KR20230005178A - 세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents

세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치 및 방법 Download PDF

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KR20230005178A
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존 티. 지. 페나
제임스 머레이 미첼
루카 다고스티노
상게타 탄달람 팔라니베루
구니히로 우류
하몬 로렌스 렘멜
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아우프바우 메디컬 이노베이션스 리미티드
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Abstract

세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치, 방법 및 시스템이 제공된다. 보다 특히, 본 발명은 대상체의 진단 및 예후에 사용하기 위한 생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 개시한다. 장치는 세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 제한 채널 및 정확한 압력 측정을 위한 균일한 유동 채널을 가질 수 있다.

Description

세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치 및 방법
본 발명은 세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치, 방법 및 시스템에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 대상체의 진단 및 예후에 사용하기 위한 생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 단리하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 개시한다.
질환의 진단 및 예후를 위한 통상적인 방법은 생물학적 샘플의 작은 분획을 분석 또는 단리하는 것을 필요로 할 수 있다. 작은 분획으로부터의 성분의 상응하는 분석은 질환의 진단 및 예후에 사용될 수 있다. 예를 들어, 개별 세포, 및 심지어 개별 핵산 분자가 검출 및 분석될 수 있다. 그러나, 이러한 통상적인 방법의 결점은 의사 결정을 위해 매우 소량의 생물학적 물질, 및 상응하는 작은 신호에 의존하는 것이다. 유용한 신호는 측정되지 않은 다른 생물학적 물질에서 놓쳐버릴 수 있다.
질환의 진단 및 예후를 위한 통상적인 방법은 종종 생물학적 샘플이 수득되고 널리 공지된 구조물이 추가의 분석을 위해 샘플로부터 단리되는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 무손상 기관 조직, 전세포, 엑소솜 및 다른 널리 공지된 구조물이 단리되고 특징화될 수 있다. 이러한 방법의 결점은 널리 공지된 구조물이 질환 상태를 용이하게 반영하지 않는 경우에 질환을 검출하거나 특징화할 수 없다는 것을 포함한다.
질환의 진단 및 예후를 위한 통상적인 방법의 추가의 결점은 대상체의 생물학적 샘플의 특정한 널리 공지된 구조적 요소, 예를 들어 엑소솜에만 관련된 바이오마커의 사용을 포함한다. 이들 방법에서, 바이오마커는 종종 관심 병리상태와 직접 관련되지 않음으로써 본질적으로 제한된다. 통상적인 방법은 종종 통계가 진단 답변을 제공할 것이라는 희망으로 질환과 멀게 또는 부분적으로 연관될 수 있는 다수의 바이오마커를 고려하려고 시도한다. 바이오마커의 조합이 상용적으로 요구되며, 결과는 매우 예측불가능하다.
종래의 장치의 추가의 결점은 생물학적 성분을 함유하는 복합 유체 내의 유동 및 압력을 정확하게 측정할 수 없다는 것을 포함한다. 생물학적 성분을 함유하는 유체는 측정을 수행하는 장치와 생물학적 성분의 상호작용 때문에 유동 및 압력의 변화를 야기할 수 있다.
특정한 생물학과 관련된 증가된 샘플 단리물을 제공할 수 있는, 진단을 위해 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 장치 및 시스템이 필요하다. 보다 특히, 질환의 진단 및 예후에 사용하기 위한 생물학적 샘플로부터 유의한 성분을 단리하기 위한 장치, 방법 및 시스템이 필요하다.
질환 상태에 보다 밀접하게 상응하는 생물학적 물질의 관련 분획을 단리할 수 있고, 관련 유체에서의 차압 및 유동을 측정할 수 있는, 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 방법 및 장치에 대한 긴급한 필요성이 존재한다.
간단한 개요
본 발명은 다양한 질환 및 상태에 적용가능한 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 장치 및 시스템을 제공한다. 생물학과 관련된 샘플 단리물을 증가시킬 수 있는, 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 본 발명의 장치 및 방법은 질환의 진단 및 예후에 사용하기 위해 생물학적 샘플로부터 유의한 성분을 단리하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 본 발명의 방법 및 장치는 체액, 조직 및 세포를 포함한 다양한 종류의 생물학적 샘플과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 질환 상태에 밀접하게 상응하는 생물학적 물질의 관련 분획을 단리할 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 장치는 생물학적 샘플의 유의한 분획을 단리하고 질환의 진단 및 예후와 관련된 그의 성분을 분석하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유의한 양의 생물학적 물질, 및 상응하게 개선된 신호 수준이 의사 결정을 위해 수득될 수 있다. 본 발명의 측면은 질환에 대한 지표로서 세포외 매트릭스체 (EMB)의 조성 및 특성을 보존하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환 상태를 보다 용이하게 반영할 수 있는 세포외 매트릭스체를 사용하여 질환을 검출하거나 특징화하는 증진된 능력을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용의 장치 및 방법은 특정 생물학적 분획을 질환 상태에 관련시키는 관련 바이오마커에 대한 증가된 신호를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 바이오마커는 질환과 연관될 수 있고, 진단 도구를 제공할 수 있다.
본 개시내용의 장치는 장치 내의 연속적이고 실질적인 유동을 유지함으로써 생물학적 성분을 함유하는 유체 내의 유동 및 압력의 정확한 측정을 제공할 수 있어, 센서가 차압 및 유동을 정확하게 측정할 수 있다. 본원에 개시된 장치 및 시스템은 연속적이고 실질적인 유동을 유지하는 채널의 배열에 의해 생물학적 성분을 함유하는 유체에서 유동 및 압력의 개선된 측정을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 장치는 시스템 내에서 연속적이고 실질적인 유동이 유지되도록 유체의 유동을 실질적으로 제한하지 않는 1개 이상의 채널을 가질 수 있다.
본 개시내용의 장치 및 시스템은 생물학적 샘플의 특유한 하위집단 또는 하위세트 분획을 단리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 고유한 하위세트 분획은 질환과 연관될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플의 고유한 하위세트 분획은 실질적으로 세포외 매트릭스체로 구성될 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 물질 또는 분자를 함유하는 유체의 초미세구조적 성분을 단리, 검출 및/또는 분석하기 위한 장치 및 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 초미세구조 성분은 질환과 연관될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 다중 및 특이적 질환 바이오마커의 공급원인 세포외 매트릭스체 (EMB)를 단리, 추출 및 이용하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 용도를 위해 세포외 매트릭스체, 생물학적 입자 및 복합체의 조성물을 단리, 검출 및 분석하기 위한 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 세포외 매트릭스체는 그의 형태학적 특징을 통해 바이오마커로서 작용할 수 있다. 추가 측면에서, 세포외 매트릭스체는 질환 경로에서 제시될 수 있는 단리된 생화학적 마커를 함유함으로써 작동할 수 있다.
본 발명의 측면은 질환-연관 세포외 매트릭스체 (EMB) 및/또는 생물학적 입자 또는 복합체를 통해 바이오마커를 검출 및 측정하기 위한 장치를 포함하는 진단 시스템을 추가로 제공할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 물질의 샘플을 제조 및 분석하기 위한 방법 및 장치를 기재한다.
생물학적 물질의 샘플은 체액, 조직 및 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함한다:
하기를 포함하는, 생물학적 샘플의 분획을 단리하기 위한 장치:
유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하는 것인 1개 이상의 제한 채널;
유동에 대한 저항을 제공하기 위해 제한 채널 내에 보유된 복수의 이격된 장애물이며, 장애물들 사이의 간격은 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로의 방향으로 감소하는 것인 장애물; 및
제한 채널의 유입구 말단과 유체 연통하는, 유체를 보유하기 위한 유입구 저장소;
유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하고, 유입구 말단은 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 1개 이상의 균일한 유동 채널.
유입구 저장소 내의 유체에 압력을 가하기 위한 압력 공급원; 및/또는 유입구 저장소에서 유체의 유량 및 압력을 측정하기 위해 유입구 저장소와 유체 연통하는 유동 센서를 추가로 포함하는 상기 장치.
장치는 제한 채널 및 균일한 유동 채널의 유출구 말단과 유체 연통하는 유출구 저장소를 추가로 포함할 수 있다.
제한 채널이 적어도 약 1 마이크로미터, 또는 적어도 약 2 마이크로미터, 또는 적어도 약 4 마이크로미터, 또는 적어도 약 10 마이크로미터, 또는 적어도 약 25 마이크로미터, 또는 적어도 약 50 마이크로미터, 또는 적어도 약 100 마이크로미터, 또는 적어도 약 200 마이크로미터, 또는 적어도 약 500 마이크로미터의 천공부를 갖는 장벽 밴드를 포함하는 것인 상기 장치.
제한 채널이 약 1-4 마이크로미터, 또는 약 1-15 마이크로미터, 또는 약 4-35 마이크로미터, 또는 약 4-100 마이크로미터, 또는 약 4-200 마이크로미터의 천공부를 포함하는 것인 상기 장치.
장치에서의 유동의 1-90%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-75%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-50%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-25%가 균일한 유동 채널 내에 있는 것인 상기 장치.
제한 채널 및 균일한 유동 채널은 동일한 칩 또는 기판과 일체형일 수 있다. 제한 채널 및 균일한 유동 채널은 상이한 칩 또는 기판에 있을 수 있다. 제한 채널은 마이크로유체 채널일 수 있다.
채널 내의 생물학적 샘플을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하는 상기 장치.
채널 내의 생물학적 샘플의 프로테옴 조성, 리피돔 조성, 트랜스크립톰 조성, 또는 탄수화물 조성을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하는 상기 장치.
채널 내의 샘플의 단리된 분획의 수준을 측정하기 위한 수단을 추가로 포함하는 상기 장치.
채널 내의 샘플의 단리된 분획 중 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 수단을 추가로 포함하는 상기 장치.
복수의 장애물이 채널과 일체형인 기둥을 포함하는 것인 상기 장치.
복수의 장애물이 인간 또는 동물 포도막 메쉬워크의 부분, 인간 또는 동물 각막공막 메쉬워크의 부분, 또는 인간 또는 동물 누소관근접부 메쉬워크의 부분 중 하나 이상을 포함하는 것인 상기 장치.
복수의 장애물이 유리 비드, 자기 비드, 겔 입자, 덱스트란 입자 또는 중합체 입자를 포함하는 것인 상기 장치.
생물학적 샘플은 인간 또는 동물 체액, 혈액, 조직 또는 세포로 구성될 수 있다. 생물학적 샘플은 담체 유체를 포함한다.
생물학적 샘플이 1종 이상의 시약을 포함하는 것인 상기 장치.
제한 채널이 샘플의 바이오마커 또는 생체분자에 결합하기 위한 결합 모이어티를 추가로 포함하는 것인 상기 장치.
생물학적 샘플은 진단 또는 예후를 겪은 대상체로부터의 것일 수 있다.
제한 채널 내에 구불구불한 유체 혼합 영역을 추가로 포함하는 상기 장치. 제한 채널 또는 연속 유동 채널이 플루오린화 코팅을 갖는 것인 상기 장치.
본 발명은 하기에 의해 생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 추출하는 방법을 추가로 고려한다:
생물학적 샘플을 제1항의 장치의 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로 유동시키는 단계; 및
장치의 유입구 말단을 향한 유체의 유동 방향을 역전시키는 단계.
하기를 포함하는, 생물학적 샘플의 분획을 단리하기 위한 마이크로유체 시스템:
하기를 포함하는 마이크로유체 장치:
유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하는 것인 1개 이상의 제한 채널;
유동에 대한 저항을 제공하기 위해 제한 채널 내에 보유된 복수의 이격된 장애물이며, 장애물들 사이의 간격은 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로의 방향으로 감소하는 것인 장애물; 및
제한 채널의 유입구 말단과 유체 연통하는, 유체를 보유하기 위한 유입구 저장소; 및
유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하고, 유입구 말단은 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 1개 이상의 균일한 유동 채널;
압력 공급원을 포함하는 구동 유닛;
유체 공급원을 포함하는 공급원 유닛이며, 압력 공급원은 유체 공급원 및 마이크로유체 장치의 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 공급원 유닛;
유입구 저장소에서 유체의 유량 및 압력을 측정하고 유량 및 압력 데이터를 프로세서에 전송하기 위해 유입구 저장소와 유체 연통하는 센서를 포함하는 센서 유닛; 및
마이크로유체 장치에서 단리된 분획을 분석하고 분석 데이터를 프로세서에 보내기 위한 1개 이상의 수단을 포함하는 온-칩 분석기 유닛; 및
유량, 압력 및 분석을 수용 및 디스플레이하기 위한 프로세서.
본 개시내용의 장치로부터 추출된 생물학적 샘플의 분획을 포함하는 조성물. 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용될 수 있다. 조성물은 대상체의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다.
생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 단리하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플을 제조하는 방법. 세포외 매트릭스체는 0.5 내지 5,000 마이크로미터, 또는 1 내지 1,000 마이크로미터, 또는 1 내지 200 마이크로미터, 또는 4 내지 100 마이크로미터의 크기를 가질 수 있다. 세포외 매트릭스체를 단리하는 것은 한외여과 또는 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 세포외 매트릭스체를 단리하는 것은 본 개시내용의 장치에 의해 수행될 수 있다.
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교를 사용하여 유리 표면 상에 세포외 매트릭스체를 고정시키는 것을 추가로 포함하는 상기 방법.
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교를 사용하여 유리 표면 상에 세포외 매트릭스체를 고정시키는 세포외 매트릭스체의 생물학적 샘플을 제조하는 방법.
도 1은 본 발명의 마이크로유체 칩 실시양태의 평면도를 나타낸다. 이러한 포맷에서, 실리콘 웨이퍼 마스터 (101)는 3개의 마이크로유체 채널 칩 패턴 (103)으로 인쇄된다. 실리콘 웨이퍼 (101)를 기판으로서 사용할 수 있다. 포토레지스트를 기판 상에 붓고, UV 광에 노출시켜 마이크로유체 칩의 패턴 (103)을 형성할 수 있다. 이와 함께, 웨이퍼 및 포토레지스트는 PDMS를 부을 수 있는 금형을 형성한다. 일단 경화되면, PDMS를 금형으로부터 박리하여, 웨이퍼 당 마이크로유체 칩의 3개의 캐스트를 제공할 수 있다. 이들 캐스트는 유리 슬라이드에 부착되어 최종 마이크로유체 칩을 형성할 수 있다.
도 2는 본 발명의 장치의 한 실시양태에서의 마이크로유체 칩 삽입물의 평면도를 나타낸다. 칩은 이 예에서 각각 2500 um 폭 및 25,000 um 길이의 2개의 제한 채널 (203)을 갖는다. 제한 채널 (203)은 원으로 나타낸 다양한 직경 및 간격의 기둥을 함유한다. 칩은 유동을 유의하게 제한하지 않는 균일한 크기 및 간격의 기둥을 갖는 제3의 균일한 유동 채널 (205)을 갖는다. 칩은 또한 보다 큰 기둥을 함유하는 유입구 저장소 (201) 및 유출구 저장소 (207)를 갖는다. 파선 화살표는 유입구 저장소로부터 유출구 저장소로의 유동 방향을 나타낸다.
도 3은 도 2에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 3은 원으로 나타낸 다양한 크기의 PDMS 중합체성 기둥 (301)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 4는 도 2의 유입구 저장소에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 4는 원으로 나타낸 기둥 (401)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 5는 도 2의 유입구 저장소 영역에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 5는 원으로 나타낸 기둥 (501)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 6은 도 2의 채널 영역에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 6은 원으로 나타낸 기둥 (601)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 본 발명의 마이크로유체 채널 장치는 난류 또는 제한된 유동을 생성하기 위한 기둥 또는 장애물의 상이한 크기 및/또는 간격의 영역을 가질 수 있다.
도 7은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 7은 원으로 나타낸 기둥 (701)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 제한 채널 내의 기둥 사이의 50 um 갭에서 25 um 갭으로의 전이를 나타낸다.
도 8은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 8은 원으로 나타낸 기둥 (801)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 제한 채널 내의 기둥 사이의 보다 큰 갭에서 보다 작은 갭으로의 전이를 나타낸다.
도 9는 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 9는 원으로 나타낸 기둥 (901)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 10은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 10은 원으로 나타낸 기둥 (1001)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 난류를 생성할 수 있는 무딘 기둥 장애물 (1001)의 영역을 갖는 채널을 나타낸다.
도 11은 도 2의 유출구 저장소 (1107)에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 11은 다양한 크기의 기둥 (1101, 1103, 및 1105)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 실시양태에서, 외부 제한 채널은 각각 매우 작고 밀접하게-이격된 기둥에 의해 형성된 장벽 (1102)을 함유한다.
도 12는 도 2의 유입구 저장소 (1201)에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 12는 다양한 크기의 기둥 (1203)을 나타낸다. 외부 제한 채널 (1207)은 다양한 크기 및 간격의 기둥을 함유한다. 균일한 유동 채널 (1205)은 균일한 크기 및 간격의 기둥을 함유한다. 외부 채널을 통한 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 13은 본 발명의 장치의 한 실시양태에서의 마이크로유체 칩의 평면도를 나타낸다. 3개의 마이크로유체 삽입물이 도시되어 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 14는 무딘 기둥 장애물 (1401)이 유동하는 본 발명의 마이크로유체 채널 장치의 실시양태의 사시도를 나타낸다. 도 14는 도 15의 확대도이다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 15는 본 발명의 마이크로유체 채널 장치의 실시양태의 사시도를 나타낸다. 도 15는 도 2의 채널 영역에 상응하는 도면을 나타낸다. 도 15는 제한 채널 내의 다양한 간격의 무딘 기둥 장애물 (1501)을 나타낸다. 이 실시양태에서, 제한 채널은 기둥 사이의 다양한 간격의 밴드로 조직화된 기둥 장애물 (1501)을 가질 수 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 16은 본 발명의 마이크로유체 칩 실시양태의 측면 입면도를 나타낸다. 유입구 저장소 (1605)는 저장소 내로 생체액 및/또는 다른 유체를 도입하기 위해 유체 라인 (1601)과 유체 연통한다. 유체 라인 (1601)은 유리 커버 슬라이드에 한정된 프로브 (1602), 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)을 통과한다. 생체액은 유입구 저장소 (1605)를 통과하여 마이크로유체 채널 (1606)에 도달한다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 17은 도 2의 유입구 영역에 상응하는 확대 평면도 및 도 16의 프로브 (1602)의 위치를 나타낸다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 18은 본 발명의 마이크로유체 칩 (1614) 실시양태의 측면 입면도를 나타낸다. 유입구 저장소는 저장소로 생체액을 도입하기 위한 유체 라인 (1601)과 유체 연통한다. 유체 라인 (1601)은 유리 커버 슬라이드 (1613)에 한정된 프로브 (1602), 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)을 통과한다. 생체액은 유입구 저장소를 통과하여 마이크로유체 채널 (1606)에 도달하고, 유출구 저장소 (1607)로 유동한다. 프로브 조정기 (1612)는 프로브 (1602)의 높이를 조정하여 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)과의 우수한 밀봉을 생성하도록 제공될 수 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 19는 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 19는 원으로 나타낸 기둥 (1701)을 나타낸다. 이 실시양태에서, 외부 채널 내의 기둥 밴드의 영역의 일부 대표적인 길이는 마이크로미터로 나타낸다.
도 20은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도의 현미경사진을 나타낸다. 도 20은 기둥을 점으로 나타낸다. 이 실시양태에서, 외부 채널 내의 기둥 밴드의 영역의 일부 대표적인 길이는 마이크로미터로 나타낸다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 21은 도 2에 상응하는 마이크로유체 장치의 한 실시양태의 평면도를 나타낸다. 생체액은 전달 프로브 (2201)에 의해 유입구 영역 저장소 (2202)로 도입될 수 있다. 유출구 저장소 영역 (2203)으로의 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다. 이 실시양태의 확대도는 외부 채널 내의 기둥 밴드의 영역의 일부 대표적인 길이를 마이크로미터로 나타낸다. 이 실시양태의 경우, 확대도에서의 점선은 장애물 중 생체액의 가능한 구불구불한 경로를 나타낸다.
도 22는 프로세서, 유체 구동 유닛, 유체 공급원 유닛, 센서 유닛, 온-칩 유닛 및 오프-칩 유닛을 갖는 본 발명의 마이크로유체 시스템의 한 실시양태를 나타낸다.
도 23은 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터의 방수가 마이크로유체 장치 내의 압력을 증가시켰다는 것을 나타낸다. 도 23은 중증 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터 수득된 인간 방수를 주입하였을 때, 마이크로유체 채널에서 기둥에 의해 형성된 인공 섬유주 내에서의 압력 (mm Hg) 변화의 상대량을 나타낸다. 유체 유량을 분당 2 μl로 일정하게 유지하고, 기준선 시스템 압력을 외부 압력 센서를 사용하여 측정하였다. 인간 방수 샘플을 화살표 및 문자 "a"에 의해 표시된 시점에 주사하였다. 압력은 27분에 최대 약 41 mm Hg로 꾸준히 상승하였다. 도 23은 POAG 녹내장으로 진단된 환자로부터의 방수가 장치 내 압력을 증가시켰음을 나타낸다.
도 24 (상부)는 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터의 인간 방수로부터 EMB를 포획한 후의 마이크로유체 칩의 공초점 현미경사진을 나타낸다. EMB의 단백질을 형광 마커인 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, 화살표로 표시됨)로 표지하였다. 원은 제한 채널 내의 기둥이다. 도 24 (하부)는 기둥 주위의 마이크로유체 채널에서 단리된 EMB를 나타낸다.
도 25는 크기 배제 필터를 사용한 생체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 단리를 보여준다. 소 유리체액을 5 μm 셀룰로스 아세테이트 시린지 필터, 이어서 1 μm 시린지-팁 필터, 및 후속적으로 0.45 um 시린지-팁 필터, 및 이어서 0.22 μm 필터로 여과하였다. 각각의 분획을 광시야 현미경검사를 사용하여 특징화하였다. 도 25는 미농축 소 유리체액 (4301)을 22 g 바늘을 갖는 1 mL 시린지 (4305)로 흡인하고, 5 μm 시린지-팁 필터 (4309)를 통해 압출한 것을 나타낸다. 여과물을 수집하고, 1 μm 시린지-팁 필터 (4311)를 통해 여과하였다. 여과물을 수집하고, 0.45 μm 시린지-팁 필터 (4313)를 통해 여과하였다. 여과물을 수집하고, 0.22 μm 시린지-팁 필터 (4315)를 통해 압출하였다. 생체액 분획을 광학 현미경검사를 위한 각각의 여과 단계 후에 수집하였다. 현미경검사 영상은 여과물이 보다 작은 필터 크기를 통해 연속적으로 통과함에 따라 보다 큰 바디의 감소를 나타냈다.
도 26은 크기 배제 필터에 의한 EMB의 단리를 위한 대표적인 투과 전자 현미경검사 (TEM) 영상을 나타낸다. 도 26a 및 도 26b는 소 유리체액의 천연 생체액에 존재하는 세포외 매트릭스체의 존재를 나타낸다. 복합 생체액으로부터 세포외 매트릭스체를 단리 및 회수하기 위해, 연속 시린지-기반 여과를 5 μm 내지 0.22 μm 세공 크기의 셀룰로스 필터로 수행하였다. 세포외 매트릭스체를 알시안 블루 염색으로 염색하였다. 도 26c는 5 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26d는 1 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26e는 0.45 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26f는 0.22 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 영상은 여과물이 보다 작은 필터 크기를 통해 연속적으로 통과함에 따라 보다 큰 ECM 바디의 상대적 감소를 나타낸다.
도 27은 원심분리를 사용한 생체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 단리를 도시한다. 4개의 펠릿 (9705, 9713, 9721 및 9729)을 연속 원심분리에 의해 수득하였다. 소 유리체를 재현탁시키고 (9701), 1 ml 튜브에 넣고, 350 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 (소르발 레전드(Sorvall Legend) RT) 펠릿 1 (9705)을 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 1 (9709)로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 2000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 (에펜도르프(Eppendorf), 5417R 시리즈, F45-30-11 에펜도르프 로터) 펠릿 2 (9713)를 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 2 (9717)로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 10,000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿 3 (9721)을 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 3 (9725)으로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 20,000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿 4 (9729)를 수득하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 4로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다.
도 28은 연속 원심분리에 의한 EMB의 단리를 위한 대표적인 투과 전자 현미경검사 (TEM) 영상을 나타낸다. 도 28a는 소 유리체액에 존재하는 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 28b에서, 450 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 마찬가지로, 도 28c에서, 2,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 도 28d에서, 10,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 도 28e에서, 20,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다.
도 29는 소 유리체액에서 안내압 (IOP)에 대한 화합물 비발리루딘 TFA의 용량-반응 거동을 나타낸다. 차압은 본 발명의 마이크로유체 장치로 측정된다.
도 30은 소 유리체액에서 안내압 (IOP)에 대한 화합물 콜리스틴 술페이트의 용량-반응 거동을 나타낸다. 차압은 본 발명의 마이크로유체 장치로 측정된다.
도 31은 소 유리체액 녹내장 모델에서 안내압 (IOP)에 대한 화합물 폴리믹신 B 술페이트의 용량-반응 거동을 나타낸다. 차압은 본 발명의 마이크로유체 장치로 측정된다.
도 32는 본 개시내용의 마이크로유체 장치의 제한 채널 내의 세포외 매트릭스체의 단리 및 추출을 나타낸다. 도 32a 및 도 32a는 소 유리체액의 생체액으로 관류된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 문자 "p"는 채널 내의 기둥을 표시한다. 관류 후에, 세포외 매트릭스체를 기둥 사이 및 주변에서 단리하였다. 도 32c 및 도 32d는 세포외 매트릭스체를 추출한 후의 채널의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 세포외 매트릭스체는 칩으로부터 이탈되었으며, 이는 추출 후에 실질적으로 더 적은 바디를 나타냈다.
도 33은 LC/MS에 의한 단리되고 추출된 소 세포외 매트릭스체의 오프-칩 프로테옴 분석을 나타낸다. 세포외 매트릭스체에 대한 바이오마커를 검출하였다.
도 34는 본 개시내용의 마이크로유체 장치의 제한 채널 내의 세포외 매트릭스체의 단리 및 그의 후속 추출을 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm이다. 도 34a는 포스페이트-완충 염수 (pH 7.0) 중에 현탁되고 알시안 블루 (회색 신호, 명시야)로 히알루론산에 대해 대조염색된 소 유리체액으로 관류된 마이크로유체 장치의 대표적인 광시야 현미경사진을 나타낸다. 도 34a는 장치의 기둥 (p) 사이에 포획된 세포외 매트릭스체 (화살표)로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 관류 후에, 응집체를 기둥 사이에서 단리하고, 덩어리-유사 형태로 관찰하였다. 세포외 매트릭스체 물질보다 더 작은 물질은 유출구 포트를 통해 배출되었다. 도 34b는 마이크로유체 장치의 제한 채널로부터의 세포외 매트릭스체의 추출을 나타낸다. 장치를 온화한 세제, 0.1% 소듐 도데실 술페이트, SDS로 관류시키고, 유출구로부터 유입구로의 유동 방향을 역전시켰다. 도 34b는 용리 후 채널 내에 존재하는 실질적으로 더 적은 수의 바디를 나타냈고, 바디가 추출되었음을 보여주었다. 도 34c는 관류 후에 기둥 (p) 사이에 포획된 세포외 매트릭스체 (화살표)의 보다 고배율의 영상을 나타낸다. 도 34d는 세제 및 역류에 의한 추출을 보여주며, 역시 추출 후 채널에서 실질적으로 더 적은 바디를 나타낸다.
도 35는 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 마이크로유체 장치에 생체액 중에 현탁된 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 유체의 관류 후, 유체는 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)는 기둥 (Lp로 표시됨) 사이에 포획되었다. 칩을 차단 용액으로 관류시켜 항체 염색 전에 비-특이적 항체 결합을 방지하였다. 다음으로, 공지된 세포외 매트릭스 성분 및 인테그린-결합 단백질인 단백질 피브로넥틴을, 항-피브로넥틴 1차 항체를 주입하고, 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척함으로써 표지하였다. 이어서, 염소 항-토끼 FITC 2차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이어서, 마이크로유체 칩을 광시야 형광 및 명시야 현미경검사 하에 영상화하였다. 도 35는 대표적인 광시야 형광 현미경사진을 나타낸다. 이 영상은 마이크로유체 채널 내의 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 큰 기둥 사이의 거리 (Lp)는 약 100 μm였다. 바디 내의 점상 신호는 피브로넥틴 염색 (항-피브로넥틴 Ab, 염소 항-토끼 2차 항체 + 알렉사(Alexa) 488, FITC, 백색 신호)을 나타낸다.
도 36은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 36a는 채널 (화살표) 내의 염색된 세포외 매트릭스체의 대표적인 현미경사진 명시야 영상을 나타낸다. 영상 스케일 바는 20 μm였다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 36a의 신호가 피브로넥틴에 대해 특이적이었음을 보여주었다. 도 36b는 또한 채널 내의 염색된 세포외 매트릭스체 (화살표)를 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm였다. 다시, 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 36b의 신호가 피브로넥틴에 대해 특이적이었음을 보여주었다.
도 37은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 37은 세포외 매트릭스체를 함유하는 생체액에서의, 공지된 암 바이오마커인, 연골의 세포외 매트릭스의 성분인 페를레칸 단백질의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 마이크로유체 칩에 생체액 중에 현탁된 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 생체액의 관류 후, 샘플은 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)는 기둥 ("p"로 표시됨) 사이에 포획되었다. 칩을 차단 용액으로 관류시켜 항체 염색 전에 비-특이적 항체 결합을 방지하였다. 항-페를레칸 1차 항체를 주입하고, 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척함으로써 페를레칸을 표지하였다. 이어서, 염소 항-토끼 TRITC 2차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이어서, 마이크로유체 칩을 광시야 형광 및 명시야 현미경검사 하에 영상화하였다. 도 37은 기둥 (p) 사이의 마이크로유체 채널 내의 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 점상 신호는 페를레칸 염색 (백색 신호)을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 37의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 나타냈다.
도 38은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 38a는 페를레칸의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진 명시야 영상을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 38a의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 나타냈다. 영상 스케일 바는 10 μm였다. 도 38b는 페를레칸의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진 명시야 영상을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 38b의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 보여주었다. 영상 스케일 바는 10 μm였다. 도 38은 또한 히알루론산에 대한 마커인 알시안 블루가 EMB에 대한 염색제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 39는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 피크로시리우스 레드 염료를 사용한 콜라겐의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 가시화된 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 39는 세포외 매트릭스체에 대한 신호 (암색 염색)를 보여주고, 이것은 EDC 가교가 표면 상에 세포외 매트릭스체를 보유함을 보여주었다.
도 40은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 피크로시리우스 레드 염료를 사용한 콜라겐의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 가시화된 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 40은 세포외 매트릭스체 내의 콜라겐 가닥에 대한 신호 (암색 염색)를 보여주고, 이것은 EDC 가교가 표면 상에 세포외 매트릭스체를 보유함을 보여주었다. 도 40은 또한 염색 피크로시리우스 레드가 EMB를 염색하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 41은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 훽스트(Hoechst) 염료를 사용한 DNA의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 세포외 매트릭스체가 가시화된 오프-칩 분석을 나타낸다. 도 41은 세포외 매트릭스체 내의 DNA (훽스트 염료, DAPI 필터, 백색 신호, DNA)에 대한 신호를 나타낸다.
도 42는 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리 및 검출을 나타낸다. 도 42는 포스페이트-완충 염수, pH 7.0 중에 현탁된 소 유리체액으로 관류되고, 알시안 블루, 암색 염색, 명시야로 히알루론산에 대해 대조염색된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 도 42는 장치의 큰 기둥 (원) 근처에 포획된 세포외 매트릭스체로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 세포외 매트릭스체는 클러스터-유사 형태로 관찰되었다. 영상 스케일 바는 50 μm였다.
도 43은 마이크로유체 장치 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리, 검출 및 분석을 나타낸다. 도 43은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 단백질에 대해 대조염색된 소 유리체액 세포외 매트릭스체의 관류 후의 채널의 대표적인 저출력 형광 현미경사진을 나타낸다. 마이크로유체 칩에 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 유체의 관류 후, 유체는 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체는 기둥 ("p"로 표시됨) 근처에 포획되었다. 영상 스케일 바는 25 μm였다.
도 44는 마이크로유체 장치 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리, 검출 및 분석을 나타낸다. 도 44는 포스페이트-완충 염수, pH 7.0 중에 현탁된 소 유리체액으로 관류되고, 피크로시리우스 레드, 암색 염색, 명시야로 콜라겐에 대해 대조염색된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 도 44a는 장치의 기둥 ("p"로 표시됨) 사이의 세포외 매트릭스체로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 도 44b는 형광 필터를 사용한 동일한 영상을 보여주고, 콜라겐이 피크로시리우스 레드 (밝은 회색 신호)로 검출되었음을 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm였다. 도 44c 및 도 44d는 더 높은 배율에서의 유사한 영상을 도시한다. 영상 스케일 바는 10 μm였다.
도 45는 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 45는 0-200 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
도 46은 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 46은 201-1000 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
도 47은 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 47은 1001-67,000 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
도 48은 본 발명의 마이크로유체 장치로부터 단리 및 추출된 소 유리체 세포외 매트릭스체의 크기 분포를 나타낸다. 본 발명의 마이크로유체 장치로부터의 단리 및 추출 후의 소 유리체액 생체액 내의 세포외 매트릭스체. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 관류 60분 후에, ECM 바디를 제한 채널 기둥 근처에서 단리하였다. 다음에, 칩을 세제 (0.1% 소듐 도데실 술페이트, SDS)로 처리하고, 역류를 통해 칩으로부터 샘플을 추출하였으며, 이는 바디가 유입구 포트 밖으로 유동하도록 하였다. 용리액의 분획을 총 80분 동안 10분 간격으로 수집하였다. 샘플을 유리 슬라이드 상에 탑재하고, 알시안 블루로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화하였다. 크기는 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 최대 약 16 x 103 μm2였다. 도 48은 시간 경과에 따라 증가한, 각각의 용리액 분획 내의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다. 이 실험은 본 발명의 마이크로유체 장치가 다양한 크기의 세포외 매트릭스체를 단리하고 추출하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다.
도 49는 세포외 매트릭스체가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 가교로 보유되면서 수행될 수 있는 오프-칩 분석을 나타낸다. 도 49a는 EDC 가교로 수득된 천연 소 유리체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 대표적인 TEM 영상을 나타낸다. 세포외 매트릭스체는 EDC 고정으로 관찰되었다. 도 49b는 EDC 가교 없이 찍은 유사한 영상을 나타낸다. 세포외 매트릭스체는 EDC 고정 없이 관찰되지 않았다.
도 50은 건강한 대조군에 비해 초기 췌장관 선암종 (PDAC) 환자로부터의 인간 혈장 샘플로부터의 세포외 매트릭스체의 단리를 나타낸다. 도 50a는 PDAC 샘플에 대한 대표적인 광시야 형광 현미경사진 영상을 나타낸다. 도 50a는 마이크로유체 채널 내에 보유된 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 50a는 추가로 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)가 기둥 ("p"로 표시됨) 사이에 머물렀음을 나타낸다. 기둥 사이의 폭은 약 100 μm였다. 보유된 세포외 매트릭스체로부터의 점상 신호는 피브로넥틴 염색 (항-피브로넥틴 Ab, 염소 항-토끼 2차 Ab + 알렉사 488, FITC, 백색 신호)을 나타낸다. 염색은 EMB 내에서 풍부한 신호 및 점상 염색을 보여주었다 (도 50a, 화살표 머리). 도 50b는 연령-매칭된 건강한 대조군 인간 혈장 샘플의 유사하게 수득된 형광 현미경사진을 나타낸다. 도 50b는 현저하게 감소된 양의 피브로넥틴 신호를 나타낸다 (도 50b, 회색 신호, 화살표). 건강한 대조군 신호는 동일한 조건 하에 처리된 경우에 질환 신호에 대한 것보다 훨씬 더 작았다. 영상 축적 막대는 20 μm였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 생물체, 물질 및/또는 분자를 단리하고 사용함으로써 다양한 질환 및 상태에 적용가능한 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 장치 및 시스템을 개시한다. 생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 장치 및 시스템은 관심 생물학과 관련된 샘플 단리물의 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 질환의 진단 및 예후에 사용하기 위한 생물학적 샘플로부터 유의한 성분을 단리하는 데 사용될 수 있다.
생물학적 샘플로부터 입자를 단리하기 위한 본 발명의 장치는 체액, 혈액, 조직, 세포 및 종양을 포함한 다양한 종류의 생물학적 물질 및 샘플과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 질환 상태에 상응하는 생물학적 물질의 관련 분획을 단리할 수 있다.
본 개시내용은 생물학적 샘플의 유의한 분획을 단리하고 질환의 진단 및 예후와 관련된 그의 성분을 분석하는 데 사용될 수 있는 장치를 제공한다. 일부 실시양태에서, 유의한 양의 생물학적 물질, 및 상응하게 개선된 신호 수준이 수득될 수 있다.
본 발명의 측면은 생물학적 유체 또는 물질로부터 세포외 매트릭스체 (EMB)의 조성 및 특성을 단리하고 보존하는 것을 포함한다. 생물학적 샘플, 유체 또는 물질로부터 단리 또는 추출된 세포외 매트릭스체 (EMB)의 조성 및 특성을 보존함으로써, EMB는 질환의 진단 또는 적응증에, 또는 샘플 물질의 화학적 또는 생물학적 과정 또는 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환 상태를 보다 용이하게 반영할 수 있는 세포외 매트릭스체를 검출하거나 특징화하는 증진된 능력을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용의 장치 및 방법은 특정 생물학적 분획을 질환 상태에 관련시키는 관련 바이오마커에 대한 증가된 신호를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 바이오마커는 질환과 연관될 수 있고, 진단 도구를 제공할 수 있다.
본 개시내용의 장치는 장치 내의 연속적이고 실질적인 유동을 유지함으로써 생물학적 성분을 함유하는 유체에서 유동 및/또는 압력의 개선된 측정을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적인 유동이 유지될 때, 센서는 차압 및 유동을 정확하게 측정할 수 있다. 본원에 개시된 장치 및 시스템은 연속적이고 실질적인 유동을 유지하는 채널의 배열에 의해 생물학적 성분을 함유하는 유체에서 유동 및 압력의 개선된 측정을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 장치는 시스템 내에서 연속적이고 실질적인 유동이 유지되도록 유체의 유동을 실질적으로 제한하지 않는 1개 이상의 채널을 가질 수 있다.
본원에 개시된 장치는 제한 채널에 추가로, 연속적이고 실질적인 유동을 유지하는 1개 이상의 균일한 유동 채널을 사용함으로써 생물학적 성분을 함유하는 유체에서 유동 및 압력의 개선된 측정을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 장치는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 1-90%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 1-75%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 1-50%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 1-25%를 가질 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 장치는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 적어도 25%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 적어도 50%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 적어도 75%, 또는 균일한 유동 채널로부터의 유동의 적어도 90%를 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 약 0.5 내지 약 5,000 마이크로미터 또는 그 초과의 직경 크기를 갖는 세포외 매트릭스체는 마이크로유체 채널 내에 보유될 수 있거나, 또는 채널에서 차단을 유발할 수 있어, 압력이 증가된다.
추가의 실시양태에서, 약 1 내지 약 200 마이크로미터 또는 그 초과의 직경 크기를 갖는 세포외 매트릭스체는 마이크로유체 채널에 보유될 수 있거나, 또는 채널에서 차단을 유발할 수 있어, 압력이 증가된다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 물질 또는 분자를 함유하는 유체의 초미세구조적 성분을 단리, 검출 및/또는 분석하기 위한 장치 및 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 초미세구조 성분은 질환과 연관될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 다중 및 특이적 바이오마커의 공급원인 세포외 매트릭스체 (EMB)를 단리, 추출 및 이용하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 용도를 위해 세포외 매트릭스체, 생물학적 입자 및 복합체의 조성물을 단리, 검출 및 분석하기 위한 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 세포외 매트릭스체는 그의 형태학적 특징을 통해 바이오마커로서 작용할 수 있다. 추가 측면에서, 세포외 매트릭스체는 질환 경로에서 제시될 수 있는 단리된 생화학적 마커를 함유함으로써 작동할 수 있다.
본 발명의 측면은 질환-연관 세포외 매트릭스체 (EMB) 및/또는 생물학적 입자 또는 복합체를 통해 바이오마커를 검출 및 측정하기 위한 장치를 포함하는 진단 시스템을 추가로 제공할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 물질의 샘플을 제조 및 분석하기 위한 방법 및 장치를 기재한다.
세포외 매트릭스체 (EMB)는 복합체일 수 있고, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 분자, 생체입자, 작은 소포, 예컨대 세포외 소포 또는 엑소솜, 및 그의 조합으로 구성될 수 있다.
생물학적 물질의 샘플은 체액, 조직 및 세포를 포함할 수 있다.
체액 샘플의 예는 전혈, 혈장, 혈액 성분, CSF, 소변, 정액, 활액, 흉막액, 질액, 위액, 심막액, 복막액, 양수, 타액, 비강액, 귀액, 모유, 및 임의의 다른 체액, 및 그의 조합을 포함한 임의의 체액을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 샘플로부터 생체입자를 단리 및 추출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 직경이 약 0.5 마이크로미터 초과 내지 직경이 약 5,000 마이크로미터인 입자, 또는 직경이 약 2 마이크로미터 초과 내지 직경이 약 700 마이크로미터인 입자인 세포외 매트릭스체 또는 복합체를 정제 또는 분리하는 데 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 생물학적 및 임상적 유체의 상대 점도 및 유동 특성을 측정하는 데 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 질환과 연관된 샘플로부터 생체입자를 단리 및 추출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 안구 유체에서 안내압을 측정하는 데 사용될 수 있다.
장치 및 시스템
본 발명은 유체 내의 압력 및/또는 유동을 측정하기 위한 마이크로유체 장치 및 시스템을 제공한다.
본 발명은 유동의 연속적이고 실질적인 속도 및 부피를 제공함으로써 유체 내의 유동 및 압력의 측정을 개선하여, 차압 및/또는 유동이 정확하게 측정될 수 있도록 한다.
추가 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 생체입자 또는 생물학적 물질 또는 유체의 다른 성분을 검출, 단리 및 추출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 생물학적 및 임상적 유체의 상대 점도 및 유동 특성을 측정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 기판에 유지될 수 있는 마이크로유체 칩을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 장애물을 갖는 채널을 가질 수 있다. 장애물은 채널 내의 유체의 유동에 영향을 미치고/거나 그를 제한할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 장애물 밴드를 갖는 채널을 가질 수 있다. 장애물 밴드는 채널의 폭을 횡단하여 장애물 밴드가 채널을 따라 유체 유동 및 플럭스에 영향을 미칠 것이다.
일부 실시양태에서, 장애물 사이의 간격은 밴드에서 일정할 수 있다. 채널 내의 장애물 사이의 간격은 유체 유동을 위한 채널 내의 천공부의 크기를 제어하는 데 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 다수의 순차적인 장애물 밴드를 갖는 채널을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 밴드 내의 장애물들 사이의 간격은 한 방향으로 채널의 길이를 따라 다수의 밴드에서 감소할 수 있다. 결과적으로, 밴드 내의 장애물들 사이의 간격은 반대 방향으로 채널의 길이를 따라 복수의 밴드에서 증가할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 마이크로유체 장치는 한 방향으로의 순서의 복수의 밴드가 장애물들 사이에 1,000 마이크로미터의 간격을 갖는 제한 채널을 가질 수 있으며, 이는 500 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 200 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 100 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 50 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 25 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 10 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접하고, 4 마이크로미터의 간격을 갖는 밴드에 인접한다.
추가 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 하나의 밴드에서 장애물들 사이의 간격이 최소인, 장애물 밴드를 갖는 채널을 가질 수 있다. 장애물들 사이에 최소의 간격을 갖는 밴드는 장벽 밴드일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 장벽 밴드가 장애물들 사이에 적어도 1 마이크로미터, 또는 적어도 2, 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 50, 또는 적어도 100, 또는 적어도 200 마이크로미터의 간격을 갖는 제한 채널을 가질 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 마이크로유체 장치는 높이가 7 내지 25 마이크로미터인 칩일 수 있다.
작동시, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 생체입자를 단리, 추출 및/또는 정제하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제한 채널은 장애물들 사이의 간격이 감소하는 밴드를 가질 수 있으며, 여기서 하나의 밴드는 장벽 밴드이다. 본 발명의 방법은 밴드의 이러한 배열을 사용하여, 입자를 함유하는 유체를 유입구로부터 채널의 유출구를 향해 간격이 감소하는 방향으로 유동시킴으로써 보다 작은 입자 및 유체로부터 보다 큰 입자를 단리할 수 있다. 이들 방법에서, 보다 큰 입자는 채널을 따라 단리 및 보유될 수 있는 반면, 보다 작은 입자 및 유체는 유출구에서 채널을 빠져나간다. 보다 큰 입자는 추출 유체의 유동 방향을 역전시켜 보다 큰 입자를 유입구로부터 추출함으로써 유입구에서 채널로부터 추출될 수 있다.
작동시, 본 발명의 마이크로유체 장치 및 시스템은 유출구에서 채널로부터 추출된 생물입자를 단리, 추출 및/또는 정제하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 보다 큰 입자는 보다 큰 입자를 파괴하기 위해 세제를 첨가하여 유출구에서 채널로부터 추출될 수 있다.
도 1은 본 발명의 마이크로유체 칩 실시양태의 평면도를 나타낸다. 이러한 포맷에서, 실리콘 웨이퍼 마스터 (101)는 3개의 마이크로유체 채널 칩 패턴 (103)으로 인쇄된다. 실리콘 웨이퍼 (101)를 기판으로서 사용할 수 있다. 포토레지스트를 기판 상에 붓고, UV 광에 노출시켜 마이크로유체 칩 (103)의 패턴을 형성할 수 있다. 이와 함께, 웨이퍼 및 포토레지스트는 PDMS를 부을 수 있는 금형을 형성한다. 일단 경화되면, PDMS를 금형으로부터 박리하여, 웨이퍼 당 마이크로유체 칩의 3개의 캐스트를 제공할 수 있다. 이들 캐스트는 유리 슬라이드에 부착되어 최종 마이크로유체 칩을 형성할 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 칩은 유체의 제한된 유동을 위한 채널, 및 유체 유동을 위한 유입구 및 유출구를 가질 수 있다. 펌프는 유입구에서 유체의 헤드 압력을 적용하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소된 또는 진공 압력을 유출구에서 사용하여 유동을 조정할 수 있다.
도 2는 본 발명의 장치의 한 실시양태에서의 마이크로유체 칩 삽입물의 평면도를 나타낸다. 칩은 이 예에서 각각 2,500 um 폭 및 25,000 um 길이의 2개의 제한 채널 (203)을 갖는다. 제한 채널 (203)은 원으로 나타낸 다양한 직경 및 간격의 기둥을 함유한다. 칩은 유동을 유의하게 제한하지 않는 균일한 크기 및 간격의 기둥을 갖는 제3의 균일한 유동 채널 (205)을 갖는다. 칩은 또한 보다 큰 기둥을 함유하는 유입구 저장소 (201) 및 유출구 저장소 (207)를 갖는다. 파선 화살표는 유입구 저장소로부터 유출구 저장소로의 유동 방향을 나타낸다. 제한 채널은 유동에 대한 장벽 (202)인, 유동에 대한 최대 제한 지점을 가질 수 있다. 차압 및/또는 유동이 유체의 조성과 관련될 수 있도록, 장벽 (202)은 유동을 제한하고 채널 및 시스템 내의 압력을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 칩은 유체의 제한된 유동을 위한 1개 이상의 채널, 및 1개 이상의 균일한 또는 연속 유동 채널을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 채널 내의 유체 유동에 대한 제한을 제시하지 않는다. 균일한 연속 유동 채널은 난류를 생성하기 위한 무딘 장애물 및/또는 유체를 유동시키기 위한 구불구불한 경로를 함유할 수 있다.
도 3은 도 2에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 3은 원으로 나타낸 다양한 크기의 PDMS 중합체성 기둥 (301)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
특정 실시양태에서, 무딘 또는 무디지 않은 장애물이 제한 유체 채널에 제공되어 특정 영역에서 구불구불한 또는 볼텍스 패턴의 유동을 생성할 수 있다. 채널 내의 장애물은 원형 또는 다른 형상의 기둥으로서 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제한 채널의 장애물은 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 10,000 초과, 또는 그 초과의 레이놀즈 수를 제공할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 연속적인 균일한 유동 채널은 다양한 제한 채널 사이에 위치할 수 있다. 특정 실시양태에서, 균일한 유동 채널 및 제한 채널은 임의의 배열 순서를 가질 수 있고, 임의의 수로 사용될 수 있다.
도 4는 도 2의 유입구 저장소에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 4는 원으로 나타낸 기둥 (401)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 5는 도 2의 유입구 저장소 영역에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 5는 원으로 나타낸 기둥 (501)을 나타낸다. 3개의 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
도 6은 도 2의 채널 영역에 상응하는 평면도를 나타낸다. 도 6은 원으로 나타낸 기둥 (601)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 본 발명의 마이크로유체 채널 장치는 난류 또는 제한된 유동을 생성하는 기둥 또는 장애물의 상이한 간격 및/또는 크기의 영역을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 마이크로유체 채널 장치는 안구 지주 메쉬를 시뮬레이션하는 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 장치는 세포외 매트릭스체 또는 복합체를 함유하는 메쉬워크 조성물을 포함할 수 있다. 메쉬워크 조성물에 사용하기 위한 세포외 매트릭스체 또는 복합체는 녹내장 안구액으로부터 추출 또는 정제될 수 있다. 안구액은 동물 또는 임상 공급원으로부터의 것일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 마이크로유체 칩은 유체의 제한된 유동을 위한 1개 이상의 채널 및 1개 이상의 균일한 유동 채널을 가질 수 있다. 균일한 유동 채널은 난류를 생성하기 위한 무딘 장애물 및/또는 유체를 유동시키기 위한 구불구불한 경로를 함유할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 마이크로유체 칩은 기판 상에 임의의 순서로 배열된, 유체의 제한된 유동을 위한 1-20개의 채널 및 1-10개의 균일한 유동 채널을 가질 수 있다. 균일한 유동 채널은 제한된 유동 채널에 대해 임의의 방식으로 분포될 수 있다.
특정 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 제한된 유동 채널에 대해 동일-선상 또는 평행 위치로 교대될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 제한된 유동 채널의 위 또는 아래에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 제한 유동 채널을 함유하는 칩과 별개의 기판에 배열될 수 있다.
추가 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 유입구 저장소로부터 유출구 저장소로의 유체 연통을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 유출구 저장소로부터 유입구 저장소로 들어가는 유체의 공급원으로의 유체 연통을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 균일한 유동 채널의 총 단면적은 본 발명의 마이크로유체 장치 내의 제한 유동 채널의 총 단면적보다 더 크거나 작을 수 있다. 다양한 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 장애물을 함유하지 않을 수 있고, 구불구불한 유체 유동을 갖지 않을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 균일한 유동 채널은 층류 또는 난류 유체 유동을 가질 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 칩은 유체의 제한된 유동을 위한 1개 이상의 제한 채널을 가질 수 있다. 제한된 유동은 채널 내의 무딘 또는 무디지 않은 장애물 또는 기둥의 다양한 배열로 인한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기둥은 유동 유체에 형상, 예컨대 원형, 구형, 삼각형, 정사각형, 다각형, 다이아몬드형, 지느러미형, 및 그의 조합을 나타낼 수 있다.
도 7은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 7은 원으로 나타낸 기둥 (701)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 제한 채널 내의 기둥 사이의 50 um 갭에서 25 um 갭으로의 전이를 나타낸다.
도 8은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 8은 원으로 나타낸 기둥 (801)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 제한 채널 내의 기둥 사이의 보다 큰 갭에서 보다 작은 갭으로의 전이를 나타낸다.
도 9는 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 9는 원으로 나타낸 기둥 (901)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다.
추가 실시양태에서, 채널에서의 제한된 유동은 채널에서의 무딘 또는 무디지 않은 장애물 또는 기둥의 다양한 배열로 인한 것일 수 있으며, 여기서 장애물의 크기 및 간격은 채널을 따라 거리에 따라 변화한다.
특정 실시양태에서, 제한 채널 내의 무딘 또는 무디지 않은 장애물 또는 기둥의 크기 및/또는 간격은 채널을 따른 거리에 따라 변할 수 있다. 무딘 또는 무딘 장애물의 크기 및/또는 간격은 채널을 따른 거리에 따라 감소할 수 있다. 제한 채널 내의 일부 위치에서, 무딘 또는 무디지 않은 장애물의 크기 및/또는 간격은 유동에 대한 최대 제한 또는 장벽을 제공하는 수준으로 감소될 수 있다.
도 10은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 10은 원으로 나타낸 기둥 (1001)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 도면은 난류를 생성할 수 있는 무딘 기둥 장애물 (1001)의 영역을 갖는 채널을 나타낸다.
도 11은 도 2의 유출구 저장소 (1107)에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 11은 다양한 크기의 기둥 (1101, 1103, 및 1105)을 나타낸다. 채널을 통한 생체액의 유동은 파선 화살표로 나타낸다. 이 실시양태에서, 외부 제한 채널은 각각 매우 작고 밀접하게-이격된 기둥에 의해 형성된 장벽 (1102)을 함유한다.
추가 실시양태에서, 제한 채널 내의 무딘 또는 무디지 않은 장애물 또는 기둥의 다양한 배열이 유동을 임의의 수준으로 제한하는 데 사용될 수 있다. 무딘 및/또는 무딘 장애물의 광범위한 간격 및/또는 패턴이 제한 채널에 사용될 수 있다. 유체는 제한 유동 채널 내에 구불구불한 경로를 가질 수 있다. 제한 채널 내의 장애물의 간격 및/또는 유체 경로의 구불구불함은 유동 방향으로 채널을 따른 거리에 따라 증가할 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 칩의 채널로부터의 유체 유출물은 채널의 유출구 말단에서 유출구 저장소 내에 수집될 수 있다. 본 발명의 마이크로유체 칩의 채널로의 유체의 유입 또는 삽입은 채널의 유입구 말단에서 저장소에 의해 달성될 수 있다.
도 12는 도 2의 유입구 저장소 (1201)에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 12는 다양한 크기의 기둥 (1203)을 나타낸다. 외부 제한 채널 (1207)은 다양한 크기 및 간격의 기둥을 함유한다. 균일한 유동 채널 (1205)은 균일한 크기 및 간격의 기둥을 함유한다. 외부 채널을 통한 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 13은 본 발명의 장치의 한 실시양태에서의 마이크로유체 칩의 평면도를 나타낸다. 3개의 마이크로유체 삽입물이 도시되어 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 14는 무딘 기둥 장애물 (1401)이 유동하는 본 발명의 마이크로유체 채널 장치의 실시양태의 사시도를 나타낸다. 도 14는 도 15의 확대도이다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 15는 본 발명의 마이크로유체 채널 장치의 실시양태의 사시도를 나타낸다. 도 15는 도 2의 채널 영역에 상응하는 도면을 나타낸다. 도 15는 제한 채널 내의 다양한 간격의 기둥 장애물 (1501)을 나타낸다. 이 실시양태에서, 제한 채널은 기둥 사이의 다양한 간격의 밴드로 조직화된 기둥 장애물 (1501)을 가질 수 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다. 연속적인 균일한 유동 채널 (1517)은 제한 채널 (1515)로부터 분리되어 배열될 수 있다.
도 16은 본 발명의 마이크로유체 칩 실시양태의 측면 입면도를 나타낸다. 유입구 저장소 (1605)는 저장소 내로 생체액 및/또는 다른 유체를 도입하기 위해 유체 라인 (1601)과 유체 연통한다. 유체 라인 (1601)은 유리 커버 슬라이드에 한정된 프로브 (1602), 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)을 통과한다. 생체액은 유입구 저장소 (1605)를 통과하여 마이크로유체 채널 (1606)에 도달한다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 17은 도 2의 유입구 영역에 상응하는 확대 평면도 및 도 16의 프로브 (1602)의 위치를 나타낸다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 18은 본 발명의 마이크로유체 칩 (1614) 실시양태의 측면 입면도를 나타낸다. 유입구 저장소는 저장소로 생체액을 도입하기 위한 유체 라인 (1601)과 유체 연통한다. 유체 라인 (1601)은 유리 커버 슬라이드 (1613)에 한정된 프로브 (1602), 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)을 통과한다. 생체액은 유입구 저장소를 통과하여 마이크로유체 채널 (1606)에 도달하고, 유출구 저장소 (1607)로 유동한다. 프로브 조정기 (1612)는 프로브 (1602)의 높이를 조정하여 프로브 어댑터 (1603) 및 홀 (1604)과의 우수한 밀봉을 생성하도록 제공될 수 있다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 19는 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도를 나타낸다. 도 19는 원으로 나타낸 기둥 (1701)을 나타낸다. 이 실시양태에서, 채널 내의 기둥 밴드의 영역의 일부 대표적인 길이는 마이크로미터로 나타낸다.
도 20은 도 2의 채널 영역에 상응하는 확대 평면도의 현미경사진을 나타낸다. 도 20은 기둥을 점으로 나타낸다. 이 실시양태에서, 채널 내의 밴드 내의 기둥의 일부 대표적인 간격이 마이크로미터로 제시된다. 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다.
도 21은 도 2에 상응하는 마이크로유체 장치의 한 실시양태의 평면도를 나타낸다. 도 21은 생체액이 전달 프로브 (2201)와 함께 유입구 영역 저장소 (2202)로 도입될 수 있음을 나타낸다. 유출구 저장소 영역 (2203)으로의 생체액의 유동 방향은 파선 화살표로 나타낸다. 이 실시양태의 확대도는 채널 내의 밴드 내의 기둥의 일부 대표적인 간격을 마이크로미터로 나타낸다. 이 실시양태의 경우, 확대도에서의 점선은 장애물 중 생체액의 가능한 구불구불한 경로를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 마이크로유체 시스템의 실시양태를 나타낸다. 프로세서 (102)는 제어 신호를 전송할 수 있고/거나 압축 가스와 같은 구동 유체를 유체 공급원 유닛 (103)에 제공하는 유체 구동 유닛 (101)으로부터 신호를 수신할 수 있다. 유체 공급원 유닛 (103)은 관심 유체, 생체액, 담체, 및/또는 시약을 포함할 수 있다. 관심 유체, 생체액, 담체 및/또는 시약은 센서 유닛 (105)으로 유동할 수 있으며, 이는 유체의 유량 및/또는 압력을 모니터링할 수 있다. 관심 유체, 생체액, 담체 및/또는 시약은 본 발명의 마이크로유체 장치를 포함할 수 있는 온-칩 유닛 (107)으로 유동할 수 있다. 관심 유체, 생체액, 담체 및/또는 시약은 온-칩 유닛 (107) 내의 본 발명의 마이크로유체 칩의 유입구 저장소에 진입할 수 있다. 관심 유체, 생체액, 담체 및/또는 시약은 온-칩 유닛 (107) 내의 본 발명의 마이크로유체 칩의 유출구 저장소에 도달하여 오프-칩 유닛 (109)으로 유동할 수 있다. 프로세서 (102)는 센서 유닛 (105)으로부터 데이터를 수신하고, 유동 및/또는 압력을 기록할 수 있다. 온-칩 유닛 (107)은 분광측정법을 위한 조사 및 광 검출기와 같은 분석 도구를 포함할 수 있다. 오프-칩 유닛 (109)은 다양한 분석 도구, 예컨대 현미경검사 도구, 영상화기 및 분석기, 크로마토그래피 분석기, 질량 분광측정 분석기 및/또는 자기 공명 분석기를 포함할 수 있다. 프로세서 (102)는 온-칩 유닛 (107) 및 오프-칩 유닛 (109)으로부터 제어 신호를 전송하고/거나 데이터를 수신할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 시스템 또는 장치 내의 유체 조성물은 다양한 기술에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 유체 조성물은 영상화 기술에 의해 분석될 수 있다.
영상화 기술의 예는 전자 현미경검사, 입체 현미경검사, 광시야 현미경검사, 편광 현미경검사, 위상 대조 현미경검사, 다광자 현미경검사, 시차 간섭 대조 현미경검사, 형광 현미경검사, 레이저 주사 공초점 현미경검사, 다광자 여기 현미경검사, 광선 현미경검사 및 초음파 현미경검사를 포함한다.
영상화 기술의 예는 양전자 방출 단층촬영, 컴퓨터 단층촬영 및 자기 공명 영상화를 포함한다.
검정 기술의 예는 비색 검정, 화학발광 검정, 분광광도측정법, 면역형광 검정 및 광 산란을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유체 조성물의 압력 및 유량을 측정하기 위한 장치를 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 유동에 대한 저항을 제공하기 위해 채널 내에 머무르는 메쉬워크 조성물을 가질 수 있다. 메쉬워크 조성물은 포도막 메쉬워크, 각막공막 메쉬워크, 및 누소관근접부 메쉬워크 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다. 이러한 메쉬워크는, 예를 들어 제한 채널에서의 장애물로 시뮬레이션될 수 있거나, 또는 안구액, 체액 또는 임상 샘플의 추출로부터 제공될 수 있다.
메쉬워크 조성물에 사용하기 위한 세포외 매트릭스체 또는 복합체는 다양한 생체분자 또는 복합체화된 입자로 구성될 수 있고, 약 0.5 내지 약 5,000, 또는 0.5 내지 1,000, 또는 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 50, 또는 1 내지 25, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5 마이크로미터 범위의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 장치에서 단리될 수 있는 세포외 매트릭스체 또는 복합체는 약 0.5 내지 약 5,000, 또는 0.5 내지 1,000, 또는 2 내지 700, 또는 1 내지 200, 또는 1 내지 100, 또는 1 내지 50, 또는 1 내지 25, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5 마이크로미터 범위의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 채널은 장애물, 예컨대 유리 비드, 마이크로 비드, 자기 비드, 겔 입자, 덱스트란 입자, 또는 중합체 입자를 함유할 수 있다. 장애물은 또한 유리 섬유, 중합체 섬유, 무기 섬유, 유기 섬유 또는 금속 섬유로 구성될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 장치 또는 채널은 샘플 유체와 유체 연통하는 장치의 요소에 부착된 결합제, 친화도 검출기 또는 면역제를 포함할 수 있다. 장치는 샘플로부터의 생물학적 분자의 내부 포획 및/또는 검출을 위한 작용제를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치는 샘플 유체의 바이오마커의 내부 포획 및/또는 검출을 위한 작용제를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 포도막 메쉬워크 또는 제한 채널은 약 25 마이크로미터의 천공부를 가질 수 있다. 각막공막 메쉬워크 또는 제한 채널은 약 2-15 마이크로미터의 천공부를 가질 수 있다. 누소관근접부 메쉬워크 또는 제한 채널은 약 1 내지 4 마이크로미터 이하의 천공부를 가질 수 있다.
장치는 유체 조성물을 유지하기 위한 유체 저장소를 추가로 포함하여, 유체 저장소가 채널의 유입구로 유체 조성물을 도입하기 위한 채널의 유입구와 유체 연통하도록 할 수 있다.
본 개시내용의 장치는 구동 유체 조성물에 압력을 적용하기 위한 구동 또는 압력 공급원을 가질 수 있다. 구동 유체는 유체 조성물을 마이크로유체 채널의 유입구로 구동하기 위한 유체 저장소로 들어갈 수 있다.
본 발명의 장치는 채널의 유입구에서 유체 조성물의 유량 및 압력을 측정하고 유량 및 압력을 프로세서에 전송하기 위해 유체 조성물과 유체 연통하는 센서 유닛을 가질 수 있다.
시스템 장치의 유닛으로부터의 신호 및 데이터는 프로세서에 의해 수신될 수 있다. 프로세서는 유량 및 압력을 디스플레이할 수 있다. 메모리 또는 매체는 명령 또는 파일을 저장할 수 있으며, 예컨대 기계-판독가능 저장 매체이다. 기계-판독가능 저장 매체는 비-일시적일 수 있다.
본 개시내용의 프로세서는 범용 또는 특수 목적 컴퓨터일 수 있다. 프로세서는 기계 판독가능 저장 장치 또는 매체에 저장된 명령을 실행할 수 있다. 프로세서는 집적 회로 칩, 마이크로프로세서, 제어기, 디지털 신호 프로세서를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 데이터를 수신 및/또는 전송하고 저장된 명령을 실행하는 데 사용될 수 있다. 프로세서는 또한 계산을 수행하고, 데이터를 변환하고/거나, 데이터를 메모리, 매체 또는 파일에 저장할 수 있다. 프로세서는 본 발명의 방법의 1개 이상의 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있는 명령을 수신 및 실행할 수 있다. 본 발명의 장치는 1개 이상의 비-일시적 기계-판독가능 저장 매체, 1개 이상의 프로세서, 1개 이상의 메모리 장치, 및/또는 1개 이상의 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 프로세서는 데이터 또는 변환된 데이터를 디스플레이하기 위한 일체형 디스플레이를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 시스템은 마이크로유체 채널을 갖는 장치를 가질 수 있다. 1개 이상의 채널이 마이크로유체 칩에 배열될 수 있다.
본 개시내용의 시스템은 채널 내의 또는 채널의 유입구에서의 또는 채널의 유출구를 빠져나가는 유체 조성물을 분석하기 위한 1개 이상의 검출기를 갖는 온-칩 유닛을 포함할 수 있다. 검출기는 또한 채널 내의 유체 조성물을 검출하도록 배열될 수 있다.
본 개시내용의 시스템은 마이크로유체 채널로부터 추출된 유체 조성물을 분석하기 위한 1개 이상의 검출기를 갖는 오프-칩 유닛을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 시스템 또는 장치에서 메쉬워크 조성물에 사용하기 위한 세포외 매트릭스체 또는 복합체는 구조물을 안정하고 균일한 조성물로 변형시킬 수 있는 고정제, 안정화 성분 또는 가교 성분을 포함할 수 있다.
안정화 성분의 예는 본원에 기재된 바와 같은 고정제, 본원에 기재된 바와 같은 가교 화합물, 유기 용매, 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 유기 염을 포함한다.
가교되는 세포외 매트릭스체 또는 복합체는 가역적으로 가교되거나, 또는 비-가역적으로 가교될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 장치는 활성제를 확인 또는 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 메쉬워크 조성물로서 세포외 매트릭스체 또는 복합체를 함유할 수 있다. 메쉬워크 조성물은 약물 전달 부형제를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 장치는 시험 샘플 내의 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 시험 샘플에서 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준을 측정하는 것은 시험 샘플에 대한 진단 마커 수준을 제공할 수 있다. 본 발명의 장치는 대상체에서 녹내장 또는 녹내장전증을 확인하는 데 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 장치는 시험 샘플 내의 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준에 관련될 수 있는 압력을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 채널 내의 압력 값은 시험 샘플 내의 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준에 직접 관련될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 장치는 시험 샘플 내의 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준에 관련될 수 있는 검정 값을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 채널 내의 조성물의 검정 값은 시험 샘플 내의 세포외 매트릭스체 또는 복합체의 양 또는 수준에 직접 관련될 수 있다.
검정의 예는 비색 검정, 화학발광 검정, 분광광도측정 검정, 면역검정 또는 광 산란 검정을 포함한다.
마이크로유체 장치에서 샘플을 분석하기 위한 수단은 분석 도구, 예컨대 분광측정법 및 분광분석법을 위한 조사원 및 광 검출기, 뿐만 아니라 면역-표지 및 검출을 포함하며, 이는 본원의 실시예에서 추가로 제시된다.
마이크로유체 장치에서 샘플을 분석하기 위한 수단은 본원의 실시예에 추가로 제시된 바와 같은 영상화 도구, 예컨대 조사원 및 현미경검사를 포함한다.
추출된 조성물 및 방법
일부 실시양태에서, 조성물은 마이크로유체 장치로부터 추출된 생물학적 샘플의 분획을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 마이크로유체 장치로부터 추출된 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 마이크로유체 장치로부터 추출된 조성물은 대상체의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다.
단리된 및/또는 추출된 세포외 매트릭스체의 조성물은 제약 담체 및 1개 이상의 제약 부형제와 조합될 수 있다.
단리 및/또는 추출된 세포외 매트릭스체의 형태는 단리 및/또는 추출 공정에 의해 변형될 수 있다.
단리 및/또는 추출된 세포외 매트릭스체의 형태는 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스체의 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위해 단리 및/또는 추출될 수 있다.
추가 실시양태에서, 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한 단리 및/또는 추출 과정에 의해 세포외 매트릭스체가 제거된 샘플을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플의 세포외 매트릭스체의 적어도 25%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 90%가 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한 단리 및/또는 추출 과정에 의해 제거되었다.
일부 측면에서, 마이크로유체 장치로부터 조성물을 추출하는 것은 대상체의 진단 또는 예후에 사용하기 위한 생물학적 샘플을 제조하는 방법일 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포외 매트릭스체를 단리하는 방법은 한외여과 또는 원심분리에 의해, 또는 본 개시내용의 마이크로유체 장치에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교를 사용하여 유리 표면 상에 세포외 매트릭스체를 고정시키는 것을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 언급된 특허, 특허 출원 공개 및 비-특허 공개를 포함한 모든 공개물은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 명백하게 포함된다.
상기 개시내용은 이해의 명료함을 위해 예로서 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 본 개시내용에 의해 이해되고, 제한이 아닌 예시로서 제시된 첨부된 청구범위의 범주 내에서 과도한 실험 없이 실시될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 추가의 실시양태, 등가물 및 변형을 포함한다. 본 발명은 다양한 예시적 성분, 실시예 및 청구된 실시양태의 특색, 물질, 요소 또는 제한의 임의의 조합 또는 혼합물을 포함한다.
본 발명 및 청구범위를 기재하는 단수 용어 및 유사한 용어는 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1. 질환-연관 생체액을 사용한 마이크로유체 장치에서의 압력 및 유동 측정. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리. 도 23은 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터의 방수가 마이크로유체 장치 내의 압력을 증가시켰다는 것을 나타낸다. 도 23은 중증 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터 수득된 인간 방수 주입시 마이크로유체 모델 섬유주 내에서의 압력 (mm Hg) 변화의 상대량을 나타낸다. 마이크로유체 채널 유량을 분당 2 μl로 일정하게 유지하고, 기준선 시스템 압력을 외부 압력 센서를 사용하여 측정하였다. 인간 방수 샘플을 화살표 및 문자 "a"에 의해 표시된 시점에 주사하였다. 압력은 27분에 최대 약 41 mm Hg로 꾸준히 상승하였다. 도 23은 POAG 녹내장으로 진단된 환자로부터의 방수가 장치 내 압력을 증가시켰음을 나타낸다.
실시예 2. 마이크로유체 장치에서의 질환-연관 세포외 매트릭스체의 단리. 도 24 (상부)는 도 23에 나타낸 실험의 종료시에, 원발성 개방각 녹내장을 갖는 환자로부터의 인간 방수로부터 EMB를 단리한 후의 마이크로유체 칩의 공초점 현미경사진을 나타낸다. 도 24 (상부)는 방수 중 단백질 함량이 형광 마커인 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르로 표지된 것을 나타낸다 (화살표). 원은 제한 채널 내의 기둥이다. 도 24 (하부)는 기둥 사이에 포획된 마이크로유체 채널에서 단리된 EMB를 나타낸다 (화살표).
실시예 3. 크기 배제 필터를 사용한 생체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 단리. 본 실시예는 EMB가 크기 배제에 의해 단리될 수 있음을 나타낸다. EMB는 크기 배제에 의해 단리되고, 보다 작은 입자, 예를 들어 유리 세포외 소포 또는 다른 작은 소포와 구별될 수 있다.
도 25는 크기 배제 필터를 사용한 생체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 단리를 보여준다. 소 유리체액을 5 μm 셀룰로스 아세테이트 시린지 필터, 이어서 1 μm 시린지-팁 필터, 및 후속적으로 0.45 um 시린지-팁 필터, 및 이어서 0.22 μm 필터로 여과하였다. 각각의 분획을 광시야 현미경검사를 사용하여 특징화하였다.
도 26은 크기 배제 필터에 의한 EMB의 단리를 위한 대표적인 광시야 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 26a 및 도 26b는 소 유리체액의 천연 생체액에 존재하는 세포외 매트릭스체의 존재를 나타낸다. 복합 생체액으로부터 세포외 매트릭스체를 단리 및 회수하기 위해, 연속 시린지-기반 여과를 5 μm 내지 0.22 μm 세공 크기의 셀룰로스 필터로 수행하였다. 세포외 매트릭스체를 EDC로 유리 슬라이드에 고정시키고, 알시안 블루 염색으로 염색하였다. 도 26c는 5 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26d는 1 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26e는 0.45 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 도 26f는 0.22 μm 시린지-팁 필터를 통한 연속 여과에 의해 단리된 소 유리체 분획을 나타낸다. 영상은 여과물이 보다 작은 필터 크기를 통해 연속적으로 통과함에 따라 보다 큰 ECM 바디의 상대적 감소를 나타낸다.
본 실시예는 EMB가 크기 배제에 의해 단리될 수 있음을 나타낸다. 단리된 EMB의 분석은 그것이 세포외 매트릭스의 성분인 DNA, RNA 및 단백질, 뿐만 아니라 히알루론산 또는 콜라겐으로 구성되었음을 보여주었다.
유리체액은 본질적으로 세포외 매트릭스로 구성된, 물 함량이 98-99.7%인 고도로 수화된 조직이다. 세포외 매트릭스의 주요 성분은 단백질 콜라겐이다. 콜라겐 단백질은 탄수화물로 변형되고, 세포로부터 방출되면, 콜라겐 원섬유로 조립된다. 세포외 매트릭스체는 세포외 매트릭스 내의 다른 위치 중에서 원섬유에 부착될 수 있다.
소 눈을 절개하여 안구에 부착된 안와 지방 및 외안근을 제거하였다. 안구를 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl (pH 8.0)을 함유하는 빙냉 트리스 완충 염수 (TBS) 5 ml로 4℃에서 1분 동안 헹구었다. 유리체를 16 g 바늘을 사용하여 윤부의 4 mm 또는 8 mm 후방에 공막절개술 절개부를 만든 다음, 가위로 원주 시상 절개부를 만들어 안구를 전방 및 후방 컵으로 분리함으로써 절개하였다. 가위를 사용하여 형성된 유리체를 절단 및 제거하고, 유리체와 안구 구조 사이의 유착을 절단하였다. 조직 샘플을 TBS (pH 8.0)로 1분 동안 4℃에서 헹구었다. 유리체 시편을 15 mL 원심분리 튜브에 수집하고, 침지 블렌더를 사용하여 균질화하였다. 균질화된 소 유리체액 (BVH)의 분취물을 1 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 소 유리체를 추가의 연구를 위해 TBS 완충제 중에 재현탁시키고, 사용시까지 -80℃에서 동결시켰다.
완충 염수로 1 mL로 희석된 균질화된 소 유리체액의 분취물을 22-게이지 바늘을 사용하여 1 mL 시린지 내에 로딩하였다. 바늘을 5 μm 셀룰로스 아세테이트 시린지 필터로 대체하고, 소 유리체액을 균일한 하향 압력을 적용함으로써 필터를 통해 압출하였다. 여과물을 새로운 1 mL 튜브에 수집하고, 80 μL 분취량의 여과물을 영상화를 위해 저장하였다. 이어서, 5 μm 여과로부터 수집된 여과물을 상기 기재된 동일한 절차에 따라 1 μm 시린지-팁 필터 내에 로딩하고, 영상화를 위해 분취물을 저장하였다. 다음에, 1 μm 필터로부터의 여과물을 동일한 절차에 따라 0.45 um 시린지-팁 필터를 통해 압출하고, 영상화를 위해 분취물을 저장하였다. 최종적으로, 0.45 μm 필터로부터의 여과물을 0.22 μm 필터를 통해 압출하였다. 여과물을 각각의 여과 단계로부터 회수하였다.
광시야 현미경검사를 사용하여 각각의 분획의 성분을 가시화하였다. 각각의 샘플을 유리 슬라이드 상에 생체액을 놓고, 샘플을 EDC로 가교시키고, 히알루론산-함유 물질을 알시안 블루로 염색함으로써 영상화하였다. 샘플의 염색을 위해, 각각의 여과물을 1:1 v/v로 1% 알시안 블루 (3% 아세트산 pH 2.5 B8483 중 시그마(Sigma) 1% 알시안 블루)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 40 μL의 염색된 여과물을 유리 슬라이드 상에 놓고, 커버슬립으로 덮고, 명시야 현미경검사를 사용하여 영상화하였다. 악시오캠(Axiocam) 105 컬러 카메라 (자이스(Zeiss))가 장착된 역위상 대조 현미경 (자이스 악시오베르트(Ziess Axiovert) 200) 상에서 컬러 명시야 영상을 포착하고, 젠(Zen) 소프트웨어 (자이스, 버전 4.3)로 영상을 프로세싱하였다.
실시예 4. 연속 원심분리를 사용한 생체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 단리. 본 실시예는 EMB가 원심분리에 의해 단리될 수 있음을 나타낸다. EMB는 원심분리에 의해 단리되고, 보다 작은 입자, 예를 들어 유리 엑소솜 또는 다른 작은 소포와 구별될 수 있다. 세포가 없는 유리체 시편을 수득하기 위해, 유리체를 먼저 일련의 저속 원심분리로 정화하였다.
도 27은 원심분리를 사용하여 생체액으로부터 세포외 매트릭스체를 단리하는 방법을 도시한다. 4개의 펠릿 (9705, 9713, 9721 및 9729)을 연속 원심분리에 의해 수득하였다. 소 유리체를 재현탁시키고 (9701), 1 ml 튜브에 넣고, 350 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 (소르발 레전드(Sorvall Legend) RT) 펠릿 1 (9705)을 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 1 (9709)로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 2000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 (에펜도르프(Eppendorf), 5417R 시리즈, F45-30-11 에펜도르프 로터) 펠릿 2 (9713)를 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 2 (9717)로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 10,000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿 3 (9721)을 형성하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 3 (9725)으로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 20,000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿 4 (9729)를 수득하였다. 상청액의 50 μl 분취물을 분석을 위해 저장하고, 상청액 4로 표지하고, 나머지 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다.
도 28은 연속 원심분리에 의한 EMB의 단리를 위한 대표적인 투과 전자 현미경검사 (TEM) 영상을 나타낸다. 도 28a는 소 유리체액에 존재하는 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 28b에서, 450 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 마찬가지로, 도 28c에서, 2,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 도 28d에서, 10,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다. 도 27e에서, 20,000 g에서의 원심분리 후에 펠릿으로부터 수집된 샘플의 대표적인 TEM 현미경사진은 펠릿 분획에 존재하는 세포외 매트릭스체를 보여주었다.
실시예 5. 녹내장 모델에서 안내압을 감소시키는 데 있어서 작용제의 활성을 검출하기 위한 마이크로유체 장치에서의 용량-반응. 안내압 (IOP)에 대한 비발리루딘 TFA의 용량-반응 거동을 녹내장을 치료하는 데 있어서 활성제로서의 그의 용도에 대해 결정하였다. 비발리루딘 TFA는 소 유리체액의 치료에 대해 1.2 nM의 EC50을 나타냈다.
화합물 비발리루딘 TFA를 마이크로유체 칩 장치에서 소 유리체액 (BVH) 중에서 시험하였다. PBS 완충제 중 25% 균질화된 BVH의 용액을 제조하고, 동등량의 화합물의 용액으로 희석하여, 총 BVH 농도가 12.5%가 되도록 하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 완충제 또는 10% 에탄올을 함유하는 PBS 또는 DMSO의 대조군을 사용하고, 동일한 조건 하에 BVH와 함께 인큐베이션하였다.
시험 화합물-BVH 용액을 마이크로유체 칩 장치의 저장소에 도입하고, 유량 및 압력 변화를 기록하였다. 다양한 농도의 화합물을 소 유리체액의 치료에 대한 효과에 대해 시험하였다. 각각의 시험 용액 7 ul를 샘플 주입기를 통해 마이크로유체 칩 내로 주입하였다. 유량 및 압력 변화의 기록을 샘플 주입 후 추가 50분 동안 계속하였다. 실험의 전체 과정에 대한 칩 압력의 상대 변화를 수득하였다.
도 29는 화합물 비발리루딘 TFA를 사용한 소 유리체액의 치료에 대한 용량 의존성 반응 곡선을 나타낸다. EC50 값을 화합물의 마이크로몰 농도의 로그 함수가 반수-최대 반응을 생성하는 x-축 상의 점으로서 취하였다. 약물의 마이크로몰 농도의 로그 함수를 y 축 상의 최대 반응의 퍼센트에 대해 x 축 상에 플롯팅하였다. 최고 약물 농도에 대한 반응의 값을 취하여 최대 반응을 얻었다. 반응은 각각의 농도에 대해 대조군과 시험 값 사이의 절대차를 취함으로써 계산하였다.
실시예 6. 녹내장 모델에서 안내압을 감소시키는 데 있어서 작용제의 활성을 검출하기 위한 마이크로유체 장치에서의 용량-반응. 안내압 (IOP)에 대한 콜리스틴 술페이트의 용량-반응 거동을 녹내장을 치료하는 데 있어서 활성제로서의 그의 용도에 대해 결정하였다. 콜리스틴 술페이트는 소 유리체액의 치료에 대해 0.36 nM의 EC50을 나타냈다.
화합물 콜리스틴 술페이트를 마이크로유체 칩 장치에서 소 유리체액 (BVH) 중에서 시험하였다. PBS 완충제 중 25% 균질화된 BVH의 용액을 제조하고, 동등량의 화합물의 용액으로 희석하여, 총 BVH 농도가 12.5%가 되도록 하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 완충제 또는 10% 에탄올을 함유하는 PBS 또는 DMSO의 대조군을 사용하고, 동일한 조건 하에 BVH와 함께 인큐베이션하였다.
시험 화합물-BVH 용액을 마이크로유체 칩 장치의 저장소에 도입하고, 유량 및 압력 변화를 기록하였다. 다양한 농도의 화합물을 소 유리체액의 치료에 대한 효과에 대해 시험하였다. 각각의 시험 용액 7 ul를 샘플 주입기를 통해 마이크로유체 칩 내로 주입하였다. 유량 및 압력 변화의 기록을 샘플 주입 후 추가 50분 동안 계속하였다. 실험의 전체 과정에 대한 칩 압력의 상대 변화를 수득하였다.
도 30은 화합물 콜리스틴 술페이트를 사용한 소 유리체액 녹내장 모델의 치료에 대한 용량 의존성 반응 곡선을 나타낸다. EC50 값을 화합물의 마이크로몰 농도의 로그 함수가 반수-최대 반응을 생성하는 x-축 상의 점으로서 취하였다. 약물의 마이크로몰 농도의 로그 함수를 y 축 상의 최대 반응의 퍼센트에 대해 x 축 상에 플롯팅하였다. 최고 약물 농도에 대한 반응의 값을 취하여 최대 반응을 얻었다. 반응은 각각의 농도에 대해 대조군과 시험 값 사이의 절대차를 취함으로써 계산하였다.
실시예 7. 녹내장 모델에서 안내압을 감소시키는 데 있어서 작용제의 활성을 검출하기 위한 마이크로유체 장치에서의 용량-반응. 안내압 (IOP)에 대한 폴리믹신 B 술페이트의 용량-반응 거동을 녹내장을 치료하는 데 있어서 활성제로서의 그의 용도에 대해 결정하였다. 폴리믹신 B 술페이트는 소 유리체액 녹내장 모델의 치료에 대해 4.3 nM의 EC50을 나타냈다.
화합물 폴리믹신 B 술페이트를 마이크로유체 칩 장치에서 소 유리체액 (BVH) 녹내장 모델에서 시험하였다. PBS 완충제 중 25% 균질화된 BVH의 용액을 제조하고, 동등량의 화합물의 용액으로 희석하여, 총 BVH 농도가 12.5%가 되도록 하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 완충제 또는 10% 에탄올을 함유하는 PBS 또는 DMSO의 대조군을 사용하고, 동일한 조건 하에 BVH와 함께 인큐베이션하였다.
시험 화합물-BVH 용액을 마이크로유체 칩 장치의 저장소에 도입하고, 유량 및 압력 변화를 기록하였다. 다양한 농도의 화합물을 소 유리체액의 치료에 대한 효과에 대해 시험하였다. 각각의 시험 용액 7 ul를 샘플 주입기를 통해 마이크로유체 칩 내로 주입하였다. 유량 및 압력 변화의 기록을 샘플 주입 후 추가 50분 동안 계속하였다. 실험의 전체 과정에 대한 칩 압력의 상대 변화를 수득하였다.
도 31은 화합물 폴리믹신 B 술페이트를 사용한 소 유리체액 녹내장 모델의 치료에 대한 용량 의존성 반응 곡선을 나타낸다. EC50 값을 화합물의 마이크로몰 농도의 로그 함수가 반수-최대 반응을 생성하는 x-축 상의 점으로서 취하였다. 약물의 마이크로몰 농도의 로그 함수를 y 축 상의 최대 반응의 퍼센트에 대해 x 축 상에 플롯팅하였다. 최고 약물 농도에 대한 반응의 값을 취하여 최대 반응을 얻었다. 반응은 각각의 농도에 대해 대조군과 시험 값 사이의 절대차를 취함으로써 계산하였다.
실시예 8. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 추출. 마이크로유체 장치를 사용하여 소 유리체 세포외 매트릭스체를 단리하였다. 단리 후, 바디를 추출하였다.
도 32는 본 개시내용의 마이크로유체 장치의 제한 채널 내의 세포외 매트릭스체의 단리를 나타낸다. 도 32a 및 도 32a는 소 유리체액으로 관류된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 문자 "p"는 채널 내의 기둥을 표시한다. 관류 후에, 세포외 매트릭스체를 기둥 사이 및 주변에서 단리하였다. 도 32c 및 도 32d는 세포외 매트릭스체를 추출한 후의 채널의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 세포외 매트릭스체를 온화한 세제, 1% 소듐 도데실 술페이트, SDS, 및 유입구 포트로부터의 유동 역전을 사용하여 칩으로부터 추출하였다. 세포외 매트릭스체는 칩으로부터 이탈되었으며, 이는 추출 후에 실질적으로 더 적은 바디를 나타냈다.
실시예 9. 프로테옴 프로파일에 의한 세포외 매트릭스체에 대한 바이오마커의 검출. 소 유리체 세포외 매트릭스체를 단리하고, LC/MS를 사용하여 그의 프로테옴 프로파일 오프-칩에 대해 분석하였다.
도 33은 LC/MS에 의한 소 세포외 매트릭스체의 오프-칩 프로테옴 분석을 나타낸다. 세포외 매트릭스체에 대한 바이오마커를 검출하였다.
농축된 소 유리체 세포외 매트릭스 응집체 펠릿을 50 μl의 1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS, 시그마) 중에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 25 Kg 원심분리를 사용하여 다시 펠릿화하였다. 펠릿을 20 μl의 2X SDS, 50 mM 디티오트레이톨 (DTT) 환원제 중에 가용화시키고, 10분 동안 초음파처리하고, 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 펠릿 및 상청액 둘 다를 NuPAGE 10% 비스-트리스 겔(Bis-Tris Gel) (1.5 mmX10 웰, 인비트로젠(Invitrogen)) 내로 전기영동에 적용하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색하였다. 겔의 사진을 포착하고, 저장한 다음, 겔을 추가의 분석을 위해 탈염색하였다.
각각의 겔 밴드를 60℃에서 30분 동안 10 mM DTT를 사용한 환원, 암실에서 실온에서 45분 동안 20 mM 아이오도아세트아미드를 사용한 알킬화에 적용하였다. 샘플을 0.2 μg 트립신 (서열분석 등급, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) Cat#90058)으로 소화시키고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 펩티드를 5% 포름산, 60% 아세토니트릴로 2회 추출하고, 진공 하에 건조시켰다.
이클립스(Eclipse) (써모피셔)와 인터페이스된 나노 LC-MS/MS (디오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate) 3000 RLSCanon 시스템, 써모피셔)를 사용하여 LC-MS에 의해 샘플을 분석하였다. 12.5 μl의 겔-내 소화된 샘플 펠릿 중 3 μl를 융합 실리카 트랩 칼럼 (어클레임 펩맵(Acclaim PepMap) 100, 75 um x 2 cm, 써모피셔) 상에 로딩하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 5 μl/분으로 5분 동안 세척한 후, 트랩 칼럼을 LC-MS/MS를 위한 분석 칼럼 (나노이즈(Nanoease) MZ 펩티드 BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 250 mm, 워터스)과 인-라인으로 가져왔다. 펩티드를 30분 내에 4-15% B (여기서 A: 0.2% 포름산, 및 B: 0.16% 포름산, 80% 아세토니트릴), 40분 내에 15-25%B, 44분 내에 25-50% B, 및 11분 내에 50-90% B의 분절 선형 구배를 사용하여 300 nL/분으로 분획화하였다. 이어서, 용액 B는 다음 실행을 위해 4%에서 5분 동안 복귀하였다.
스캔 순서는 MS1 스펙트럼 (오비트랩(Orbitrap) 분석, 해상도 120,000, M/Z 375-1500으로부터의 스캔 범위, 자동 게인 조절 (AGC) 표적 1E6, 최대 주입 시간 100 ms)으로 시작하였다. 상위 S (3초) 듀티 사이클 스킴을 사용하여 각각의 사이클에 대해 수행된 MSMS의 수를 결정하였다. 전하 2-7의 모 이온을 MSMS를 위해 선택하고, 반복 샘플링을 피하기 위해 60초의 동적 배제를 사용하였다. 모 질량을 1.2 m/z의 단리 윈도우, 자동 게인 조절 (AGC) 표적 1E5를 갖는 사중극자로 단리하고, 30%의 정규화된 충돌 에너지를 갖는 보다 고-에너지 충돌 해리로 단편화하였다. 단편을 오비트랩에서 15,000의 해상도로 스캐닝하였다. MSMS 스캔 범위는 모 이온의 전하 상태에 의해 결정되었지만, 하한치는 110 amu로 설정되었다.
유리체 소 세포외 매트릭스체 분획에서 발현된 선택된 세포외 매트릭스-연관 단백질을 프로테옴 프로파일링에 의해 확인하고, 표 1에 제시한다.
표 1: 유리체 소 세포외 매트릭스체 내의 세포외 매트릭스 단백질
Figure pct00001
유리체 분획을 마이크로유체 장치를 사용하여 저속 원심분리 및 단리에 의해 수득하였다. 스펙트럼 카운트 값이 높을수록 더 많은 양의 단백질을 나타낸다.
유리체 소 세포외 매트릭스체 분획에서 발견되는 단백질-응집에 관여하는 것으로 알려진 선택된 단백질을 프로테옴 프로파일링에 의해 확인하고, 표 2에 제시한다.
표 2: 유리체 소 세포외 매트릭스체에서의 단백질-응집 단백질
Figure pct00002
유리체 ECM 응집체 분획을 프로토유형 마이크로유체 장치를 사용하여 저속 원심분리 및 단리에 의해 수득하였다. 단백질은 기능에 의해 분류되었고, 강조된 단백질은 세포외 매트릭스에서 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 보체 C3 (스펙트럼 카운트, 408), 알파-에놀라제 (스펙트럼 카운트, 151), 및 클러스테린 (스펙트럼 카운트, 74)은 비교적 높은 스펙트럼 카운트에서 발견되었다.
실시예 10. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 추출. 마이크로유체 장치를 사용하여 소 유리체 세포외 매트릭스체를 단리하였다. 단리 후, 바디를 추출하였다.
도 34는 본 개시내용의 마이크로유체 장치의 제한 채널 내의 세포외 매트릭스체의 단리 및 그의 후속 추출을 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm이다. 도 34a는 포스페이트-완충 염수 (pH 7.0) 중에 현탁되고 알시안 블루 (회색 신호, 명시야)로 히알루론산에 대해 대조염색된 소 유리체액으로 관류된 마이크로유체 장치의 대표적인 광시야 현미경사진을 나타낸다. 도 34a는 장치의 기둥 (p) 사이에 포획된 세포외 매트릭스체 (화살표)로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 관류 후에, 응집체를 기둥 사이에서 단리하고, 덩어리-유사 형태로 관찰하였다. 세포외 매트릭스체 물질보다 더 작은 물질은 유출구 포트를 통해 배출되었다. 도 34b는 마이크로유체 장치의 제한 채널로부터의 세포외 매트릭스체의 추출을 나타낸다. 장치를 온화한 세제, 0.1% 소듐 도데실 술페이트, SDS로 관류시키고, 유출구로부터 유입구로의 유동 방향을 역전시켰다. 도 34b는 용리 후 채널 내에 존재하는 실질적으로 더 적은 수의 바디를 나타냈고, 바디가 추출되었음을 보여주었다. 도 34c는 관류 후에 기둥 (p) 사이에 포획된 세포외 매트릭스체 (화살표)의 보다 고배율의 영상을 나타낸다. 도 34c는 세제 및 역류에 의한 추출을 보여주며, 역시 추출 후 채널에서 실질적으로 더 적은 바디를 나타낸다.
실시예 11. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 추출. 이 실험은 온-칩 염색이 세포외 매트릭스체의 단리를 검출하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다.
도 35는 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 마이크로유체 장치에 생체액 중에 현탁된 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 유체의 관류 후, 유체는 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)는 기둥 (Lp로 표시됨) 사이에 포획되었다. 칩을 차단 용액으로 관류시켜 항체 염색 전에 비-특이적 항체 결합을 방지하였다. 다음으로, 공지된 세포외 매트릭스 성분 및 인테그린-결합 단백질인 단백질 피브로넥틴을 항-피브로넥틴 1차 항체를 주입하고, 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척함으로써 표지하였다. 이어서, 염소 항-토끼 FITC 2차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이어서, 마이크로유체 칩을 광시야 형광 및 명시야 현미경검사 하에 영상화하였다. 도 35는 대표적인 광시야 형광 현미경사진을 나타낸다. 이 영상은 마이크로유체 채널 내의 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 큰 기둥 사이의 거리 (Lp)는 약 100 μm였다. 바디 내의 점상 신호는 피브로넥틴 염색 (항-피브로넥틴 Ab, 염소 항-토끼 2차 항체 + 알렉사 488, FITC, 백색 신호)을 나타낸다.
도 36은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 36a는 채널 내의 염색된 세포외 매트릭스체의 대표적인 현미경사진 명시야 영상 (화살표)을 나타낸다. 영상 스케일 바는 20 μm였다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 36a의 신호가 피브로넥틴에 대해 특이적이었음을 보여주었다. 도 36b는 또한 채널 내의 염색된 세포외 매트릭스체 (화살표)를 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm였다. 다시, 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 36b의 신호가 피브로넥틴에 대해 특이적이었음을 보여주었다.
실시예 12. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 추출. 이 실험은 온-칩 염색이 세포외 매트릭스체의 단리를 검출하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다.
도 37은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 37은 세포외 매트릭스체를 함유하는 생체액에서의 연골의 세포외 매트릭스의 성분인 페를레칸 단백질의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 마이크로유체 칩에 생체액 중에 현탁된 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 생체액의 관류 후, 샘플은 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)는 기둥 ("p"로 표시됨) 사이에 포획되었다. 칩을 차단 용액으로 관류시켜 항체 염색 전에 비-특이적 항체 결합을 방지하였다. 항-페를레칸 1차 항체를 주입하고, 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척함으로써 페를레칸을 표지하였다. 이어서, 염소 항-토끼 TRITC 2차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이어서, 마이크로유체 칩을 광시야 형광 및 명시야 현미경검사 하에 영상화하였다. 도 37은 기둥 (p) 사이의 마이크로유체 채널 내의 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 점상 신호는 페를레칸 염색 (백색 신호)을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 37의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 나타냈다.
도 38은 본 개시내용의 장치 채널 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 면역조직화학 염색을 나타낸다. 도 38a는 페를레칸의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진 명시야 영상을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 38a의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 나타냈다. 영상 스케일 바는 10 μm였다. 도 38b는 페를레칸의 온-칩 면역조직화학 염색의 대표적인 현미경사진 명시야 영상을 나타낸다. 대조군 영상은 형광 신호가 없었고, 이는 도 38c의 신호가 페를레칸에 대해 특이적이었음을 나타냈다. 영상 스케일 바는 10 μm였다.
실시예 13. 마이크로유체 장치로부터 추출된 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치 채널로부터 추출될 수 있는 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석을 보여주었다.
도 39는 세포외 매트릭스체가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 알시안 블루 염료를 사용한 히알루론산의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 가시화될 수 있음을 나타낸다. 도 39는 세포외 매트릭스체에 대한 신호 (암색 염색)를 보여주고, 이것은 EDC 가교가 표면 상에 세포외 매트릭스체를 보유함을 보여주었다.
실시예 14. 마이크로유체 장치로부터 추출된 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석. 본 실험은 본 개시내용의 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석을 보여주었다.
도 40은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 피크로시리우스 레드 염료를 사용한 콜라겐의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 가시화될 수 있는 세포외 매트릭스의 오프-칩 분석을 나타낸다. 도 40은 세포외 매트릭스체 내의 콜라겐 가닥에 대한 신호 (암색 염색)를 보여주고, 이것은 EDC 가교가 표면 상에 세포외 매트릭스체를 보유함을 보여주었다. 이는 또한 EMB가 콜라겐 염색에 의해 가시화될 수 있음을 나타낸다.
실시예 15. 마이크로유체 장치로부터 추출된 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석. 이 실험은 핵산 마커를 갖는 유리 표면 상에서 가시화될 수 있는 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석을 보여주었다.
도 41은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교 및 훽스트 염료를 사용한 DNA의 염색을 사용하여 유리 표면 상에서 가시화될 수 있는 세포외 매트릭스체의 오프-칩 분석을 나타낸다. 도 41은 세포외 매트릭스체 내의 DNA에 대한 신호를 나타낸다.
실시예 16. 마이크로유체 장치에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 검출. 본 실험은 본 개시내용의 장치 채널에서 세포외 매트릭스체의 단리 및 검출을 보여주었다.
도 42는 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리 및 검출을 나타낸다. 도 42는 포스페이트-완충 염수, pH 7.0 중에 현탁된 소 유리체액으로 관류되고, 알시안 블루, 암색 염색, 명시야로 히알루론산에 대해 대조염색된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 도 42는 장치의 큰 기둥 (원) 근처에 포획된 세포외 매트릭스체로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 세포외 매트릭스체는 클러스터-유사 형태로 관찰되었다. 영상 스케일 바는 50 μm였다.
실시예 17. 마이크로유체 장치에서의 온-칩 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치 채널에서 온-칩 세포외 매트릭스체 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 43은 마이크로유체 장치 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리, 검출 및 분석을 나타낸다. 도 43은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 단백질에 대해 대조염색된 소 유리체액 세포외 매트릭스체의 관류 후의 채널의 대표적인 저출력 형광 현미경사진을 나타낸다. 마이크로유체 칩에 균질화된 소 유리체를 함유하는 유체를 주입하였다. 장치로의 유체의 관류 후, 유체는 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 보다 큰 세포외 매트릭스체는 기둥 ("p"로 표시됨) 근처에 포획되었다. 영상 스케일 바는 25 μm였다.
실시예 18. 마이크로유체 장치에서의 온-칩 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치 채널에서 온-칩 세포외 매트릭스체 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 44는 마이크로유체 장치 내의 세포외 매트릭스체의 온-칩 단리, 검출 및 분석을 나타낸다. 도 44는 포스페이트-완충 염수, pH 7.0 중에 현탁된 소 유리체액으로 관류되고, 피크로시리우스 레드, 암색 염색, 명시야로 콜라겐에 대해 대조염색된 마이크로유체 칩의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 도 44a는 장치의 기둥 ("p"로 표시됨) 사이의 세포외 매트릭스체로부터의 신호를 나타낸다. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 도 44b는 형광 필터를 사용한 동일한 영상을 보여주고, 콜라겐이 피크로시리우스 레드 (밝은 회색 신호)로 검출되었음을 나타낸다. 영상 스케일 바는 50 μm였다. 도 44c 및 도 44c는 더 높은 배율에서의 영상을 도시한다. 영상 스케일 바는 10 μm였다.
실시예 19. 마이크로유체 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 45는 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 45는 0-200 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
실시예 20. 마이크로유체 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 46은 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 46은 201-1000 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
실시예 21. 마이크로유체 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 47은 건강한 상태 및 질환전 상태, 녹내장 의심 및 녹내장전증으로부터의 인간 방수 생체액에 존재하는 인간 세포외 매트릭스체의 빈도 크기 분포를 나타낸다. 방수를 9 내지 25 mmHg 범위의 안내압을 갖는 8명의 환자, 건강한 샘플 또는 녹내장전증 진단으로부터 수득하였다. 인간 샘플은 원심분리 또는 다른 수단에 의해 처리하지 않았다. 세포외 매트릭스체의 크기는 카르보디이미드 EDC 고정제를 사용하여 샘플을 유리 슬라이드에 가교시키고, 우라닐 아세테이트로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화함으로써 결정하였다. 크기는 모든 8개의 샘플에서 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 약 1.67 μm2 내지 약 67 x 103 μm2 범위였다. 도 47은 1001-5000 μm2 범위의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다.
실시예 22. 마이크로유체 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 본 개시내용의 장치를 사용한 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 48은 본 발명의 마이크로유체 장치로부터 단리 및 추출된 소 유리체 세포외 매트릭스체의 크기 분포를 나타낸다. 본 발명의 마이크로유체 장치로부터의 단리 및 추출 후의 소 유리체액 생체액 내의 세포외 매트릭스체. 칩을 적어도 60분 동안 생체액으로 관류시켰다. 관류 60분 후에, ECM 바디를 제한 채널 기둥 근처에서 단리하였다. 다음에, 칩을 세제 (0.1% 소듐 도데실 술페이트, SDS)로 처리하고, 역류를 통해 칩으로부터 샘플을 추출하였으며, 이는 바디가 유입구 포트 밖으로 유동하도록 하였다. 용리액의 분획을 총 80분 동안 10분 간격으로 수집하였다. 샘플을 유리 슬라이드 상에 탑재하고, 알시안 블루로 염색하고, 광시야 현미경검사로 영상화하였다. 크기는 자동화 프로그램 (ImageJ)을 사용하여 정량화하였다. 세포외 매트릭스체의 크기 (면적)는 최대 약 16 x 103 μm2였다. 도 48은 시간 경과에 따라 증가한, 각각의 용리액 분획 내의 세포외 매트릭스체의 수를 나타낸다. 이 실험은 본 발명의 마이크로유체 장치가 다양한 크기의 세포외 매트릭스체를 단리하고 추출하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 23. 마이크로유체 장치에서의 온-칩 세포외 매트릭스체의 단리, 검출 및 분석. 본 실험은 오프-칩 세포외 매트릭스체 단리, 검출 및 분석을 보여주었다.
도 49는 세포외 매트릭스체가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 가교로 보유되면서 수행될 수 있는 오프-칩 분석을 나타낸다. 도 49a는 EDC 가교로 수득된 천연 소 유리체액으로부터의 세포외 매트릭스체의 대표적인 TEM 영상을 나타낸다. 세포외 매트릭스체는 EDC 고정으로 관찰되었다. 도 49b는 EDC 가교 없이 찍은 유사한 영상을 나타낸다. 세포외 매트릭스체는 EDC 고정 없이 관찰되지 않았다.
실시예 24. 마이크로유체 장치를 사용한 인간 혈장 샘플을 사용한 초기 췌장암에서의 세포외 매트릭스체의 단리 및 검출. 이 실험은 마이크로유체 장치를 사용하여 인간 혈장 샘플을 사용한 초기 췌장암에서 세포외 매트릭스체의 단리 및 검출을 보여주었다. 본 실험은 초기 췌장암에서 세포외 매트릭스체가 본 발명의 마이크로유체 장치를 사용하여 인간 혈장 샘플로부터 단리되고 검출될 수 있음을 보여주었다. 본 실험은 세포외 매트릭스체가 초기 췌장관 선암종 혈장을 건강한 대조군으로부터 구별하기 위한 유용한 마커임을 추가로 보여주었다.
도 50은 건강한 대조군에 비해 초기 췌장관 선암종 (PDAC) 환자로부터의 인간 혈장 샘플로부터의 세포외 매트릭스체의 단리를 나타낸다.
이 실험에서, 마이크로유체 칩에 초기 췌장관 선암종 (PDAC)으로부터의 인간 혈장을 주입하였다. 장치로의 관류 후, 생체액은 유입구를 통해 유동하고, 유출구를 통해 배출되었다. 결과를 건강한 연령-매칭 대조군과 비교하였다.
칩을 차단 용액으로 관류시켜 항체 염색 전에 비-특이적 항체 결합을 방지하였다. 다음으로, 공지된 세포외 매트릭스 성분 및 인테그린-결합 단백질인 단백질 피브로넥틴을 항-피브로넥틴 1차 항체를 주입하고, 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척함으로써 온-칩 면역조직화학 염색에 의해 표지하였다. 이어서, 염소 항-토끼 FITC 2차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이어서, 마이크로유체 칩을 형광 현미경검사 하에 영상화하였다.
도 50a는 PDAC 샘플에 대한 대표적인 광시야 형광 현미경사진 영상을 나타낸다. 도 50a는 마이크로유체 채널 내에 보유된 세포외 매트릭스체를 나타낸다. 도 50a는 추가로 보다 큰 세포외 매트릭스체 (화살표)가 기둥 ("p"로 표시됨) 사이에 머물렀음을 나타낸다. 기둥 사이의 폭은 약 100 μm였다. 보유된 세포외 매트릭스체로부터의 점상 신호는 피브로넥틴 염색 (항-피브로넥틴 Ab, 염소 항-토끼 2차 Ab + 알렉사 488, FITC, 백색 신호)을 나타낸다. 염색은 EMB 내에서 풍부한 신호 및 점상 염색을 보여주었다 (도 50a, 화살표 머리).
도 50b는 연령-매칭된 건강한 대조군 인간 혈장 샘플의 유사하게 수득된 형광 현미경사진을 나타낸다. 도 50b는 현저하게 감소된 양의 피브로넥틴 신호를 나타낸다 (도 50b, 회색 신호, 화살표). 건강한 대조군 신호는 동일한 조건 하에 처리된 경우에 질환 신호에 대한 것보다 훨씬 더 작았다. 영상 축적 막대는 20 μm였다.

Claims (35)

  1. 하기를 포함하는, 생물학적 샘플의 분획을 단리하기 위한 장치:
    유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하는 것인 1개 이상의 제한 채널;
    유동에 대한 저항을 제공하기 위해 제한 채널 내에 보유된 복수의 이격된 장애물이며, 장애물들 사이의 간격은 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로의 방향으로 감소하는 것인 장애물; 및
    제한 채널의 유입구 말단과 유체 연통하는, 유체를 보유하기 위한 유입구 저장소;
    유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하고, 유입구 말단은 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 1개 이상의 균일한 유동 채널.
  2. 제1항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 장치:
    유입구 저장소 내의 유체에 압력을 가하기 위한 압력 공급원;
    유입구 저장소에서 유체의 유량 및 압력을 측정하기 위해 유입구 저장소와 유체 연통하는 유동 센서.
  3. 제1항에 있어서, 제한 채널 및 균일한 유동 채널의 유출구 말단과 유체 연통하는 유출구 저장소를 추가로 포함하는 장치.
  4. 제1항에 있어서, 제한 채널이 적어도 약 1 마이크로미터, 또는 적어도 약 2 마이크로미터, 또는 적어도 약 4 마이크로미터, 또는 적어도 약 10 마이크로미터, 또는 적어도 약 25 마이크로미터, 또는 적어도 약 50 마이크로미터, 또는 적어도 약 100 마이크로미터, 또는 적어도 약 200 마이크로미터, 또는 적어도 약 500 마이크로미터의 천공부를 갖는 장벽 밴드를 포함하는 것인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 제한 채널이 약 1-4 마이크로미터, 또는 약 1-15 마이크로미터, 또는 약 4-35 마이크로미터, 또는 약 4-100 마이크로미터, 또는 약 4-200 마이크로미터의 천공부를 포함하는 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 장치에서의 유동의 1-90%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-75%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-50%가 균일한 유동 채널 내에 있거나, 또는 장치에서의 유동의 1-25%가 균일한 유동 채널 내에 있는 것인 장치.
  7. 제1항에 있어서, 제한 채널 및 균일한 유동 채널이 동일한 칩 또는 기판과 일체형인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 제한 채널 및 균일한 유동 채널이 상이한 칩 또는 기판에 있는 것인 장치.
  9. 제1항에 있어서, 제한 채널이 마이크로유체 채널인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 채널 내의 생물학적 샘플을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  11. 제1항에 있어서, 채널 내의 생물학적 샘플의 프로테옴 조성, 리피돔 조성, 트랜스크립톰 조성 또는 탄수화물 조성을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  12. 제1항에 있어서, 채널 내의 샘플의 단리된 분획의 수준을 측정하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  13. 제1항에 있어서, 채널 내의 샘플의 단리된 분획 중 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  14. 제1항에 있어서, 복수의 장애물이 채널과 일체형인 기둥을 포함하는 것인 장치.
  15. 제1항에 있어서, 복수의 장애물이 하기 중 하나 이상을 포함하는 것인 장치:
    인간 또는 동물 포도막 메쉬워크의 부분;
    인간 또는 동물 각막공막 메쉬워크의 부분; 및
    인간 또는 동물 누소관근접부 메쉬워크의 부분.
  16. 제1항에 있어서, 복수의 장애물이 유리 비드, 자기 비드, 겔 입자, 덱스트란 입자 또는 중합체 입자를 포함하는 것인 장치.
  17. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간 또는 동물 체액, 혈액, 조직 또는 세포로 구성된 것인 장치.
  18. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 담체 유체를 포함하는 것인 장치.
  19. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 1종 이상의 시약을 포함하는 것인 장치.
  20. 제1항에 있어서, 제한 채널이 샘플의 바이오마커 또는 생체분자에 결합하기 위한 결합 모이어티를 추가로 포함하는 것인 장치.
  21. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 진단 또는 예후를 겪은 대상체로부터의 것인 장치.
  22. 제1항에 있어서, 제한 채널 내에 구불구불한 유체 혼합 영역을 추가로 포함하는 장치.
  23. 제1항에 있어서, 제한 채널 또는 연속 유동 채널이 플루오린화 코팅을 갖는 것인 장치.
  24. 하기를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 추출하는 방법:
    생물학적 샘플을 제1항의 장치의 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로 유동시키는 단계; 및
    장치의 유입구 말단을 향한 유체의 유동 방향을 역전시키는 단계.
  25. 하기를 포함하는, 생물학적 샘플의 분획을 단리하기 위한 마이크로유체 시스템:
    하기를 포함하는 마이크로유체 장치:
    유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하는 것인 1개 이상의 제한 채널;
    유동에 대한 저항을 제공하기 위해 제한 채널 내에 보유된 복수의 이격된 장애물이며, 장애물들 사이의 간격은 유입구 말단으로부터 유출구 말단으로의 방향으로 감소하는 것인 장애물; 및
    제한 채널의 유입구 말단과 유체 연통하는, 유체를 보유하기 위한 유입구 저장소; 및
    유입구 말단 및 유출구 말단을 가지며, 유입구 말단 및 유출구 말단은 채널을 통해 유체 연통하고, 유입구 말단은 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 1개 이상의 균일한 유동 채널;
    압력 공급원을 포함하는 구동 유닛;
    유체 공급원을 포함하는 공급원 유닛이며, 압력 공급원은 유체 공급원 및 마이크로유체 장치의 유입구 저장소와 유체 연통하는 것인 공급원 유닛;
    유입구 저장소에서 유체의 유량 및 압력을 측정하고 유량 및 압력 데이터를 프로세서에 전송하기 위해 유입구 저장소와 유체 연통하는 센서를 포함하는 센서 유닛; 및
    마이크로유체 장치에서 단리된 분획을 분석하고 분석 데이터를 프로세서에 보내기 위한 1개 이상의 수단을 포함하는 온-칩 분석기 유닛; 및
    유량, 압력 및 분석을 수용 및 디스플레이하기 위한 프로세서.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 장치로부터 추출된 생물학적 샘플의 분획을 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 대상체의 진단 또는 예후에 사용하기 위한 조성물.
  29. 생물학적 샘플로부터 세포외 매트릭스체를 단리하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플을 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간 또는 동물 체액, 혈액, 조직 또는 세포로 구성된 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 세포외 매트릭스체가 0.5 내지 5,000 마이크로미터, 또는 1 내지 1,000 마이크로미터, 또는 1 내지 200 마이크로미터, 또는 4 내지 100 마이크로미터의 크기를 갖는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 세포외 매트릭스체를 단리하는 단계가 한외여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 세포외 매트릭스체의 단리가 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 장치에 의해 수행되는 것인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 세포외 매트릭스체를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교를 사용하여 유리 표면 상에 고정시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 가교를 사용하여 유리 표면 상에 세포외 매트릭스체를 고정시키는 세포외 매트릭스체의 생물학적 샘플을 제조하는 방법.
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