以流向传感器单元105，其可以监测流体的流速和/或压力。感兴趣的流体、生物流体、载体和/或试剂可以流向片上单元107，其可以包括本发明的微流体装置。感兴趣的流体、生物流体、载体和/或试剂可以进入片上单元107中的本发明微流体芯片的入口贮液器。感兴趣的流体、生物流体、载体和/或试剂可以到达片上单元107中的本发明微流体芯片的出口贮液器并流向片外单元109。处理器102可以接收来自传感器单元105的数据，并记录流量和/或压力。片上单元107可以包括用于光谱测定法的分析工具，例如辐照和光检测器。片外单元109可以包括各种分析工具，例如显微镜工具、成像仪和分析仪、色谱分析仪、质谱分析仪和/或磁共振分析仪。处理器102可以发送控制信号和/或接收来自片上单元107和片外单元109的数据。
在一些方面，可以通过各种技术分析本发明的系统或装置中的流体组合物。例如，可以通过成像技术分析流体组合物。
成像技术的示例包括电子显微镜术、立体显微镜术、宽视野显微镜术、偏光显微镜术、相差显微镜术、多光子显微镜术、微分干涉相差显微镜术、荧光显微镜术、激光扫描共聚焦显微镜术、多光子激发显微镜术、射线显微镜术和超声显微镜术。
成像技术的示例包括正电子发射断层扫描、计算机断层扫描和磁共振成像。
测定技术的示例包括比色测定、化学发光测定、分光光度法、免疫荧光测定和光散射。
在一些实施方案中，本发明可以提供一种用于测量流体组合物的压力和流速的装置。在某些实施方案中，装置可具有停留在通道中以提供流动阻力的网状结构组合物。网状结构组合物可以具有葡萄膜网状结构、角膜巩膜网状结构和小管旁网状结构中的任何一种或多种。例如，这些网状结构可以用限制通道中的障碍物来模拟，或者从眼液、体液或临床样品的提取中提供。
用于网状结构组合物的细胞外基质体或复合物可由各种生物分子或复合颗粒组成，直径范围可为约0.5至约5,000，或0.5至1,000，或1至200，或1至100，或1至50，或1至25，或1至10，或1至5微米。
可在本发明的装置中分离的细胞外基质体或复合物的直径范围为约0.5至约5,000，或0.5至1,000，或2至700，或1至200，或1至100，或1至50，或1至25，或1至10，或1至5微米。
在一些实施方案中，通道可包括障碍物，例如玻璃珠、微珠、磁珠、凝胶颗粒、葡聚糖颗粒或聚合物颗粒。障碍物也可以由玻璃纤维、聚合物纤维、无机纤维、有机纤维或金属纤维组成。
在另外的实施方案中，本发明的装置或通道可包括结合剂、亲和检测剂(detector)或免疫剂，其附着在与样品流体流体连通的装置元件上。装置可具有用于内部捕获和/或检测来自样品的生物分子的试剂。在某些实施方案中，装置可具有用于内部捕获和/或检测样品流体的生物标志物的试剂。
在某些实施方案中，葡萄膜网状结构或限制通道可具有约25微米的开窗。角膜巩膜网状结构或限制通道可具有约2-15微米的开窗。小管旁网状结构或限制通道可具有约1至4微米或更小的开窗。
装置还可包括用于容纳流体组合物的流体贮液器，使得流体贮液器与通道的入口流体连通，以将流体组合物引入通道的入口。
本公开的装置可以具有用于向驱动流体组合物施加压力的驱动源或压力源。驱动流体可以进入流体贮液器以驱动流体组合物进入微流体通道的入口。
本发明的装置可具有与流体组合物流体连通的传感器单元，用于测量通道入口处的流体组合物的流速和压力，并将流速和压力传输至处理器。
来自系统装置单元的信号和数据可以由处理器接收。处理器可以显示流速和压力。存储器或介质可以存储指令或文件，例如机器可读存储介质。机器可读存储介质可以是非瞬态的。
本公开的处理器可以是通用或专用计算机。处理器可以执行存储在机器可读存储装置或介质中的指令。处理器可以包括集成电路芯片、微处理器、控制器、数字信号处理器，它们中的任何一个都可以用于接收和/或传输数据并执行存储的指令。处理器还可以执行计算和转换数据，和/或将数据存储在存储器、介质或文件中。处理器可以接收并执行指令，所述指令可以包括执行本发明方法的一个或多个步骤。本发明的装置可以包括一个或多个非瞬态机器可读存储介质、一个或多个处理器、一个或多个存储器装置和/或一个或多个用户界面。处理器可以具有用于显示数据或转换数据的集成显示器。
在一些方面，本公开的系统可以具有带有微流体通道的装置。一个或多个通道可以布置在微流体芯片中。
本公开的系统可包括片上单元，其具有一个或多个检测器，用于分析通道内或通道入口处或离开出口处的流体组合物。还可以布置检测器以检测通道内的流体组合物。
本公开的系统可以包括片外单元，其具有一个或多个检测器，用于分析从微流体通道中提取的流体组合物。
在某些实施方案中，用于本公开的系统或装置中的网状结构组合物的细胞外基质体或复合物可包括固定剂、稳定组分或交联组分，其可将结构转化为稳定、均匀的组合物。
稳定组分的示例包括本文所述的固定剂、本文所述的交联化合物、有机溶剂、多肽和药学上可接受的有机盐。
交联的细胞外基质体或复合物可以是可逆交联的或不可逆交联的。
在一些实施方案中，本发明的装置可包含细胞外基质体或复合物，作为可用于鉴定或筛选活性剂的网状结构组合物。网状结构组合物可包括药物递送赋形剂。
在另外的实施方案中，本发明的装置可用于测量测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平。测量测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平可以为测试样品提供诊断标记物水平。本发明的装置可用于鉴定受试者的青光眼或青光眼前期。
在进一步的实施方案中，本发明的装置可用于测量与测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平相关的压力。通道中的压力值可以与测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平直接相关。
在某些实施方案中，本发明的装置可用于测量可与测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平相关的测定值。通道中组合物的测定值可以与测试样品中细胞外基质体或复合物的数量或水平直接相关。
测定的实例包括比色测定、化学发光测定、分光光度测定、免疫测定或光散射测定。
用于在微流体装置中分析样品的器具包括分析工具，例如用于光谱测定和光谱学的辐照源和光检测器，以及免疫标记和检测，如本文的实施例中进一步所示的。
用于在微流体装置中分析样品的器具包括成像工具，例如辐照源和显微镜术，如本文的实施例中进一步所示的。
提取的组合物和方法
在一些实施方案中，组合物可包含从微流体装置提取的生物样品的级分。
在某些实施方案中，从微流体装置提取的组合物可用于治疗人体或动物体。
在另外的实施方案中，从微流体装置提取的组合物可用于受试者的诊断或预后。
分离和/或提取的细胞外基质体的组合物可以与药物载体和一种或多种药物赋形剂组合。
分离和/或提取的细胞外基质体的形态可以通过分离和/或提取过程进行修饰。
分离和/或提取的细胞外基质体的形态可以进行化学修饰。
在一些实施方案中，可以分离和/或提取细胞外基质体的组合物，以用于治疗人体或动物体。
在进一步的实施方案中，组合物可包含样品，已通过分离和/或提取过程从中去除细胞外基质体，以用于治疗人体或动物体。在某些实施方案中，样品的至少25％、或至少50％、或至少75％、或至少90％的细胞外基质体已通过分离和/或提取过程去除，以用于治疗人体或动物体。
在一些方面，从微流体装置中提取组合物可以是用于制备用于受试者的诊断或预后的生物样品的方法。
在某些实施方案中，分离细胞外基质体的方法可通过超滤或离心或通过本公开的微流体装置进行。
本发明的实施方案进一步包括使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联将细胞外基质体固定在玻璃表面上。
出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物，包括专利、专利申请公开和非专利出版物，均各自明确地通过引用以其整体并入本文。
尽管出于清楚理解的目的已经通过举例的方式详细地描述了前述公开，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，某些改变和修改涵盖在本公开内，并且可以在所附权利要求的范围内无需过度实验就可以实施，所附权利要求通过说明而非限制的方式提出。本发明包括所有这样的另外的实施方案、等同方案和修改。本发明包括各种示例性组分、实施例和要求保护的实施方案的特征、材料、要素或限定的任何组合或混合。
描述本发明以及权利要求中的术语“一(a/an)”、“该/所述(the)”和类似术语应被解释为包括单数和复数。
实施例
实施例1.使用与疾病相关的生物流体在微流体装置中进行压力和流量测量。在微流体装置中分离细胞外基质体。图23显示来自原发性开角型青光眼患者的房水增加了微流体装置中的压力。图23显示当注入从重度原发性开角型青光眼患者获得的人房水时，微流体模型小梁网内的相对压力(mm Hg)变化量。微流体通道流速保持恒定在每分钟2μl，并使用外部压力传感器测量基线系统压力。在箭头和字母“a”表示的时间点注射人房水样品。压力在27分钟时稳步上升到约41mm Hg的最大值。图23显示来自被诊断患有POAG青光眼的患者的房水增加了装置中的压力。
实施例2.在微流体装置中分离与疾病相关的细胞外基质体。图24(上图)显示了在图23所示的实验结束时从原发性开角型青光眼患者的人房水中分离EMB后微流体芯片的共聚焦显微照片。图24(上图)显示房水中的蛋白质内容物被荧光标记物羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(箭头)标记。圆圈是限制通道中的立柱。图24(下图)显示了微流体通道中分离的EMB被捕获在立柱之间(箭头)。
实施例3.使用尺寸排阻过滤器从生物流体中分离细胞外基质体。这个实施例表明EMB可以通过尺寸排阻来分离。EMB可以通过尺寸排阻分离，并与较小的颗粒(例如游离细胞外囊泡或其他小囊泡)区分开来。
图25图示了使用尺寸排阻过滤器从生物流体中分离细胞外基质体。牛玻璃体液先用5μm醋酸纤维素针筒式过滤器过滤，然后用1μm针尖式过滤器过滤，然后用0.45um针尖式过滤器过滤，然后用0.22μm过滤器过滤。每个级分都使用宽视野显微镜术进行表征。
图26显示通过尺寸排阻过滤器分离EMB的代表性宽视野显微镜图像。图26a和图26b显示存在于牛玻璃体液的天然生物流体中的细胞外基质体的存在。为了从复杂的生物流体中分离和回收细胞外基质体，使用孔径从5μm到0.22μm的纤维素过滤器进行序列的基于注射器的过滤。细胞外基质体用EDC固定在载玻片上并用阿尔新蓝染色剂染色。图26c显示通过5μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26d显示通过1μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26e显示通过0.45μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图26f显示了通过0.22μm针尖式过滤器序列过滤分离的牛玻璃体级分。图像显示，当滤液序列通过较小的过滤器尺寸时，较大的ECM体相对减少。
这个实施例表明EMB可以通过尺寸排阻分离。对分离的EMB的分析表明，它由DNA、RNA和蛋白质以及透明质酸或胶原蛋白组成，这些都是细胞外基质的组分。
玻璃体液是一种高度含水的组织，含水量在98-99.7％之间，主要由细胞外基质组成。细胞外基质的主要组分是蛋白质胶原蛋白。胶原蛋白用碳水化合物修饰，且一旦从细胞中释放出来，就会组装成胶原原纤维。细胞外基质体可以附着于原纤维，以及细胞外基质中的其他位置。
解剖牛眼以去除眼眶脂肪和附着在眼球上的眼外肌。在4℃下，用含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl的5ml冰冷Tris缓冲盐水(TBS)(pH 8.0)冲洗眼球1分钟。通过使用16g针在角膜缘后4毫米或8毫米处做一个巩膜切开术切口，然后用剪刀剪出一个圆周矢状切口，将眼球分成前杯和后杯，从而分离玻璃体。使用剪刀切割和去除形成的玻璃体并切断玻璃体和眼结构之间的粘连。组织样品在4℃下用TBS(pH 8.0)冲洗1分钟。玻璃体标本收集在15mL离心管中，并使用浸入式搅拌器进行均质化。将均质化的牛玻璃体液(BVH)的等分试样转移到1mL离心管中。将牛玻璃体重悬于TBS缓冲液中以供进一步研究，并冷冻于-80℃直至使用。
使用22号针头将用缓冲盐水稀释至1mL的均质化牛玻璃体液等分试样装入1mL注射器中。将针头更换为5μm醋酸纤维素针筒式过滤器，并通过施加均匀的向下压力将牛玻璃体液挤出过滤器。将滤液收集到新的1mL管中，并保存80μL滤液的等分试样用于成像。然后，按照上述相同的步骤，将从5μm过滤中收集的滤液装入1μm针尖式过滤器中，并保存等分试样用于成像。接下来，按照相同的程序，将来自1μm过滤器的滤液通过0.45um针尖式过滤器挤出，并保存等分试样用于成像。最后，将来自0.45μm过滤器的滤液通过0.22μm过滤器挤出。从每个过滤步骤中回收滤液。
使用宽视野显微镜来可视化每个级分的组分。通过将生物流体放在载玻片上，用EDC交联样品，并用阿尔新蓝染色含有透明质酸的材料，对每个样品进行成像。对于样品的染色，将每种滤液与1％阿尔新蓝(Sigma 1％阿尔新蓝在3％乙酸pH2.5中B8483)在室温下以1:1v/v的比例温育30分钟。温育后，将40μL染色滤液置于载玻片上并盖上盖玻片，并使用亮视野显微镜术成像。在配备Axiocam105彩色相机(Zeiss)的倒置相差显微镜(ZiessAxiovert 200)上捕获彩色亮视野图像，并使用Zen软件(Zeiss，4.3版)处理图像。
实施例4.使用序列离心从生物流体中分离细胞外基质体。这个实施例表明EMB可以通过离心分离。EMB可以通过离心分离，并与较小的颗粒(例如游离外体或其他小囊泡)区分开来。为了获得不含细胞的玻璃体试样，首先通过一系列低速离心澄清玻璃体。
图27图示了使用离心从生物流体分离细胞外基质体的方法。通过序列离心获得四个沉淀物9705、9713、9721和9729。将牛玻璃体重新悬浮9701并置于1ml管中并在4℃下以350g离心(Sorvall Legend RT)10分钟以形成沉淀物1 9705。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液19709，将剩余的上清液转移到新管中并在4℃下以2000g离心(Eppendorf，5417R系列，F45-30-11Eppendorf转子)10分钟形成沉淀物2 9713。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液2 9717，将剩余的上清液转移到新管中。然后将上清液在4℃下以10,000g离心10分钟以形成沉淀物3 9721。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液3 9725，并将剩余的上清液转移到新管中。然后将上清液在4℃下以20,000g离心10分钟，得到沉淀物4 9729。保存50μl等分试样的上清液用于分析并标记为上清液4，将剩余的上清液转移到新管中。
图28显示了通过序列离心分离EMB的代表性透射电子显微镜(TEM)图像。图28a显示存在于牛玻璃体液中的细胞外基质体。在图28b中，在450g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。同样，在图28c中，在2,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。在图28d中，在10,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。在图27e中，在20,000g离心后从沉淀物收集的样品的代表性TEM显微照片显示细胞外基质体存在于沉淀物级分中。
实施例5.在微流体装置中用于检测药剂在青光眼模型中降低眼内压活性的剂量-反应。为了将比伐卢定TFA用作治疗青光眼的活性剂，确定比伐卢定TFA对眼内压(IOP)的剂量-反应行为。比伐卢定TFA表现出1.2nM的用于治疗牛玻璃体液的EC50。
将化合物比伐卢定TFA在微流体芯片装置中在牛玻璃体液(BVH)中进行了测试。制备25％的均质化BVH的PBS缓冲液溶液，并用等量的化合物溶液稀释，使总BVH浓度为12.5％。将样品涡旋并在37℃下温育1小时。使用PBS缓冲液或含10％乙醇或DMSO的PBS作为对照，并在相同条件下与BVH一起温育。
将测试化合物-BVH溶液引入微流体芯片装置的贮液器中并记录流速和压力变化。测试了各种浓度的化合物对治疗牛玻璃体液的效果。通过进样器将7ul的每种测试溶液注入微流体芯片。在样品注入后，再继续记录流速和压力变化50分钟。获得整个实验过程中芯片压力的相对变化。
图29显示了用化合物比伐卢定TFA治疗牛玻璃体液的剂量依赖性反应曲线。EC50值取为x轴上化合物微摩尔浓度的对数函数产生半数最大反应的点。药物微摩尔浓度的对数函数绘制在x轴上，最大反应的百分比绘制在y轴上。通过取对最高药物浓度的反应的值获得最大反应。通过取每个浓度的对照值和测试值之间的绝对差值来计算反应。
实施例6.在微流体装置中用于检测药剂在青光眼模型中降低眼内压活性的剂量-反应。为了将硫酸黏菌素用作治疗青光眼的活性剂，确定了硫酸黏菌素对眼内压(IOP)的剂量-反应行为。硫酸黏菌素表现出0.36nM的用于治疗牛玻璃体液的EC50。
将化合物硫酸黏菌素在微流体芯片装置中在牛玻璃体液(BVH)中进行了测试。制备25％的均质化BVH的PBS缓冲液溶液，并用等量的化合物溶液稀释，使总BVH浓度为12.5％。将样品涡旋并在37℃下温育1小时。使用PBS缓冲液或含10％乙醇或DMSO的PBS作为对照，并在相同条件下与BVH一起温育。
将测试化合物-BVH溶液引入微流体芯片装置的贮液器中并记录流速和压力变化。测试了各种浓度的化合物治疗牛玻璃体液的效果。通过进样器将7ul的每种测试溶液注入微流体芯片。在样品注入后，再继续记录流速和压力变化50分钟。获得整个实验过程中芯片压力的相对变化。
图30显示了用化合物硫酸黏菌素治疗牛玻璃体液青光眼模型的剂量依赖性反应曲线。EC50值取为x轴上化合物微摩尔浓度的对数函数产生半数最大反应的点。药物微摩尔浓度的对数函数绘制在x轴上，最大反应的百分比绘制在y轴上。通过取对最高药物浓度的反应的值获得最大反应。通过取每个浓度的对照值和测试值之间的绝对差值来计算反应。
实施例7.在微流体装置中用于检测药剂在青光眼模型中降低眼内压的活性的剂量-反应。为了将硫酸多黏菌素B用作治疗青光眼的活性剂，确定了硫酸多黏菌素B对眼内压(IOP)的剂量-反应行为。硫酸多黏菌素B显示出4.3nM的用于治疗牛玻璃体液青光眼模型的EC50。
将化合物硫酸多黏菌素B在微流体芯片装置中在牛玻璃体液(BVH)青光眼模型中进行了测试。制备25％的均质化BVH的PBS缓冲液溶液，并用等量的化合物溶液稀释，使总BVH浓度为12.5％。将样品涡旋并在37℃下温育1小时。使用PBS缓冲液或含10％乙醇或DMSO的PBS作为对照，并在相同条件下与BVH一起温育。
将测试化合物-BVH溶液引入微流体芯片装置的贮液器中并记录流速和压力变化。测试了各种浓度的化合物治疗牛玻璃体液的效果。通过进样器将7ul的每种测试溶液注入微流体芯片。在样品注入后，再继续记录流速和压力变化50分钟。获得整个实验过程中芯片压力的相对变化。
图31显示了用化合物硫酸多黏菌素B治疗牛玻璃体液青光眼模型的剂量依赖性反应曲线。EC50值取为x轴上化合物微摩尔浓度的对数函数产生半数最大反应的点。药物微摩尔浓度的对数函数绘制在x轴上，最大反应的百分比绘制在y轴上。通过取对最高药物浓度的反应值获得最大反应。通过取每个浓度的对照值和测试值之间的绝对差值来计算反应。
实施例8.在微流体装置中细胞外基质体的分离和提取。微流体装置用于分离牛玻璃体细胞外基质体。分离后，提取细胞外基质体。
图32显示了在本公开的微流体装置的限制通道中细胞外基质体的分离。图32a和图32a显示了用牛玻璃体液灌注的微流体芯片的代表性显微照片。字母“p”标记了通道中的一根立柱。灌注后，细胞外基质体被分离在立柱之间和立柱周围。图32c和图32d显示了提取细胞外基质体后通道的代表性显微照片。使用温和的去污剂1％十二烷基硫酸钠(SDS)和从入口端口往外的反向流从芯片中提取细胞外基质体。将细胞外基质体从芯片上移出，其显示提取后明显更少的细胞外基质体。
实施例9.通过蛋白质组学谱检测针对细胞外基质体的生物标志物。分离牛玻璃体细胞外基质体并使用LC/MS片外分析其蛋白质组学谱。
图33显示通过LC/MS进行的牛细胞外基质体的片外蛋白质组学分析。检测到针对细胞外基质体的生物标志物。
将浓缩的牛玻璃体细胞外基质聚集体沉淀重悬于50μl 1％十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma)中，并在室温下使用25Kg离心10分钟再次沉淀。将沉淀物溶解在20μl的2X SDS、50mM二硫苏糖醇(DTT)还原剂中，超声处理10分钟并在95℃下温育5分钟。将沉淀物和上清液电泳到NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(1.5mmX10孔，Invitrogen)中。凝胶用考马斯亮蓝R250染色。捕获并储存凝胶的照片，然后将凝胶脱色用于进一步分析。
每个凝胶条带在60℃下用10mM DTT还原30分钟，在黑暗中于室温用20mM碘乙酰胺烷基化45分钟。用0.2μg胰蛋白酶(测序级，Thermo Scientific Cat#90058)消化样品，并在37℃下温育16小时。肽用5％甲酸、60％乙腈提取两次并在真空下干燥。
使用与Eclipse(ThermoFisher)接口的Nano LC-MS/MS(DionexUltimate3000RLSCanon系统，Thermofisher)通过LC-MS分析样品。将12.5μl凝胶内消化的样品沉淀中的3μl加载到熔融石英捕集柱(Acclaim PepMap 100，75umx2cm，ThermoFisher)上。用0.1％三氟乙酸(TFA)以5μl/min的速度洗涤5分钟后，将捕集柱与分析柱(NanoeaseMZ肽BEH C18，130A，1.7μm，75μm x 250mm，Waters)联机用于LC-MS/MS。，使用分段线性梯度：30分钟内4-15％B(其中A：0.2％甲酸，和B：0.16％甲酸、80％乙腈)、40分钟内15-25％B、44分钟内25-50％B，以及11分钟内50-90％B，以300nL/min来分级肽。然后溶液B返回4％运行5分钟以进行下一次运行。
扫描序列从MS1谱开始(Orbitrap分析，分辨率120,000，扫描范围从M/Z 375–1500，自动增益控制(AGC)目标1E6，最大注入时间100ms)。顶部S(3秒)占空比方案用于确定每个循环执行的MSMS数。为MSMS选择电荷2-7的母离子，并使用60秒的动态排除来避免重复采样。母离子质量在四极杆中被隔离，隔离窗口为1.2m/z，自动增益控制(AGC)目标为1E5，并通过30％归一化碰撞能量的高能碰撞解离进行片段化。这些片段在分辨率为15,000的Orbitrap中进行扫描。MSMS扫描范围由母离子的电荷状态决定，但下限设置为110amu。
在玻璃体牛细胞外基质体级分中表达的选定细胞外基质相关蛋白由蛋白质组学谱鉴定并如表1所示。
表1：玻璃体牛细胞外基质体中的细胞外基质蛋白
Figure BDA0003963343050000341
Figure BDA0003963343050000351
通过低速离心和使用微流体装置的分离获得玻璃体级分。更高的光谱计数值代表更大量的蛋白质。
已知参与玻璃体牛细胞外基质体级分中发现的蛋白聚集的选定蛋白通过蛋白质组学谱鉴定并显示在表2中。
表2：玻璃体牛细胞外基质体中的蛋白聚集蛋白
Figure BDA0003963343050000361
通过低速离心和使用原型微流体装置的分离获得玻璃体ECM聚集体级分。这些蛋白按功能分类，且突出显示的蛋白已知在细胞外基质中发挥作用。例如，发现补体C3(光谱计数，408)、α-烯醇化酶(光谱计数，151)和簇集素(光谱计数，74)的光谱计数相对较高。
实施例10.在微流体装置中细胞外基质体的分离和提取。微流体装置用于分离牛玻璃体细胞外基质体。分离后，提取细胞外基质体。
图34显示了在本公开的微流体装置的限制通道中细胞外基质体的分离及其随后的提取。图像比例尺为50μm。图34a显示了用悬浮在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中的牛玻璃体液灌注并用阿尔新蓝针对透明质酸进行复染的微流体装置的代表性宽视野显微照片(灰色信号，亮视野)。图34a显示来自被捕获在装置的立柱(p)之间的细胞外基质体(箭头)的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。灌注后，聚集体被分离在立柱之间，以团块样形成物被观察到。小于细胞外基质体物质的物质已经通过出口端口排出。图34b显示从微流体装置的限制通道提取细胞外基质体。该装置用温和的去污剂0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)灌注，并逆转流动方向为从出口到入口。图34b显示洗脱后通道中存在的细胞外基质体明显更少，并表明细胞外基质体已被提取。图34c显示灌注后被捕获在立柱(p)之间的细胞外基质体(箭头)的更高倍率图像。图34c显示了用去污剂和反向流进行的提取，再次显示提取后通道中的细胞外基质体明显更少。
实施例11.在微流体装置中细胞外基质体的分离和提取。该实验表明，片上染色可用于检测细胞外基质体的分离。
图35显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。微流体装置注入含有悬浮在生物流体中的均质化牛玻璃体的流体。在将流体灌注到装置中之后，流体流动通过入口并经由出口流出。较大的细胞外基质体(箭头)被捕获在立柱(标记为Lp)之间。用封闭溶液灌注芯片以防止抗体染色前的非特异性抗体结合。接下来，通过注入抗纤连蛋白一抗、将样品温育2小时并洗涤来标记蛋白纤连蛋白，这是一种已知的细胞外基质组分和整合素结合蛋白。然后，将山羊抗兔FITC二抗温育1小时并洗涤。然后在宽视野荧光和亮视野显微镜术下对微流体芯片进行成像。图35显示了代表性的宽视野荧光显微照片。此图像显示微流体通道中的细胞外基质体。大的立柱(Lp)之间的距离为约100μm。细胞外基质体内的点状信号代表纤连蛋白染色(抗纤连蛋白Ab，具有Alexa488、FITC的山羊抗兔二抗，白色信号)。
图36显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图36a显示通道中染色的细胞外基质体(箭头)的代表性显微照片亮视野图像。图像比例尺为20μm。对照图像没有荧光信号，这表明图36a中的信号对纤连蛋白特异。图36b再次显示通道中的染色细胞外基质体(箭头)。图像的比例尺为50μm。再次地，对照图像没有荧光信号，这表明图36b中的信号对纤连蛋白特异。
实施例12.在微流体装置中细胞外基质体的分离和提取。该实验表明，片上染色可用于检测细胞外基质体的分离。
图37显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图37显示在含有细胞外基质体的生物流体中，串珠蛋白聚糖蛋白的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片，串珠蛋白聚糖蛋白是软骨细胞外基质的一种组分。微流体芯片注入含有悬浮在生物流体中的均质化牛玻璃体的流体。在将生物流体灌注到装置中后，样品流动通过入口并通过出口流出。较大的细胞外基质体(箭头)被捕获在立柱(标记为“p”)之间。用封闭溶液灌注芯片以防止抗体染色前的非特异性抗体结合。串珠蛋白聚糖通过注入抗串珠蛋白聚糖一抗、将样品温育2小时并洗涤来标记。然后，将山羊抗兔TRITC二抗温育1小时并洗涤。然后在宽视野荧光和亮视野显微镜术下对微流体芯片进行成像。图37显示立柱(p)之间的微流体通道中的细胞外基质体。点状信号代表串珠蛋白聚糖染色(白色信号)。对照图像没有荧光信号，这表明图37中的信号对串珠蛋白聚糖特异。
图38显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上免疫组织化学染色。图38a显示串珠蛋白聚糖的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片亮视野图像。对照图像没有荧光信号，这表明图38a中的信号对串珠蛋白聚糖特异。图像比例尺为10μm。图38b显示串珠蛋白聚糖的片上免疫组织化学染色的代表性显微照片亮视野图像。对照图像没有荧光信号，这表明图38c中的信号对串珠蛋白聚糖特异。图像比例尺为10μm。
实施例13.从微流体装置中提取的细胞外基质体的片外分析。该实验显示了如可以从本公开的装置通道提取的细胞外基质体的片外分析。
图39显示使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联并使用阿尔新蓝染料染色透明质酸可以在玻璃表面上可视化细胞外基质体。图39显示细胞外基质体的信号(暗染色)，其显示EDC交联将细胞外基质体保留在表面上。
实施例14.从微流体装置中提取的细胞外基质体的片外分析。该实验显示了本公开的细胞外基质体的片外分析。
图40显示细胞外基质的片外分析，所述细胞外基质可使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联并使用天狼星红染料对胶原蛋白进行染色而在玻璃表面上可视化。图40显示细胞外基质体内胶原蛋白链的信号(暗染色)，其显示EDC交联将细胞外基质体保留在表面上。这也显示EMB可以通过胶原蛋白染色进行可视化。
实施例15.从微流体装置中提取的细胞外基质体的片外分析。该实验显示了细胞外基质体的片外分析，这些细胞外基质体可以用核酸标志物在玻璃表面上可视化。
图41显示细胞外基质体的片外分析，所述细胞外基质体可使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联和使用赫斯特染料对DNA进行染色而在玻璃表面上可视化。图41显示细胞外基质体中的DNA信号。
实施例16.在微流体装置中细胞外基质体的分离和检测。该实验显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的分离和检测。
图42显示细胞外基质体的片上分离和检测。图42显示了灌注有牛玻璃体液的微流体芯片的代表性显微照片，牛玻璃体液悬浮在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中，并用阿尔新蓝对透明质酸进行复染，暗染色，亮视野。图42显示来自被捕获在装置的大立柱(圆圈)附近的细胞外基质体的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。观察到簇状形成物的细胞外基质体。图像比例尺为50μm。
实施例17.在微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。该实验显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。
图43显示在微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。图43显示了灌注牛玻璃体液细胞外基质体后通道的代表性低倍率荧光显微照片，该牛玻璃体液细胞外基质体用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对蛋白质进行复染。微流体芯片注入含有均质化牛玻璃体的流体。在将流体灌注到装置中之后，流体流动通过入口并经由出口流出。较大的细胞外基质体被捕获在立柱(标记为“p”)附近。图像比例尺为25μm。
实施例18.在微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。该实验显示在本公开的装置通道中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。
图44显示微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。图44显示了灌注有牛玻璃体液的微流体芯片的代表性显微照片，牛玻璃体液悬浮在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中，并用天狼星红对胶原蛋白进行复染，暗染色，亮视野。图44a显示来自装置的立柱(标记为“p”)之间的细胞外基质体的信号。芯片用生物流体灌注至少60分钟。图44b显示带有荧光滤光片的相同图像，并显示用天狼星红(浅灰色信号)检测到胶原蛋白。图像比例尺为50μm。图44c和图44c显示更高倍率的图像。图像比例尺为10μm。
实施例19.用微流体装置分离、检测和分析细胞外基质体。该实验显示了使用本公开的装置分离、检测和分析细胞外基质体。
图45显示来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图45显示0-200μm2范围内的细胞外基质体的计数。
实施例20.用微流体装置分离、检测和分析细胞外基质体。该实验显示了使用本公开的装置分离、检测和分析细胞外基质体。
图46显示来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图46显示了201-1000μm2范围内的细胞外基质体的计数。
实施例21.用微流体装置分离、检测和分析细胞外基质体。该实验显示了使用本公开的装置分离、检测和分析细胞外基质体。
图47显示来自健康和疾病前状态、疑似青光眼和青光眼前期的人房水生物流体中存在的人细胞外基质体的频率大小分布。房水获自8名患者、健康样品或青光眼前期诊断，眼内压范围为9至25mmHg。人类样品未通过离心或其他方式处理。细胞外基质体的大小是通过使用碳二亚胺EDC固定剂将样品交联到载玻片、用乙酸双氧铀染色并用宽视野显微镜术成像来确定的。在所有八个样品中使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)范围为约1.67μm2至约67×103μm2。图47显示了1001-5000μm2范围内的细胞外基质体的计数。
实施例22.用微流体装置分离、检测和分析细胞外基质体。该实验显示了使用本公开的装置分离、检测和分析细胞外基质体。
图48显示了从本发明的微流体装置中分离和提取的牛玻璃体细胞外基质体的大小分布。从本发明的微流体装置分离和提取后牛玻璃体液生物流体中的细胞外基质体。芯片用生物流体灌注至少60分钟。灌注60分钟后，ECM体被分离在限制通道立柱附近。接下来，用去污剂(0.1％十二烷基硫酸钠，SDS)处理芯片，并通过反向流从芯片中提取样品，这使细胞外基质体从入口端口流出。以10分钟的间隔收集洗脱液的级分，总共收集80分钟。将样品固定在载玻片上并用阿尔新蓝染色，并用宽视野显微镜术成像。使用自动化程序(ImageJ)量化大小。细胞外基质体的大小(面积)可达约16×103μm2。图48显示每个洗脱液级分中细胞外基质体的计数，其随时间而增加。该实验表明，本发明的微流体装置可用于分离和提取各种大小的细胞外基质体。
实施例23.在微流体装置中细胞外基质体的片上分离、检测和分析。本实验显示了细胞外基质体的片外分离、检测和分析。
图49显示细胞外基质体的片外分析可以通过用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)交联进行保留来完成。图49a显示了来自用EDC交联获得的天然牛玻璃体液的细胞外基质体的代表性TEM图像。用EDC固定观察细胞外基质体。图49b显示在没有EDC交联的情况下拍摄的类似图像。在没有EDC固定的情况下，没有观察到细胞外基质体。
实施例24.使用微流体装置用人血浆样品分离和检测早期胰腺癌中的细胞外基质体。该实验显示了使用微流体装置用人血浆样品分离和检测早期胰腺癌中的细胞外基质体。该实验表明，可以使用本发明的微流体装置从人血浆样品中分离和检测早期胰腺癌中的细胞外基质体。该实验进一步表明，细胞外基质体是区分早期胰腺导管腺癌血浆与健康对照的有用标志物。
图50显示与健康对照相比，从患有早期胰腺导管腺癌(PDAC)的患者的人血浆样品中分离细胞外基质体。
在这个实验中，微流体芯片被注入来自早期胰腺导管腺癌(PDAC)的人血浆。灌注到装置中后，生物流体通过入口流动并通过出口排出。将结果与年龄匹配的健康对照进行比较。
用封闭溶液灌注芯片以防止抗体染色前的非特异性抗体结合。接下来，通过注入抗纤连蛋白一抗、将样品温育2小时并洗涤，通过片上免疫组织化学染色标记蛋白纤连蛋白(一种已知的细胞外基质组分和整合素结合蛋白)。然后，将山羊抗兔FITC二抗温育1小时并洗涤。然后在荧光显微镜下对微流体芯片进行成像。
图50a显示PDAC样品的代表性宽视野荧光显微照片图像。图50a显示停留在微流体通道中的细胞外基质体。图50a进一步显示较大的细胞外基质体(箭头)停留在立柱(标记为“p”)之间。立柱之间的宽度为约100μm。来自停留的细胞外基质体的点状信号代表纤连蛋白染色(抗纤连蛋白Ab、带有Alexa488、FITC的山羊抗兔二级Ab，白色信号)。染色显示在EMB内有丰富的信号和点状染色(图50a，箭头)。
图50b显示了年龄匹配的健康对照人血浆样品的类似获得的荧光显微照片。图50b显示纤连蛋白信号的量明显减少(图50b，灰色信号，箭头)。在相同条件下处理时，健康对照信号远小于疾病信号。图像比例尺为20μm。

Claims (35)

1.一种用于分离生物样品的级分的装置，其包括：
一个或多个具有入口端和出口端的限制通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通；
多个间隔开的障碍物，其位于限制通道中以提供流动阻力，其中障碍物之间的间隔在从入口端到出口端的方向上变小；以及
用于容纳流体的入口贮液器，其中入口流体贮液器与限制通道的入口端流体连通；
一个或多个具有入口端和出口端的均匀流动通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通，其中入口端与入口贮液器流体连通。
2.根据权利要求1所述的装置，其还包括：
用于对入口贮液器中的流体施加压力的压力源；
与入口贮液器流体连通的流量传感器，用于测量入口贮液器处的流体的流速和压力。
3.根据权利要求1所述的装置，其还包括与限制通道和均匀流动通道的出口端流体连通的出口贮液器。
4.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道包括具有至少约1微米、或至少约2微米、或至少约4微米、或至少约10微米、或至少约25微米、或至少约50微米、或至少约100微米、或至少约200微米、或至少约500微米的开窗的屏障带。
5.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道包括约1-4微米、或约1-15微米、或约4-35微米、或约4-100微米、或约4-200微米的开窗。
6.根据权利要求1所述的装置，其中装置中1-90％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-75％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-50％的流量在均匀流动通道内，或装置中1-25％的流量在均匀流动通道内。
7.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道和均匀流动通道与同一芯片或基板集成。
8.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道和均匀流动通道位于不同的芯片或基板中。
9.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道是微流体通道。
10.根据权利要求1所述的装置，其还包括用于分析通道中的生物样品的器具。
11.根据权利要求1所述的装置，其还包括用于分析通道中生物样品的蛋白质组学组成、脂质组学组成、转录组学组成或碳水化合物组成的器具。
12.根据权利要求1所述的装置，其还包括用于测量通道内样品的分离级分的水平的器具。
13.根据权利要求1所述的装置，其还包括用于测量通道内样品的分离级分中的生物标志物水平的器具。
14.根据权利要求1所述的装置，其中多个障碍物包括与通道集成的立柱。
15.根据权利要求1所述的装置，其中多个障碍物包括以下一项或多项：
人或动物葡萄膜网状结构的一部分；
人或动物角膜巩膜网状结构的一部分；以及
人或动物的小管旁网状结构的一部分。
16.根据权利要求1所述的装置，其中多个障碍物包括玻璃珠、磁珠、凝胶颗粒、葡聚糖颗粒或聚合物颗粒。
17.根据权利要求1所述的装置，其中生物样品由人或动物体液、血液、组织或细胞组成。
18.根据权利要求1所述的装置，其中生物样品包含运载流体。
19.根据权利要求1所述的装置，其中生物样品包含一种或多种试剂。
20.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道还包括用于结合样品的生物标志物或生物分子的结合部分。
21.根据权利要求1所述的装置，其中生物样品来自正在经历诊断或预后的受试者。
22.根据权利要求1所述的装置，其还包括限制通道中的弯曲流体混合区域。
23.根据权利要求1所述的装置，其中限制通道或连续流动通道具有氟化涂层。
24.一种从生物样品中提取细胞外基质体的方法，该方法包括：
使生物样品从权利要求1所述的装置的入口端流向出口端；和
使流体的流动方向逆转为朝向装置的入口端。
25.一种用于分离生物样品的级分的微流体系统，该系统包括：
微流体装置，其包括
一个或多个具有入口端和出口端的限制通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通；
多个间隔开的障碍物，其位于限制通道中以提供流动阻力，其中障碍物之间的间隔在从入口端到出口端的方向上变小；以及
用于容纳流体的入口贮液器，其中流体贮液器与限制通道的入口端流体连通；和
一个或多个具有入口端和出口端的均匀流动通道，其中入口端和出口端通过通道流体连通，其中入口端与入口贮液器流体连通；
包括压力源的驱动单元；
包括流体源的源单元，其中压力源与流体源和微流体装置的入口贮液器流体连通；
传感器单元，其包括与入口贮液器流体连通的传感器，用于测量入口贮液器处流体的流速和压力，并将流量和压力数据发送到处理器；以及
片上分析器单元，其包括一个或多个用于分析微流体装置中的分离级分并将分析数据发送到处理器的器具；以及
用于接收和显示流速、压力和分析的处理器。
26.一种组合物，其包含从权利要求1-23中任一项所述的装置中提取的生物样品的级分。
27.根据权利要求26所述的组合物，其用于治疗人体或动物体。
28.根据权利要求26所述的组合物，其用于受试者的诊断或预后。
29.一种制备生物样品的方法，该方法包括从生物样品中分离细胞外基质体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中生物样品由人或动物体液、血液、组织或细胞组成。
31.根据权利要求29所述的方法，其中细胞外基质体的尺寸为0.5至5,000微米，或1至1,000微米，或1至200微米，或4至100微米。
32.根据权利要求29所述的方法，其中分离细胞外基质体通过超滤或离心进行。
33.根据权利要求29所述的方法，其中分离细胞外基质体通过权利要求1-23中任一项所述的装置进行。
34.根据权利要求29所述的方法，其还包括使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联将细胞外基质体固定在玻璃表面上。
35.一种使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联将细胞外基质体固定在玻璃表面来制备细胞外基质体生物样品的方法。
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