CN107533076A - 连续流微流体系统 - Google Patents

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T·利弗
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K·欧
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Abstract

本公开涉及用于大规模生产用于递送治疗材料的纳米颗粒的改进的系统和方法。该设备可用于制造包含治疗材料的广泛的纳米颗粒，包括但不限于脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。在某些实施例中，连续流操作和微流体混合器的并行化有助于提高纳米颗粒的生产量。

Description

连续流微流体系统
相关申请的交叉引用
本申请要求在2015年2月24日提交的美国专利申请No.62/120179以及在2016年1月6日提交的美国专利申请No.62/275630的权益，其全部内容通过引用包含于此。
背景技术
大规模制造用于临床开发和商业生产的药物组合物历来具有挑战性。通常用于药物的小规模生产的在实验室中使用的技术不适合放大。当制造诸如纳米颗粒的复杂的药物胶体系统时，这些挑战更加严重。纳米颗粒包含多个组分，包括但不限于脂类、聚合物、低分子量化合物、核酸、蛋白质、肽和包括无机分子的成像剂。制造纳米颗粒的传统工艺是基于批量的系统，并且通常导致产生亚稳定的纳米颗粒，其中，诸如尺寸、多分散性、和包封率的颗粒特性对于批量制造工艺内的(局部)环境变化是敏感的，包括但不限于，温度、PH、离子强度、缓冲液组成、溶剂浓度。因此，制造纳米颗粒的传统的批量工艺是昂贵的、耗时的并且难以再现，这需要对导致增加商业风险的批量尺寸增加的实质性优化。此外，传统的纳米颗粒制造工艺需要纳米颗粒产品与制造设备接触，这需要昂贵和耗时的清洗和灭菌验证，因为在每批制造之后处理设备不是经济上可行的。
考虑到这些挑战，期望产生更大的生产量的改进的纳米颗粒制造系统。
发明内容
提供本概述以简化形式介绍下文在具体实施方式中进一步描述的概念的选择。本概述不旨在确定所要求保护的主题的主要特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
在一个方面，提供了一种用于微流体芯片的连续流操作的系统。在一个实施例中，系统包括：
(1)微流体芯片，包括：
(a)第一入口，其被配置成接收第一溶液；
(b)第二入口，其被配置成接收第二溶液；以及
(c)第一混合器，包括：
(i)第一入口微通道，其被配置成从所述第一入口接收所述第一溶液；
(ii)第二入口微通道，其被配置成从所述第二入口接收所述第二溶液；以及
(iii)混合微通道，其被配置成混合所述第一溶液和所述第二溶液以在混合器出口提供纳米颗粒溶液；以及
(d)芯片出口，其通过纳米颗粒溶液微通道与所述混合器出口流体连通；
(2)第一连续流流体驱动器，其被配置成将来自第一溶液储藏器的所述第一溶液连续地驱动至所述微流体芯片的所述第一入口；
(3)第二连续流流体驱动器，其被配置成将来自第二溶液储藏器的所述第二溶液连续地驱动至所述微流体芯片的所述第二入口；以及
(4)系统出口，其与所述芯片出口流体连通，其中所述系统出口被配置成输出所述纳米颗粒溶液。
在一个方面，提供了形成纳米颗粒的方法。在一个实施例中，该方法包括使第一溶液和第二溶液流过根据所公开的实施例的系统，并在微流体芯片的第一混合器中形成纳米颗粒溶液。
附图说明
当结合附图参考以下详细描述时，本发明的上述方面和许多附带的优点将变得更容易理解并同样更好地理解，其中：
图1是本公开的连续流系统的示意图。
图2是本公开的连续流系统的示意图。
图3是本公开的代表性流体装置的示意图。
图4示出代表性siRNA-脂质纳米颗粒(siRNA-LNP)的粒径(nm)和多分散指数(PDI)，其作为使用歧管并行布置的四个单微流体混合器装置或在图3所示的代表性单个装置中并行布置的四个微流控混合器的函数。siRNA-LNP由摩尔比为50:10:38.5:1.5的1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，且siRNA-总脂质比为0.06wt/wt，并且使用图2所示的示例性连续流系统产生纳米颗粒，该连续流系统具有使用歧管(4X歧管)并行布置的四个单微流体混合器装置，或者具有在图3所示的在单个装置中并行布置的四个微流体混合器(芯片上4X(4X on-chip))。在图例中示出通过微流体装置的总流速。误差棒表示平均值的标准偏差。
图5示出代表性siRNA-脂质纳米颗粒(siRNA-LNP)的粒径(nm)和多分散指数(PDI)，其作为制备体积的函数。siRNA-LNP由摩尔比为50:10:38.5:1.5的1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，且siRNA-总脂质比为0.06wt/wt，并且使用图2所示的示例性连续流系统产生纳米颗粒，该连续流系统具有使用歧管并行布置的八个单微流体混合器装置。每100mL从0mL至500mL采样纳米颗粒，结果与使用NanoAssemblrTMBenchtop Instrument制备的相同siRNA-LNP的2mL制剂进行比较。NanoAssemblrTM台式仪是市售可得的实验室设备，其使用微流体制造固定体积批量的纳米颗粒。误差棒表示平均值的标准偏差。
图6是本公开的代表性系统、连续流交错人字形(SHM)微混合器的示意图。两个单独的流的混合发生在图案化的中心通道中，其凹槽化的壁驱动混沌搅拌注入的流体的交替的二次流。混沌混合导致界面面积的指数增加，从而减少两种流体之间的扩散距离。两相的快速相互扩散(包含水和乙醇的完全溶剂化脂质)导致LNP的自组装，其尺寸主要取决于其脂质组成和水/乙醇流速比。
图7是用于制备极限尺寸的脂质纳米颗粒的代表性并行流体结构的三维图。
图8A示出了图7中所示的代表性并行流体结构的顶视图，并且图8B示出了侧视图。图8A的顶视图示出了并行的两个平面人字形结构。图8B的侧视图示出了流体并行的流体结构具有三层，以提供总共六个人字形结构。
图9示出了用于制备极限尺寸的脂质纳米颗粒的第二代表性并行流体结构。
图10是具有“垂直”连接(即，垂直于装置的主平面延伸)的示例性4x并行微流体系统的标记照片，其包括两个连续流泵以及耦合到入口和出口歧管的四个微流体混合芯片。
图11是具有“水平”连接(即，平行于装置的主平面延伸)的示例性8x并行微流体系统的标记照片，其包括两个连续流泵以及耦合到两个入口歧管和一个出口歧管的八个微流体混合芯片。
图12A示出了根据所公开的实施例的环形对Dean涡流分叉混合器(DVBM)。图12B是根据所公开的实施例的示例性环形DVBM混合器的照片。
具体实施方式
本公开涉及用于大规模生产用于递送治疗材料的纳米颗粒的改进的系统和方法。该设备可用于制造包含治疗材料的广泛的纳米颗粒，包括但不限于脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。在某些实施例中，连续流操作和微流体混合器的并行化有助于增加纳米颗粒的生产量。虽然目前的描述主要涉及通过混合溶液来制造纳米颗粒，但可以意识到，这些装置、系统和方法通常适用于这些应用之外。因此，由所公开的实施例设想到任何组合物的两种或两种以上的溶液的混合。
微流体混合器是集成到在微流体芯片上的微流体装置中的微流体元件。如本文所用的，将微流体芯片定义为包含设置在其中的一个或多个微流体装置，以及用于将流体输入和输出连接到微流体装置的入口和出口的平台。将微流体装置定义为微流体元件，其包括至少一个入口、一个出口、以及一个执行诸如混合、加热、过滤、反应等的流体功能的部分。在本文公开的几个示例性实施例中，所述微流体装置是被配置成在混合器中混合第一溶液和第二溶液以提供混合溶液的微流体混合装置。然而，其它微流体装置也与所公开的系统兼容。
特别地，本公开提供了一种用于制造纳米颗粒的连续流设备，其能够实现纳米颗粒的从用于临床前开发的小规模(例如，小于50mL)生产到用于临床开发和商业供应的大规模生产(例如，大于1000L)的简单、快速和可再现的制造。此外，本公开采用微流体技术，其在制备期间具有对环境因素的精致控制的优点，并且微流体技术拥有另外的优点，即在不需要另外的工艺优化的情况下通过微流体混合器的并行化来使增加的输出成为可能。并行的微流体混合器的数量由批量尺寸需求以及用于批量制造的期望时间范围决定。在其他实施例中，本公开提供具有完全一次性的流体路径的用于制造纳米颗粒的连续流扩大设备。完全一次性的流体路径使得用户消除了用于GMP制造的昂贵和耗时的清洁验证方案。
图1是用于大规模纳米颗粒生产的基于连续流微流体的制造设备的本公开的范围的示意图。代表性系统100使用软件系统102来控制制造参数，诸如但不限于流体流速、用于独立的流体流的流速的比率、设备内的压力、以及温度控制。设备100包括由流体驱动器106(例如，泵)驱动的两个或更多个(n1)独立的流体入口流以将纳米颗粒和治疗材料的流从储藏器104提供至分流连续流动流的歧管系统107，并且驱动相等的流量至包含在并行的微流体混合器阵列108内的每个微流体混合器的入口。微流体混合器的数量(n2)根据吞吐量需求来缩放。在一个实施例中，混合器的数量是2或更大。在一个实施例中，混合器的数量是2。在一个实施例中，混合器的数量是3或更大。在一个实施例中，混合器的数量为3。在一个实施例中，混合器的数量是4或更大。在一个实施例中，混合器的数量是4。在一个实施例中，混合器的数量是8或更大。在一个实施例中，混合器的数量是8。在一个实施例中，混合器的数量是10或更大。在一个实施例中，混合器的数量是10。在一个实施例中，混合器的数量是20或更大。
在某些实施例中，在混合器阵列108之后，按顺序布置一个或多个(n3)后形成的微流体混合器110，以使得一个或多个附加组件(n4)(例如，靶向配体)可以被添加到从最初的微流体混合器阵列108出来的纳米颗粒，或者使得快速缓冲交换或稀释可以直接在纳米颗粒制造后发生。后形成的微流体混合器110也可以与混合器阵列108一样是并行的，并且从流体驱动器112经由连续流从储藏器114供给材料。
经由由于混合器阵列108内的流体流的快速混合引起的纳米沉淀而形成纳米颗粒。在一个实施例中，来自微流体混合器阵列108或后形成微流体混合器110的出口流被合并回单个的流(例如，使用歧管)并且所产生的纳米颗粒/水性/有机混合物随后利用经由流体驱动器116递送的水性试剂118的一个或多个(n5)流稀释以在进一步处理前稳定纳米颗粒产品。稀释步骤可以通过在线稀释实现，其中，水性缓冲液直接与输出流接触。可替换地，可以使用另一微流体混合器阵列作为后形成微流体混合器110的一部分来实现稀释。连续流加工中的另一个好处是在稀释颗粒产品中的时间延迟会影响颗粒的质量和稳定性。因此，混合器和稀释之间的管道长度和滞留体积可以被调整，以便在稀释之前有足够的时间使颗粒“成熟”。管道用作累加器以在稀释之前收集和保持产品(在“保持时间”内)。在一个实施例中，最后混合器(例如，108或110)和稀释结(dilution junction)之间的距离约为1cm至约50cm。在一个实施例中，最后混合器(例如，108或110)和稀释结之间的距离约为1cm至约10cm。在一个实施例中，最后混合器(例如，108或110)和稀释结之间的距离约为10cm至约50cm。
在另一实施例中，将包括管道尺寸和流量特性的系统配置成产生特定的保持时间。在一个实施例中，保持时间为约5秒至约1小时。在一个实施例中，保持时间为约30分钟至约1小时。在一个实施例中，保持时间为约5秒至约60秒。在一个实施例中，保持时间为约5秒至约10秒。在一个实施例中，保持时间大于约5秒。在一个实施例中，保持时间大于约10秒。在一个实施例中，保持时间大于约60秒。在一个实施例中，保持时间大于约10分钟。在一个实施例中，保持时间大于约30分钟。在一个实施例中，保持时间大于约45分钟。
当阀被配置成使得流被引导至最终的纳米颗粒产品收集部件128时，阀在系统到达稳定状态之前将流引导至废料收集部件119。
在某些实施例中，在专门的屏障设施中进行纳米颗粒制造，该设施消除了过滤的需要，以确保无菌产品。
图2是本公开的代表性系统，一种用于大规模纳米颗粒生产的基于连续流微流体的制造设备的示意图。代表性系统200包括两个流体驱动器206、208，以经由连接整个系统的管道226提供水性缓冲液204和含水溶性有机物的溶解的脂质流202的连续流。歧管210和211分流连续流动流，并且驱动相等的流量至每个并行的混合器的入口。微流体混合器的数量根据吞吐量需求来缩放，并且在示例212中有8个混合器。纳米颗粒经由由于微流体混合器内的水性的有机流的快速混合引起的纳米沉淀来形成。来自8个并行的混合器的出口流使用歧管214合并回单个流并且所产生的纳米颗粒/水性/有机混合物随后利用经由T型连接器220泵入218的水性试剂216稀释以在进一步处理前稳定纳米颗粒产品。在一个实施例中，从每个微流体混合器形成的纳米颗粒在合并到最终的输出流之前进行质量和期望特性的分析。在将流引导至样本收集部件228时，在系统222的末端的阀在系统到达稳定状态之前引导来自废料收集部件224的流。在描述的场景中的流体接触材料可以重新使用，或者是一次性使用的。一次性使用消除了对流体接触部件进行清洁和清洁验证的需要，从而节省了大量的时间和资源。
图2示出了本公开的一个实施例，设备200。在一个实施例中，所述设备提供用于制造包含核酸的脂质纳米颗粒的系统。在另一实施例中，该设备提供了用于制造极限尺寸脂质纳米颗粒的系统，极限尺寸脂质纳米颗粒包括但不限于包含治疗材料的脂质体和纳米乳。在另一实施例中，该设备提供用于制造包含治疗材料的聚合物纳米颗粒的系统。
在一个方面，提供用于微流体芯片的连续流操作的系统。在一个实施例中，系统包括：
(1)微流体芯片，包括：
(a)被配置成接收第一溶液的第一入口；
(b)被配置成接收第二溶液的第二入口；以及
(c)第一混合器，包括：
(i)第一入口微通道，被配置成从第一入口接收第一溶液；
(ii)第二入口微通道，被配置成从第二入口接收第二溶液；
以及
(iii)混合微通道，被配置成混合第一溶液和第二溶液以在混合器出口提供纳米颗粒溶液；以及
(d)芯片出口，经由纳米颗粒溶液微通道与混合器出口流体连通；
(2)第一连续流流体驱动器，被配置成将来自第一溶液储藏器的第一溶液连续地驱动至微流体芯片的第一入口；
(3)第二连续流流体驱动器，被配置成将来自第二溶液储藏器的第二溶液连续地驱动至微流体芯片的第二入口；以及
(4)与芯片出口流体连通的系统出口，其中，系统出口被配置成输出纳米颗粒溶液。
现在将更详细地描述系统和方法。
连续流
连续流允许使用传统上为小批量生产系统的微流体生产大量的产品(例如，纳米颗粒)。在下文中更详细地描述的并行化的使用进一步增加了与连续流相结合的生产能力。
如本文使用的，术语“连续的”和“连续地”指的是在长的持续时间内的相对恒定流速的系统流操作。恒定流速不是不变的，而是在长时间操作中改变很少。在流中的变化称为“脉冲”或“脉动”。脉动的水平取决于流体驱动器的操作条件(例如，流速和背压)。在一个实施例中，恒定流速在50毫升/分的流速和250PSI的背压下变化+/-10％或更少。在另一实施例中，恒定流速在50毫升/分的流速和250PSI的背压下变化+/-4％或更少。这些值为在没有任何脉冲阻尼器的情况下。
脉冲阻尼器在某些实施例中被合并至系统以最小化来自连续流流体驱动器的一个或多个的流脉动。
在一个实施例中，脉冲阻尼器在流脉动中具有3:1的降低(取决于泵操作条件)。在一个示例性实施例中，脉冲阻尼器包括柔性PTFE薄膜和不锈钢和聚醚醚酮作为流体接触材料。
在一个实施例中，在连续操作期间产生的体积是在10分钟持续时间内完成的至少100mL。在另一实施例中，在连续操作期间产生的体积是在2.5分钟持续时间内完成的至少100mL。在另一实施例中，在连续操作期间产生的体积是在1.3分钟持续时间内完成的至少100mL。
由于对高吞吐量和必要的高流速的期望，微流体装置所经历的压力相对较高。在一个实施例中，该系统在高达500PSI的压力下工作。系统的峰值压力在泵的出口处。泵出口处的背压是每个下游部件(管道、歧管、芯片等)的背压的总和。对于系统中的微流体元件，最大压力发生在芯片的入口处。微流体芯片的入口压力可以达到200PSI的最大值。在一个实施例中，微流体芯片上的峰值压力从约100PSI到约200PSI。在一个实施例中，系统在约5PSI到约200PSI的压力下工作。
在一个实施例中，该系统能够在每个微流体混合器上每小时产生大于500毫升的产品。在一个实施例中，该系统能够在每个微流体混合器上每小时产生大于750毫升的产品。这些生产率可以通过并行化来增加，以使单个系统每小时产生多升的产品。
由于经由微流体的生产的小型化和由连续流操作提供的增加的容量，所公开的系统的占地面积(footprint)与能够每单位时间产生类似体积的已知系统相比大大减小。作为示例，最小的商业可用的批量系统NanoAssemblr(由不列颠哥伦比亚的温哥华的Precision Nanosystems公司制造)是具有小的占地面积的微流体系统。然而，由于批量处理的缓慢性质，为了在80分钟产生1L的纳米颗粒，将需要40个NanoAssemblr，这将导致约2m2的占地面积。这至少是在本文中公开的甚至最基本的连续流系统的占地面积的两倍。
在一个实施例中，该系统的占地面积为1平方米或更少。在一个实施例中，该系统的占地面积为0.8平方米或更少。图10中示出了代表性系统的照片，其具有驱动四个微流体混合芯片(4x)的两个泵，每个具有单个混合器。该系统的占地面积约0.8平方米，并且它每小时可产生超过1升的纳米颗粒溶液。进一步的并行化可以提高该生产率，甚至还同时保持基本相同的占地面积。
图10的系统包括3:1的流量比(泵#2：泵#1)以及歧管和微流体芯片之间的“垂直”连接(垂直于芯片的主要表面)。
参考图11，示出了由两个泵驱动的8x系统。两个歧管分配要在八个芯片上混合的溶液，每个芯片包含类似于图6所示的单个SHM混合装置。单个第三歧管接收来自八个芯片的混合溶液并将它们集中在单个流中以用于后混合处理、稀释和/或产品捕获。图11的系统区别于与图10的系统也在于从歧管至芯片的连接是“水平”构造，平行于芯片的主要表面。与垂直构造相比，连接的水平构造是意料不到地有益的。垂直构造原本似乎更有优势，因为每个混合器组件占用更少的空间。然而，在由垂直连接器创建的受限空间中，由用户对连接的操纵变得困难。通过使用水平连接器，连接容易操作且更加用户友好。
在一个实施例中，系统的生产量为每小时0.76升的纳米颗粒溶液。在具有多个混合器的实施例中(例如，在相同的微流体芯片或分离的微流体芯片上)，可以通过混合器的数量N来增加生产量。例如，四个混合器可以产生4×0.76升/小时的体积。在另一实施例中，该系统的生产量为每小时0.5升的纳米颗粒溶液。在另一实施例中，系统的生产量为每小时1.0升的纳米颗粒溶液。
在一个实施例中，该系统是可缩放的以产生从0.025L至5000L的产品溶液。
在一个实施例中，系统的输出仅受初始材料的量的限制。也就是说，只要初始溶液可用，系统就可以从初始溶液中产生产品。因此，由于连续流的使用，单个操作期间中的生产量基本上不受系统约束的限制。
微流体混合器
微流体芯片被配置成通过混合区域将第一溶液与第二溶液混合。这种混合过程的许多方法是已知的。在一个实施例中，混合是混沌对流。相容的微流体混合方法和装置在以下公开：
(1)美国专利申请No.13/464690,其是2010年11月4日提交的PCT/CA2010/001766的继续，其要求于2009年11月4日提交的USSN 61/280510的利益；
(2)美国专利申请No.14/353460,其是2012年10月25日提交的PCT/CA2012/000991的继续，其要求2011年10月25日提交的USSN 61/551366的利益；
(3)2014年3月14日提交的PCT/US2014/029116(在2014年10月23日公布为WO2014/172045),其要求2013年3月15日提交的USSN 61/798495的利益；
(4)2014年7月25提交的PCT/US2014/041865(在2015年1月29日公布为WO 2015/013596),其要求2013年7月26日提交的USSN 61/858973的利益；
(5)PCT/US2014/060961,其要求2013年10月16日提交的USSN 61/891758的利益；以及
(6)2016年1月6日提交的美国专利申请No.62/275630,
其公开的全部内容通过引用包含于此。此外，代表性微流体装置在本文更详细地公开。
在某些实施例中，提供装置用于制备本文公开的类型的纳米颗粒。微流体装置被合并至本文公开的连续流系统和方法中。在一个实施例中，参考图6，装置包括：
(a)第一入口302，用于接收包含第一溶剂的第一溶液；
(b)第一入口微通道304，与第一入口流体连通以提供包含第一溶剂的第一流；
(c)第二入口306，用于接收在第二溶剂中包含脂质颗粒形成材料的第二溶液；
(d)第二入口微通道308，与第二入口流体连通以提供在第二溶剂中包含脂质颗粒形成材料的第二流；以及
(e)第三微通道310，用于接收第一和第二流，其中第三微通道具有第一区域312和第二区域314，第一区域312适于使第一和第二流流动，第二区域314适于使第一和第二流的内含物混合以提供包含极限尺寸脂质纳米颗粒的第三流。这样形成的脂质纳米颗粒由微通道316从第二(混合)区域引导至出口318。
在一个实施例中，微通道的第二区域包括浅浮雕结构。在某些实施例中，微通道的第二区域具有主流动方向和具有限定在其中的至少一个凹槽或突起的一个或多个表面，所述凹槽或突起具有与主方向形成一角度的定向。在其它实施例中，第二区域包括微混合器。
在装置和系统中，用于改变第一流和第二流的流速的手段用于快速混合流，从而提供纳米颗粒。
在某些实施例中，本公开的装置提供完全混合在小于10ms内发生。
在某些实施例中，装置的一个或多个区域被加热。
在一个实施例中，第一混合器包括混合区域，所述混合区域包括微流体混合器，所述微流体混合器被配置成混合所述第一溶液和所述第二溶液以提供由所述第一溶液和所述第二溶液混合形成的纳米颗粒溶液。
在一个实施例中，第一混合器是混沌对流混合器。
在一个实施例中，混合区域包括人字形混合器。虽然SHM混合器在某些图(例如图6)中示出，但可以理解，也考虑其它混合配置。在一个实施例中，混合器是迪恩(Dean)涡流混合器。在另一实施例中，混合器是Dean涡流分叉混合器(DVBM)，这在下面更详细地讨论。在一个实施例中，微流体芯片包括两种不同类型的混沌对流混合器。在另一实施例中，两种不同类型的混沌对流混合器是SHM和Dean涡流。在一个实施例中，微流体芯片包括两种不同的类型的混沌对流混合器，其中，两个混沌对流混合器中的至少一个选自由SHM和Dean涡流组成的集合。
在一个实施例中，混合区域具有约20微米至约300微米的流体动力学直径。在一个实施例中，混合区域具有约113微米至约181微米的流体动力学直径。在一个实施例中，混合区域具有约150微米至约300微米的流体动力学直径。如本文所使用的，流体动力学直径使用通道宽度和高度尺寸被定义为(2*宽度*高度)/(宽度+高度)。
混合区域也可以使用标准宽度和高度测量来定义。在一个实施例中，混合区域具有约100至约500微米的宽度和约50至约200微米的高度。在一个实施例中，混合区域具有约200至约400微米的宽度和约100至约150微米的高度。
为了维持层流和保持在微流体装置中的溶液的行为可预测和方法可重复，系统被设计成以低雷诺数支持流动。在一个实施例中，第一混合器被设计尺寸并且被配置成以小于2000的雷诺数混合第一溶液和第二溶液。在一个实施例中，第一混合器被设计尺寸并且被配置成以小于1000的雷诺兹数混合第一溶液和第二溶液。在一个实施例中，第一混合器被设计尺寸并且被配置成以小于900的雷诺数混合第一溶液和第二溶液。在一个实施例中，第一混合器被设计尺寸并且被配置成以小于500的雷诺数混合第一溶液和第二溶液。
在一个实施例中，微流体混合器装置包含一个微混合器。在一个实施例中，单个混合器微流体装置具有两个区域：第一区域，用于接收和流过至少两个流(例如，一个或多个第一流和一个或多个第二流)。第一和第二流的内含物在第二区域的微通道中混合，其中第一和第二区域的微通道具有约20至约500微米的流体动力学直径。在另一实施例中，微通道的第二区域具有主流动方向和具有限定在其中的至少一个凹槽或突起的一个或多个表面，凹槽或突起具有与主方向形成一角度的定向(例如，交错人字形混合器)，如在US 2004/0262223中描述，其全部内容明确地通过引用包含于此。在一个实施例中，微通道的第二区域包括浅浮雕结构。在某些实施例中，第二区域各自具有从1至约50毫升/分钟的流体流速。在优选实施例中，微流体装置的混合通道为300微米宽和130微米高。人字形结构是40微米高和50-75微米厚。
在其它实施例中，第一和第二流利用其它微混合器混合。合适的微混合器包括液滴混合器、T形混合器、锯齿形混合器、多层混合器、或其它有源混合器。
在一个实施例中，微流体混合器装置安装在包含夹紧系统的装置保持器中。装置保持器和夹紧系统在微流体混合器装置上提供机械力以密封装置的入口和出口端口。在另一实施例中，装置保持器和夹紧系统包括密封垫片，以在微流体混合器装置和装置保持器的入口和出口端口之间提供紧密密封。在一个实施例中，密封垫片用作弹簧，以当通过夹紧系统安装在装置保持器中时，均匀地将力分布在平面微流体混合器装置上。在优选实施例中，密封垫片是O形环。在一个实施例中，装置保持器和夹紧系统包括通过紧固螺钉施加机械力的实心聚碳酸酯板。在另一实施例中，微流体混合器装置和装置保持器是单个一次性塑料件，无需基于垫片的夹紧系统。
溶液和产品
本文公开的系统和方法的一个功能是在溶液中形成纳米颗粒(“产品”)。本发明人的先前公开涉及生成与本系统相容的纳米颗粒，诸如之前通过引用并入的那些申请。已知的和未来开发的纳米颗粒方法可以在所公开的系统上进行到以下程度，所述方法需要第一溶液与第二溶液的受控组合以形成纳米颗粒产品，如本文所述。
本文也被称为“水性试剂”的第一溶液在此在第一溶液储藏器中提供。在一个实施例中，第一溶液包括第一溶剂。在一个实施例中，第一溶液包括活性药物成分。在一个实施例中，第一溶液包括第一溶剂中的核酸。在另一实施例中，第一溶液包括缓冲液。在一个实施例中，第一溶液基本上由缓冲液组成。
本文也被称为“溶剂试剂”的第二溶液在此在第二溶液储藏器中提供。在一个实施例中，第二溶液包括第二溶剂。在一个实施例中，第二溶液包括第二溶剂中的脂质颗粒形成材料。在一个实施例中，第二溶剂是水溶性溶剂(例如，乙醇或乙腈)。在某些实施例中，第二溶液是含有聚合物纳米颗粒形成试剂的水性缓冲液。
在一个实施例中，第一溶液包括第一溶剂中的核酸，和第二溶液包含第二溶剂中的脂质颗粒形成材料。
并行化
在所公开的系统的最基本配置中，单微流体混合器包含在一个微流控芯片上的一个微流体装置中。然而，生产量的增加是通过并行化混合器实现的，无论是通过芯片上并行化、使用多个芯片、或两者。
在一个实施例中，系统还包括多个混合器，每个混合器包括第一入口、第一入口微通道、第二入口、第二入口微通道、混合微通道、混合器出口和芯片出口，其中多个混合器包括第一混合器。在一个实施例中，多个混合器都是相同的尺寸。在另一实施例中，多个混合器具有不同的尺寸。
在一个实施例中，多个混合器在多个微流体芯片内。在另一实施例中，多个混合器位于单个微流体芯片上。
在一个实施例中，微流体混合器阵列包括并行布置的1-128个微流体混合器，以增加制造系统的吞吐量。作为示例，根据所公开的实施例的128-混合器系统能够产生约1.5升/分钟的纳米颗粒溶液。
在另一实施例中，微流体混合器装置包含多于一个微混合器。在一个实施例中，单个装置包含四个微流体混合器(图3)。在示例性实施例中，微流体混合器并行地布置在单个装置中。图3提供了代表性装置250的示图，该装置250包括两个入口通道255，其用于供给流体歧管系统260(即，芯片上歧管)。流体歧管系统在并行地布置在单个装置260中的四个微流体混合器之间平均地分流入口流。微流体混合器的输出被收集在出口265中。在另一实施例中，以与类似于图2的出口歧管214的方式，每个混合器的出口265与从所有四个装置收集混合溶液的出口歧管系统(未图示)进行流体连通。
图3中的装置是单个装置中的微流体混合器的平面并行化的一个示例。平面并行化是指将一个或更多个混合器放置在同一水平面上。这些混合器可以或可以不通过流体总线通道连接(例如，连接四个出口265)。通过在入口和出口之间创建相同的流体路径来确保通过每个混合器的相等的流量。垂直并行化是通过形成平面混合器并将它们一起以共享共同入口的方式分层来实现的。理论上，从入口流动到下部混合器的流体比流向顶部混合器的流体遇到更高的阻力，从而导致较低的流速。然而，通过最小化混合器之间的间隔，与混合结构的整体电阻相比，增加的电阻可以忽略不计(其对于每一层都是相同的)。此外，增加通向微流体混合器入口的流体总线的直径减少总线的阻抗和所产生的各个混合器之间的阻抗差。
在另一实施例中，单个装置具有在芯片的平面和垂直方向的微流体混合器阵列，用于高密度三维微流体并行化。在其它实施例中，微流体混合器阵列可按顺序布置以用于复杂纳米颗粒系统的多步制备。在某些实施例中，本公开的系统以每个微流体混合器在1毫升/分钟和50毫升/分钟之间的流速运行。在另一实施例中，该系统的至少一个微流体混合器以约10毫升/分钟至约25毫升/分钟的流速运行。在另一实施例中，每个独立的连续流流体驱动器以1升/分钟的流速运行。
在一个实施例中，多个混合器的至少一部分是并行地布置的并行化混合器，其中，多个混合器的该部分的每一个具有与系统出口流体连通的混合器出口。
在一个实施例中，并行化混合器以堆叠构造布置在微流体芯片上。
在一个实施例中，并行化混合器以水平构造布置在微流体芯片上的基本相同的平面中。
在一个实施例中，并行化混合器以水平构造和堆叠构造两者布置在微流体芯片上。
在某些实施例中，本公开提供了包括多于一个流体混合结构(即，流体结构的阵列)的装置。在某些实施例中，本公开提供了单个装置(即，阵列)，其包括从2至约40个并行的流体混合结构，其能够以约2至约2000毫升/分钟的速度产生脂质纳米颗粒。在这些实施例中，在不改变脂质纳米颗粒的性质的情况下，装置产生100毫升至约400升。
在一个实施例中，微流体装置包括：
(a)第一入口，用于接收包含第一溶剂的第一溶液；
(b)第一入口微通道，与第一入口流体连通以提供包含第一溶剂的第一流；
(c)第二入口，用于接收在第二溶剂中包含脂质颗粒形成材料的第二溶液；
(d)第二入口微通道，与第二入口流体连通以提供在第二溶剂中包含脂质颗粒形成材料的第二流；
(e)多个微通道，用于接收第一和第二流，其中每个微通道具有第一区域和第二区域，第一区域适于使第一和第二流流动，第二区域适于使第一和第二流的内含物混合以提供包含脂质纳米颗粒的多个流；以及
(f)第四微通道，用于接收和组合包含脂质纳米粒的多个流。
在某些实施例中，用于接收第一流和第二流的多个微通道中的每一个包括：
(a)第一微通道，与第一入口微通道流体连通以接收包含第一溶剂的第一流；
(b)第二微通道，与第二入口微通道流体连通以接收包含第二溶剂的第二入口流；以及
(c)第三微通道，用于接收第一和第二流，其中每个第三微通道具有第一区域和第二区域，第一区域适于使第一和第二流流动，第二区域适于使第一和第二流的内含物混合以提供包含脂质纳米颗粒的多个流。
在某些实施例中，该装置包括用于接收第一流和第二流的2至约40个微通道。在这些实施例中，该装置具有从2到约1600毫升/分钟的总流速。
在某些实施例中，第二区域各自具有从约20至约300μm的液压直径。在某些实施例中，第二区域各自具有从1至约40毫升/分钟的流体流速。
对于包括加热元件的实施例，加热元件有效地将第一和第二微通道中的第一和第二流的进入第三微通道之前的温度提高到预定温度。在这些实施例中，入口流体被加热到期望温度，并且混合充分迅速地发生，以使得在脂质纳米颗粒形成之前流体温度没有明显改变。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于制造包括并行微流体结构的极限尺寸纳米颗粒的系统。在并行结构中，布置N个单混合器布置以使得实现N×F的总流速，其中F是用于非并行实施的流速。代表性并行微结构在图7-9中示意性地示出。
代表性的并行微结构的透视图在图7中示出；平面图在图8A中示出；以及图8A的装置的侧视图在图8B中示出。
参考图7，装置500包括与每个系统垂直地布置的三个流体系统400a、400b和400c，每个系统包括一个第一溶剂入口402、两个第二溶剂入口406和406’、两个混合区域410和410’、以及单个出口408。每个系统包括用于分别接收第一流和第二流(402以及406和406’)的微通道。
参考图8A和8B，每个流体系统包括：
(a)第一微通道402，经由第一入口302a与第一入口微通道304a流体连通以接收包含第一溶剂的第一流；
(b)第二微通道406，经由第二入口306a与第二入口微通道308a流体连通以接收包含第二溶剂的第二入口流；以及
(c)第三微通道310a，用于接收第一和第二流，其中每个微通道各自具有第一区域312a和第二区域314a，第一区域312a适于使第一和第二流流动，第二区域314a适于使第一和第二流的内含物混合以提供包含脂质纳米颗粒的多个流。微通道316a经由出口318a将多个流中之一从混合区域引导至第四微通道408，出口318a从装置引导脂质纳米颗粒。
仍参考图8A和8B，应该理解的是，在装置的该实施例中，流体系统300a包括第二溶剂入口406’和混合区域310a’，组件用附图标记302a’、304a’、306a’、308a’、312a’、314a’、316a’和318a’表示。这些附图标记在图8A和8B中对应于它们的非主要配件302、304、306、308、312、314、316和318。
与单混合器芯片相比，这种结构以更高的流速产生囊泡，并产生与由单混合器芯片产生的相同的囊泡。在该代表性实施例中，使用三个试剂入口来集成六个混合器。这是使用平面并行化和垂直并行化两者实现的，如图7、8A和8B所示。
平面并行化是指将一个或多个混合器放置在同一水平面上。这些混合器可以或可以不通过流体总线通道连接。通过在入口和出口之间创建相同的流体路径来确保通过每个混合器的相等的流量，或者有效地，通过使用低阻抗总线通道连接入口和出口来实现相等的流量，如图9所示(具有明显低于混合器的流体阻抗的流体阻抗的通道)。
图9示出并行化装置500，其包括与每个系统水平地布置的五个流体系统300a、300b、300c、300d和300e，每个系统包括一个第一溶剂入口、一个第二溶剂入口、一个混合区域、以及单个出口408。装置500包括用于接收第一流和第二流(402和406)的微通道，以及用于从装置中引导在该装置中产生的脂质纳米颗粒的微通道408。
参考图9，流体系统500a包括：
(a)第一微通道402(具有入口403)，经由第一入口302a与第一入口微通道304a流体连通以接收包含第一溶剂的第一流；
(b)第二微通道406(具有入口405)，经由第二入口306a与入口微通道304a流体连通以接收包含第二溶剂的第二入口流；以及
(c)第三微通道310a，用于接收第一和第二流，其中第三微通道具有第一区域312a和第二区域314a，第一区域312a适于使第一和第二流流动，第二区域314a适于使第一和第二流的内含物混合以提供包含脂质纳米颗粒的第三流。在图9中，微通道316a经由出口318a将第三流从混合区域引导至第四微通道408。微通道408经由出口409从装置引导脂质纳米颗粒。
在图9的流体系统中，五个流体系统300a-300e布置在单个平面上，该平面不是第一微通道402、第二微通道406、或第四微通道408的平面。因此，流体总线(由402、406和408表示)在一个平面中并且混合器(由300a-300e表示)在单独的平面中。尽管这种构造对装置添加了制造复杂的附加层(例如，通过需要光刻的附加层以限定具有混合器的层)，但这种并行化装置提供大幅提高的吞吐量，而不需要成比例的量的装置面积。例如，在图9的装置中，芯片上的设备500的占地面积远远小于具有可比较的总混合体积输出的五个独立装置的组合的占地面积。因此，在一个实施例中，并行化装置具有n个流体系统(例如，300a等)并配置成产生等于或大于n个独立混合器(例如，如图6所示)的输出的混合输出体积，并且在更小的总装置面积上(即，并行化装置具有比n个独立混合器的总组合面积小的装置面积)。
参考图8A和8B，应该理解的是，在装置的该实施例中，流体系统300a包括第二溶剂入口406’和混合区域310a’，组件用附图标记302a’、304a’、306a’、308a’、312a’、314a’、316a’和318a’表示。这些附图标记在图8A和8B中对应于它们的非主要配件302、304、306、308、312、314、316和318。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生极限尺寸脂质纳米颗粒的装置，该装置包括n个流体装置，每个流体装置包括：
(a)第一入口302a，用于接收包含第一溶剂的第一溶液；
(b)第一入口微通道304a，与第一入口流体连通以提供包含第一溶剂的第一流；
(c)第二入口306a，用于接收在第二溶剂中包含脂质颗粒形成材料的第二溶液；
(d)第三微通道310a，用于接收第一和第二流，其中第三微通道具有第一区域312a和第二区域314a，第一区域312a适于使第一和第二流流动，第二区域314a适于使第一和第二流的内含物混合以提供包括通过微通道316a从混合区域引导的极限尺寸脂质纳米颗粒的第三流，
其中，每个流体装置300a-100n的第一入口302a-302n经由第一总线通道402液体连通，第一总线通道402将第一溶液提供至第一入口的每一个，
其中，每个流体装置300a-300n的第二入口306a-306n经由第二总线通道406液体连通，第二总线通道406将第二溶液提供至第二入口的每一个，以及
其中，每个流体装置300a-300n的出口318a-318n经由第三总线通道408液体连通，第三总线通道408从装置引导第三流。附图标记是图9中的代表性装置500。
在某些实施例中，n是从2到40的整数。
垂直并行化是通过形成平面混合器并将它们堆叠在一起并通过垂直总线连接入口和出口而实现的。理论上，从入口流动到下部混合器的流体比流向顶部混合器的流体遇到更高的阻力，从而导致较低的流速。然而，当分离两个混合器的距离小于500微米时，与混合结构的总电阻相比，增加的电阻可以忽略不计(这对于每一层都是相同的)。通过实验结果和流体流动模拟两者证实了这一点。分离混合层的距离(该条件为真的)取决于总线的宽度。
并行化装置通过首先创建具有由平面总线通道并行地连接的一个或多个微流体混合器的平面并行化混合器的全压式模具来形成。这些模具然后用于浇铸、压花或以其它方式形成平面并行化混合器的层，其一个或多个层然后可以使用垂直总线通道被堆叠、结合和连接。在某些实施中，平面混合器和总线可以在垂直地堆叠之前由两个单独的模具形成(如果需要的话)。在一个实施例中，使用标准光刻法在硅晶片上创建2x平面结构的全压式模具。在示例性制造方法中，按比例的PDMS的厚层然后被倾倒在模具上，被除气，并在80℃固化25分钟。固化的PDMS然后被剥离，并且然后10:1的PDMS的第二层以500rmp在晶片上旋转60秒并且然后在80℃烘烤25分钟。在烘烤之后，两层被暴露于氧等离子体，然后对齐。然后对齐的芯片在80℃烘烤15分钟。然后重复这个过程以形成期望数量的层。可以通过切割芯片并分别对齐每一个以及还通过为每一层制作单独的晶片(这导致固化期间聚合物的收缩)来帮助对齐。通过使用定制的芯片保持器，该芯片已经使用标准螺纹连接器接口于泵。这允许实现高达72毫升/分钟的流速。以前，在单元件混合器中，大约10毫升/分钟的流量是不可靠的，因为通常引脚会从芯片中泄漏出来。为了与这些保持器接口，芯片在背面被密封到玻璃，并且在顶面被密封到聚碳酸酯或玻璃的定制切割件(接口孔被预先钻孔)。PC至PDMS的结合使用硅烷处理来实现。硬表面需要用O形环形成可靠的密封。保持玻璃衬垫用于密封混合器，因为硅烷化学被示出为影响纳米颗粒的形成。
本公开的装置和系统提供了极限尺寸纳米颗粒的可缩放的生产。以下结果表明使用图7-8B中所示的微流体混合器产生相同的囊泡的能力，如由相同的平均直径建议的。
歧管
在一个实施例中，本公开包括一种歧管系统，其将流体流从两个或多个独立的连续流泵送系统分流成多个流体流，并将多个流体流引导到微流体混合器阵列中。在另一实施例中，单个装置包含具有装置上或脱离装置的流体分配方案的多个微流体混合器，例如，但不限于流体总线。
如本文所用，术语“歧管”指分流或合并液体流的任何流体管道。歧管可以在微流体装置外部(例如，通过入口或出口端口与微流体芯片连接，如图10所示)或集成到微流体芯片中，如图3所示。
在图2中示出的一个实施例中，由独立连续流泵送系统驱动的流体流进入两个歧管，第一歧管210连接到水性流体驱动器20以及第二歧管211连接到溶剂流体驱动器206。歧管210和211将在其中流动的溶液分流成多个流体流，多个流体流流向并行化微流体混合装置212。
在另一实施例中，使用第三歧管214将从微流体混合器阵列中出来的多个流收集到单个输出流中。在一个实施例中，从微流体混合器阵列出来的包含纳米颗粒的8个单独的流体流经由歧管合并以形成单个输出流，微流体混合器阵列由8个包含单微流体混合器的并行化微流体混合器装置组成。
在一个实施例中，系统还包括第一歧管，其被配置成从第一溶液储藏器接收第一溶液，并将第一溶液分配到多个混合器的第一入口。
在一个实施例中，系统还包括第二歧管，其被配置成从第二溶液储藏器接收第二溶液，并将第二溶液分配到多个混合器的第二入口。
在一个实施例中，系统还包括第三歧管，其被配置成从多个混合器的芯片出口接收和组合纳米颗粒溶液，并在单个通道中引导其朝向系统出口。
在一个实施例中，该系统还包括：
第一歧管，其被配置成从第一溶液储藏器接收第一溶液，并将第一溶液分配到多个混合器的第一入口；
第二歧管，其被配置成从第二溶液储藏器接收第二溶液，并将第二溶液分配到多个混合器的第二入口；以及
第三歧管，其被配置成接收和组合来自多个混合器的芯片出口的纳米颗粒溶液，并在单通道中引导其朝向系统出口。
在一个实施例中，多个混合器位于微流体芯片内。
代表性的歧管材料包括PEEK、不锈钢、COC/COP、聚碳酸酯和聚醚酰亚胺。
在一个实施例中，歧管装置包括但不限于与0.0625英寸外径管道连接的9个端口。在另一实施例中，0.0625英寸外径管道和歧管的端口之间的接口以单件的形式使用10-24螺纹配件制造。在另一实施例中，0.0625英寸外径管道和歧管的端口之间的接口使用10-24螺纹配件作为螺母和套圈制造。在另一实施例中，9端口0.0625英寸外径管道歧管用于将由独立的连续流动的泵送系统驱动的流体流分流成8个单独的流体流，其被供给至8个包含单微流体混合器的并行化微流体混合器装置。由歧管产生的多个输出流的相对流速由每个输出流的相对流体阻力控制。在并行化微流体混合器阵列中，微流体混合器提供在流体路径中的超过95％的流体阻力。由此，流的均匀分配归因于微流体混合器装置中的微通道特征，并且从歧管至微流体混合器装置的管道长度的相对差是微不足道的。
流体驱动器系统
在一个实施例中，流体驱动器是泵。在一个实施例中，该系统包括两个或更多个独立的连续流流体驱动器。
在图2所示的实施例中，溶剂计量泵206和水计量泵208是在设备中提供流体流的独立连续流泵送系统。
在一个实施例中，第一连续流流体驱动器和第二连续流流体驱动器独立地选自由容积式流体驱动器(诸如，往复活塞、蠕动、齿轮、隔膜、螺丝、螺杆)、离心泵和压力驱动泵组成的组。
在一个实施例中，连续流泵送系统为容积式泵。容积式泵的例子包括但不限于蠕动泵、齿轮泵、螺旋泵和螺杆泵。在优选实施例中，独立的连续流泵是双头往复容积式泵。
在另一实施例中，双头往复容积式泵具有前置安装的可更换泵头。在另一实施例中，前置安装的可更换泵头能实现从10毫升/分钟到1000毫升/分钟的独立流速。
在另一实施例中，双头往复容积式泵是Knauer Azura P2.2L泵。在另一实施例中，Knauer Azura P2.2L泵被修改为具有泵主体外部的压力传感器支座，允许容易更换泵的压力传感器。
可更换的泵头实现连续流制造系统的简单和快速的缩放。在某些实施例中，前置安装的可更换泵头控制来自水储藏器204的流体流速与来自溶剂储藏器202的流体流速的比率。在某些实施例中，来自水储藏器204的流速与来自溶剂储藏器202的流速的比率大于1:1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，包括中间的比率)。在其它实施例中，来自溶剂储藏器102的流速与来自水储藏器204的流速的比率大于1:1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，包括中间的比率)。图10示出了利用3:1的比率(泵#2：泵#1)操作的系统。
在一个实施例中，双头往复泵头提供低脉动流。在另一实施例中，脉动通过10-500PSI背压的添加进一步被抑制。背压系统的优选实施例包括但不限于添加到泵送系统的出口的背压调节器、或延伸长度的管道。在一个实施例中，背压是通过增加内径为0.02英寸的24英寸管道来实现的。
在另一个实施例中，从离心泵和压力驱动泵中选择独立的连续流泵送系统。独立的连续流泵送系统提供了易于更换的组件，减少了更换一次性使用的流体接触组件所需的时间。
稀释
在一个实施例中，系统还包括稀释元件，其中稀释元件包括第三连续流流体驱动器，其被配置成持续地在芯片出口和系统出口之间经由稀释通道将稀释溶液从稀释溶液储藏器驱动至系统。
在另一实施例中，参考图2，本公开包括一个或多个附加泵218，以利用缓冲液216或其它合适的介质稀释来自微流体混合器阵列的纳米颗粒。在某些实施例中，通过持续地将一种或多种缓冲液泵送至从微流体混合器阵列出来的输出流来实现稀释过程。在一个实施例中，稀释泵送系统是容积式泵。在另一实施例中，容积式泵选自蠕动泵、齿轮泵、螺旋泵和螺杆泵。在某些实施例中，稀释泵送系统是蠕动泵。在某些实施例中，稀释泵送系统是具有双泵头的蠕动泵。在优选的实施例中，稀释泵送系统是具有双泵头的Masterflex蠕动泵。在另一实施例中，泵送系统选自离心泵和压力驱动泵。此处列出的泵的选择具有代表性，并且不应限制本公开的范围。普通技术人员将认识到可以与本公开一起使用其它可替换泵送系统。
在某些实施例中，稀释介质通过连接器被引入纳米颗粒流。在一个实施例中，连接器是T形连接器。在另一实施例中，连接器是Y形连接器。在某些实施例中，稀释介质以0.1°到179.9°的角度接触纳米颗粒流。在稀释过程中，接触的角度减轻在稀释过程中在纳米颗粒上诱发的搅拌的水平。在优选实施例中，Masterflex蠕动泵的双泵头具有偏移30°的辊型，由此将泵的输出流脉动水平减小80-95％。
在某些实施例中，稀释介质被引入第二在线微流体混合器中。在一个实施例中，第二微流体混合器在第二在线装置上。在另一实施例中，第二微流体混合器在相同的微流体装置上。
稀释纳米颗粒溶液减小了在溶液中存在的溶剂的百分比。对于某些纳米颗粒，稀释溶剂低于50％提高颗粒稳定性。在其它实施例中，通过稀释溶剂低于25％促进纳米颗粒的稳定性。在进一步的实施例中，在低于10％的溶剂含量，纳米颗粒稳定。
在设备200(图2)中，存在两个储藏器，溶剂储藏器202和水储藏器204。在一个实施例中，储藏器是一次性袋。在另一实施例中，储藏器是容器，包括但不限于不锈钢储藏器。在一个实施方式中，溶剂是水溶性溶剂，诸如但不限于包含一种或多种脂质的乙醇，并且该水溶液是低pH缓冲液，诸如但不限于柠檬酸盐缓冲液pH 4.0。在另一实施例中，诸如但不限于柠檬酸盐缓冲液pH 4.0的低pH缓冲液包含一种或多种核酸。在另一实施例中，溶剂是水溶性溶剂，诸如但不限于包含一种或多种聚合物或聚合物药物缀合物的乙腈，该水溶液是诸如但不限于柠檬酸盐缓冲液pH4.0的缓冲液。对于聚合物纳米颗粒的形成，代表性的缓冲液是盐溶液。
在一个实施例中，管道226是在微流体芯片上的微流体通道。在一个实施例中，管道226是微流体芯片外部的金属管道。在一个实施例中，管道是塑料管道。在另一实施例中，管道的内径的范围从0.01英寸到0.25英寸。在另一实施例中，配件220、222包括但不限于带钩的、压缩的、清洁的和螺纹的。在另一实施例中，配件是金属或塑料的。在优选实施例中，配件是塑料的。
在一个实施例中，制造设备具有稀释从微流体混合器阵列出来的纳米颗粒流体流的机构。在一个实施例中，稀释通过在线稀释实现，其中，水性缓冲液与输出流直接接触。
在一个实施例中，流体驱动器218使稀释试剂从储藏器216流出，并且稀释试剂流在由T形连接器220控制稀释试剂流的流量的结点处结合纳米颗粒流体流。在另一实施例中，流体驱动器218使稀释试剂从储藏器216流动，稀释试剂流通过一个入口进入微流体混合器装置并且纳米颗粒流体流通过第二入口进入微流体混合器装置，并且两个流流到微流体混合器区域中，其中纳米颗粒流体流通过与稀释试剂流体流混合来稀释。在进一步的实施例中，流体驱动器218使稀释试剂从储藏器216流动，并且稀释试剂流体流进入歧管，其中，稀释试剂流体流被分成多个稀释试剂流体流，并且纳米颗粒流体流进入歧管，其中，纳米颗粒流体流被分成多个纳米颗粒流体流。多个稀释试剂流体流和多个纳米颗粒流体流进入并行地布置的多个微流体混合器装置，其中，纳米颗粒流体流通过与稀释试剂流体流混合来稀释。在一个实施例中，纳米颗粒流体流的流速与稀释试剂流体流的流速的比率大于1:1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，包括中间的比率)。在其它实施例中，稀释试剂流体流的流速与纳米颗粒流体流的流速的比率大于1:1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，包括中间的比率)。
在一个实施例中，系统包括在没有微流体装置的情况下的在线稀释。
废料排出阀
在本公开的另一实施例中，用于纳米颗粒的可缩放生产的基于微流体的连续流制造设备包括将废料收集部件224与样本收集部件228分离的机构，如图2所示。在一个实施例中，阀门系统将输出流引导至废料收集部件或样本收集部件。在一个实施例中，两容器收集部件(废料和样本)通过将来自制造系统的输出流分流成两个并打开/关闭独立管线上的阀以收集在期望容器中来实现。在一个实施例中，阀系统是手动系统或自动化系统用来夹紧软管。在另一实施例中，手动阀系统是管夹。在另一实施例中，自动化系统是螺线管夹管阀。
在一个实施例中，系统还包括在芯片出口和系统出口之间的与废料排出阀流体连通的废料出口，其中废料排出阀被配置成可控制地朝向废料出口引导流体。废料排出阀用于从启动系统或其它非生产操作清除废料。如图2所示，废料排出阀222将流引导至与样本容器228分离的废料容器224。
完全一次性的流体路径
在本公开的一个实施例中，系统包括完全一次性的流体路径。如本文所使用的，术语“一次性流体路径”是指接触流体的每个元件是“一次性”的系统。鉴于系统的某些产品(例如，纳米药物)的之前的性质以及此类产品的相关值，本文使用的术语“一次性”是指与所制造的产品有关的成本相对较低的组件。典型的一次性组件包括可以由塑料制成的管道、歧管和储藏器。然而，在本公开中，一次性也指诸如泵头和微流体芯片的组件。因此，一次性组件包括由金属制成的(例如，泵头)和/或精细制造的组件(例如，微流体装置)。
在图2中所示的实施例中，完全一次性的流体路径包括试剂袋202,204,216；管道226；可更换泵头206,208；配件220,222；歧管210,211,214和微流体装置212。
在一个实施例中，一次性流体路径包括一次性微流体芯片、第一连续流泵的一次性第一泵头、第二连续流泵的一次性第二泵头和一次性系统出口。
在一个实施例中，一次性第一泵头和一次性第二泵头由独立地选自由不锈钢、聚合物(例如，聚醚醚酮(PEEK))、钛和陶瓷组成的组中选择的材料制成。在一个实施例中，一次性第一泵头或一次性第二泵头中至少之一包括金属。
在一个实施例中，由第一溶液、第二溶液和纳米颗粒溶液所接触的每个表面都是一次性的。
在某些实施例中，设备流体路径是完全一次性的。在某些实施例中，设备是符合GMP的。在这些实施例中的所有流体接触材料都可以重复使用，或者单次地一次性使用。
无菌系统组件
在一个实施例中，微流体芯片是无菌的。灭菌对于某些生产过程是必不可少的。在另一实施例中，微流体芯片在集成到系统之前被灭菌。在另一实施例中，微流体芯片在系统内就地灭菌。
代表性灭菌方法包括高压蒸气灭菌、干热、化学灭菌(即氢氧化钠或环氧乙烷)、伽玛辐射、气体及其组合。在特定的实施例中，微流体芯片利用伽玛辐射来灭菌。
由于在某些应用中的灭菌的重要性，在某些实施例中，微流体芯片由与针对特定应用优选的某些类型的灭菌相容的材料形成。
在一个实施例中，微流体芯片由与伽玛辐射相容的材料形成。与伽玛辐射相容的材料是可以被辐照的材料。例如，聚碳酸酯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、以及高密度聚乙烯和低密度聚乙烯。不能被辐照的材料包括聚酰胺、聚四氟乙烯和任何金属。
除了提供促进系统组件的灭菌的实施例以外，另外的实施例包括包含无菌系统和/或系统组件的无菌包装。这些无菌包装允许用户通过避免就地灭菌程序来减少时间和成本。
此外，可以利用所公开的系统合成的某些颗粒与最终灭菌是不相容的，因此不能在下游被灭菌，因此需要无菌的制造路径。一般来说，无菌过滤是一种用于最终灭菌的技术，并且尺寸(例如，直径)大于约200nm的颗粒与最终灭菌不相容。因此，在一个实施例中，系统和方法被配置成提供具有200nm或更大的尺寸的颗粒的无菌合成。因此，在一个实施例中，系统和方法被配置成没有最终灭菌的颗粒的无菌合成。
与最终灭菌(例如，无菌过滤)不相容的代表性的颗粒包括通过将DNA/RNA与预形成的脂质体混合来制造的DNA/RNA脂质体，这可能导致大于200nm的颗粒结构，其不能被最终灭菌。具有高的多分散性的某些药物偶联聚合物纳米颗粒也大到足以使最终灭菌不实际。
根据所公开的实施例，可以在生产环境中打开无菌包装，在系统中实施包装的内含物，并且系统在没有预灭菌步骤的情况下操作。因此，在一个实施例中，提供了无菌包装。在一个实施例中，无菌包装包括密封在无菌包装内的根据本公开的无菌的微流体芯片。在另一实施例中，无菌包装包括密封在无菌包装内的包括泵头的完整的无菌的一次性流体路径。
无菌系统部件可以通过本领域技术人员已知的和在本文公开的任何方法来灭菌。例如，伽玛辐射在某些实施例中使用来对系统部件进行灭菌。
在灭菌之后，无菌系统部件在无菌环境中进行维护，并以密封的方式包装，以保持无菌状态，直到使用为止。
在某些实施例中，纳米颗粒制造是在专门的隔离设施中进行的，它消除了过滤的要求，以确保无菌产品。
软件控制
在由软件控制的系统中(例如，图1的部分102)。在进一步的实施例中，整个制造系统是软件控制的。这种软件控制通常是本领域技术人员已知的。在一个实施例中，参考图2，软件控制第一202和第二204流体驱动器。在另一个实施例中，软件控制系统100或200中的所有流体驱动器。
用于制造纳米颗粒的方法
在一个实施例中，本公开提供了使用本公开的基于微流体的连续流制造设备来用于纳米颗粒的可缩放生产的方法。
在一个方面，提供了形成纳米颗粒的方法。在一个实施例中，该方法包括通过根据所公开的实施例中的任一个的系统使第一溶液和第二溶液流动，并在微流体芯片的第一混合器中形成纳米颗粒溶液。
在一个实施例中，该系统包括多个混合器，该方法还包括通过多个混合器使第一溶液和第二溶液流动以形成纳米颗粒溶液，其中多个混合器包括第一混合器。
在一个实施例中，多个混合器包含在多个微流体芯片中。
在一个实施例中，多个混合器包含在单个微流体芯片中。
在一个实施例中，该设备提供用于制造包含治疗材料的脂质纳米颗粒的系统和过程。
在另一实施例中，该设备提供用于制备包含治疗材料的聚合物纳米颗粒的系统和过程。
在一个实施例中，该设备具有两个储藏器：溶剂储藏器和水储藏器。在一个方面，溶剂储藏器包含水溶性溶剂，诸如但不限于包含一种或更多种脂质的乙醇。在另一方面，溶剂储藏器包含水溶性溶剂，诸如但不限于包含一种或更多种聚合物或聚合物药物缀合物的乙腈。在一个方面，水储藏器包含缓冲液，诸如但不限于柠檬酸盐缓冲液pH 4.0。在另一方面，水储藏器包含缓冲液，诸如但不限于包含一种或多种治疗材料的柠檬酸盐缓冲液pH4.0。
在一个实施例中，储藏器的内含物通过独立的连续流泵送系统抽吸到本公开的设备的流体路径。在一个方面，每个独立的连续流制造泵以0.1升/分钟-1.0升/分钟的流速操作。在一个方面，本公开包括歧管系统，其将来自两个或多个独立的连续流泵送系统的流体流分流成多个流体流以使得：
(a)包括第一溶剂(例如水性缓冲液)的第一流以第一流速被引入到每个独立的微流体混合器的第一通道中；
(b)包括第二溶剂(例如水溶性溶剂)的第二流以第二流速到每个独立的微流体混合器的第二通道中以提供第一和第二相邻流，其中所述第一和第二溶剂不是相同的，并且其中第一流速与第二流速的比率大于1；
(c)使第一和第二流从第一区域流到第二区域；以及
(d)在设备的第二区域中混合第一流和第二流以提供包括脂质纳米颗粒的第三流。
在一个实施例中，该设备是微流体设备。在某些实施例中，预混合的流为层流。在某些实施例中，混合第一流和第二流包括混沌对流。在其它实施例中，混合第一流和第二流包括利用微混合器混合。
在一个方面，微流体混合器阵列包括并行地布置的1-128个微流体混合器，以增加制造系统的吞吐量。在某些方面，单微流体混合器包含在一个装置上。在另一方面，单个装置包含多个微流体混合器。在一个实施例中，单个装置包含四个微流体混合器(图3)。
在一个实施例中，每个微流体混合器的第一流和第二流的流速在1毫升/分钟和50毫升/分钟之间。
在某些实施例中，第一流速与第二流速的比率大于1:1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1，包括中间的比率)。
在某些实施例中，最终的纳米颗粒产品被分配到无菌瓶中。
Dean涡流分叉混合器(“DVBM”)
如上所述，DVBM在所公开的连续流系统中用作混合器。本文公开的类型的DVBM用作高效混合器，其注塑模具可以通过半径R(例如300μm)的立铣刀产生。所提供的DVBM混合器包括多个环形混合元件(本文也称为“环形混合器”。如本文所使用的，“环形”指的是通常圆环形的结构，其具有限定环形混合器的入口和出口之间的环形的圆周的两个“腿”通道。环形混合器在某些实施例中是圆环形的。在其它实施例中，环形混合器不是完全圆形的，而可以是椭圆形或非规则形状。
图12A示出根据所公开的实施例的一对环形DVBM混合器。图12B是根据所公开的实施例的示例性环形DVBM混合器的照片。
在一个实施例中，DVBM混合器被配置成混合至少第一液体和第二液体，混合器包括通向串联地布置的多个环形混合元件的入口通道，其中，多个环形混合元件包括在入口通道下游的第一环形混合元件、以及经由第一颈部区域与第一环形混合元件流体连通的第二环形混合元件，以及其中，第一环形混合元件限定入口通道和第一颈部区域之间的第一颈部角度。
在一个实施例中，第一颈部角度从0度到180度。
在一个实施例中，第一颈部区域的长度具有0.2毫米或更长的长度。
在一个实施例中，多个混合元件包括具有约20微米至约2毫米的流体动力学直径的通道。
在一个实施例中，混合器被设计尺寸并被配置成以小于1000的雷诺数混合第一液体和第二液体。
在一个实施例中，混合器包括两个或多个并行的混合器，每个混合器具有多个环形混合元件。
在一个实施例中，第一环形混合元件和第二环形混合元件定义混合对，其中混合器包括多个混合对，其中每个混合对以颈部角度由颈部区域结合。
在一个实施例中，第一环形混合元件具有第一长度的第一腿和第二长度的第二腿，以及其中第二环形混合元件具有第三长度的第一腿和第四长度的第二腿。
在一个实施例中，第一长度大于第二长度。
在一个实施例中，第三长度大于第四长度。
在一个实施例中，第一长度与第二长度的比率大约等于第三长度与第四长度的比率。
在一个实施例中，第一环形混合元件具有第一阻抗的第一腿和第二阻抗的第二腿，以及其中第二环形混合元件具有第三阻抗的第一腿和第四阻抗的第二腿。
在一个实施例中，第一阻抗大于第二阻抗。
在一个实施例中，第三阻抗大于第四阻抗。
在一个实施例中，第一阻抗与第二阻抗的比率约等于第三阻抗与第四阻抗的比率。
在一个实施例中，混合器包括串联的2至20个环形混合元件。
在一个实施例中，混合器包括串联的1到10对环形混合元件。
在一个实施例中，环形混合元件的内半径约为0.1毫米至约2毫米。
还提供了将第一液体与第二液体混合的方法，包括使第一液体和第二液体流动通过根据所公开的实施例的DVBM混合器。
定义
微流体
如本文所使用的，术语“微流体”是指用于操纵(例如流动、混合等)流体样本的系统或装置，所述流体样本包括具有微米尺度尺寸(即，小于1毫米的尺寸)的至少一个通道。
治疗材料
如本文所使用的，术语“治疗材料”被定义为旨在提供药理活性或以其它方式在疾病的诊断、治愈、缓解、理解、治疗或预防中具有直接影响，或在恢复、修正或修改生理功能中具有直接影响的物质。治疗材料包括但不限于小分子药物、核酸、蛋白质、肽、多糖、无机离子和放射性核素。
纳米颗粒
如本文所使用的，术语“纳米颗粒”被定义为用于封装治疗材料并具有小于250纳米的最小尺寸的包含多于一种组分材料(例如脂质、聚合物等)的均匀颗粒。纳米颗粒包括，但不限于，脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。
脂质纳米颗粒
在一个实施例中，脂质纳米颗粒包括：
(a)核心；及
(b)围绕所述核心的外壳，所述外壳包括磷脂。
在一个实施例中，该核心包括脂质(例如脂肪酸甘油三酯)并且是固体。在另一实施例中，核心是液体(例如水)，并且颗粒是囊泡，如脂质体。在一个实施例中，围绕核心的外壳是单层。
如上所述，在一个实施例中，脂质核心包括脂肪酸甘油三酯。适当的脂肪酸甘油三酯包括C8-C20脂肪酸甘油三酯。在一个实施例中，脂肪酸甘油三酯是油酸甘油三酯。
脂质纳米颗粒包括外壳，所述外壳包括围绕所述核心的磷脂。合适的磷脂包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一个实施例中，磷脂是C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱。代表性的磷脂是1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)。
在某些实施例中，磷脂与脂肪酸甘油三酯的比例为从20:80(摩尔：摩尔)至60:40(摩尔：摩尔)。优选地，甘油三酯以大于40％且小于80％的比例存在。
在某些实施例中，纳米颗粒还包含固醇。代表性的固醇包括胆固醇。在一个实施例中，磷脂与胆固醇的比例为55:45(摩尔：摩尔)。在代表性的实施例中，纳米颗粒包括55-100％的POPC和高达10mol％的PEG-脂质。
在其它实施例中，本公开的脂质纳米颗粒可以包括一种或多种包括磷酸甘油酯的其它脂质，其代表性示例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。其它不含磷的化合物，诸如鞘脂和鞘糖脂家族是有用的。三酰基甘油也是有用的。
本公开的代表性纳米颗粒具有从约10至约100nm的直径。较小的直径限制为从约10至约15nm。
本公开的极限尺寸的脂质纳米颗粒可以包括一种或多种治疗和/或诊断剂。这些试剂通常包含在颗粒核心内。本公开的纳米颗粒可以包括多种治疗和/或诊断剂。
合适的治疗剂包括化学治疗剂(即抗肿瘤剂)、麻醉剂、β-肾上腺素能阻滞剂、抗高血压剂、抗抑郁剂、抗惊厥剂、止吐剂、抗组胺剂、抗心律失常剂，和抗疟疾剂。
代表性抗肿瘤剂包括阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、博来霉素、链脲菌素、长春花碱、长春新碱、氮芥、盐酸盐、美法仑、环磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、氟尿嘧啶、羟基脲、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿苷、达卡巴嗪、顺铂、丙卡巴肼、长春瑞滨、环丙沙星、诺氟沙星、紫杉醇、多烯紫杉醇、依托泊苷、贝沙罗汀、替尼泊苷、维A酸、异维A酸、西罗莫司、氟维司群、戊柔比星、长春地辛、甲酰四氢叶酸、伊立替康、卡培他滨、吉西他滨、盐酸米托蒽醌、奥沙利铂、亚德里亚霉素、氨甲蝶呤、卡铂、雌莫司汀，以及其药学上可接受的盐。
在另一实施例中，脂质纳米颗粒是核酸脂质纳米颗粒。
术语“核酸-脂质纳米颗粒”是指含有核酸的脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子性脂质，一种或多种第二脂质，和一种或更种核酸。
阳离子性脂质。脂质纳米颗粒包括阳离子性脂质。如本文所用的，术语“阳离子性脂质”是指当pH降低到脂质的可电离基团的pK以下时为阳离子性的或变为阳离子性的(质子化的)，但在较高pH值时逐渐更加中性的脂质。在低于pK的pH值下，脂质随后能够与带负电荷的核酸(例如，寡核苷酸)缔合。如本文所用的，术语“阳离子性脂质”包括在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。
术语“阳离子性脂质”是指在选择性pH(诸如生理pH)下携带净正电荷的许多脂质种类中的任一种。此类脂质包括但不限于N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和N-(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙烷-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。此外，可用于本公开的阳离子性脂质的许多市售制剂是可获得的。这些包括例如(从GIBCO/BRL，Grand Island，NY市售可得的包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的阳离子性脂质体)；(从GIBCO/BRL市售可得的包含N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)的阳离子性脂质体)；和(从Promega Corp.，Madison，WI市售可得的在乙醇中包含双十八烷基酰胺甘氨酰羧基精胺(DOGS)的阳离子性脂质)。以下脂质是阳离子性的，并且在低于生理pH下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施例中，阳离子性脂质是氨基脂质。用于本公开的合适的氨基脂质包括在WO 2009/096558中描述的那些氨基脂质，其全部内容通过引用包含于此。代表性的氨基脂质包括1,2-二亚油基氧-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)，1,2-二亚油基氧-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)，1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)，1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA·Cl)，1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物(DLin-TAP·Cl)，1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)，3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)，3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)，1,2-二亚油基氧基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA)。
合适的氨基脂质包括具有下式的那些氨基脂质：
其中R1和R2相同或不同，并且独立地为可选地替代的C10-C24烷基，可选地替代的C10-C24烯基，可选地替代的C10-C24炔基或可选地替代的C10-C24酰基；
R3和R4相同或不同，并且独立地为可选地替代的C1-C6烷基，可选地替代的C2-C6烯基或可选地替代的C2-C6炔基，或者R3和R4可结合以形成4至6个碳原子和选自氮和氧的1或2个杂原子的可选地替代的杂环环；
R5不存在或存在，并且当存在时为氢或C1-C6烷基；
m、n和p相同或不同，独立地为0或1，附带条件是m、n和p不同时为0；
q是0、1、2、3或4；以及
Y和Z相同或不同，并且独立地是O、S或NH。
在一个实施例中，R1和R2各自是亚油基，并且氨基脂质是二亚油基氨基脂质。在一个实施例中，氨基脂质是二亚油基氨基脂质。
代表性的有用的二烯丙基氨基脂质具有下式：
其中n为0、1、2、3或4。
在一个实施例中，阳离子性脂质是DLin-K-DMA。在一个实施例中，阳离子性脂质是DLin-KC2-DMA(上述DLin-K-DMA，其中n为2)。
其它合适的阳离子性脂质包括在约生理pH下携带净正电荷的阳离子性脂质，除了上述具体描述的那些之外，还包括，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(2,3-二油基氧基)丙基-N,N-N-三乙基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DOTAP·Cl)；3β-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)，N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰胺甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)，N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。此外，可以使用许多阳离子性脂质的商业制剂，例如LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，得自GIBCO/BRL)和LIPOFECTAMINE(包括DOSPA和DOPE，得自GIBCO/BRL)。
阳离子性脂质以从约30至约95摩尔百分比的量存在于脂质颗粒中。在一个实施例中，阳离子性脂质以从约30至约70摩尔百分比的量存在于脂质颗粒中。在一个实施例中，阳离子性脂质以从约40至约60摩尔百分比的量存在于脂质颗粒中。
在一个实施例中，脂质颗粒包括(“由...组成”)仅一种或多种阳离子性脂质和一种或多种核酸。
第二脂质。在某些实施例中，脂质纳米颗粒包括一种或更种第二脂质。合适的第二脂质在其形成期间稳定纳米颗粒的形成。
术语“脂质”是指一组有机化合物，其为脂肪酸的酯并且特征在于在水中是不溶的但在许多有机溶剂中是可溶的。脂质通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生的脂质”如类固醇。
合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子性脂质。
中性脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性脂质包括例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧化物(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
在一个实施例中，中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
阴离子性脂质。术语“阴离子性脂质”是指在生理pH值下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)和与中性脂质结合的其它阴离子改性基团。
其它合适的脂质包括糖脂(例如单唾液酸神经节苷脂GM1)。其它合适的第二脂质包括固醇，如胆固醇。
聚乙二醇-脂质。在某些实施例中，第二脂质是聚乙二醇-脂质。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施例中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施例中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。
在某些实施例中，第二脂质以从约0.5至约10摩尔百分比的量存在于脂质颗粒中。在一个实施例中，第二脂质以从约1至约5摩尔百分比的量存在于脂质颗粒中。在一个实施例中，第二脂质以约1摩尔百分比存在于脂质颗粒中。
核酸。本公开的脂质纳米颗粒可用于核酸的全身或局部递送。如本文所述的，核酸在其形成期间掺入脂质颗粒中。
如本文所用的，术语“核酸”意在包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有多达50个核苷酸的片段通常称为寡核苷酸，更长的片段称为多核苷酸。在特定实施例中，本公开的寡核苷酸的长度为20-50个核苷酸。在本公开的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键联组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或寡聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括功能类似的包含非天然存在的单体的聚合物或寡聚物，或其部分。由于诸如增强的细胞摄取和在核酸酶存在下增加的稳定性等性质，此类经修饰或替代的寡核苷酸通常优于天然形式。寡核苷酸被分类为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧伯糖的5-碳糖组成，所述脱氧核糖共价地结合至该糖的5'和3'碳上的磷酸以形成交替的无支链的聚合物。核糖寡核苷酸由类似的重复结构组成，其中5-碳糖是核糖。存在于根据本公开的脂质颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文使用的核酸可以是单链DNA或RNA、或双链DNA或RNA、或DNA-RNA杂合体。双链DNA的示例包括结构基因、包括控制区和终止区的基因、和自我复制系统，诸如病毒或质粒DNA。双链RNA的示例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括反义寡核苷酸、核酶、微RNA和三链形成的寡核苷酸。
在一个实施例中，多核酸是反义寡核苷酸。在某些实施例中，核酸是反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、miRNA、mRNA、lncRNA、预凝缩的DNA或适体。
术语“核酸”还指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸-糖-主链寡核苷酸、其它核苷酸、核苷酸类似物及其组合，并且可以是单链的、双链的或适当时，含有双链序列和单链序列两者的部分。
如本文所用的，术语“核苷酸”一般包括以下术语，其定义如下：核苷酸碱基、核苷、核苷酸类似物和通用核苷酸。
如本文所用的，术语“核苷酸碱基”是指替代或未替代的母体芳环或环。在一些实施例中，芳环或环含有至少一个氮原子。在一些实施例中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示例性的核苷酸碱基及其类似物包括，但不限于，嘌呤，诸如2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤(A)、亚乙烯基腺嘌呤、N6-2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-2-异戊烯基-2甲基巯腺嘌呤(2ms6iA)、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤(G)、异鸟嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、2-巯基嘧啶、6-硫鸟嘌呤(6sG)次黄嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤；7-脱氮-嘌呤，诸如7-脱氮腺嘌呤(7-脱氮-A)和7-脱氮鸟嘌呤(7-脱氮-G)；嘧啶，诸如胞嘧啶(C)、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、胸腺嘧啶(T)、4-巯基胸腺嘧啶(4sT)、5,6-二氢胸腺嘧啶、O4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(U)、4-硫尿嘧啶(4sU)和5,6-二氢尿嘧啶(二氢尿嘧啶；D)；吲哚，诸如硝基吲哚和4-甲基吲哚；吡咯，诸如硝基吡咯；烟支杯伞素；碱基(Y)。在一些实施例中，核苷酸碱基是通用核苷酸碱基。另外的示例性核苷酸碱基可见于Fasman,1989,Practical Handbook of Biochemistry and MolecularBiology,pp.385-394，CRC Press,Boca Raton,Fla.,及本文中引用的参考文献。通用碱基的其它示例可见于，例如，Loakes，N.A.R.2001,vol 29:2437-2447和Seela N.A.R.2000,vol 28:3224-3232中。
如本文所用的，术语“核苷”是指具有共价链接至五碳糖的C-1'碳的核苷酸碱基的化合物。在一些实施例中，键联是通过杂芳环氮。典型的五碳糖包括但不限于这样的五碳糖，其中碳原子的一个或多个各自独立地被相同或不同的-R、-OR、-NRR或卤素基团的一个或多个替代，其中每个R独立地是氢、(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基。五碳糖可以是饱和的或不饱和的。示例性五碳糖及其类似物包括但不限于，核糖、2'-脱氧核糖、2'-(C1-C6)烷氧基核糖、2'-(C5-C14)芳氧基核糖、2',3'-二脱氧核糖、2',3'-二脱氢核糖、2'-脱氧-3'-卤代核糖、2'-脱氧-3'-氟代核糖、2'-脱氧-3'-氯代核糖、2'-脱氧-3'-氨基核糖、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷基核糖、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷氧基核糖和2'-脱氧-3'-(C5-C14)芳氧基核糖。还可以参见例如2'-O-甲基，4'-α-异头核苷酸，1'-α-异头核苷酸(Asseline(1991)Nucl.Acids Res.19:4067-74)，2'-4'-和3'-4'-链接和其它“锁定的”或“LNA”、双环糖修饰(WO 98/22489；WO 98/39352；WO 99/14226)。“LNA”或“锁核酸”是被构象锁定以使得核糖环被2'-氧与3'-或4'-碳之间的亚甲基键联约束的DNA类似物。由键联强加的构象约束通常增强针对互补序列的结合亲和力和增强这样的双链体的热稳定性。
糖包括在2'-或3'-位的修饰、诸如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷氨基、氟基、氯基和溴基。核苷和核苷酸包括天然D构型异构体(D型)，以及L构型异构体(L型)(Beigelman，美国专利No.6,251,666；Chu，美国专利No.5,753,789；Shudo，EP0540742；Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.21：4159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112:7435；Urata，(1993)Nucleic AcidsSymposium Ser.29:69-70)。当核碱基是嘌呤，例如A或G时，核糖附接于核碱基的N9位上。当核碱基是嘧啶，例如C、T或U时，五碳糖附接于核碱基的N1位(Kornberg和Baker，(1992)DNAReplication，第2版，Freeman，San Francisco，Calif.)。
核苷的五碳糖碳的一个或多个可被磷酸酯替代。在一些实施例中，磷酸酯附接于五碳糖的3'-或5'-碳。在一些实施例中，核苷是其中核苷酸碱基是嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶、通用核苷酸碱基、特定核苷酸碱基或其类似物的那些核苷。
如本文中所用的，术语“核苷酸类似物”是指其中五碳糖和/或核苷酸碱基和/或核苷的一个或多个磷酸酯可被其各自的类似物替代的实施例。在一些实施例中，示例性五碳糖类似物是上述的那些。在一些实施例中，核苷酸类似物具有如上所述的核苷酸碱基类似物。在一些实施例中，示例性磷酸酯类似物包括但不限于，烷基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phosphoroanilidate)、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯(boronophosphate)，并且可以包括相关的抗衡离子。其它核酸类似物和碱基包括例如嵌入核酸(intercalating nucleicacids)(INA，如Christensen和Pedersen，2002中所述的)和AEGIS碱基(Eragen，美国专利No.5,432,272)。各种核酸类似物的其它描述还可见于例如以下文献中：Beaucage等人，Tetrahedron 49(10)：1925(1993)及其中的参考文献；Letsinger，J.Org.Chem.35：3800(1970)；Sprinzl等人，Eur.J.Biochem.81：579(1977)；Letsinger等人，Nucl.AcidsRes.14：3487(1986)；Sawai等人，Chem.Lett.805(1984)，Letsinger等人(J.Am.Chem.Soc.110：4470(1988)；和Pauwels等人，Chemica Scripta 26：141 91986))，硫代磷酸酯(Mag等人，Nucleic Acids Res.19:1437(1991)；和美国专利No.5,644,048。其它核酸类似物包含二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺键联(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach,Oxford University Press)、具有阳性主链的那些(Denpcy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097(1995)；非离子性主链(美国专利No.5,386,023、5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141，和4,469,863。Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger等人，J.Am.Chem Soc.110:4470(1988)；Letsinger等人，Nucleoside&Nucleotide 13:1597(194)：第2和3章，ASC Symposium Series 580，“CarbohydrateModifications in Antisense Research”，Ed.Y.S.Sangui和P.Dan；Mesmaeker等人，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等人，J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖主链，包括美国专利No.5,235,033和5,034,506以及第6和7章，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modifications inAntisense Research”，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook中描述的那些非核糖主链。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176)。在Rawls，C&E News，1997年6月2日，第55页中也描述了几种核酸类似物。
如本文中所用的，术语“通用核苷酸碱基”或“通用碱基”是指芳环部分，其可以含有或可以不含有氮原子。在一些实施例中，通用碱基可以共价附接于五碳糖的C-1'碳以制备通用核苷酸。在一些实施例中，通用核苷酸碱基不与另一个核苷酸碱基特异性氢键合。在一些实施例中，通用核苷酸碱基与核苷酸碱基氢键键合，多至和包括特定目标多核苷酸中的所有核苷酸碱基。在一些实施例中，核苷酸碱基可以通过疏水性堆叠与同一核酸链上的相邻核苷酸碱基相互作用。通用核苷酸包括但不限于脱氧-7-氮杂吲哚三磷酸(d7AITP)、脱氧异喹诺酮三磷酸(dICSTP)、脱氧丙炔基异喹诺酮三磷酸(dPICSTP)、脱氧甲基-7-氮杂吲哚三磷酸(dM7AITP)、脱氧ImPy三磷酸(dImPyTP)、脱氧PP三磷酸(dPPTP)或脱氧丙炔基-7-氮杂吲哚三磷酸(dP7AITP)。此类通用碱基的其它示例可见于，除其它以外公开的美国申请No.10/290,672和美国专利No.6,433,134中。
如本文所用的，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且意指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，其通过例如3'-5'和2'-5'的核苷酸间磷酸二酯键键联、例如3'-3'和5'-5'的反向键合、支链结构或核苷酸类似物链接。多核苷酸具有相关的抗衡离子，例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸，完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。多核苷酸可以包含核苷酸间、核碱基和/或糖类似物。多核苷酸的大小通常为从少数单体单元例如3-40个(此时它们在本领域中更常见地通常被称为寡核苷酸)至数千个单体核苷酸单元。除非另有所指，否则每当表示多核苷酸序列时，将理解，核苷酸从左至右依次为5'至3'，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞嘧啶，“G”表示脱氧鸟苷，和“T”表示胸苷，除非另有说明。
如本文所用的，"核碱基"是指为利用核酸技术或利用肽核酸技术来由此产生可序列特异性结合于核酸的聚合物的技术人员所公知的那些天然存在的和非天然存在的杂环部分。合适的核碱基的非限制性示例包括：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤)和N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤)。合适的核碱基的其它非限制性示例包括Buchardt等人(WO92/20702或WO92/20703)的图2(A)和2(B)中举例说明的那些核碱基。
如本文所用的，“核碱基序列”是指包含含有核碱基的亚单位的聚合物的任何区段，或两个或更多个区段的聚集体(例如，两个或更多个寡聚物嵌段的聚集核碱基序列)。合适的聚合物或聚合物区段的非限制性示例包括寡脱氧核苷酸(例如DNA)、寡核糖核苷酸(例如RNA)、肽核酸(PNA)、PNA嵌合体、PNA组合寡聚体、核酸类似物和/或核酸模拟物。
如本文所用的，“多核碱基链”是指包含核碱基亚单位的完整单个聚合物链。例如，双链核酸的单核酸链是多核碱基链。
如本文所用的，“核酸”是具有从核苷酸或其类似物形成的主链的含核碱基序列的聚合物或聚合物区段。
优选的核酸是DNA和RNA。
如本文所用的，核酸还可以指“肽核酸”或“PNA”，其意指包含两个或多个PNA亚单位(残基)而非核酸亚单位(或其类似物)的任何寡聚物或聚合物链区段(例如嵌段寡聚体)，包括，但不限于如美国专利No.5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053和6,107,470中所提及或称为肽核酸的寡聚物或聚合物区段的任一种；所有这些都通过引用包含于此。术语“肽核酸”或“PNA”还适用于包含以下出版物中描述的那些核酸模拟物的两个或多个亚单位的任何寡聚物或聚合物区段：Lagriffoul等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，4：1081-1082(1994)；Petersen等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，6：793-796(1996)；Diderichsen等人，Tett.Lett.37：475-478(1996)；Fujii等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637-627(1997)；Jordan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687-690(1997)；Krotz等人，Tett.Lett.36：6941-6944(1995)；Lagriffoul等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1081-1082(1994)；Diederichsen，U.，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，7：1743-1746(1997)；Lowe等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，(1997)1:539-546；Lowe等人，J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:547-554(1997)；Lowe等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.11：555-560(1997)；Howarth等人，J.Org.Chem.62：5441-5450(1997)；Altmann，K-H等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，7：1119-1122(1997)；Diederichsen，U.，Bioorganic&Med.Chem.Lett.，8：165-168(1998)；Diederichsen等人，Angew.Chem.Int.Ed.,37：302-305(1998)；Cantin等人，Tett.Lett.，38：4211-4214(1997)；Ciapetti等人，Tetrahedron，53：1167-1176(1997)；Lagriffoule等人，Chem.Eur.J.，3：912-919(1997)；Kumar等人，OrganicLetters 3(9)：1269-1272(2001)；以及如WO96/04000中公开的Shah等人的基于肽的核酸模拟物(PENAMS)。
聚合物纳米颗粒
术语“聚合物纳米颗粒”是指含有治疗材料的聚合物纳米颗粒。聚合物纳米颗粒已经开发出使用广泛的材料，包括但不限于：合成的均聚物，诸如聚乙二醇、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺；合成共聚物，诸如聚(丙交酯-共乙交酯)、聚(丙交酯)-聚(乙二醇)、聚(丙交酯-共-乙交酯)-聚(乙二醇)、聚(己内酯)-聚(乙二醇)；天然聚合物，诸如纤维素、几丁质和藻酸盐，以及聚合物治疗材料缀合物。
如本文所用的，术语“聚合物”是指主要或完全从键合在一起的大量相似单元构建的通常高分子量的化合物。此类聚合物包括众多天然、合成和半合成聚合物中的任一种。
术语“天然聚合物”是指来源于自然界的任何数目的聚合物种类。此类聚合物包括但不限于多糖、纤维素、几丁质和藻酸盐。
术语“合成聚合物”是指未在自然界中发现的任何数目的合成聚合物种类。此类合成聚合物包括但不限于合成均聚物和合成共聚物。
合成均聚物包括但不限于聚乙二醇、聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐、聚赖氨酸和聚乙烯亚胺。
“合成共聚物”是指由两个或多个合成均聚物亚单位构成的任何数目的合成聚合物种类。此类合成共聚物包括但不限于聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯)-聚(乙二醇)、聚(丙交酯-共-乙交酯)-聚(乙二醇)和聚(己内酯)-聚乙二醇)。
术语“半合成聚合物”是指通过天然聚合物的化学或酶处理衍生的任何数目的聚合物。此类聚合物包括但不限于羧甲基纤维素、乙酰化羧甲基纤维素、环糊精、壳聚糖和明胶。
如本文所用的，术语“聚合物缀合物”是指通过将一个或更多个分子种类共价或非共价地缀合于聚合物而制备的化合物。这种聚合物缀合物包括但不限于聚合物-治疗材料缀合物。
聚合物-治疗材料缀合物是指其中缀合的分子种类的一种或多种是治疗材料的聚合物缀合物。这样的聚合物-治疗材料缀合物包括，但不限于，聚合物-药物缀合物。
“聚合物-药物缀合物”是指与任何数目的药物种类缀合的任何数目的聚合物种类。这种聚合物药物缀合物包括但不限于乙酰甲基纤维素-聚乙二醇-多烯紫杉醇。
如本文所用的，除非另有说明，术语“约”表示可以通过加或减5％(+/-5％)修改相关值，并且保持在所公开的实施例的范围内。
为了说明而不是限制所描述的实施例，包括以下示例。
示例
示例1：使用利用歧管并行布置的四个单微流体混合器装置，或使用在单个装置中 并行布置的四个微流体混合器制造的siRNA-脂质纳米颗粒(siRNA-LNP)。
在本示例中，将使用利用歧管并行的四个单微流体混合器装置产生的siRNA-LNP与使用在单个装置中并行布置的四个微流体混合器产生的siRNA-LNP(图3)进行比较。本示例的目的是证明存在布置微流体混合器的开启-装置和关闭-装置的方法。流体驱动泵在相同的工艺条件下操作，具有相同的纳米颗粒形成材料，并且对每种布置方法进行测试。图4中的结果显示了使用两种布置方法产生的类似的siRNA-LNP，并且siRNA-LNP不受布置方法的影响。本示例显著证明使用布置的开启-装置和关闭-装置方法的二者之一或两者的可能性，以显著增加单个系统中的混合器的数量。使用布置的开启-装置和关闭-装置方法两者产生布置微流体混合器的二维方法。
图4示出代表性siRNA-脂质纳米颗粒(siRNA-LNP)的粒径(nm)和多分散指数(PDI)，其作为使用歧管并行布置的四个单微流体混合器装置或在图3所示的代表性单个装置中并行布置的四个微流控混合器的函数。siRNA-LNP由摩尔比为50:10:38.5:1.5的1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，且siRNA-总脂质比为0.06wt/wt，并且使用图2所示的示例性连续流系统产生纳米颗粒，该连续流系统具有使用歧管(4X歧管)并行布置的四个单微流体混合器装置，或者具有在图3所示的在单个装置中并行布置的四个微流体混合器(芯片上4X(4X on-chip))。在图例中示出通过微流体装置的总流速。误差棒表示平均值的标准偏差。
在该示例中，将在50mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)中的0.231mg/mLsiRNA和在单独注射器中的脂质混合物(在乙醇中以50:10:38.5:1.5摩尔比的12.5mM 1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/Chol/PEG-c-DMA)装入独立的Harvard PHDUltra注射泵(Harvard Apparatus，Holliston，MA)中。siRNA-总脂质比为0.06wt/wt。siRNA与脂质混合物的混合体积比为3:1，每个混合器处理5mL总体积(即总制剂体积：1X＝5mL，2X＝10mL，4X＝20mL)。在siRNA与脂质混合物流速比为3:1时(即，在1X中为9mL/min siRNA和3mL/min脂质混合物)，每个混合器的流速为12mL/min。将在每种制剂运行开始时从混合器出口收集的第一个2mL体积作为废料丢弃，并收集剩余体积作为样品。在粒径测量之前，将1mL收集的样品进一步稀释成3mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(不含钙和不含镁)。
如下进行粒径测量：将siRNA-LNP用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(不含钙和不含镁)稀释至合适浓度，并通过使用Malvern Zetasizer Nano ZS双角度粒度仪(MalvernInstruments Ltd.，Malvern，Worcestershire，UK)的动态光散射(DLS)确定平均粒径(强度加权)。
示例2：使用利用歧管并行布置的八个单微流体混合器装置制造的siRNA-脂质纳 米颗粒(siRNA-LNP)
在该示例中，使用利用外部歧管并行布置的八个单微流体混合器装置产生520mL体积的siRNA-LNP。阵列中的每个混合器是相同的，从而在每个混合器中形成siRNA-LNP的工艺条件是相同的。本实验的目的是证明大量并行混合器对siRNA-LNP的尺寸和质量的影响。本示例显著证明在相同系统中并行使用的大量微流体混合器的成功利用，以使用本文公开的示例性系统产生大体积批量的siRNA-LNP。
图5示出代表性siRNA-脂质纳米颗粒(siRNA-LNP)的粒径(nm)和多分散指数(PDI)，其作为制备体积的函数。siRNA-LNP由摩尔比为50:10:38.5:1.5的1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA组成，且siRNA-总脂质比为0.06wt/wt，并且使用图2所示的示例性连续流系统产生纳米颗粒，该连续流系统具有使用歧管并行布置的八个单微流体混合器装置。每100mL从0mL至500mL采样纳米颗粒，结果与使用NanoAssemblrTMBenchtop Instrument制备的相同siRNA-LNP的2mL制剂进行比较。NanoAssemblrTM台式仪是市售可得的实验室设备，其使用微流体制造固定体积批量的纳米颗粒。误差棒表示平均值的标准偏差。
在该示例中，将在50mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)中的0.231mg/mLsiRNA和脂质混合物(在乙醇中以50:10:38.5:1.5摩尔比的12.5mM 1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷基-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯/DSPC/胆固醇/PEG-c-DMA)装入单独的Flash 100计量泵(ScientificSystems，Inc.，StateCollege，PA)中。siRNA-总脂质比为0.06wt/wt。siRNA与脂质混合物的混合体积比为3:1，每个混合器处理65mL总体积(即：在8X中总制剂体积＝520mL)。在siRNA与脂质混合物流速比为3:1时，每个混合器的流速为12mL/min(总流速＝96ml/min，从而siRNA和脂质混合物的流速分别为72mL/min和24mL/min)。将在制剂运行开始时从混合器出口收集第一个20mL体积作为废料丢弃，并收集剩余体积作为样品。在收集第一个20mL初始废料，利用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(无钙和无镁)在线稀释颗粒制剂，1份颗粒溶液与3份DPBS，由具有双Easy-Load II型泵头的Masterflex L/S蠕动泵(Cole-ParmerInstrument Company，Montreal，QC，Canada)驱动。以等分收集所得的颗粒制剂并定尺寸。
虽然已经示出和描述了说明性的实施例，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变。

Claims (36)

1.一种用于微流体芯片的连续流操作的系统，所述系统包括：
(1)微流体芯片，包括：
(a)第一入口，其被配置成接收第一溶液；
(b)第二入口，其被配置成接收第二溶液；以及
(c)第一混合器，包括：
(i)第一入口微通道，其被配置成从所述第一入口接收所述第一溶液；
(ii)第二入口微通道，其被配置成从所述第二入口接收所述第二溶液；以及
(iii)混合微通道，其被配置成混合所述第一溶液和所述第二溶液以在混合器出口提供纳米颗粒溶液；以及
(d)芯片出口，其通过纳米颗粒溶液微通道与所述混合器出口流体连通；
(2)第一连续流流体驱动器，其被配置成将来自第一溶液储藏器的所述第一溶液连续地驱动至所述微流体芯片的所述第一入口；
(3)第二连续流流体驱动器，其被配置成将来自第二溶液储藏器的所述第二溶液连续地驱动至所述微流体芯片的所述第二入口；以及
(4)系统出口，其与所述芯片出口流体连通，其中所述系统出口被配置成输出所述纳米颗粒溶液。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一溶液包含活性药物成分。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述第二溶液包含第二溶剂中的颗粒形成材料。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一溶液包含第一溶剂中的核酸，且所述第二溶液包含第二溶剂中的脂质颗粒形成材料。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一混合器包括混合区域，所述混合区域包括微流体混合器，所述微流体混合器被配置成混合所述第一溶液和所述第二溶液以提供由所述第一溶液和所述第二溶液的混合形成的纳米颗粒溶液。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述第一混合器是混沌对流混合器。
7.根据权利要求5所述的系统，其中所述混合区域包括人字形混合器。
8.根据权利要求4所述的系统，其中所述混合区域具有约20微米至约300微米的流体动力学直径。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一混合器被设计尺寸并被配置成以小于1000的雷诺数混合所述第一溶液和所述第二溶液。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述微流体芯片是无菌的。
11.根据权利要求1所述的系统，还包括多个混合器，每个混合器包括第一入口、第一入口微通道、第二入口、第二入口微通道、混合微通道、混合器出口和芯片出口，其中所述多个混合器包括所述第一混合器。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述多个混合器在多个微流体芯片内。
13.根据权利要求11所述的系统，其中所述系统还包括第一歧管，所述第一歧管被配置成从所述第一溶液储藏器接收所述第一溶液并将所述第一溶液分配到所述多个混合器的所述第一入口。
14.根据权利要求11所述的系统，其中所述系统还包括第二歧管，所述第二歧管被配置成从所述第二溶液储藏器接收所述第二溶液并将所述第二溶液分配到所述多个混合器的所述第二入口。
15.根据权利要求11所述的系统，其中所述系统还包括第三歧管，所述第三歧管被配置成接收并组合来自所述多个混合器的所述芯片出口的所述纳米颗粒溶液，并在单通道中引导其朝向所述系统出口。
16.根据权利要求11所述的系统，其中所述系统还包括：
第一歧管，其被配置成从所述第一溶液储藏器接收所述第一溶液并将所述第一溶液分配到所述多个混合器的第一入口；
第二歧管，其被配置成从所述第二溶液储藏器接收所述第二溶液并将所述第二溶液分配到所述多个混合器的第二入口；以及
第三歧管，其被配置成从所述多个混合器的所述芯片出口接收并组合所述纳米颗粒溶液，并在单通道中引导其朝向所述系统出口。
17.根据权利要求11所述的系统，其中所述多个混合器在所述微流体芯片内。
18.根据权利要求11所述的系统，其中所述多个混合器的至少一部分是并行布置的并行化混合器，其中多个混合器的所述部分中的每一个具有与所述系统出口流体连通的混合器出口。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述并行化混合器以堆叠构造布置在所述微流体芯片上。
20.根据权利要求18所述的系统，其中所述并行化混合器以水平构造布置在所述微流体芯片上的基本相同的平面中。
21.根据权利要求18所述的系统，其中所述并行化混合器以水平构造和堆叠构造两者布置在所述微流体芯片上。
22.根据权利要求1所述的系统，还包括稀释元件，其中所述稀释元件包括：
第三连续流流体驱动器，其被配置成经由稀释通道在所述芯片出口和所述系统出口之间将稀释溶液从稀释溶液储藏器连续地驱动到系统中。
23.根据权利要求1所述的系统，还包括与所述芯片出口和所述系统出口之间的废料排出阀流体连通的废料出口，其中所述废料排出阀被配置成可控制地引导流体朝向所述废料出口。
24.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一连续流流体驱动器和所述第二连续流流体驱动器独立地选自由容积式泵、离心泵和压力驱动泵组成的组。
25.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统包括一次性流体路径。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述一次性流体路径包括一次性微流体芯片、所述第一连续流泵的一次性第一泵头、所述第二连续流泵的一次性第二泵头和一次性系统出口。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述一次性第一泵头和所述一次性第二泵头由独立地选自由不锈钢、聚合物、钛和陶瓷组成的组的材料制成。
28.根据权利要求25所述的系统，其中被所述第一溶液、所述第二溶液和所述纳米颗粒溶液接触的每个表面是一次性的。
29.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统具有1m2或更小的占地面积。
30.根据权利要求29所述的系统，其中所述系统具有每小时至少0.76升纳米颗粒溶液的生产量。
31.根据权利要求1所述的系统，还包括脉冲阻尼机构，所述脉冲阻尼机构被配置成使来自所述第一连续流流体驱动器、所述第二连续流流体驱动器或两者的流量脉动最小化。
32.一种包括根据前述权利要求中任一项所述的无菌微流体芯片的无菌包装，所述无菌微流体芯片密封在所述无菌包装内。
33.一种形成纳米颗粒的方法，包括使第一溶液和第二溶液流过根据前述权利要求中任一项所述的系统，并在所述微流体芯片的第一混合器中形成纳米颗粒溶液。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述系统包括多个混合器，并且所述方法还包括使所述第一溶液和所述第二溶液流过所述多个混合器以形成所述纳米颗粒溶液，其中所述多个混合器包括所述第一混合器。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个混合器包含在多个微流体芯片内。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个混合器包含在单微流体芯片内。
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