CN102802797A - 细胞、颗粒和其它分析物的多重分析 - Google Patents

细胞、颗粒和其它分析物的多重分析 Download PDF

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Abstract

总体而言，本发明特征为用于多孔膜上细胞、颗粒和其它分析物的分析的多重装置、系统、方法和试剂盒。优选装置检测、鉴定并定量复杂生物样品例如血液中低水平的微生物。示例性的装置包括具有与多个通道流体连通的流体入口的壳体，例如具有基本相同流体抗性的通道。所述多个通道的每一个与容纳用于分析细胞、颗粒或与颗粒结合的分析物的储存器流体连通；一个或多个基本上平面的多孔膜，所述细胞或颗粒不通过该膜；和一个或多个出口，其中远离所述入口流动的液体在所述多个通道之间被分开且经一个或多个膜流向所述出口；并且其中将所述储存器安置在所述一个或多个膜的上游。

Description

细胞、颗粒和其它分析物的多重分析
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年4月21日提交的美国临时申请号61/171,275的权益，其通过引用结合到本文中。
发明背景
本发明涉及细胞例如微生物和其它分析物例如生物分子的分析的领域。
环境、食物和临床样品中病原生物、其它细胞和生物分子的分析例如检测和鉴定对人和动物安全、健康和福利是重要的。
由于人口统计和其它因素，暴露于环境中的病原体导致越来越多的健康问题。因素包括人口增长和城市化、大气和水资源污染增加、由迁移、国际贸易和与动物种群接触导致的病原体传播。细菌和真菌污染是包括制药、美容、眼护理产品和半导体在内许多行业的重大关注。细菌污染的疑似和实际发生事件已导致昂贵和损害性的产品召回。
同样，由食物传播的病原体导致的疾病是重大健康问题。据估计，在美国受污染食物每年致使7.6×107例疾病、325,000例住院治疗和5000例死亡(Mead，PS等，1999，Emerging Infectious Diseases 5(5)：607-625)。
根据世界卫生组织的2001世界卫生报告，传染病和寄生虫病是世界上的第二大死因。用于检测和鉴定病原生物体的方法对于这些生物体定居并因而给他们自身(例如手术期间)或其他人(在疗养院和医院)造成威胁的个体的筛查，以及对于受感染个体中感染的诊断都是必需的。
因此，存在用于宽范围样品中病原生物体、其它细胞和生物分子的分析例如检测、鉴定和计数的改进方法的必要。
发明概述
总体而言，本发明特征为用于多孔膜上细胞、颗粒和其它分析物的分析的多重装置、系统、方法和试剂盒。优选装置检测、鉴定并定量复杂生物样品例如血液中低水平的微生物。
因此，在一方面，本发明特征为装置，其包括
具有与多个通道流体连通的流体入口的壳体(housing)，其中每一通道与容纳用于分析的细胞、颗粒或与颗粒结合的分析物的储存器；一个或多个基本上平面的多孔膜，所述细胞或颗粒不通过该膜；一个或多个出口(例如允许气体而不是液体通过的出口)，其中远离入口流动的液体在通道间被分开且经一个或多个膜流向出口，并且其中储存器安置在一个或多个膜的上游，即朝向入口。在一个实施方案中，分析试剂结合到与颗粒结合的靶分析物。
本发明的任何装置还可包括用于颗粒的至少一个储存器，其中所述储存器安置在入口和一个或多个膜之一之间，并且其中颗粒的储存器与多个通道的至少一个流体连通。在本发明的任何装置中，壳体可包括一部分，通过该部分，在所述膜之一上可进行细胞或颗粒的光学分析。本发明的任何装置还可包括邻近膜安置或在膜上安置的用于细胞或颗粒电分析的电极。本发明的任何装置还可包括与膜邻近的用于细胞或颗粒磁弛豫分析的磁共振检测器。本发明的任何装置还可包括安置在膜和出口之间的废料储存器。本发明的任何装置还可包括容纳液体试剂的储存器，其安置在入口和膜之间且通过阀与通道分开。本发明的任何装置可包括安置在入口和膜之间且与通道流体连通的容纳样品的储存器，任选还包括通过阀与所述样品储存器分开的容纳液体试剂的储存器。
本发明的任何装置还可包括安置在入口和膜之间的温度传感器、加热或冷却元件、和/或被动混合器或主动混合器元件。
在某些实施方案中，通道具有基本上相同的流体抗性(fluidicresistance)。在其它实施方案中，容纳分析试剂的储存器安置在通道内。替代地或此外，储存器通过阀与通道分开。
本发明的任何装置还可包括多个分析试剂的储存器，其中每一储存器与多个通道中的至少一个流体连通。例如，多个储存器中的每一个与多个通道的一个且仅一个流体连通。这样的储存器可与通道安置或通过储存器阀分开。当通过储存器阀分开时，装置还可包括多个通道阀，当其关闭时，防止通道和入口之间的流动。
在某些实施方案中，分析试剂的储存器与每一通道流体连通，使得分析试剂远离入口的流动在通道间被分开。
用于本发明装置的膜优选基本上非荧光的和/或通过醇、酸或碱抵抗降解。
本发明的任何装置还可包括样品室和液体试剂室，其中所述样品室和液体试剂室通过阀分开并且安置在入口和多个通道之间。
在某些实施方案中，装置的任何储存器或室可为机械可变形
室，其中所述室的压缩排出其内容物。
在相关方面，本发明特征为具有用于与本发明任何装置配合(mate)(例如插入)的容器(receptacle)的系统并且包括用于将流体从装置入口泵向装置出口的致动器；配置为与装置对接(interface)的温度控制器，以控制所述装置中至少一部分的温度；和配置为与用于分析膜上细胞、颗粒或与颗粒结合分析物的装置对接的检测器(例如光学检测器、电检测器、或者磁弛豫或磁共振检测器)。该系统还可包括配置为与装置对接的主动混合器元件，以混合入口和膜之间的两种流体。该系统还可包括流体储存器和泵，以将流体从所述储存器递送到所述装置的所述入口。
本发明特征还为使用本发明的装置分析样品(包括细胞、颗粒或与颗粒结合的分析物)的方法。所述方法包括将样品引入装置，允许分析试剂与细胞、颗粒或分析物接触；捕获膜上的细胞或颗粒；并且分析所述膜上的细胞或颗粒，例如用于检测、计数和/或鉴定。用于分析的优选试剂包括针对核酸或抗体的探针(例如PNA、DNA或LNA)。所述方法还可包括使细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物与结合探针或抗体的试剂接触，从而导致信号放大。分析试剂可经标记用于光学、电、放射性或磁检测。分析试剂还可包括光学上可区分的并且与不同细胞、颗粒或结合至颗粒的分析物结合的多种试剂。
方法还可包括在检测前用液体试剂处理样品。如本文所述的，所述液体试剂可通过主动或被动混合器与样品混合。在一个实施方案中，装置包括样品储存器和由阀与样品储存器分开的液体试剂储存器，并且主动混合包括致动所述阀并且将液体试剂转移至样品储存器或将样品转移至液体试剂储存器。还可重复该过程以移去两个储存器之间的液体体积直至达到所需混合水平。
在其它实施方案中，方法还可包括在装置中用液体试剂处理样品(例如稀释剂、裂解缓冲液或具有与分析物例如生物分子结合的部分的颗粒)。这样的处理可用于处理样品使得目标颗粒(例如与分析物结合的)或细胞滞留在膜表面上而样品的剩余部分流过膜。样品可具有高含量的干扰细胞，例如可阻塞膜的血液。在一些情况下，样品可另外包含粘液例如支气管样品或蛋白质例如尿样品，其可导致滤器阻塞。如本文所述的，可使用去污剂和酶的组合，以裂解血液细胞并且溶解细胞碎片、粘液和/或蛋白质而留下基本上完好无损的微生物，例如细菌和酵母。在这样的实施方案中，装置可包括被动混合器，其经安置使得在流经装置的同时并且在接触膜之前液体试剂与样品混合。替代地或此外，处理步骤可包括将样品与液体试剂主动混合。处理步骤还可包括使液体试剂和样品混合物的温度在预设时间长度内提高至指定温度(例如37℃)。在某些实施方案中，装置包括样品储存器和通过阀与样品储存器分开的液体试剂储存器，其中将样品引入样品储存器，液体试剂储存于液体试剂储存器中，并且主动混合包括致动所述阀和将液体试剂转移至样品储存器或将样品转移至液体试剂储存器。
在其它实施方案中，将样品与具有结合部分的颗粒在如下条件下接触：其中样品的分析物例如生物分子与颗粒结合，颗粒然后由膜捕获。
样品还可与对照颗粒接触，对照颗粒随后在多个通道之间与样品成比例地被分开，其中所述对照颗粒由膜捕获。
分析试剂储存器可安置在多个通道内的每一个中，其中试剂通过相邻液体的流动从储存器释放。或者或此外，分析试剂的储存器通过阀与多个通道的每一个分开并且致动所述阀导致样品与试剂接触。
本发明还括试剂盒，其包括本发明的装置和稀释剂、裂解缓冲液、杂交缓冲液或对照颗粒。
用于本发明的示例性样品是培养物、环境样品或生物样品。示例性细胞是微生物和/或受试者由于疾病而产生的那些。
本文将更详细描述本发明的具体用途。例如，本发明可用于分析导管相关血流感染(CR-BSI)或酵母物种(yeast speciation)。本发明的多重性还得以在装置的每一通道分析多于一种生物体。例如，装置可包括4个通道，每个通道包括6种不同试剂，其具有至少3种不同标记且在每一通道中可相同或不同。另一装置包括6个通道，每个通道包括6种不同试剂，其具有至少3种不同标记且在每一通道中可相同或不同。
本发明省去了动手步骤；允许对单个样品进行多重测试；自动对测定评分；增加测试灵敏度以允许直接分析样品例如血液中低水平的分析物，例如生物分子和细胞，例如微生物；提供细胞计数；并且使得能够现场护理(point-of-care)和现场试验(point-of-test)应用。本发明在高度浓缩细胞样品例如血液中对酵母的灵敏度为至少1-10cfu/mL，对细菌的灵敏度为10-100cfu/mL。本发明还为各种类型细胞提供宽动态范围的灵敏度。
本发明微生物的分析例如检测和鉴定允许采取预防和改善行动并且做出医疗处理决定。此外，本发明样品细胞例如微生物的计数可提供决策必需的信息。在临床微生物学中，例如尿、支气管灌洗液和其它身体样本中的细菌通常必须以超过预设阈值水平的浓度存在，以便认为是需要临床介入的真感染。在输液医学领域，测试血小板浓缩物的细菌存在情况。根据FDA指导方针，细菌水平低于1000cfu/ml的浓缩物被认为可接受用于输液用途。定量分析还允许测定时间趋势、空间分布和化学灵敏度。
从以下描述、附图和权利要求中，其它特征和优点将变得明显。
“储存器”是指装置中的容量(volume)，所述装置中以液体、凝胶或固体形式储存试剂或容纳一定体积的流体(例如样品或缓冲液)。储存器可为装置内的室，其与装置内的通道物理分开并且需要致动来打开，以使试剂或流体量与装置的另一部分接触。或者，储存器可为试剂的受限等分试样，例如经干燥或其它方式与通道壁粘附，在此情况下，流经装置的液体将在不致动(不同于流动所需要的)情况下与储存器接触。
“与……流体连通”是指允许与流体接触或流体之间的流动。根据本发明所用的术语，通过关闭阀(例如夹阀或脆性密封(frangible seal))分开的装置区域彼此流体连通。
“靶细胞或颗粒不通过的多孔膜”是指具有一定大小的孔的膜，以防止靶细胞或颗粒在未裂解或破碎的情况下通过。
“光学检测可通过其进行”是指允许所检测波长的光在例如红外、可见光、紫外光谱中透过。
“被动混合”是指不需要能量输入的混合，其不同于在其它固定流体结构中流体流动所需的。
“主动混合”是指需要例如磁的或机械的能量输入的混合，其不同于流体流动所需的。
附图简述
图1A-1C是本发明装置的底部、横截面和顶部的示意图。
图2是本发明备选装置的展开图。
图3是本发明另一装置的流体通道、阀和储存器的示意图。
图4A-4B是本发明装置的侧视图和顶视图。
图5是图4A-4B装置的流体通道、阀和储存器的示意图。
图6是用于混合流体的通道结构示意图
图7A-7B是图6所示通道中流体混合以及结合到此通道的装置的图解描述。
图8A-8B是在有背光和没有背光的情况下，部分涂有铝的膜上的荧光显微照片。
图9用于支持膜以确保平面性的结构的图解描述。
图10A-10D是通道中点样(spot)的试剂的溶解图。
图11A-11F是4-通道装置中所用分析试剂的图解描述以及用各种样品获得的结果。
图12A-12I是使用图1A-1C装置的方法的图解描述。
图13是一系列荧光显微照片，其显示随着细胞与杂交试剂接触并随后被洗涤的图像变化。
图14A-14B是荧光显微照片，其显示在6-通道装置中对含有不同酵母菌株的样品进行试验的结果。
图15是本发明的系统的示例性框图。
发明详述
本发明提供用于多重分析细胞例如微生物和其它分析物例如生物分子的装置、相关系统、试剂盒和它们的使用方法。
装置
总体而言，本发明提供多重装置，其将样品分为两个或更多个等分试样用于在一个或多个流通道中平行或连续分析。装置还采用多孔膜，以使样品中生物细胞或颗粒与溶解或更小组分分离。在与储存在装置上的一种或更多种试剂接触后，细胞被分析例如经光学分析。通道可经设计，例如通过全长或横截面面积设计以均等或不均等分开样品。
装置的多重性允许连续或平行测定单个样品的许多不同生物体。替代地或者此外，多重装置允许对同一样品进行重复测定。装置上样品分开允许在不同条件下平行测定同一样品的等分试样。例如样品的每一等分试样可与不同试剂一起使用、采用不同分析技术或采用不同样品处理条件(例如温度或化学修饰)或采用不同多孔膜(例如以阻留不同大小的细胞或其它分析物)。通过使用多种分析技术可增加多重性。例如通过使用针对不同分析物具有可区分颜色的试剂，用多种波长的光学检测将允许在每一流通道中对多于一种分析物进行分析。
当预期不同类型的细胞以不同数目存在于样品中时，可使用不均等样品分开。不均等样品分开允许递送适当体积用于测定；例如以较大数目存在的细胞所需体积小于以较小数目存在的细胞所需体积。不均等样品分开还允许在灵敏度范围内测定单个样品的相同类型细胞，例如当样品中可能存在的细胞数目高度变化时。
参考具体实施例，现在将更详细描述本发明。
图1A-1C显示本发明的装置。装置包括用透明带密封的模制体外壳。在该实施方案中，装置经设计使得仅需一个模制部件来限定多个通道。多孔膜如所示的粘附到体部。单次使用的盒(cartridge)包含所有分析试剂并储存生成的废料。该装置包括由其载入样品的单个入口和分开样品并将样品体积的一部分引导至多个(例如6个)通道的每一个的结构。这些通道的每一个包括试剂储存器，其经干燥或另外沉积在通道表面上用于分析细胞、颗粒或其它分析物。试剂与靶细胞或颗粒(例如结合的分析物)中的组分相互作用例如结合并且允许例如用荧光成像分析。该装置允许例如通过对每一通道不同膜区域成像来分析。
备选的装置示于图2和3。这些装置包括储存测定中所用液体试剂的泡罩包(blister pack)即储存器。如本领域公知的，泡罩包是广泛用于储存处方和非处方药丸和胶囊的结构。泡罩包还可用于储存流体，例如在美国专利5,374,395中所描述的。泡罩包可通过冷成型铝和聚合物层压件制成，以产生空腔和热结合两层或更多层从而形成密封室和流通道。可进行热结合使得特定区域的结合是脆性的。当在泡罩的内容物中生成足够压力时，充当阀的脆性结合经设计将产生通道。脆性结合的存在为泡罩包提供密封形式的长储存期，同时允许内容物排出到装置的流通道。还可使用用于储存液体试剂的其它室结构(例如刚性室，其内容物通过活塞、泵或其它力排出)。图2和3的装置可包括壳体，其具有用透明带和泡罩箔密封的单个模制体。将这些装置中多个样品通道的每一个连接至储存分析试剂的储存器(例如含肽-核酸(PNAs)的杂交缓冲液(Hybe))和用于分离用于分析的细胞、颗粒或其它分析物(例如与颗粒结合的分析物)的多孔膜。储存器通过阀与通道分离，例如破裂阀，例如脆性密封，其在致动前保持关闭。装置还可包括用于其它试剂例如所示的push试剂、裂解试剂和洗涤缓冲液的一个或多个储存器。该装置包括阀例如夹阀，其用于分离每一通道与装置的其它部分。当分析试剂储存器和洗涤缓冲液储存器被致动时，这些阀关闭以防止回流。本发明的装置还可包括不通过膜的通道，如图3所示，允许用于压力释放或用于样品或试剂溢流的替代途经。
另一装置示于图4A-4B和5。该装置还使用用于容纳试剂(杂交缓冲液)和任选洗涤缓冲液的储存器。此外，该装置包括用于裂解缓冲液和“push”缓冲液的储存器。此外，这些储存器保持分离状态直至阀例如破裂阀致动。该装置允许血液细胞(或与分析试剂接触前，其它样品处理)的装置上裂解。可将所述样品引入至样品例如血液、室并与裂解试剂或其它试剂混合。混合物可随后在装置上两个储存器之间例如混合物和样品储存器之间移动，以确保两种流体的完全混合。在该实例中，使用压力口，流体可在储存器之间移动，其中一个储存器中的正压力使液体移向另一储存器。或者，负压力可用于将一个储存器的液体牵引至另一储存器。“push”储存器中的流体还可用来确保全部样品被推动经过膜。一旦载入样品，该装置能够储存完成测定必需的所有流体和试剂。试剂可按干燥的形式储存于装置中。可将试剂溶液点样(spot)在装置中的一个或多个通道壁上并且在制造过程中干燥。或者，在制造期间经干燥试剂的珠可加入装置中。流体储存器的使用和在储存器之间来回移动流体的能力还可与经干燥试剂联合使用，所述经干燥试剂储存于装置中并且可在适当时间在装置上溶解以进行测定。
除使用用于混合两种流体的多个室之外，还可使用任何其它合适的混合技术。被动混合技术在图6中说明。在该技术中，通道包括使用无序混合(chaotic mixing)(Leong等Phys Rev Lett.1990；64：874-877)来被动混合两种流体的结构(Stroock等Anal.Chem.2002；74：5306-5312)。这样的通道可并入如图7A-7B所示的蛇纹设计中。还可使用主动混合技术，例如机械或磁搅拌棒、机械振摇或超声混合的使用。在这样的实施方案中，主动混合器元件可包括在装置中，例如在样品储存器、裂解液储存器、混合物储存器或通道中。例如装置可包括磁搅拌棒或机械旋转组件，其由装置中其它元件致动或与装置配合，所述装置例如为用于机械搅拌的旋转磁铁或旋转马达。
本发明的装置可由任何合适材料制成。例如装置的壳体通过热压纹(hot embossing)并用聚烯烃带(3M 9795R)密封以环烯烃共聚物(例如Topas 5013或Zeonex)制成。该带结合了基于硅氧烷的粘合剂，其适用于其中使用含有醇的缓冲液的装置。还可使用其它聚合物例如环烯烃聚合物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。除了热压纹之外，还可使用其它制造技术例如注塑。
本发明的装置还包括一个或多个出口以允许流体泵送期间液体或气体逸出。优选地，装置包括用于储存废料液体和试剂的储存器例如以允许阻封潜在生物危害的废料和便于处理。出口可用合适材料覆盖以防止(或基本上阻碍)液体流过而允许气体逸出。
膜。本领域公知用于分离细胞、其它颗粒和其它分析物(例如与颗粒结合的分析物)与流体和更小碎片的合适膜。通常，这样的细胞或颗粒尺寸将大于0.1μm。可使用粘合剂、热结合、超声焊接、激光焊接或压配合使膜粘附到装置。用于各通道的膜可作为装置中的单个元件(例如跨越所有通道的单个条带材料)或多个元件提供。当膜是单个元件时，所用材料优选不具有侧向孔隙率(lateral porosity)，使得在装置中各自的等分试样不混合。
示例性膜示于表1。径迹蚀刻膜具有通过蚀刻穿过聚碳酸酯(或聚脂)的膜而生成的圆柱状孔。Anopore氧化铝膜通过铝上电解氧化物形成随后铝溶解而产生。这些膜是平整的并且具有高的孔隙率。基底(substrate)易碎，这可能是缺点。Black Nylon是碳颗粒掺入尼龙线的深度滤器(depth filter)。它不像其它滤器那么平整。
表1.
Figure BPA00001482421800111
膜的优选特性包括孔径大小：0.4至0.8μm；孔密度：＞3×107/cm2；平整和光滑表面；通过任何合适方法可与塑料结合；背景荧光低；入射光吸收足够低使得光学检测期间的膜加热不会过度。膜还优选对分析试剂的非特异性结合有抗性。7mm2的面积通常足以用于分析处理1mL样品例如血液的6-通道装置的每一通道中的细胞。
膜可用染料(例如依加仑黑(irgalan black))处理或经涂覆用于减少背景荧光和改善成像。依加仑黑-染色的聚碳酸酯膜滤器从若干供应商(Sterlitech，SPI Supplies等)购得。示例性涂料包括炭黑、无电镀镍、溅踱金或金-钯和蒸发铝(Durtschi等Journal of MedicalMicrobiology 2005；54：843-850和Nishimura等Fisheries Science 2006；72：723-727)。
具体的膜包括孔径大小为0.6μm、9μm厚和3×107孔/cm2的径迹蚀刻聚碳酸酯膜；涂有50nm铝涂料的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；以及孔径大小为0.4μm、10μm厚、1×108孔/cm2、不含PVP、涂有50nm铝涂料的径迹蚀刻聚碳酸酯膜。
铝涂层具有显著优点，包括背景荧光低；激发光的吸收低并因此产热少，允许快速成像；表面光滑；无浸出(no leaching)；孔开放并且可伸缩；制造成本低。图8A-8B显示涂覆和未涂覆膜上细胞的显微照片。
铝在高和低pH时具有反应性。铝涂层可受到碱或酸介质腐蚀。若在测定中使用碱或酸介质，则可用SiO2外涂层使铝免受腐蚀。孔径大小为0.8μm、9μm厚和3×107孔/cm2、涂有50nm铝和50nmSiO2的径迹蚀刻聚碳酸酯膜适合与碱性介质使用。
对于光学检测，膜优选基本上为平面的。如图9所示，支持结构可用于保持平面性。也合乎需要的是，膜和成像光学器件(optic)之间液体量的最小化例如通过使通道深度最小化。到膜表面的光学通路通过透明层或壁提供。该层可为密封带、模制壳体的壁或透明材料例如玻璃的窗，其以密封方式附着到装置。光学检测器还可置于装置内部并且从外部不可见。
额外组件
本发明的装置还可包括例如用于样品引入、移动、分析和储存的额外元件。例如，本发明的装置可包括接受样品的储存器并且还包括用于接受取样器具(例如拭子、移液器或注射器针头)的样品室中的容器。这种容器的实例包括装置中的间隔(septa)和开口。在取样工具已将样品引入后可关闭任何开口，或者取样工具可通过间隔或垫圈密封到装置。
本发明的装置还可包括一个或多个光学传感器，例如如图5所示。传感器可用于确定特定量流体例如血液或含有光学可检测试剂的流体何时流经装置。其它类型的传感器例如电极或温度传感器也可用于此目的。
本发明的装置还可包括植入装置中或安置在装置附近的加热元件例如电阻加热元件以控制温度。温度传感器例如热敏电阻或热电偶可用于监测温度和/或提供恒温器控制。
本发明的装置还可包括用于分析的元件，包括光学元件，例如滤波器、镜片和光源(例如LED)以及电极，例如用于电导率(conductivity)、伏安法、电流测定法。
还将理解的是，可将本发明的装置制成本文所述那些元件的变型。装置还可包括与多个独立通道连接的两个或更多个独立入口，例如以测定在同一装置上的两个或更多个样品或者同一样品的两个或更多个等分试样。装置还可同时或连续采用多于一种类型的分析；例如样品可通过光学或电学测定。在这样的结构中，装置可包括用于每一方法的多种分析试剂，或者一种或多种分析方法可依赖于样品的固有性质。装置可包括不同类型的储存器；例如单个装置可采用粘附到通道壁的试剂和储存于用阀密封的室中的分析试剂。装置可包括任何数量的用于样品分开的通道，并且每一通道可采用相同或不同分析方法和/或分析试剂。
系统
本发明还包括用于分析和/或致动所述装置的系统。该系统包括用于例如通过插入与装置配合的容器。取决于所用的装置类型，系统可包括流体储存器和用于递送和移动试剂和/或样品通过该装置的泵。替代地或者此外，系统包括用于装置上的阀致动器。对于破裂阀，此类致动器可施加足够的机械压力以使阀上的密封破裂。夹阀还可通过施加到夹点(pinch point)的机械压力而致动。其它阀方案为本领域公知。装置中含有流体的阀的压缩也可用于泵送装置中的流体，避免需要单独的阀。
系统还包括检测器，通常是光学成像仪。若使用光学成像仪，则通常配置用于荧光检测，然而其他光度测定的检测是可能的，例如吸光度、磷光、浊度分析法和化学发光。成像仪可包括光源，例如发光二级管(LED)、激光或宽带源例如弧光或白炽灯，其适合用于被检测的光学信号。示例性光源使用三种LED；例如用于荧光素或Alexa 488的蓝色(457nm)；例如用于Tamra或Alexa 532的绿色(525nm)；以及例如用于Cy5或Alexa 647的红色(640nm)。具有高输出的LED可得自Luminus Devices，Inc(Billerica，MA)。成像仪还包括物镜。示例性的物镜特性是20×放大倍数、0.45数值孔径(NA)和1.25mm视野(FOV)。更优选地，10×放大倍数、0.45NA物镜(NikonInc，Melville，NY)可与成像镜片使用，其提供17.5×的总放大倍数和2.5mm FOV。成像仪还可包括光敏组件例如光电二极管、电荷耦合器件(CCD)阵列或光电倍增管(PMT)。放大倍数17.5×的光学系统可与格式为4872×3248像素的7.4微米像素CCD照相机(DVC，Austin，TX)组合以对2.5mm FOV成像。还可采用如本领域熟知的光学纤维和镜片。特别合适的荧光团和滤波器示于表2。
表2
Figure BPA00001482421800151
可通过将电极并入装置中使用非光学方法例如电化学方法。随后电极连接至系统中的电路。这样的测量实例包括电流测定法、循环伏安法或电导率。尿样本中病原体的电化学分析已通过联合使用塑料基底上的金电极与DNA捕获和分析探针而实现(Liao等Journalof Clin Microbiol 2006；44：561-570)。血液和其它样品中特定寡核苷酸的分析已用涂有自装配烷硫醇单层的金电极上的氧化还原标记的DNA茎-环探针的交流伏安法而实现(Lubin等Anal.Chem.2006；785671-5677)。
还可使用磁检测或放射性检测。例如磁弛豫测量可用于分析病原体例如鸟分支杆菌副结核种(Mycobacterium avium spp.Paratuberculosis)，其基于磁纳米颗粒的聚集(Nano Lett.，2007；：380-383)。
系统还可包括用于装置温度控制的加热和冷却系统，例如从20-80℃。加热和冷却可通过元件实现，所述元件为装置的一部分或当插入系统时与装置接触。加热和冷却可通过珀耳帖元件、电阻加热元件、散热装置、冷却扇或加热/冷却的循环流体而实现。加热和冷却还可通过当插入系统时的装置周围加热或冷却空气流而实现。
系统还可包括用于分析例如检测和/或计数装置的膜上的细胞、颗粒或分析物(例如与颗粒结合的分析物)的软件。基于颜色、形状、大小、亮度或第二形态(secondary morphology)(例如成簇)，软件还可用于区分不同类型的细胞、颗粒或分析物(例如与颗粒结合的分析物)。这样的软件可购自许多销售商例如Metamorph(MDS)和ImagePro(Media Cybernetics)或可使用数学软件例如MATLAB(Mathworks)创建。软件的性质还取决于所用的分析方法。
可提供其它组件。例如可包括条形码阅读器用于扫描装置上的鉴定鉴定标签和与样品相关的患者标识符。这样的条形码阅读器可构建入系统中或可以是通过导线(cable)或无线连接连接至系统的外部手提类型。打印机可用于生成打印的读出结果，其可并入患者图表或病历。系统还可包括用于连接至设备中主机(例如医院信息系统)的硬件和软件。
系统的元件可一起安装在单个单元中或者可为分开的组件。此外，尽管将用于分析、流体移动和温度所需的元件描述为系统的一部分，但与装置配合至系统相反的是，所述元件可集成至装置、系统或介于两者之间，如本文所描述。示例性系统框图示于图15。
方法
本发明的装置用于分析各种样品中细胞、颗粒和其它分析物(例如与颗粒结合的分析物)。用于本发明的步骤通常包括使样品(其可经预处理)通过装置，使得细胞、颗粒和其它分析物沉积于膜上。如本文所述，使细胞、颗粒和其它分析物(例如与颗粒结合的分析物)与分析试剂接触并且成像或另外进行分析。还可采用洗涤步骤以去除可干扰精确测量的任何分析试剂。
在一些方法中，将细胞裂解以释放其内容物。靶生物分子例如DNA、RNA、蛋白质、脂质和它们的复合物可随后捕获在装置中提供的颗粒例如珠上。样品中的分析物还可在引入装置中之前，结合至颗粒。颗粒通常用结合部分例如抗体或针对核酸的序列特异性探针(其经设计用于捕获靶分析物)表面功能化。这样的颗粒是本领域熟知的，例如胶乳珠、二氧化硅珠和顺磁珠。捕获步骤之后，颗粒混合物通过装置并沉积在膜上。分析可如细胞的情况一样进行。例如颗粒可以是荧光的。在Luminex xMAP系统中，具有不同结合部分的颗粒可发出与荧光不同的颜色。这样的颗粒随后可经混合并通过发射颜色区分。这允许在同一测定中分析多个分析物。用报告荧光团标记的结合部分可用于分析例如检测和定量分析物。若颗粒是荧光的，则报告荧光团与颗粒的颜色不同。
方法还可用于分析任何类型的细胞。例如方法可用于鉴定以下来源的生物体：培养物、环境样品例如空气、水、土壤或工业样品或生物样品例如血液、血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、气管内吸出物、痰、尿、脑脊液(CSF)和淋巴。方法可用于分析植物细胞、动物细胞、细菌、真菌(例如酵母菌)和原生生物，例如以鉴定特定生物体种类或其它分类例如细菌的、真菌的或原生生物。示例性的用途用于鉴定感染性生物体，例如血液培养物中酵母或细菌种类，和用于检测和鉴定导管相关血流感染(CR-BSI)。例如酵母分析可用于鉴定白假丝酵母(C.albicans)、平滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和热带假丝酵母(C.tropicali)。该方法还可用于区分金黄色葡萄球菌(S.aureus)对比凝固酶-阴性葡萄球菌(CNS)；粪肠球菌(E.faecalis)对比其它肠球菌；大肠杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)(EK)对比铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；白假丝酵母对比其它假丝酵母属(Candida)；以及血液培养物或CR-BSI中的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体(任选)。本发明的方法还可用于测定来自患者的细胞，例如用于诊断疾病状态。这样的细胞包括癌细胞、红细胞和白细胞、祖细胞、干细胞、胎儿细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞和血小板。微粒细胞器例如细胞核、叶绿体、线粒体还可在与其它用于分离的颗粒结合或不结合的情况下进行分析。
优选分析试剂是标记的核酸结合探针，例如WO 2005/121373所描述的PNA FISH探针(该专利通过引用结合到本文中)，DNA和LNA探针。探针可用多种可检测标签标记，包括荧光团、酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、电化学活性标记、磁颗粒、生物素和半抗原。其它分析试剂包括标记的抗体、适体和细胞内染料。还可使用用于免疫测定的试剂，例如ELISA所用的抗体-酶缀合物。
试剂可储存在储存器中的装置上，例如通道中的密封室或经干燥或胶化位置。对于沉积在通道上的试剂，几何形状和基质决定溶解试剂必需的时间。图10A显示几何形状对溶解的影响。如该图所示，平整表面(菱形)上的沉积比孔(正方形、三角形)中沉积导致更快释放。孔的宽度与深度的比率也影响释放速率，其中较窄较深的孔(三角形)导致释放较慢。图10B显示基质对溶解的影响。蔗糖(正方形)和无基质(菱形)比葡聚糖硫酸酯基质(三角形)导致释放更快。图10C-D显示以下不同基质对溶解速率的影响：360kDa聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(正方形)、葡聚糖硫酸酯(DS)(三角形)和甘露糖(正方形)。PVP比甘露糖或葡聚糖硫酸酯的释放快。额外的基质材料包括聚乙烯醇和聚乙二醇。
光学检测可为单色的或多色的。可用的荧光团集合包括FITC(或Alexa 488)/Tamra/Cy5(或Alexa 647)、FITC/Texas红色/Cy5和Alexa 405/FITC/Texas红色。原则上，三色的使用允许我们编码装置每一通道中的7个实体(entity)。这样的实例示于图11A-11F。图11A显示对于4道装置的道分配。1道包括用于金黄色葡萄球菌和对照生物体(C.O.)的绿色标记(FITC)试剂；用于CNS和C.O.的红色标记试剂(Tamra)；以及用于革兰氏阳性(G+)和泛真菌(pan fungal)的紫色标记试剂(Cy5)。2道包括用于粪肠球菌和C.O.的绿色标记试剂；用于其它肠球菌(OE)和C.O.的红色标记试剂；以及用于革兰氏阳性(G+)和泛真菌的紫色标记试剂。3道包括用于大肠杆菌+肺炎克雷伯氏菌(EK)和C.O.的绿色标记试剂；用于铜绿假单胞菌(P.aer)和C.O.的红色标记试剂；以及用于革兰氏阴性(G-)和泛真菌的紫色标记试剂。4道包括用于白假丝酵母和C.O.的绿色标记试剂；用于其它假丝酵母属种(O假丝酵母)和C.O.的红色标记试剂；以及用于全体细菌(BacUni)和泛真菌的紫色标记试剂。图11B显示包括金黄色葡萄球菌的样品的结果。在该测定中，在1道中，金黄色葡萄球菌细胞将被染成绿色和紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在2道中，金黄色葡萄球菌细胞将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在3道中，金黄色葡萄球菌将不会被染色，而C.O.将被染成绿色和红色；在4道中，金黄色葡萄球菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色。结果显示金黄色葡萄球菌存在于样品中而不含酵母菌或其它细菌于样品中。图11C显示包括铜绿假单胞菌样品的结果。在该测定中，在1道和2道中，铜绿假单胞菌将不会被染色，而C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在3道中，铜绿假单胞菌将被染成红色和紫色，并且C.O.将被染成红色和绿色；在4道中，铜绿假单胞菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色。结果显示铜绿假单胞菌存在于样品中，而酵母菌或其它细菌不存在于样品中。图11D显示包括棒状杆菌样品的结果。在该测定中，在1道、2道和4道中，棒状杆菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在3道中，棒状杆菌将不会被染色，而C.O.将被染成绿色和红色。结果显示未鉴定的革兰氏阳性细菌存在于样品中，并且对该生物体计数。图11E显示包括白假丝酵母样品的结果。在该测定中，在1道和2道中，白假丝酵母将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在3道中，白假丝酵母将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色和红色；在4道中，白假丝酵母将被染成绿色和紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色。结果显示白假丝酵母存在于样品中，而细菌或其它酵母菌不存在于样品中。图11F显示包括新生隐球菌(Cryptococcus neoforman)样品的结果。在该测定中，在1道和2道中，新生隐球菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色；在3道中，新生隐球菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色和红色；在4道中，新生隐球菌将被染成紫色，并且C.O.将被染成绿色、红色和紫色。结果显示酵母菌而非细菌存在于样品中，并且可对酵母菌计数。
图12A-12I显示使用图1A-1C装置的方法示意图。在步骤(a)中，例如经吸量管人工加入样品例如100μL-1mL。随后在步骤(b)中，将装置连接至系统并且将液体例如600μL/min杂交缓冲液泵送经过装置，例如达3分钟。在步骤(c)中，继续液体的泵送；例如流速降至20μL/min，并且将装置加热至55℃。在步骤(d)-(f)中，继续液体的泵送，导致沉积于多个通道的每一个中的分析试剂(例如PNAFISH试剂)释放(如伸长的椭圆形所示)。这些步骤可进行例如超过27分钟。在步骤(g)-(h)中，继续液体的泵送例如300μL/min达5分钟，导致从分析物中洗掉未结合的试剂。随后对染色的细胞或颗粒成像，例如在＜35℃(步骤(i))下。这些事件的顺序图像示于图13。
示例性方法步骤在实施例中描述。这些步骤可用于本发明的任何方法。
样品制备
在递送至装置前，样品可经或可不经预处理。样品可经处理以消除背景细胞或以溶解样品的粘性组分。样品可经预处理以从源基质分离目标细胞或样品可经处理以稳定目标细胞或富集目标细胞。例如血液样品可用抗凝血剂处理或可经处理以选择性裂解血液细胞。样品还可经过滤以去除非-细胞碎片。样品还可经稀释以降低粘度。额外的样品处理方法包括透化和固定。在分析之前，样品处理可在或可不在装置上进行。
用于血液样品的示例性裂解方法涉及将样品与9份0.7％吐温-20、0.01M磷酸钠缓冲液和来自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶(Amano/Sigma)接触，并且在37℃加热1小时。溶液还可按1∶1使用，在37℃加热30分钟。裂解缓冲液的额外成分可包括脂肪酶、胆固醇酯酶、双链DNA酶、0.1M磷酸钠缓冲液，以及不同或另外的去污剂(例如皂苷和Triton-X)。在如CR-BSI实例中所述的装置中进行裂解可能是有利的。
内部对照
本发明的方法还可使用内部对照细胞或颗粒，例如其可在裂解阶段加入至样品中。对照生物体的实例包括Protothecawickerhamii(藻类的一种)、椰氏副球菌(Paracoccus yeeii)(革兰氏阴性)和球形芽孢杆菌属(Bacillus sphaericus)(革兰氏阳性杆菌)。这些方法在每道中将使用针对对照生物体的探针；对照生物体还可与存在的其它探针反应(例如BacUni或G+，若生物体是革兰氏阳性菌)。对照生物体的形态可用作附加的标识符。内部对照的使用得以确定该方法是否恰如其分的起作用并且可用于说明装置中样品的不均等分开。
实施例1-酵母菌分析
设计假丝酵母物种板(Candida Speciation Panel)以分析血流感染中5个最普遍的假丝酵母种：白假丝酵母、平滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母和热带假丝酵母。它还包含通用酵母菌探针、其用于确定样品是否为酵母。假丝酵母物种板使用基于甲醇的PNA FISH测定，这可参见WO 2005/121373。整个测定是在本发明的装置中自动运行的。装置包含具有6种不同酵母探针的6个通道。将样品加入装置中，在此处进行杂交和洗涤。在杂交和洗涤步骤期间，有持续的流，其允许样品流向膜。一旦完成测定，观察膜的阳性酵母细胞。方法如下：
1.将酵母种(来自新鲜YM平板)接种到YM液体培养基并且生长约4-6小时。
2.4-6小时后，取100μL液体培养基培养物，稀释到1mL甲醇-杂交缓冲液中并且以600μL/min加入到图1的装置中。
3.在55℃以300μL/min的流速使探针/杂交溶液流经装置达5分钟，随后在55℃将流速降至20μL/min，达25分钟。
4.在55℃以300μL/min的流速使洗涤溶液流经装置达20分钟。
5.让装置冷却，随后使用20×物镜用FITC或双光带滤波器观察荧光。
试剂
杂交缓冲液包含甲醇(50％)、0.1M氯化钠、0.025M Tris-HCL(pH 9.0)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5％酵母提取液溶液和DEPC水(补至100％)。洗涤缓冲液包含0.025M氯化钠、0.005M Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、0.05％(v/v)ProClin 300和DEPC水(补至100％)。表3提供所用探针。
表3.
  白假丝酵母   Can26S03   Flu-OO-AGAGAGCAGCATGCA   SEQ ID No：1
  平滑假丝酵母   Cgla26S07k   Flu-OO-ACAGTCCCAAAGTGGT   SEQ ID No：2
  克鲁斯假丝酵母   Ckru26S02a   Flu-OO-CCTTCCACACAGACTC   SEQ ID No：3
  近平滑假丝酵母   Cpar26S04d   Flu-OO-TAGGTCTGGGACATC   SEQ ID No：4
  热带假丝酵母   Ctro26S07f   Flu-OO-CCAACGCAATTCTCCT   SEQ ID No：5
在该表中，显示PNA探针的序列。Flu代表连接在PNA分子N-末端的荧光素、O代表O-接头，用于使荧光团远离探针的杂交部分的9个原子二醇接头(即-NH(CH2CH2O)2CH2C(O)-)，以及A、C、T和G代表携带相应碱基的PNA单体。
若通道为阳性，则具有绿色荧光的酵母细胞存在于此通道的膜上。
针对代表10个真菌种类的10个参考菌株筛选假丝酵母物种板(表4)。
表4
Figure BPA00001482421800231
Figure BPA00001482421800241
用于鉴定酵母的方法的结果示于图14A-B。
系统中测定的替代操作如下。操作人员将样品加入装置中。样品进入装置并且流经分流器，其将样品的相等等分试样送至6个反应道的每一个。一旦插入系统，在装置上进行一系列的操作以处理样品。使含有除气的杂交缓冲液的泡罩致动。致动打开破裂阀，杂交缓冲液的受控流动开始。流动驱使样品至捕获膜，重构干燥的PNA，并且使试剂经过捕获在每个膜上的细胞。在55℃在流动下使细胞杂交30分钟。接着，使含有除气的洗涤缓冲液的泡罩致动。致动打开破裂阀并且使流动开始。在55℃洗涤缓冲液流经捕获的细胞达5分钟。随后将装置冷却至低于30℃。用对于每一视野寻找最佳焦点的自动聚焦系统光学扫描膜。基于细胞荧光和细胞形态对图像进行分析且评分。解读评分并且显示试验结果。储存图像用于调用和回顾。
该方法旨在用于临床微生物学实验室以分类(speciate)分离物(液体培养物或菌落)中酵母。
实施例2-CR-BSI
CR-BSI试验分析导致导管相关血流感染的一组最普遍生物体的样品：金黄色葡萄球菌/CNS、粪肠球菌/其它肠球菌、EK(大肠杆菌+肺炎克雷伯氏菌)/铜绿假单胞菌、白假丝酵母/其它假丝酵母属。其还并入通用酵母探针和细菌探针，这允许不包括其特异性探针的生物体的分析。革兰氏阳性和革兰氏阴性探针提供有关用通用探针检测的细菌的进一步信息。该方法解决了对用于诊断和控制导管相关血流感染的现场护理试验的未满足的临床需求。该试验可在重症监护病房(ICU)以及在插入导管患者接受护理时的类似情况下进行。该方法分析例如检测和分类从这些患者中取出的血液样品中细菌和酵母(主要通过导管且还可能外周取出)。
用于该测定的步骤总结如下(参考图5)
●加入血液；盖上；插入分析仪
●致动裂解液；打开破裂阀；将裂解液递送至血液室
●通过来回驱使血液/裂解液至混合室而混合(通过压力口的空气驱动)；孵育
●驱使经裂解的血液至膜(通过压力口的空气驱动(pneumaticdrive))
●致动push以将样品完全递送至膜并且进行介质交换；固定细菌
●致动杂交缓冲液包括分析探针；递送至膜；在慢速流动下孵育
●致动洗涤缓冲液；递送至膜；在流动下孵育
●成像
具体温度、流速和时间的范围示于表5。
表5
Figure BPA00001482421800261
HB＝杂交缓冲液；Push是不含甲醇的溶液例如裂解试剂。
TCEP＝三(2-羧乙基)膦
具体实验方案如下：
Figure BPA00001482421800262
Figure BPA00001482421800271
用于4-通道CR-BSI测定的示例性探针在图11A-11F中用图表描述。特异性探针示于表6。
表6
Figure BPA00001482421800272
1EK；2O假丝酵母
用于革兰氏阳性、革兰氏阴性和特定对照生物体的探针对于本领域技术人员将是公知的。
其它实施方案
尽管通过参考目前被认为是优选的实施例已经描述本发明，但应理解的是本发明不受限于公开的实施例。与此相反，在所附权利要求的精神和范围内，本发明意欲涵盖各种改变和等效改编。
所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中，其程度与特别地并且逐一指明每一单个出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合一样。当术语在本申请与在通过引用结合到本文的文献中限定不同时，本文提供的定义将用作该术语的定义。
其它实施方案在权利要求范围内。

Claims (49)

1.一种装置，其包括
具有与多个通道流体连通的流体入口的壳体，其中所述多个通道的每一个与容纳用于分析细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物的试剂的储存器流体连通；
一个或多个基本上平面的多孔膜，所述细胞或颗粒不通过所述膜；和
一个或多个出口，其中远离所述入口流动的液体在所述多个通道之间被分开且经所述一个或多个膜流向所述出口；
并且其中所述储存器安置在所述一个或多个膜的上游。
2.权利要求1的装置，其中所述分析试剂结合至与所述颗粒结合的靶分析物。
3.权利要求1的装置，还包括至少一个用于所述颗粒的储存器，其中所述储存器安置在所述入口和所述一个或多个膜中的一个之间，并且其中用于所述颗粒的所述储存器与所述多个通道的至少一个流体连通。
4.权利要求1的装置，其中所述壳体包括一个部分，通过所述部分可在所述一个或多个膜中之一上进行所述细胞或颗粒的光学分析。
5.权利要求1的装置，还包括邻近所述一个或多个膜中之一或在其上安置的用于所述细胞或颗粒电分析的电极。
6.权利要求1的装置，还包括用于所述细胞或颗粒磁弛豫分析的与所述一个或多个膜中之一邻近的磁共振检测器。
7.权利要求1的装置，还包括安置在所述一个或多个膜中之一和所述出口之间的废料储存器。
8.权利要求1的装置，还包括容纳液体试剂的储存器，其安置在所述入口和所述一个或多个膜中之一之间且通过阀与所述多个通道分开。
9.权利要求1的装置，还包括用于容纳样品的储存器，其安置在所述入口和所述一个或多个膜中之一之间且与所述多个通道流体连通。
10.权利要求9的装置，还包括通过阀与所述样品储存器分开的容纳液体试剂的储存器。
11.权利要求1的装置，还包括温度传感器和/或加热或冷却元件。
12.权利要求1的装置，还包括安置在所述入口和所述一个或多个膜中之一之间的被动混合器或主动混合器元件。
13.权利要求1的装置，其中所述多个通道的每一个具有基本相同的流体抗性。
14.权利要求1的装置，其中，对于所述多个通道的至少一个，将所述储存器安置在所述通道内。
15.权利要求1的装置，还包括多个分析试剂的储存器，其中每一储存器与所述多个通道中的至少一个流体连通。
16.权利要求15的装置，其中所述多个储存器中的每一个与所述多个通道的一个且仅一个流体连通。
17.权利要求16的装置，其中将每一所述储存器安置在所述通道内。
18.权利要求1的装置，其中，对于所述多个通道的至少一个，所述储存器通过阀与所述通道分开。
19.权利要求1的装置，其中分析试剂的所述储存器与所述多个通道的每一个流体连通，使得所述分析试剂远离所述入口的流动在所述多个通道之间被分开。
20.权利要求1的装置，其中所述一个或多个膜中之一是基本上非荧光的。
21.权利要求1的装置，其中所述一个或多个膜中之一对醇、酸或碱的降解有抗性。
22.权利要求1的装置，还包括分析试剂的多个储存器，其中所述多个通道的每一个通过储存器阀与所述试剂的储存器之一分开，并且还包括多个通道阀，当所述阀关闭时，防止所述通道和所述入口之间的流动。
23.权利要求22的装置，还包括样品室和液体试剂室，其中所述样品室和所述液体试剂室通过阀分开并且安置在所述入口和所述多个通道之间。
24.权利要求1的装置，其中所述储存器是机械可变形室，并且压缩所述室排出其内容物。
25.权利要求1的装置，其中所述出口允许气体而非液体通过。
26.具有用于与前述权利要求中任一项的装置配合的容器的系统，其包括(i)用于将流体从所述装置的所述入口泵向所述装置的所述出口的致动器；(ii)配置为与所述装置对接的温度控制器，以控制所述装置至少一部分的温度；和(iii)配置为与用于分析所述膜上细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物的所述装置对接的检测器。
27.权利要求26的系统，还包括配置为与所述装置对接的主动混合器元件，以混合所述入口和所述膜之间的两种流体。
28.权利要求26的系统，其中所述检测器是光学检测器、电检测器、或磁弛豫或磁共振检测器。
29.权利要求26的系统，还包括流体储存器和泵，以将流体从所述储存器递送到所述装置的所述入口。
30.分析样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将样品引入装置，所述装置包括
具有与多个通道流体连通的流体入口的壳体，其中所述多个通道的每一个与容纳用于分析细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物的试剂的储存器流体连通；
一个或多个基本上平面的多孔膜，所述细胞或颗粒不通过所述膜；和
一个或多个出口，其中远离所述入口流动的液体在所述多个通道之间被分开且经所述一个或多个膜流向所述出口；
并且其中所述储存器安置在所述一个或多个膜的上游。
其中所述样品包括所述细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物；
(ii)允许所述分析试剂与所述细胞、颗粒或分析物接触；
(iii)捕获所述膜上的所述细胞或颗粒；和
(iv)分析所述膜上的所述细胞或颗粒。
31.权利要求30的方法，其中所述分析试剂包括针对核酸的探针或抗体。
32.权利要求31的方法，其中所述探针包括PNA、DNA或LNA。
33.权利要求32的方法，其中所述细胞、颗粒或与所述颗粒结合的分析物还与结合所述探针或抗体的试剂接触，从而导致信号放大。
34.权利要求30的方法，其中所述分析试剂经标记用于光学、电或磁检测。
35.权利要求30的方法，其中所述分析试剂包括光学上可区分的并且与不同细胞、颗粒或结合至所述颗粒的分析物结合的多种试剂。
36.权利要求30的方法，还包括，在步骤(i)之后且在步骤(iv)之前，用液体试剂处理所述样品。
37.权利要求36的方法，其中所述装置还包括被动混合器，其经安置使得在流经所述装置的同时并且在接触所述膜之前，所述液体试剂和所述样品混合。
38.权利要求36的方法，其中所述处理步骤还包括用所述液体试剂主动混合所述样品。
39.权利要求38的方法，其中所述装置还包括样品储存器和通过阀与所述样品储存器分开的液体试剂储存器，其中在步骤(i)中将所述样品引入所述样品储存器，所述液体试剂储存于所述液体试剂储存器中，并且所述主动混合包括致动所述阀和将所述液体试剂转移至所述样品储存器或将所述样品转移至所述液体试剂储存器。
40.权利要求36的方法，其中所述液体试剂包括稀释剂、裂解缓冲液或包含与所述分析物的结合部分的所述颗粒。
41.权利要求40的方法，其中将所述样品与包含结合部分的所述颗粒在如下条件下接触：其中所述样品的所述分析物与所述颗粒结合，在步骤(iii)中其由所述膜捕获。
42.权利要求30的方法，其中所述样品与对照颗粒接触，对照颗粒随后在多个通道之间与所述样品成比例地被分开，其中所述对照颗粒在步骤(iii)中由所述膜捕获。
43.权利要求30的方法，其中所述装置还包括容纳分析试剂的多个储存器，其中所述多个储存器之一安置在所述多个通道的每一个内，并且在步骤(ii)中所述分析试剂通过相邻液体的流动从所述储存器释放。
44.权利要求30的方法，其中所述装置还包括容纳分析试剂的多个储存器，其中所述多个储存器之一通过阀与所述多个通道的每一个分开，并且步骤(ii)包括致动所述阀。
45.权利要求30的方法，其中所述细胞是微生物并且对其进行分析。
46.权利要求30的方法，其中分析所述细胞并且受试者由于疾病而产生所述细胞。
47.权利要求30的方法，其中所述样品包括培养物、环境样品或生物样品。
48.包括权利要求1-25中任一项的装置和稀释剂、裂解缓冲液、杂交缓冲液或对照颗粒的试剂盒。
49.可检测、鉴定和定量复杂生物样品中低水平微生物的装置。
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