KR102248719B1 - 뇌 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 우울증 약리 효능의 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
발명은 조직 투명화 조성물 및 키트와, 이를 이용한 투명화 뇌 조직의 제조방법, 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법 및 우울증의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 조직투명화 조성물 및 방법을 이용하는 경우, 뇌 조직을 투명화 시킴으로써 GAD유전자의 GFP 형광 발현을 선명한 3차원 이미지로 획득할 수 있고, GAD-GFP 유전자의 분포 및 변화를 효과적으로 분석하고 정량화하여 우울증 개선 효능의 평가 및 우울증 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝 하는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 뇌 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 우울증 약리 효능의 평가 방법 등에 관한 것이다.
우울증 연구에서의 in-vivo 평가 방법은 동물의 행동을 관찰하는 방법이 대부분이며 특히, 동물의 전체 뇌조직에서 우울증 유전자 marker의 분포 및 발현 변화를 기준으로 하는 시스템 및 분석 방법은 아직까지 잘 알려진 바가 없는 실정이다.
최근, 생체 조직 전체에서의 유전자 발현 등을 관찰하기 위한 방법으로 조직 투명화 기술이 개발되고 있으며, 매우 다양한 방법으로 조직을 투명화 할 수 있는 기술 등이 개발되었다. 기존의 조직 투명화 기술은 유기용매를 이용한 조직 투명화 방법인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성을 가지며, 이는 클라리티(CLARITY)와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하여, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
최근에 개발된 클라리티(CLARITY)법은 조직 내 hydrogel을 넣어서 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 material 등을 붙잡아 주는 일종의 그물망 지지체를 만든 뒤 전기영동을 실시하여 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. 클라리티(CLARITY) 및 관류 도움 시약 방출방법(PARS)과 같이 광학적으로 투명하고 고분자 투과가 가능한 이미지를 창출할 수 있는 조직투명성 기술은 매우 향상된 기관계 이미징에 있어서 주요한 진전을 제공하였다.
그러나, 상기 클라리티 방법은 hydrogel 농도가 높아질수록 단백질과의 결합도가 높아져 더 조직이 단단해지고 지질의 제거가 어려워 지기 때문에 투명화하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이는 조직 표면에 공기 및 검은 입자의 침착을 야기한다. 또한, 기존의 클라리티 법은 과정이 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 한 조직만 투명화 할 수 있어 경제적, 시간적 손실을 유발하며 항체를 이용한 염색이 불안정한 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시킬 수 있는 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직 전체를 투명화하고, 상기 뇌 조직에서 우울증 관련 유전자의 발현을 분석하여 우울증 개선 효능 연구를 통한 신약개발 등에 활용할 수 있는 우울증 개선 효능 평가 방법 등을 발명하고자 하였다.
본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시킬 수 있는 조직 투명화 용액 및 이를 이용한 뇌 조직에서의 우울증 개선 효능의 평가방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조성물을 사용하면 뇌조직의 투명화 및 투명화된 뇌조직으로부터 GAD-GFP 유전자의 발현을 측정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 조직 투명화 조성물 및 이를 포함하는 조직 투명화용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조직 투명화 조성물을 이용한 투명화 뇌 조직의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법 및 우울증의 예방 또는 치료용 후보물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 0.1-10 %(w/v)의 N-라우릴사르코신, 10-40 %(w/v)의 CHAPS, 및 30-70 %(w/v)의 우레아를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 N-라우릴사르코신은 0.1-9, 0.1-8, 0.1-7, 0.1-6, 0.1-5, 0.1-4, 0.1-3, 0.1-2, 0.1-1, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 추가적으로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 0.01-1%(w/v), 0.1-1%(w/v), 또는 0.1-0.5%(w/v)의 농도로 포함할 수 있다.
상기 NaCl(염화나트륨)은 삼투압에 의한 조직의 변형과 이온 강도(ion strength)를 안정화시켜 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 조직 투명화용 키트를 제공한다:
(a) 고정 용액;
(b) N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액;
(c) 세척 용액; 및
(d) 마운팅 용액.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고정 용액은 수크로오스를 포함할수 있다. 상기 수크로오스는 20-100 %(w/v), 20-90 %(w/v), 20-80 %(w/v), 20-70 %(w/v), 20-60 %(w/v), 20-50 %(w/v), 20-40 %(w/v), 20-30 %(w/v), 30-100 %(w/v), 30-90 %(w/v), 30-80 %(w/v), 30-70 %(w/v), 30-60 %(w/v), 30-50 %(w/v), 30-40 %(w/v), 40-100 %(w/v), 40-90 %(w/v), 40-80 %(w/v), 40-70 %(w/v), 40-60 %(w/v), 또는 40-50 %(w/v)의 농도로 수크로오스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 수크로오스는 농도를 20%(w/v) 이상으로 포함될 경우 조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세척 용액은 0.001-0.5 %(w/v)의 아지드화 나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다. 상기 아지드화 나트륨은 0.01-0.4 %(w/v), 0.01-0.3 %(w/v), 0.01-0.2 %(w/v), 0.01-0.1 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있거나, 0.01-0.5 %(w/v), 0.1-0.5 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세척 용액은 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마운팅 용액은 N-라우릴사르코신, CHAPS, 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 마운팅 용액은 0.1-10%(w/v)의 N-라우릴사르코신, 20-60 %(w/v)의 CHAPS, 및 10-50 %(w/v)의 우레아(urea)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 마운팅 용액은 0.001-3 %(w/v)의 NaCl을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 마운팅 용액의 굴절률을 1.45로 맞추기 위해 상기 CHAPS 및 우레아의 조성은 각각 40%(w/v), 40%(w/v)로 포함할 수 있으며, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.1 내지 1%(w/v)로 포함할 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 투명화 뇌 조직의 제조방법을 제공한다:
(a) 채취된 뇌 조직을 고정 용액에 침지하여 고정하는 단계;
(b) 고정된 뇌 조직을 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액에 침지시키는 투명화 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 뇌 조직에 부착된 유기물을 세척하는 세척 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 뇌 조직을 고정시키는 단계.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법을 제공한다:
(a) GAD-GFP transgenic 동물모델에 평가대상 약리 물질을 처리하는 단계;
(b) N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액을 이용하여 상기 동물모델의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계; 및
(c) 상기 뇌 조직 시료에서 GAD-GFP 유전자의 발현 및 분포를 분석하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어 "GAD (Glutamate Decarboxylase)"는 신경전달물질인 (gamma-aminobutyric acid : GABA)의 합성에 관여하는 효소로서, GAD의 발현이 비정상적으로 증가되는 경우 GABA의 혈중 농도를 향상시킴으로써 직접 또는 간접적으로 신경이상증세를 야기하며 간질병, 파킨슨병, 정신분열, 치매, 지연성 운동장애, 허혈 등의 행동장애 발생 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유류라면 그 종류에 특별히 제한이 없으며, 예컨대 비-인간 영장류, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 말, 또는 소일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 동물은 마우스일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 다음 단계를 포함한다:
(b-1) 상기 동물모델의 뇌 조직을 고정 용액에 침지하여 고정하는 단계;
(b-2) N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액에 상기 고정된 뇌 조직을 침지시키는 투명화 단계;
(b-3) 세척 용액으로 상기 뇌 조직에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계; 및
(b-4) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 우울증 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) GAD-GFP transgenic 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 우레아(urea) 및 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액을 이용하여 상기 동물모델의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계;
(c) 상기 투명화된 뇌 조직에서 GAD-GFP 유전자의 발현 및 분포를 분석하여 우울증 개선 여부를 평가하는 단계; 및
(d) GAD-GFP 유전자 발현이 후보물질을 처리하기 전에 비해 개선된 경우 상기 (a)의 후보물질을 우울증의 예방 또는 치료용 후보물질로 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 우울증 예방 또는 치료용 후보물질은 우울증 모델인 GAD-GFP transgenic 모델의 뇌 조직에서 GAD 유전자 발현 및 분포를 분석함으로써 우울증 예방 또는 치료 효능을 확인하기 위한 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 예컨대 화학물질, 단백질, (폴리)뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA), 또는 천연물 추출물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 신경계 질환 치료제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 평가 방법 또는 스크리닝 방법에서상기 GAD-GFP 유전자의 발현 및 분포를 분석하는 단계는 이마리스(ImarisTM) 프로그램을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 당업계에 공지된 형광 신호를 3차원적으로 검출 및 분석할 수 있는 프로그램을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 우울증 동물모델의 뇌 조직을 투명화하기 위한 용액을 제조하고, 상기 용액을 사용하여 우울증 질환 동물모델의 뇌 조직을 투명화한 후 면역 염색하여 뉴런의 3차원 면역 염색 이미지를 획득하였다(실시예 1).
본 발명의 일 실시예에서는, 이마리스(ImarisTM) 프로그램을 이용하여 상기 투명화한 뇌 조직에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 관찰하고, 이를 정량적으로 분석하였다(실시예 2).
본 발명의 상기 투명화 뇌 조직의 제조방법, 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법 및 우울증 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법은 상술한 조직 투명화용 키트의 구성요소인 고정 용액, 조직 투명화 용액, 세척 용액 및 마운팅 용액을 공통적인 구성요소로 포함하는 바, 이들 발명 사이에 공통되는 내용은 중복기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 조직 투명화 조성물 및 키트와, 이를 이용한 투명화 뇌 조직의 제조방법, 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법 및 우울증의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 상기 조직투명화 조성물 및 방법을 이용하는 경우, 뇌 조직을 투명화 시킴으로써 GAD유전자의 GFP 형광 발현을 선명한 3차원 이미지로 획득할 수 있고, GAD-GFP 유전자의 분포 및 변화를 효과적으로 분석하고 정량화하여 우울증 개선 효능의 평가 및 우울증 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝 하는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직을 투명화하여 획득한 GAD-GFP 유전자 발현의 3차원 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 방법으로 Young 및 Old 마우스의 뇌 조직을 투명화 하여 획득한 GAD-GFP 유전자 발현의 3차원 형광 이미지를 Imaris 분석 프로그램을 이용하여 정량화 하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 방법으로 Old 마우스에 aroma 향을 처치하고 획득한 GAD-GFP 유전자 발현의 3차원 형광 이미지를 Imaris 분석 프로그램을 이용하여 정량화 하여 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 방법으로 Young 및 Old 마우스의 뇌 조직을 투명화 하여 획득한 GAD-GFP 유전자 발현의 3차원 형광 이미지를 Imaris 분석 프로그램을 이용하여 정량화 하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 방법으로 Old 마우스에 aroma 향을 처치하고 획득한 GAD-GFP 유전자 발현의 3차원 형광 이미지를 Imaris 분석 프로그램을 이용하여 정량화 하여 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
1: GAD-
GFP
transgenic
마우스의 뇌 조직 투명화 및 GAD 유전자 발현의 3차원 면역 염색 이미지 획득
1-1. 고정 용액, 조직
클리어링
용액, 세척 용액, 및
마운팅
용액의 제조
뇌 조직을 투명화시키기 위해 먼저 조직 투명화를 위해 필요한 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액을 제조하였으며, 상기 용액의 구성 성분은 하기 표 1에 나타내었다.
| 연번 | 구성 | 구성 성분 |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(30%(w/v)) |
| 2 | Tissue clearing solution | N-lauroylsarcosine (0.1%(w/v)), CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1%(w/v)) |
| 3 | Washing solution | PBS, sodium azide (0.1 %(w/v)) |
| 4 | Mounting solution | N-lauroylsarcosine (0.1%(w/v)) CHAPS(40%(w/v)), Urea(40%(w/v)), NaCl(0.1%(w/v)) |
구체적으로, 생체조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유 결합된 시료를 보다 강하게 고정시키기 위해, 농도가 30%(w/v) 인 수크로오스(sucrose)를 구성성분으로 하는 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다.
또한, 삼투압에 의한 조직의 변형과 이온 강도(ion strength)를 안정화시켜 생체조직 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화하기 위해, 20%(w/v) CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 50%(w/v) 우레아(urea)에 0.1 내지 0.5%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가하여, 본 발명의 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)을 제조하였다.
이어서, 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척시킬 수 있도록 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 0.1 %(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 첨가하여 세척 용액(washing solution)을 제조하였다.
또한, 40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 40%(w/v) 우레아(urea)로 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 굴절률을 1.45로 맞추었다.
1-2. 뇌 조직 투명화 및
GAD유전자의
3차원 이미지 획득
뇌 조직의 뉴런 3차원 이미지를 확인하기 위해 상기 실시예 1-1에서 제조한 용액(표 1 참조)을 사용하여 GAD-GFP transgenic 마우스의 뇌 조직 시료를 투명화 하였다. 마우스의 brain 시료를 얻기 위해 마취가스로 이소플루란 (isoflurane)을 이용하여 100% 산소와 혼합하여 흡입 마취하였으며, 마취후 개복하여 30 ml PBS (pH 7.2)로 3-5분동안 심장 관류(cardiac perfusion)를 실시하고, 다시 30-50 ml의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 20분 동안 관류(perfusion) 하였다.
구체적으로, 상기 뇌 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/50 rpm에서 가라앉을 때까지 진탕배양(shaking incubation) 하고, 가라앉은 뇌 조직 시료를 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 진탕배양(shaking incubation)하고, 동일한 조건으로 1회 더 반복하였다.
상기 투명화 반응이 끝난 뇌 조직 시료에 50 ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 진탕배양(shaking incubation)을 하였으며(3회 반복), 3회 반복 세척이 끝난 뇌 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 동안 진탕배양(shaking incubation)하고, 동일한 조건으로 1회 더 반복하였다.
그런 다음, 상기 마운팅 용액으로 처리한 뇌 조직 시료를 1200 rpm에서 30분 동안 원심분리를 하여 시료 내 기포(bubble)를 제거하고, 뇌 조직 시료를 현미경 관찰을 위한 이미지 챔버 슬라이드(Ibidi사, 독일)에서 보관하거나 1X PBS에 4℃에서 보관하였다.
상기 방법으로 투명화가 완료된 뇌 조직의 GAD-GFP의 형광량을 시트광(lightsheet) 현미경을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 방법으로 투명화한 뇌 조직에서 선명한 GAD 유전자 발현에 대한 이미지를 확인할 수 있었다.
실시예
2.
이마리스
(
Imaris
) 프로그램을 통한
GAD유전자
발현 및 분포 분석
본 발명자들은 연령별 및 약물 투여 여부에 따른 GAD 유전자의 발현을 본 발명의 투명화 조성물을 이용하여 비교할 수 있을지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저 마우스의 연령에 따른 GAD 유전자 발현정도를 비교하기 위하여, 암컷 Young 마우스(6주령)와 Old 마우스(36주령)를 구입(Jackson lab, C57BL/6)하여 1주일간 12시간의 명암주기로 순치시킨 후 상기 실시예 1-2의 방법으로 각 마우스의 뇌를 적출하여 조직을 투명화 시켰다. 투명화된 뇌 조직에서의 GAD 유전자 발현은 이마리스(Imaris)의 3D 분석 프로그램을 사용하여 3차원으로 나타난 GAD 유전자의 발현을 정량화 하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Young 마우스와 비교하여 Old 마우스에의 뇌조직에서 GAD가 약 5배 더 많이 발현되는 것을 확인하였다. 따라서 Young 마우스보다 Old 마우스의 우울감에 대한 표현형이 높은 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 약물 투여 여부에 따른 GAD 유전자의 발현정도를 비교하기 위하여, 36주령의 GAD-GFP transgenic mouse(C57BL/6), 암컷 Old 마우스에 사이트러스 계열의 아로마 오일을 7일동안 하루 3번씩 2 mL의 부피로 페트리 디쉬에 떨어뜨려 처치한 후, 상기 실시예 1-2의 방법으로 마우스의 뇌를 적출하여 조직을 투명화 시켰다. 투명화된 뇌조직의 GAD 유전자 발현은 이마리스의 3D 분석 프로그램을 사용하여 3차원으로 나타난 GAD 유전자의 발현을 정량화 하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 아로마 향을 처리한 Old 마우스는 아로마 향을 처리하지 않은 대조군 Old 마우스에 비하여 GAD 유전자의 발현량이 현저히 낮았다. 따라서, 아로마 향은 마우스의 우울감을 감소시킬 수 있으며, 본 발명의 투명화 조성물은 뇌조직의 투명화를 통하여 GAD-GFP 유전자의 발현을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- 0.1-3 %(w/v)의 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), 10-40 %(w/v)의 CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 30-70 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 조직 투명화 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 다음을 포함하는 조직 투명화용 키트:
(a) 고정 용액;
(b) 0.1-3 %(w/v)의 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), 10-40 %(w/v)의 CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 30-70 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액;
(c) 세척 용액; 및
(d) 0.1-10%(w/v)의 N-라우릴사르코신, 20-60 %(w/v)의 CHAPS, 10-50 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-3 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 마운팅 용액. - 제4항에 있어서, 상기 고정 용액은 20-100%(w/v)의 수크로오스를 포함하는 것인, 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 세척 용액은 0.001-0.5 %(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 것인, 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 세척 용액은 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 포함하는 것인, 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 다음 단계를 포함하는 투명화 뇌 조직의 제조방법:
(a) 채취된 뇌 조직을 고정 용액에 침지하여 고정하는 단계;
(b) 고정된 뇌 조직을 0.1-3 %(w/v)의 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), 10-40 %(w/v)의 CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 30-70 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액에 침지시키는 투명화 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 뇌 조직에 부착된 유기물을 세척하는 세척 단계; 및
(d) 0.1-10%(w/v)의 N-라우릴사르코신, 20-60 %(w/v)의 CHAPS, 10-50 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-3 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 마운팅 용액으로 상기 뇌 조직을 고정시키는 단계. - 다음 단계를 포함하는 우울증에 대한 약리 효능의 평가 방법:
(a) GAD-GFP transgenic 동물모델에 평가대상 약리 물질을 처리하는 단계;
(b-1) 상기 동물모델의 뇌 조직을 고정 용액에 침지하여 고정하는 단계;
(b-2) 0.1-3 %(w/v)의 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), 10-40 %(w/v)의 CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 30-70 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액에 상기 고정된 뇌 조직을 침지시키는 투명화 단계;
(b-3) 세척 용액으로 상기 뇌 조직에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계;
(b-4) 0.1-10%(w/v)의 N-라우릴사르코신, 20-60 %(w/v)의 CHAPS, 10-50 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-3 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계; 및
(c) 상기 뇌 조직 시료에서 GAD-GFP 유전자의 발현 및 분포를 분석하는 단계. - 삭제
- 다음 단계를 포함하는, 우울증 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법:
(a) GAD-GFP transgenic 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b-1) 상기 동물모델의 뇌 조직을 고정 용액에 침지하여 고정하는 단계;
(b-2) 0.1-3 %(w/v)의 N-라우릴사르코신(N-lauroylsarcosine), 10-40 %(w/v)의 CHAPS [3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate], 30-70 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-1 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 조직 투명화 용액에 상기 고정된 뇌 조직을 침지시키는 투명화 단계;
(b-3) 세척 용액으로 상기 뇌 조직에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계;
(b-4) 0.1-10%(w/v)의 N-라우릴사르코신, 20-60 %(w/v)의 CHAPS, 10-50 %(w/v)의 우레아(urea) 및 0.001-3 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계;
(c) 상기 투명화된 뇌 조직에서 GAD-GFP 유전자의 발현 및 분포를 분석하여 우울증 개선 여부를 평가하는 단계; 및
(d) GAD-GFP 유전자 발현이 후보물질을 처리하기 전에 비해 개선된 경우 상기 (a)의 후보물질을 우울증의 예방 또는 치료용 후보물질로 선별하는 단계.
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