JP2020521781A - リポソームに内包されたｒｎａを製造する方法 - Google Patents

リポソームに内包されたｒｎａを製造する方法 Download PDF

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ベルナルド ジャン ストロディオット，ローレン
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Abstract

本発明は、マイクロ流体デバイスを用いてRNA内包リポソームを含む非ウイルス送達系を製造するための方法、及びそれに使用するための組成物が提供される。【選択図】図１２

Description

本発明は、マイクロ流体デバイスを用いてカチオン性脂質及び核酸分子を含む脂質ナノ粒子を製造する方法及び関連する態様に関する。
動物を免疫するための核酸の送達は、数年にわたる目標である。DNA若しくはRNAの使用、ウイルス若しくは非ウイルス送達媒体の使用（又は、「裸」ワクチンでの、送達媒体なしでさえ）、複製若しくは非複製ベクターの使用、又はウイルス若しくは非ウイルスベクターの使用など、さまざまな手法が試験されている。非ウイルス送達媒体にはリポソームが含まれる。
リポソームは、例えば、脂質のエタノール溶液を核酸及び緩衝液の水溶液と混合することによる、さまざまな方法によって製造され得る。混合のための方法としては、核酸水溶液の供給流が脂質溶媒溶液の1つの流と単一の混合区域で合わされるプロセスが挙げられる。
リポソームに内包された核酸の安全且つ便利で費用効果がある生産を商業的に実行可能な規模で可能にしつつ慣用的な製造アプローチで得られる免疫学的性能を維持する物理学的特性を保存する新しい製造アプローチに対するニーズが残されている。
マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法及びそこで使用するための組成物が提供される。該方法及びマイクロ流体デバイスは、商業的に実行可能な規模でRNAを封入するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造するために使用し得る。
一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、以下のステップ：デバイス内で、溶媒及びカチオン性脂質を含む第1の溶液と、水及びRNAを含む第2の溶液とを混合するステップ;並びに溶媒を除去するステップを含む。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、デバイス内で、溶媒、カチオン性脂質、DSPC、ステロール、及びPEG-PEとPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液と、水及びRNAを含む第2の溶液とを混合するステップ;並びに溶媒を除去するステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、溶媒、及び1〜10mg/mLの脂質を含むストック溶液を使用する。一部の実施形態では、溶媒はエタノールを含む。一部の実施形態では、ストック溶液は水をさらに含み、水とエタノールとの比率は3:7未満である。
図1は、実施例で使用したマイクロ流体デバイスの設計を示す。 図2は、LNPサイズ及びPDIにおけるTFRの影響を示す。 図3は、内包におけるTFRの増大の影響を示す。 図4は、LNPサイズ及びPDIにおける水性：有機比率の影響を示す。 図5は、RNA内包における水性：有機比率の影響を示す。 図6は、LNPサイズ及びPDIにおけるストック溶液濃度の影響を示す。 図7は、RNA内包収率におけるストック溶液濃度の影響を示す。 図8は、LNPサイズ及びPDIにおけるT°の影響を示す。 図9は、RNA内包収率におけるT°の影響を示す。 矢印A：均一なコントラストを有するLNP。矢印B：氷晶。矢印C：穴の縁。矢印D：不均一な材料密度を有するLNP。 矢印A：均一なコントラストを有するLNP。矢印D：不均一な材料密度を有するLNP。 狂犬病Gタンパク質抗原をコードするmRNAを送達するRV39（丸）、RV88（四角）及びRV94（三角）に基づくリポソームのEC50決定。
定義
「ヒンダードエステル基」とは、バルク置換基、例えば、環状又は分岐部分の存在により、C(=O)の周りに立体的に密集した環境を意味する。
「脂質」とは、脂肪酸又はそれらの誘導体であり、水に不溶性であるが、天然油、ワックス、及びステロイド(例えば、コレステロールを含むステロール)などの有機溶媒に可溶性である有機化合物の種類を意味する。
「リポソーム」とは、1つ以上の水性区画を囲むことができる脂質両親媒性分子の1つ以上の二重層で構成される微小胞を意味する。
非ウイルス送達系
リポソーム
RNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、本明細書の他の場所に記載されている拡大縮小が可能なマイクロ流体デバイスを利用する。本発明は、ポリペプチドをコードするRNAをその内部に内包するリポソームを利用する。したがって、RNAは(天然ウイルスのように)任意の外部媒体から分離される。リポソーム内の内包は、RNAをRNase消化から保護することが判明している。リポソームは、いくらかの外部RNAを(例えば、リポソームの表面上に)含み得るが、少なくともRNAの半分(例えば、少なくとも75％、少なくとも90％、理想的にはそのすべて)がリポソームのコアに内包される。リポソーム内への内包は、例えば、RNAが予め形成されたリポソームと混合されるRNA複合体とは異なる。
リポソームは、通常、3つのグループに分けられる:多層小胞(MLV);小さな単層小胞(SUV);及び大きな単層小胞(LUV)。MLVは、各小胞に複数の二重層を有し、いくつかの別々の水性区画を形成する。SUV及びLUVは、水性コアを封入した単一の二重層を有する;SUVは、典型的には、径が≦50nmであり、LUVは、径が＞50nmである。本明細書におけるリポソームは、理想的には、60〜180nmの範囲、好ましくは80〜160nmの範囲の径を有するLUVである。異なる径を有するLUVの集団を含む組成物の場合:(i)数において少なくとも80％が20〜220nmの範囲の径を有する必要があり、(ii)集団の平均径(Zav、強度による)は、理想的には140nm未満であり、及び/又は(iii)多分散性指数は＜0.3である。本明細書におけるリポソームが球状でない場合、「径」という用語は、リポソームの最大断面径を指す。
RNAを内包するのに有用なリポソームは、少なくとも1つの脂質が5.0〜7.6の範囲のpKa(及び好ましくは第三級アミン)を有するという条件で、単一の脂質又は脂質の混合物から形成することができる。このpKaの範囲内で、好ましい脂質は、pKaが5.5〜6である。pKaは、脂質の50％が帯電するpHであり、脂質が完全に帯電する点と脂質が完全に帯電しない点の中間にある。様々な方法で測定することができるが、「pKa測定」というタイトルのセクションで以下に開示する方法を使用して測定することが好ましい。pKaは、典型的には、他の脂質も含む混合物の状況の脂質についてではなく、むしろ脂質単独で測定される必要がある。
本明細書におけるリポソームが脂質の混合物から形成される場合、所望の範囲内のpKaを有するそれらの脂質の割合は、脂質の総量の20〜80％、例えば、30〜70％、又は40〜60％であるべきであることが好ましい。残りは、例えばコレステロール(例えば35〜55％コレステロール);及び/又はDMG(場合によりPEG化される)若しくはDMG PE;及び/又はDSPCで作製され得る。このような混合物は以下で使用される。これらの％値はモルパーセンテージである。
上述のように、リポソームは、親水性部分がPEG化されている(すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合により修飾されている)両親媒性脂質を含み得る。この修飾は、安定性を向上させ、リポソームの非特異的な吸着を防ぐことができる。例えば、脂質は、当該技術分野において公知である技術を使用してPEGにコンジュゲートすることができる。PEGは、好ましい薬物動態特性を付与することができる被覆を有するリポソームを提供する。RNA(特に自己複製性RNA)の効率的な内包、5.0〜7.6の範囲のpKaを有するカチオン性脂質、及びPEG化された表面の組み合わせは、複数の細胞型(免疫細胞と非免疫細胞の両方を含む)への効率的な送達を可能にし、それによりPEG化せずに第四級アミンを使用する場合よりも強く及び良好な免疫応答を引き出す。様々な長さのPEGを使用することができ、例えば0.5〜8kDaの間であり、例えば、PEG2K(PEG2000)、すなわち、およそ2KダルトンのPEG分子を含む。
本発明で使用される脂質は、飽和又は不飽和であり得る。リポソームを調製するための少なくとも1つの不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が2つの尾部を有する場合、両方の尾部が不飽和であり得、又は1つの飽和尾部及び1つの不飽和尾部を有することができる。
一部の実施形態では、リポソームは、第三級アミンを有する頭部基を含むカチオン性脂質(イオン化可能なカチオン性脂質)を含む。一部の実施形態では、本明細書におけるカチオン性脂質は、少なくとも1つのヒンダードエステル基;少なくとも1つのカーボネート基;又はコア内の少なくとも1つの芳香族基をさらに含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、非ヒンダードエステル基をさらに含む。
本出願人は、特定のイオン化可能なカチオン性脂質を含むリポソームに内包されたRNAの生物活性が、他のイオン化可能なカチオン性脂質を含むリポソームに内包された同じRNAより数倍高いことを観察した。したがって、イオン化可能なカチオン性脂質の選択は、満足のいく生物活性を有するRNA内包リポソームを生成するための重要なパラメータである。リポソームに内包されたRNAの活性は、本明細書の他の場所で詳細に説明されているように、ハイコンテントイメージングを使用してインビトロで抗原発現を決定することにより測定することができる。簡単に述べれば、RNA濃度の関数としての抗原発現細胞のパーセンテージの回帰が行われ、EC50値(最大応答の半分を生じさせるRNAの濃度)が得られる。一部の実施形態では、本明細書における使用に適したイオン化可能なカチオン性脂質は、2.5ng/ウェル未満、例えば、2.4ng/ウェル未満、2.3ng/ウェル未満、2.2ng/ウェル未満、2.1ng/ウェル未満、2.0ng/ウェル未満、1.9ng/ウェル未満、1.8ng/ウェル未満、1.7ng/ウェル未満、1.6ng/ウェル未満、1.5ng/ウェル未満、1.4ng/ウェル未満、1.3ng/ウェル未満、1.2ng/ウェル未満、1.1ng/ウェル未満、1.0ng/ウェル未満、0.9ng/ウェル未満、0.8ng/ウェル未満、0.7ng/ウェル未満、0.6ng/ウェル未満、0.5ng/ウェル未満、0.4ng/ウェル未満、0.3ng/ウェル未満、0.25ng/ウェル未満、0.20ng/ウェル未満、0.15ng/ウェル未満、又は0.10ng/ウェル未満のEC50を有するRNAを内包したリポソームを生成する。
一部の実施形態では、本明細書におけるカチオン性脂質は、式I:
の構造を有し、式中、
nは、1から3の整数であり、
(i)R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、及びYはCであり;又は
(ii)R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCであり;又は
(iii)R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、及びYはOであり;
oは、0又は1であり;
Xは、
(i)
{式中、
R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である};又は
(ii)-CH(-R6)-R7
{式中、
(1)R6は、-(CH2)p-O-C(O)-R8若しくは-Cp-R8であり;
(2)R7は、-(CH2)p'-O-C(O)-R8'若しくは-Cp'-R8'であり;
(3)p及びp'は、独立して、0、1、2、3若しくは4であり;及び
(4)R8及びR8'は、独立して、
(A)オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC8〜20炭化水素鎖;
(B)-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖;
(C)-C6〜16飽和炭化水素鎖;
(D)-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖;
(E)-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖;及び
(F)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖
である}
である。
一部の実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、YはCである。一部の実施形態では、R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCである。一部の実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、YはOである。
一部の実施形態では、Xは、
であり、式中、R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、及びR8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7はCp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8''であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV28である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV31である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV33である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV37である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV39である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV42である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV44である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV73である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV75である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV81である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV84である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV85である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV86である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV88である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV91である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV92である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV93である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV94である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV95である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV96である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV97である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV99である。
一部の実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV101である。
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、RV39、RV88、及びRV94からなる群から選択される。
式Iを有する化合物、並びにRV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99、及びRV101を合成するための組成物及び方法は、2014年12月17日に出願されたPCT/US2014/070882(国際公開番号第2015/095340号)及びPCT/US2014/070891(国際公開番号第2015/095346号において、並びに2015年9月4日に出願されたPCT/US2015/048535(国際公開番号第2016/037053号)に見出すことができる。
リポソームは、典型的には、ヘルパー脂質をさらに含む。有用なヘルパー脂質には、双性イオン脂質、例えば、DPPC、DOPC、DSPC、ドデシルホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、及び1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPyPE);ステロール、例えば、コレステロール;PEG化脂質、例えば、PEG-DMPE(PEGコンジュゲートした1,2-ジミリストイル-Sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)])又はPEG-DMG(PEGコンジュゲートした1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)が含まれる。一部の実施形態では、有用なPEG化脂質は、PEG2K-DMPE(PEGコンジュゲートした1,2-ジミリストイル-Sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000])又はPEG2K-DMG(PEGコンジュゲートした1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール-2000)であり得る。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、(i)pKaが5.0〜7.6の範囲であるイオン化可能なカチオン性脂質、(ii)DSPC、(iii)ステロール、及び(iv)PEG化脂質を含む脂質を利用する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、(i)pKaが5.0〜7.6の範囲であるイオン化可能なカチオン性脂質、(ii)DSPC、(iii)ステロール、及び(iv)PEG化脂質から本質的になる脂質を利用する。一部の実施形態では、PEG化脂質は、PEG-PE及びPEG-DMGから選択される。一部の実施形態では、脂質は、(i)式Iを有するカチオン性脂質、(ii)DSPC、(ii)ステロール、及び(iv)PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、(i)式Iを有するカチオン性脂質、(ii)DSPC、(ii)ステロール、及び(iv)PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質から本質的になる。一部の実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、pKaが5.5〜6.7、5.7〜6.6、5.9〜6.5、6.0〜6.4の範囲である。一部の実施形態では、脂質は、(i)カチオン性脂質が少なくとも1つのヒンダードエステル基、少なくとも1つのカーボネート基、又はコア内の少なくとも1つの芳香族基を含むイオン化可能なカチオン性脂質、(ii)DSPC、(iii)ステロール、及び(iv)PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEGを含む。一部の実施形態では、脂質は、(i)カチオン性脂質が少なくとも1つのヒンダードエステル基、少なくとも1つのカーボネート基、又はコア内の少なくとも1つの芳香族基を含むイオン化可能なカチオン性脂質、(ii)DSPC、(iii)ステロール、及び(iv)PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEGから本質的になる。一部の実施形態では、ステロールはコレステロールである。一部の実施形態では、脂質は、式Iを有するカチオン性脂質、DSPC、コレステロール、及びPEG-DMGを含む。一部の実施形態では、脂質は、RV39、RV88、及びRV94、DSPC、コレステロール、及びPEG-DMGからなる群から選択されるカチオン性脂質を含む。
本明細書の方法で利用される脂質は、個々の脂質を溶媒に可溶化し、適切な量を組み合わせて、各脂質の計算されたパーセント、比率、又は重量を含む総脂質のストック溶液を生成することにより調製することができる。あるいは、本明細書の方法で利用される脂質は、各脂質の適切な量を組み合わせ、次にそれらを溶媒に可溶化することによって調製することができる。
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の20〜80％、30〜70％、又は40〜60％(モルパーセント)はカチオン性である。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の約35％、約40％、約45％、約50％、約55％(モルパーセント)はカチオン性である。
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の35〜55％又は40〜50％(モルパーセント)はコレステロールである。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％(モルパーセント)はコレステロールである。
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の0.5〜5％又は1.0〜3.0％(モルパーセント)は、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質である。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の約1.5％、約1.6％、約1.7％、約1.8％、約1.9％、約2.0％、約2.5％(モルパーセント)は、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質である。
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の5〜15％又は7.5〜13％(モルパーセント)はDSPCである。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液中の総脂質の約8％、約9％、約10％、約11％、約12％(モルパーセント)はDSPCである。
一部の実施形態では、カチオン性脂質:(コレステロール+PEG化脂質+DSPC)(モル:モル)の比率は、1:5〜4:5、3:10〜7:10、2:5〜3:5である。一部の実施形態では、コレステロール:(カチオン性脂質+PEG化脂質+DSPC)(モル:モル)の比率は、7:20〜11:20、又は2:5〜1:2である。一部の実施形態では、PEG化脂質:(カチオン性脂質+コレステロール+DSPC)の比率(モル:モル)は、1:200〜1:20、又は1:100〜3:100である。一部の実施形態では、DSPC:(カチオン性脂質+コレステロール+PEG化脂質)(モル:モル)の比率は、1:20〜3:20、又は15:200〜13:100である。
本明細書で使用するための脂質+溶媒のストック溶液は、脂質の便利な濃度で調製される。有利なことに、ストック溶液の濃度を上げることにより、ナノ沈殿前に低容量で作業することができ、最終製造物をより濃縮することができる。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液は、少なくとも1mg/mL、少なくとも2mg/mL、少なくとも3mg/mL、少なくとも4mg/mL、少なくとも5mg/mL、少なくとも6mg/mL、少なくとも7mg/mL、少なくとも8mg/mL、少なくとも9mg/mL、少なくとも10mg/mL、少なくとも15mg/mL、少なくとも20mg/mLの総脂質をさらに含む。一部の実施形態では、溶媒を含む溶液は、1〜20mg/mL、1〜15mg/mL、1〜10mg/mLの総脂質をさらに含むが、50mg/mL以下の総脂質である。
脂質の溶液に利用される溶媒は、脂質と適合性があり、水溶液と混和性である。一部の実施形態では、脂質の溶液中の溶媒は、クラス3溶媒、例えば、酢酸、ヘプタン、アセトン、酢酸イソブチル、アニソール、酢酸イソプロピル、1-ブタノール、酢酸メチル、2-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、tert-ブチルメチルエーテル、2-メチル-1-プロパノール、ジメチルスルホキシド、ペンタン、エタノール、1-ペンタノール、酢酸エチル、1-プロパノール、エチルエーテル、2-プロパノール、ギ酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸、及びトリエチルアミンであり得る。一部の実施形態では、脂質の溶液中の溶媒は、有機アルコールであり得る。一部の実施形態では、溶媒は70〜100％のエタノールを含む。一部の実施形態では、溶媒は、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％の有機アルコールである。一部の実施形態では、溶媒は、10％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満の水である。一部の実施形態では、脂質の溶液中の溶媒は、イソプロパノール及びエタノールからなる群から選択される。一部の実施形態では、溶媒は70〜100％のエタノールを含む。一部の実施形態では、溶媒は、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％のエタノールである。一部の実施形態では、エタノールは、10％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満の水である。一部の実施形態では、溶媒は100％エタノールである。
RNA
本発明は、免疫原をコードするRNAのインビボ送達に有用である。RNAは、送達部位で非免疫細胞によって翻訳され、免疫原の発現をもたらす。非免疫細胞はまた、存在する場合の免疫細胞がそうであるように、RNAに応答してI型インターフェロン及び/又は炎症誘発性サイトカインを分泌する場合があり、これは局所的なアジュバント効果を提供し得る。
RNAは+鎖であるため、任意の介在する複製ステップ、例えば、逆転写を必要とせずに、非免疫細胞によって翻訳することができる。また、免疫細胞によって発現されるTLR7受容体に結合し、それによりアジュバント効果を開始することができる。
好ましい+鎖RNAは自己複製性である。自己複製性RNA分子(レプリコン)は、いずれものタンパク質がなくても脊椎動物細胞に送達した場合、それ自体からの転写(それ自体から生成されるアンチセンスコピーを介した)により、複数の娘RNAの生成へと導く。したがって、自己複製性RNA分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得る+鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、続いて、送達されたRNAからアンチセンス転写産物とセンス転写産物の両方を生成する。したがって、送達されたRNAは、複数の娘RNAの生成へと導く。これらの娘RNA、並びに同一線上のサブゲノム転写産物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、又は転写されて、免疫原のインサイチュ発現を提供するために翻訳される送達RNAと同じセンスのさらなる転写産物を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数を巨大に増幅するため、コードされた免疫原は細胞の主要なポリペプチド産物になる。
以下に示すように、自己複製活性は、RNAがアジュバント効果を提供するために必要ではないが、トランスフェクション後のサイトカイン分泌を増強することができる。自己複製活性は、非免疫細胞による免疫原の高レベルの発現を達成するために特に有用である。また、非免疫細胞のアポトーシスを増強することができる。
自己複製を達成するための1つの適切な系は、アルファウイルスに基づくRNAレプリコンを使用することである。これらの+鎖レプリコンは、細胞に送達後に翻訳されて、レプリカーゼ(又はレプリカーゼ転写酵素)を与える。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは自己切断して複製複合体を提供し、これが+/-鎖の送達されたRNAのゲノム-/-鎖コピーを生成する。これらの-/-鎖転写産物は、それ自体が転写されて+/-鎖の親RNAのさらなるコピーを与え、また免疫原をコードするサブゲノム転写産物を与えることができる。したがって、サブゲノム転写産物の翻訳は、感染した細胞による免疫原のインサイチュ発現へと導く。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどからのレプリカーゼを使用することができる。突然変異又は野生型のウイルス配列を使用することができ、例えば、VEEVの弱毒化TC83突然変異体はレプリコンで使用されている。
こうして好ましい自己複製性RNA分子は、(i)自己複製性RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)免疫原をコードする。このポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼであり得、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3、及びnsP4の1つ以上を含む。
自己複製性RNAウイルスの天然ゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードするが、本発明の自己複製性RNA分子は構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、好ましい自己複製性RNAは、細胞内でそれ自体のゲノムRNAコピーの生成へと導くことができるが、ビリオンを含むRNAの生成には導くことができない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型ウイルス、例えば、アルファウイルスとは異なり、自己複製性RNA分子がそれ自体、感染性の形態で永続化することができないことを意味する。野生型ウイルスの永続化に必要とされるアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製性RNAには存在せず、それらの場所は、目的の免疫原をコードする遺伝子(複数可)によって占有され、そのため、サブゲノム転写産物は、構造ビリオンタンパク質ではなく免疫原をコードする。
したがって、本発明で有用な自己複製性RNA分子は、2つのオープンリーディングフレームを有する場合がある。第1の(5')オープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードする。第2の(3')オープンリーディングフレームは免疫原をコードする。一部の実施形態では、RNAは、例えば、さらなる免疫原をコードするため(以下を参照されたい)、又はアクセサリーポリペプチドをコードするために、追加の(例えば、下流の)オープンリーディングフレームを有することができる。
自己複製性RNA分子は、コードされたレプリカーゼと適合性がある5'配列を有することができる。
自己複製性RNA分子は、様々な長さを持つことができるが、それらは、典型的には、5000〜25000ヌクレオチドの長さ、例えば8000〜15000ヌクレオチド、又は9000〜12000ヌクレオチドの長さである。したがって、RNAは、siRNA送達で見られるものよりも長い。
本発明で有用なRNA分子は、5'キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有することができる。このキャップは、RNAのインビボ翻訳を増強することができる。
本発明で有用なRNA分子の5'ヌクレオチドは、5'三リン酸基を有することができる。キャップされたRNAでは、これは5'から5'への架橋を介して7-メチルグアノシンに連結され得る。5'三リン酸がRIG-I結合を強化し、したがって、アジュバント効果を促進することができる。
RNA分子は、3'ポリAテールを有することができる。これはまた、その3'末端近辺にポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)を含むことができる。
本発明に有用なRNA分子は、典型的には、一本鎖である。一本鎖RNAは、一般的に、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼ及び/又はPKRに結合することにより、アジュバント効果を開始することができる。二本鎖形態で送達されるRNA(dsRNA)は、TLR3に結合することができ、この受容体はまた、一本鎖RNAの複製の間、又は一本鎖RNAの二次構造内、のいずれかに形成されたdsRNAにより誘発することができる。
本発明に有用なRNA分子は、好都合には、インビトロ転写(IVT)により調製することができる。IVTは、細菌中でプラスミドの形で作製及び増幅されるか、又は合成的に(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)工学的方法により)作製される(cDNA)鋳型を使用することができる。例えば、DNA鋳型からRNAを転写するために、DNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、バクテリオファ-ジT7、T3、又はSP6 RNAポリメラーゼ)を使用することができる。適切なキャッピング及びポリA付加反応を、必要に応じて使用することができる(通常、レプリコンのポリAはDNA鋳型内にコードされているが)。これらのRNAポリメラーゼは、転写された5'ヌクレオチド(複数可)についてのストリンジェントな要件を有することがあり、一部の実施形態では、これらの要件を、コードされたレプリカーゼの要件と一致させて、IVT転写されたRNAが、自己によりコードされるそのレプリカーゼのための基質として効率的に機能できることを確実にする必要がある。
自己複製性RNAは、(任意の5'キャップ構造に加えて)修飾された核酸塩基を有する1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。したがって、RNAは、m5C(5-メチルシチジン)、m5U(5-メチルウリジン)、m6A(N6-メチルアデノシン)、s2U(2-チオウリジン)、Urn(2'-O-メチルウリジン)、mlA(l-メチルアデノシン)、m2A(2-メチルアデノシン);Am(2'-O-メチルアデノシン);ms2m6A(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン);i6A(N6-イソペンテニルアデノシン);ms2i6A(2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン);io6A(N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン);ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン);g6A(N6-グリシニルカルバモイルアデノシン);t6A(N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);ms2t6A(2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);m6t6A(N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);hn6A(N6.-30ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン);ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン);Ar(p)(2'-O-リボシルアデノシン(リン酸));I(イノシン);mIl(l-メチルイノシン);m'Im(1, 2'-O-ジメチルイノシン);m3C(3-メチルシチジン);Cm(2T-O-メチルシチジン);s2C(2-チオシチジン);ac4C(N4-アセチルシチジン);f5C(5-ホルミルシチジン);m5Cm(5, 2-O-ジメチルシチジン);ac4Cm(N4アセチル2TOメチルシチジン);k2C(リシジン);mIG(1-メチルグアノシン);35m2G(N2-メチルグアノシン);m7G(7-メチルグアノシン);Gm(2'-O-メチルグアノシン);m22G(N2, N2-ジメチルグアノシン);m2Gm(N2, 2'-O-ジメチルグアノシン);m22Gm(N2, N2, 2'-O-トリメチルグアノシン);Gr(p)(2'-O-リボシルグアノシン(リン酸));yW(ワイブトシン);o2yW(ペルオキシワイブトシン);OHyW(ヒドロキシワイブトシン);OHyW*(過少修飾ヒドロキシワイブトシン);imG(ワイオシン);mimG(メチルグアノシン);Q(キューオシン);oQ(エポキシキューオシン);galQ(ガルタクトシルキューオシン);manQ(マンノシル-キューオシン);preQo(7-シアノ-7-デアザグアノシン);preQi(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン);G(アルカエオシン);D(ジヒドロウリジン);m5Um(5, 2'-O-ジメチルウリジン);s4U(4-チオウリジン);m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン);s2Um(2-チオ-2'-O-メチルウリジン);acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン);ho5U(5-ヒドロキシウリジン);mo5U(5-メトキシウリジン);cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸);mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル);chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン));mchm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル);mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン);mcm5Um(S-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン);mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン);nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン);mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン);mnm5s2U(5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン);mnm5se2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン);ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン);ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2'-O-メチルウリジン);cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン);cnmm5Um(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-LOメチルウリジン);cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン);m62A(N6, N6-ジメチルアデノシン);Tm(2'-O-メチルイノシン);m4C(N4-メチルシチジン);m4Cm(N4, 2-O-ジメチルシチジン);hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン);m3U(3-メチルウリジン);cm5U(5-カルボキシメチルウリジン);m6Am(N6, T-O-ジメチルアデノシン);rn62Am(N6, N6, O-2ートリメチルアデノシン);m2'7G(N2, 7-ジメチルグアノシン);m2'2'7G(N2, N2, 7ートリメチルグアノシン);m3Um(3, 2T-O-ジメチルウリジン);m5D(5-メチルジヒドロウリジン);f5Cm(5-ホルミル-2'-O-メチルシチジン);mlGm(1, 2'-0-ジメチルグアノシン);m'Am(1, 2-O-ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン);tm5s2U(S-タウリノメチル-2-チオウリジン);imG-l4(4-デメチルグアノシン);imG2(イソグアノシン);又はac6A(N6-アセチルアデノシン)、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-(C1〜C6)-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-(C2〜C6)-アルケニルウラシル、5-(C2〜C6)-アルキニルウラシル、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-(C1〜C6)-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-(C2〜C6)-アルケニルシトシン、5-(C2〜C6)-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7(C2〜C6)アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、又は脱塩基ヌクレオチドを含むことができる。例えば、自己複製性RNAは、1つ以上の修飾ピリミジン核酸塩基、例えば、シュードウリジン及び/又は5-メチルシトシン残基を含むことができる。しかしながら、一部の実施形態では、RNAは修飾された核酸塩基を含まず、修飾されたヌクレオチドを含まない場合があり、すなわち、RNAのヌクレオチドはすべて、標準A、C、G及びUリボヌクレオチド(7'-メチルグアノシンを含み得る、いずれもの5'キャップ構造を除く)である。他の実施形態では、RNAは、7'-メチルグアノシンを含む5'キャップを含み得、最初の1、2又は3の5'リボヌクレオチドは、リボースの2'位でメチル化され得る。
本発明で使用されるRNAは、理想的には、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合のみを含むが、一部の実施形態では、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、及び/又はメチルホスホネート結合を含むことができる。
理想的には、リポソームは、異なる10種未満の種のRNA、例えば、5、4、3、又は2つの異なる種を含み;最も好ましくは、リポソームは、単一のRNA種を含み、すなわち、リポソーム中のすべてのRNA分子は、同じ配列及び同じ長さを有する。
リポソームあたりのRNA量は様々であり得る。リポソームあたりの個々の自己複製性RNAの10分子の数は、典型的には、≦50個であり、例えば、リポソームあたり＜20個、＜10個、＜5個、又は1〜4個である。
本発明で使用されるRNA分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。リポソームの投与後、RNAはインビボで翻訳され、免疫原はレシピエントで免疫応答を引き出すことができる。免疫原は、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫に対する(又は、一部の実施形態では、アレルゲンに対する;及び他の実施形態では、腫瘍抗原に対する)免疫応答を引き出し得る。免疫応答は、抗体応答(通常、IgGを含む)及び/又は細胞媒介性免疫応答(例えば、CD4及び/又はCD8T細胞応答)を含み得る。ポリペプチド免疫原は、典型的には、対応する細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫(又はアレルゲン若しくは腫瘍)ポリペプチドを認識する免疫応答を引き出すが、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ミモトープとして作用して、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫の糖を認識する免疫応答を引き出す。免疫原は、典型的には、表面ポリペプチド、例えば、アドヘシン、血球凝集素、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などである。
自己複製性RNA分子は、単一のポリペプチド免疫原又は複数のポリペプチドをコードすることができる。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原(融合ポリペプチド)として、又は別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が別個のポリペプチドとして発現される場合、これらの1つ以上は、上流のIRES又は追加のウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒プロテアーゼ(例えば、口蹄疫ウイルス2Aタンパク質)に融合した個々の免疫原をコードするポリタンパク質から、又はインテインとして発現され得る。
本明細書の方法の一部の実施形態では、RNAは、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも2500ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも3500ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも4500ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも5500ヌクレオチド、少なくとも6000ヌクレオチド、少なくとも6500ヌクレオチド、少なくとも7000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも8000ヌクレオチド、少なくとも8500ヌクレオチド、少なくとも9000ヌクレオチド、又はそれ以上のmRNAである。本明細書の方法の一部の実施形態では、RNAは、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも2500ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも3500ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも4500ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも5500ヌクレオチド、少なくとも6000ヌクレオチド、少なくとも6500ヌクレオチド、少なくとも7000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも8000ヌクレオチド、少なくとも8500ヌクレオチド、少なくとも9000ヌクレオチド、又はそれ以上の自己複製性RNAである。
本明細書で使用するためのRNAは、水を含む水溶液で調製される。水溶液は、RNAとともに使用するのに適した賦形剤をさらに含み得る。一部の実施形態では、RNAの溶液はクエン酸緩衝液を含む。
RNAを内包するリポソームを生成するための一般的なパラメータ
上述のように、RNA含有リポソームを調製するプロセスは、(a)脂質のpKaより低いが、4.5を上回るpHでRNAを脂質と混合するステップ、次に(b)pHを上げて脂質のpKaを超えさせるステップを含み得る。したがって、カチオン性脂質は、ステップ(a)におけるリポソーム形成中に正に帯電するが、その後のpH変化は、正に帯電した基の大部分(又はすべて)が中性になることを意味する。このプロセスは、RNAを内包するリポソームの調製に有利である。ステップ(a)で4.5を下回るpHを回避することにより、内包されたRNAの安定性が改善する。ステップ(a)のpHは4.5を上回り、理想的には4.8を上回る。5.0〜6.0の範囲、又は5.0〜5.5の範囲のpHを用いると、適切なリポソームを得ることができる。ステップ(b)で上昇したpHは、脂質のpKaを上回る。pHは、理想的には9未満、好ましくは8未満のpHに上昇する。脂質のpKaに応じて、ステップ(b)のpHは、したがって、6〜8の範囲内、例えば、pH6.5±0.3に上昇し得る。ステップ(b)のpH上昇は、リポソームを適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水に移すことによって達成することができる。ステップ(b)のpH上昇は、理想的には、リポソームの形成が行われた後に実行される。ステップ(a)で使用されるRNAは、脂質の有機溶液(例えば、エタノール溶液)と混合するために水溶液中にあり得る。次に、混合物を希釈してリポソームを形成させることができ、その後、ステップ(b)でpHを上昇させることができる。
混合するためのデバイスの選択は、集団及び/又は多分散性指数の達成可能な平均径(強度によるZav)の制限に影響を与える可能性がある。特定のデバイスはまた、免疫学的性能を維持する物理化学的特性を維持しながら、商業的に実行可能な規模でのリポソーム内包された核酸の安全であり、便利である費用対効果の高い生産にも影響を与える。
マイクロ流体デバイス
マイクロ流体デバイスは、典型的に少なくとも1つの面がmm以下の程度の寸法を有し、混合が典型的に受動的手段によって起こる(即ち、混合チャンバ内に可動部品がなく、流体流の接触によって起こる)流体処理装置である。マイクロ流体デバイスは、第1の溶液と第2の溶液を混合する混合チャンバを含む。
混合チャンバは典型的に25.6mm2以下、例えば12.8mm2以下、適切には6.4mm2以下、殊に3.2mm2以下、特に1.6mm2以下の断面積を有する。混合チャンバは典型的に0.1mm2以上、適切には0.2mm2以上、殊に0.3mm2以上、特に0.4mm2以上の断面積を有する。一部の実施形態では、混合チャンバは0.2〜3.2mm2、例えば0.4〜1.6mm2、殊に0.6〜1.2mm2、特に0.7〜1.0mm2(例えば0.8mm2)の断面積を有する。
混合チャンバの断面はいかなる形状でもよいが、典型的に対称である。断面は実質的に長方形(例えば正方形)でよい。断面は実際上細長くてよく、大きい方の寸法が垂直方向の寸法の少なくとも二倍、例えば少なくとも三倍又は少なくとも四倍である。大きい方の寸法は垂直方向の寸法の十倍以下、例えば八倍以下又は六倍以下でよい。大きい方の寸法は通常垂直方向の寸法の二〜十倍、例えば三〜八倍、殊に四〜六倍、特に五倍である。
長方形の断面は1〜8mm、例えば1〜4mm、例えば1.4〜3.2mm、殊に1.6〜2.4mm、特に1.8〜2.2mm(例えば2mm)の長辺を有し得る。長方形の断面は0.1〜4mm、例えば0.1〜2mm、場合により0.1〜1.2mm、例えば0.1〜0.8mm、殊に0.2〜0.6mm、特に0.3〜0.5mm(例えば0.4mm)の短辺を有し得る。
マイクロ流体デバイスは第1の溶液の送達のために混合チャンバへの少なくとも1つの入口(例えば1つの入口)を有する。デバイスは第1の溶液の送達のために混合チャンバへの複数の入口、例えば2つの入口を有していてもよい。
マイクロ流体デバイスは第2の溶液の送達のために混合チャンバへの少なくとも1つの入口を有する。デバイスは第2の溶液の送達のために混合チャンバへの複数の入口、例えば2つの入口を有していてもよい。
適切な混合を容易にするために、より大きい断面積の混合チャンバの場合、第1の溶液及び第2の溶液のための入口の数を増やしてもよい。
入口の断面はいかなる形状でもよいが、典型的に対称である。断面は長方形(例えば正方形)でもよい。
各々の入口は典型的に1.28mm2以下、適切には0.64mm2以下、殊に0.32mm2以下、特に0.16mm2以下の断面積を有する。各々の入口は典型的に0.01mm2以上、適切には0.02mm2以上、殊に0.03mm2以上、特に0.04mm2以上の断面積を有する。一部の実施形態では、各々の入口は0.02〜0.32mm2、例えば0.04〜0.16mm2、殊に0.06〜0.12mm2、特に0.07〜0.10mm2(例えば0.8mm2)の断面積を有する。
全ての入口の合計断面積は混合チャンバの断面積の70％未満、例えば60％未満、殊に50％未満が適切である。
便利には、入口は混合チャンバの1つの辺の全長に及び得る。
各々の入口の形状及びサイズは独立して変わり得る。しかし、典型的に、第1の溶液のための入口は形状及びサイズが同じであり、第2の溶液のための入口は形状及びサイズが同じである。全ての入口の形状及びサイズが同じであるのが便利である。特定の入口デザインは形状が長方形であり、0.2mmの幅で、混合チャンバの他の辺の全長に及ぶ(例えば0.4mmの高さ)。
入口は、典型的に、混合チャンバ内への第1の溶液及び第2の溶液の流れの方向が混合チャンバを通る流れの全般的な方向に対して実質的に平行(例えば15度以内、例えば10度以内、特に5度以内)、例えば平行であるように位置する。したがって、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスは、ティー接合部（Tee-junction）又はティーミキサー（Tee-mixer）など、混合チャンバへの第1の溶液及び第2の溶液の流れの方向が反対である装置を含まない。
マイクロ流体デバイスは混合材料の回収のために混合チャンバからの少なくとも1つの出口を有する。デバイスは混合材料の回収のために混合チャンバからの複数の出口、例えば2つ又は3つの出口を有していてもよく、これらは後に一緒にされる。デバイスは混合材料の回収のために混合チャンバからの単一の出口を有するのが適切である。
出口の断面はいかなる形状であってもよいが、典型的に対称である。断面は長方形(例えば正方形)でよく、典型的に0.2〜1mm2、例えば0.3〜0.6mm2、例えば0.4〜0.5mm2の面積を有する。他の例において、出口は円形の断面であってもよい(例えば0.5〜1mm、例えば0.6〜0.8mm、例えば0.75mmの直径を有する)。
全ての出口の合計断面積は混合チャンバの断面積の70％未満、例えば60％未満、殊に50％未満であるのが適切である。
混合チャンバは、液体が出口に到達する時間までに混合が実質的に完全になるのが可能なように適切な長さであるべきである。典型的に、チャンバーは長さが1〜10cm、例えば1.5〜5cm、殊に1.8〜4cm、特に2〜3cm、例えば2.5cmである。
1つの実施形態において、デバイスは断面が長方形の混合チャンバを含み、これは0.2〜3.2mm2(例えば0.6〜1.0mm2)の断面積、1.4〜3.2mm(例えば1.6〜2.4mm)の長辺、0.1〜1.2mm(例えば0.32〜0.48mm)の短辺、第1の溶液のための1つの入口及び混合チャンバの近位端に対称に配置された第2の溶液のための2つの入口、1.5〜5cm(例えば2〜3cm)の混合チャンバ長さ、並びに混合チャンバの遠位端に位置する出口を有する。入口は0.16〜0.24mmの幅で、混合チャンバの他の辺の全長に及ぶのが適切である。
マイクロ流体デバイスはいずれかの適切な材料、即ち第1の溶液及び第2の溶液中に使用される成分に認容され、且つ製造に適している材料から形成され得る。適切な材料にはシリコン及びガラスが含まれる。デバイスはそのような材料からエッチングによって製造することができ、例えばシリコンデバイスはDeep Reactive Ion Etching(DRIE又はプラズマエッチング)によって製造することができ、ガラスデバイスはウェットエッチング(HFエッチング)によって製造することができる。
扱い易い期間であるバッチ実行時間(例えば240分以下、殊に120分以下)を達成するには、系が充分なレベルの生産性を達成することが必要である。加えて、始動及び停止効果の影響を低減することによってバッチ間の一貫性を支援するには、実行時間が適切な長さ(例えば少なくとも30分、殊に少なくとも60分)であることが必要である。
マイクロ流体力学によるRNAを内包するリポソームの製造方法
本発明は、マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、溶媒を含む第1の脂質溶液と、第2のRNA水溶液とを混合し、続いて溶媒を除去することを含む。一部の実施形態では、本方法は、溶媒を含む脂質/RNA溶液を混合し、続いて溶媒を除去することを含む。
一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、以下のステップ：（a）デバイス内で、溶媒、水、RNA、pKaが5.5〜6.7のイオン化可能なカチオン性脂質、DSPC、ステロール、及びPEG-PEとPEG-DMGからなる群より選択されるPEG化脂質を含む溶液を混合するステップ;並びに（b）溶媒を除去するステップを含み、マイクロ流体デバイスは、2〜128個の混合チャンバを含む。
一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法は、以下のステップ：（a）デバイス内で、（i）溶媒、pKaが5.5〜6.7のイオン化可能なカチオン性脂質、DSPC、コレステロール、及びPEG-PEとPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液と、（ii）水及びRNAを含む第2の溶液とを混合するステップ;並びに（b）溶媒を除去するステップを含み、マイクロ流体デバイスは、2〜128個の混合チャンバを含む。
本明細書の方法で使用される成分は、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成する割合で混合することができる。さらに、本明細書の方法は、特定の温度及び/又は流量（flow rate）で使用して、生成されるLNPの物理化学的特性を高めることができる。
例えば、カチオン性脂質は窒素を含み、RNAはリン酸を含む。1μgのRNAには3nmolのリン酸が含まれる。一部の実施形態では、窒素：リン酸（N：P）比は、1：1〜10：1、2：1〜9：1、3：1〜8：1、4：1〜8：1、5：1〜8：1である。一部の実施形態では、N：P比は約1：1、約2：1、約3：1、又は約4：1、約5：1、約6：1、約7：1、約8：1、約9：1、約10：1から選択される。一部の実施形態では、N：P比は8：1である。N：P比が8：1である一実施形態では、RNAが40μg/mL（120nmol）で存在する場合、カチオン性脂質は960nmolで存在し得る。
本明細書で使用される有機成分に対する水性成分の比率は、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成するように調整し得る。一部の実施形態では、水（すなわち水溶液）の有機溶媒に対する比率は、1：1〜5：1v/v、1.25：1〜4：1v/v、1.5〜3：1v/vである。一部の実施形態では、水と有機溶媒の比率は約1.4：1v/v、約2：1v/v、又は約3：1v/vである。一部の実施形態では、水と有機溶媒の比率は約2：1v/vである。一部の実施形態では、有機溶媒はエタノールであり、水とエタノールの比率は1：1〜5：1v/v、1.25：1〜4：1v/v、1.5〜3：1v/vである。一部の実施形態では、水とエタノールの比率は約1.4：1、約2：1、又は約3：1である。一部の実施形態では、水とエタノールの比率は約2：1である。
マイクロ流体デバイスの総流量（TFR）を制御することにより、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成し得る。本明細書に記載のマイクロ流体デバイスは、商業的に有意な流量（1.0ml/分/mm2を超える）で駆動しながら許容可能な物理化学的特性を有するLNPを生成できるため、ティー接合やティーミキサーなどの装置を含まない。一部の実施形態では、8ml/分/mm2を超えるデバイスのTFRは、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成する。一部の実施形態では、TFRは、8〜30mL/分/mm2、12〜28mL/分/mm2、14〜26mL/分/mm2、16〜24mL/分/mm2、又は約18mL/分/mm2若しくは約22mL/分/mm2である。
デバイス内の1つ又は複数の溶液の温度も調整して、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成し得る。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイス内の溶液の温度は、10℃〜37℃、例えば15℃〜36℃、15℃〜36℃、15℃〜19℃、19℃〜24℃、24℃〜28℃、28℃〜36℃、20℃〜35℃、25℃〜34℃、30℃〜33℃、約17℃、約22℃、約26℃、又は約30℃である。
上記のようにTFRを維持しながら、マイクロ流体デバイス内の水性溶媒と有機溶媒の流量比を制御することにより、許容し得る物理化学的特性を有するLNPを成功的に生成することができる。一部の実施形態では、水性溶媒の流量と有機溶媒の流量の比率は、1：1〜5：1、例えば約1.4：1、約2：1、又は約3：1である。一部の実施形態では、水性溶媒の流量と有機溶媒の流量の比は約2：1である。一部の実施形態では、水性溶媒は緩衝液を含む水であり、有機溶媒はエタノールであり、水とエタノールの流量比率は約1：1〜5：1、例えば約1.4：1、約2：1又は約3：1である。一部の実施形態では、水の流量のエタノールの流量に対する比率は約2：1である。
一部の実施形態では、上記の方法を使用すると、平均サイズが140nm以下、130nm以下、120nm以下、又は100nm以下のリポソームが生成される。一部の実施形態では、上記の方法を使用すると、多分散性が0.3以下、0.2以下、又は0.1以下のリポソームが生成される。
マイクロ流体デバイスのスケールアップ
工業規模(例えば毎分少なくとも0.5gのカチオン性脂質、例えば毎分少なくとも1g、特に毎分少なくとも2g、殊に毎分少なくとも4gの規模)でのRNAを内包するリポソームの製造を容易にするために、大きい混合チャンバを使用してもよいし、又は複数の混合チャンバを並行して作動させてもよい。例えば、2つ以上の混合チャンバ、特に4つ以上、殊に8つ以上、例えば16以上(例えば16)。並行して作動させる複数の混合チャンバは128以下、例えば64以下、特に32以下でよい。それ故、一部の実施形態では、複数の混合チャンバは2〜128、例えば4〜64、例えば8〜32である。
幾つかの状況において、複数の混合チャンバの各々の混合チャンバは独立して作動させ、第1の溶液及び第2の溶液を独立したポンプにより混合チャンバへ供給することができる(即ち、各々のポンプが同時に他の混合チャンバへ溶液を供給することはない)。第1の溶液及び/若しくは第2の溶液は独立した容器に貯蔵してもよいし(即ち、これらの容器は第1の溶液及び/若しくは第2の溶液を1つより多くの混合チャンバに同時に供給することはない)、又は第1の溶液及び/若しくは第2の溶液を1つより多くの混合チャンバ(例えば全ての混合チャンバ)内に使用される1つの容器に貯蔵してもよい。各々の混合チャンバからの混合材料は個別に回収し、貯蔵/処理することができ、場合により後の段階で合わせてもよいし、又は更に処理及び/若しくは貯蔵する前に(例えば全ての混合チャンバからのものを)合わせてもよい。
複数の混合チャンバの全ての混合チャンバに同一のポンプで供給し、全ての混合チャンバからの混合材料を更に処理及び/又は貯蔵する前に回収するのが便利である。
混合チャンバ、入口及び出口、第1の溶液の供給、第2の溶液及び複数の混合チャンバの混合材料の回収は作動中実質的に同じであるように構成するのが最適である。
複数の混合チャンバの各々の混合チャンバは個々のチップとして構成してもよいし、又は便宜上幾つかの混合チャンバを単一のチップに組み合わせてもよい(例えば8つの混合チャンバを含有する)。そのようなチップの幾つかは複数のチャンバーを提供するように並行して使用することができる(例えば、各々が8つの混合チャンバを含有する2つのチップは並行して作動する全部で16の混合チャンバを提供する)。
複数の混合チャンバは50〜2000ml/分、例えば100〜1000ml/分、特に200〜500ml/分の総速度で混合された材料を製造することができるのが適切である。一部の実施形態では、複数の混合チャンバは、毎分少なくとも1gのカチオン性脂質の速度で混合材料を生成することができる。一部の実施形態では、複数の混合チャンバ内のすべての混合チャンバは同じポンプによって供給され、すべての混合チャンバからの混合材料は、さらなる処理及び/又は貯蔵の前に回収される。
マイクロ流体プロセス後のステップ
一部の実施形態では、溶媒は、緩衝液交換、透析濾過（ダイアフィルトレーション）、限外濾過、透析、又はそれらの組み合わせにより除去される。一部の実施形態では、溶媒除去は、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％水v/vの水分含量をもたらす。一部の実施形態では、上述の方法の後に、所望の最終濃度などに希釈する追加のステップが続く。一部の実施形態では、上述の方法の後に、濾過による滅菌の追加のステップが続く。
医薬組成物
本発明のリポソームは、様々な疾患に対して対象を免疫化するための医薬組成物の成分として有用である。これらの組成物は、典型的には、リポソームに加えて薬学的に許容される担体を含む。本発明の医薬組成物は、1つ以上の小分子免疫増強剤を含み得る。例えば、組成物は、TLR2アゴニスト(例えば、Pam3CSK4)、TLR4アゴニスト(例えば、アミノアルキルグルコサミニドリン酸、例えばE6020)、TLR7アゴニスト(例えば、イミキモド)、TLR8アゴニスト(例えば、レシキモド(TLR7アゴニストも))、及び/又はTLR9アゴニスト(例えば、IC31)を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には分子量が＜2000Daである。一部の実施形態では、このようなアゴニスト(複数可)は、リポソーム内のRNAとともに内包されるが、他の実施形態では内包されない。本発明の医薬組成物は、淡水(例えば、w.f.i.)又は緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、又はクエン酸緩衝液中にリポソームを含み得る。緩衝液塩は、通常は5〜20mMの範囲で含まれる。本発明の医薬組成物は、5.0〜9.5、例えば、6.0〜0のpHを有し得る。本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含み得る。10±2mg/ml NaClの濃度が典型的であり、例えば、約9mg/mLである。
本発明の組成物は、金属イオンキレート剤を含み得る。これらは、リン酸ジエステルの加水分解を加速し得るイオンを除去することにより、RNAの安定性を延長させることができる。したがって、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1つ以上を含み得る。このようなキレート剤は、典型的には、10〜500mM、例えば0.1mMで存在する。クエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムはまた、キレート剤として作用することができ、一方で、緩衝活性も有利に提供する。
本発明の医薬組成物は、200mOsm/kg〜750mOsm/kg、例えば、240〜360mOsm/kg、又は290〜310mOsm/kgの浸透圧を有し得る。本発明の医薬組成物は、低張性又は軽度の高張性であり得る。本発明の医薬組成物は、1つ以上の防腐剤、例えば、チオメルサール又は2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀を含まない組成物が好ましく、防腐剤を含まないワクチンを調製することができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは滅菌である。本発明の医薬組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば、1用量あたり＜1ED(内毒素単位、標準尺度)、好ましくは1用量あたり＜0.1EUである。本発明の医薬組成物は、好ましくはグルテンを含まない。本発明の医薬組成物は、単位用量剤形で調製することができる。一部の実施形態では、単位用量は、0.1〜1.0ml、例えば、約0.5mlの体積を有し得る。
組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。組成物は、例えば吸入器で、微細な噴霧を使用して、肺投与用に調製され得る。組成物は、例えば、噴霧又はドロップとして、経鼻、耳又は眼投与用に調製され得る。筋肉内投与用の注射剤が典型的である。組成物は、免疫学的に有効な量のリポソーム、及び必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回投与又は一連の投与の部分としてのいずれかで、その量を個体に投与することが治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康及び身体的状態、年齢、治療される個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、治療状況の治療する医師による評価、及び他の関連要因に依存して変化する。その量は、通常の試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に収まることが期待される。本発明の組成物のリポソーム及びRNA含量は、一般的に、用量あたりのRNAの量に関して表される。好ましい用量は、20≦100gのRNA(例えば、10〜100μg、例えば約10μg、25μg、50μg、75μg又は100μg)を有するが、発現は、非常に低いレベルで見ることができ、例えば、≦1μg/用量、≦100ng/用量、≦10ng/用量、≦1ng/用量などである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む送達デバイス(例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど)を提供する。このデバイスは、脊椎動物対象に組成物を投与するために使用することができる。本発明のリポソームは、リボソームを含まない。
治療方法及び医療用途
本発明のリポソーム及び医薬組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を引き出すための、又は遺伝子治療のためのインビボでの使用のためである。本明細書に開示されるように、有効量の本発明のリポソーム又は医薬組成物を投与するステップを含む、脊椎動物の免疫応答を高める方法が提供される。免疫応答は、好ましくは予防的であり、好ましくは抗体及び/又は細胞媒介性免疫を伴う。本方法は、追加免疫応答を高めることができる。
本発明はまた、脊椎動物において免疫応答を高めるための方法において使用するための本発明のリポソーム又は医薬組成物を提供する。本発明はまた、脊椎動物における遺伝子治療の方法で使用するための本発明のリポソーム又は医薬組成物を提供する。
本発明はまた、脊椎動物において免疫応答を高めるための薬剤の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。
これらの使用及び方法により脊椎動物において免疫応答を高めることにより、脊椎動物は、様々な疾患及び/又は感染症、例えば、上記で検討された細菌及び/又はウイルス疾患に対して保護することができる。リポソーム及び組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的(すなわち、感染を防止するため)又は治療的(すなわち、感染を治療するため)のいずれかであり得るが、典型的には予防的である。
脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物であり、例えば、ヒト又は大型獣医哺乳動物(例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、及びブタ)である。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児(例えば、乳幼児又は幼児)又はティーンエイジャーである。ワクチンが治療用である場合、ヒトは、ティーンエイジャー又は成人であることが好ましい。小児用のワクチンを成人に投与することも可能であり、これは、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するためである。
本発明に従って調製されたワクチンは、小児と成人の両方を治療するために使用され得る。したがって、ヒト患者は、1歳未満、5歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳、又は少なくとも55歳であり得る。ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者(例えば、20〜50歳、〜60歳、好ましくは〜65歳)、若年者(例えば、〜5歳)、入院患者、医療従事者、軍務従事者及び軍人、妊婦、慢性的な病気、又は免疫不全の患者である。しかしながら、ワクチンはこれらのグループだけに適しているわけではなく、集団でより一般的に使用することができる。
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、又は組織の間質腔)により達成され得る。別の送達経路には、直腸、経口(例えば、錠剤、噴霧)、口腔、舌下、膣、局所、経皮(transdermal)若しくは経皮(transcutaneous)、鼻腔内、眼、耳、肺又は他の粘膜投与が含まれる。皮内及び筋肉内の投与は2つの好ましい経路である。注射は針(例えば皮下注射針)を介し得るが、代わりに無針注射を使用し得る。典型的な筋肉内用量は0.5mLである。
本発明は、全身性及び/又は粘膜性免疫を引き出すために、好ましくは増強された全身性及び/又は粘膜性免疫を引き出すために使用され得る。
投薬量は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールによることができる。一次免疫化スケジュール及び/又は追加免疫化スケジュールにおいて、複数回用量を使用し得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量を同じ又は異なる経路、例えば、非経口初回及び粘膜追加、粘膜初回及び非経口追加などにより与えることができる。複数回用量は、典型的には、少なくとも1週間間隔(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)で投与される。一実施形態では、複数回用量は、出生後の約6週間、10週間及び14週間、例えば、世界保健機関の予防接種に関する拡張プログラム(「EPI」)でよく使用されている6週齢、10週齢、及び14週齢で投与され得る。別の実施形態では、2回の初回用量が約2か月間隔で、例えば、約7、8又は9週間間隔で投与され、続いて、2回目の初回用量の約6か月から1年後に、例えば、2回目の初回用量から約6、8、10又は12か月後に1回以上の追加免疫用量が投与される。さらなる実施形態では、3回の初回用量が約2か月間隔で、例えば、約7、8又は9週間間隔で投与され、続いて、3回目の初回用量の約6か月から1年後に、例えば、3回目の初回用量から約6、8、10又は12か月後に1回以上の追加免疫用量が投与される。
全般
他に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」には、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「又は(or)」という言葉は、文脈から明確に他に示されない限り、「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は、2つ以上を指す。さらに、物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限定、例えば、溶液成分濃度又はその比率、及び反応条件、例えば、温度、圧力及びサイクル時間は、近似値であることが意図される。本明細書で使用される「約」という用語は、量±10％を意味することが意図される。他に指示がない限り、数値範囲が提供される場合、包括的である。すなわち、終点が含まれる。
以下の非限定的な図面及び実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。
[実施例]
[実施例1]
フラッシュナノ沈殿の原理は、従来の製造アプローチから生じる免疫学的性能を維持する物理化学的特性を保持しながら、商業的に実行可能な規模でリポソーム内包された核酸の安全であり、便利である費用対効果の高い生産を可能にする製造アプローチの開発の問題に適用された。フラッシュナノ沈殿は、沈殿を誘導するためにマイクロチップ内で混合される2つの混和性流体を伴う。脂質は、有機相(溶媒)に可溶化され、粒子を作製するために水ベースの相(貧溶媒)でmRNAと混合される。これらの実施例で説明されているナノフラッシュ沈殿プロセスは、水相(貧溶媒)中のRNAと混合した場合、有機溶媒中のDSPC、RV39、コレステロール、PEG脂質(C14:0-PEG2K)の沈殿に影響を与える混合条件に基づいている。
材料
機器
本明細書の実施例で使用されるマイクロチップ(Micronit Microtechnologies(商標)製)の概略図を図1に示す。MicroNitから入手可能なチップホルダーを介して、2つの中圧Nemesys(商標)ポンプをマイクロチップに接続した。チューブ接続は、径:IDEX 1528L 1/16×0.030ftであった。1つは、脂質混合物を含む有機相に使用された(マイクロ流体の中央チャネルに接続された)。2つ目は、クエン酸緩衝液及びRNA(外部チャネルに接続された)を含む水相に使用された。
Nemesysポンプは、コンピューターにインストールされた「neMESYS Userinterface(商標)」によって制御された。
実験パラメータ、調製、ストック溶液
最初の評価では、以下の体積が利用された。
・有機相:1ml〜5mlのCetoni(商標)ガラスシリンジに1〜5ml
・水相:2.5〜10mlのCetoniガラスシリンジに2.5〜10ml
・実行時間:試験した流量に依存。
マイクロチップを出る最初の0.5mlを廃棄した。(システムのパージ)次の2〜3mlを回収した。
作業領域は、RNase除染液(RNaseZap(商標))で処理された。オペレーターは、手袋を着用し、RNase除染液でそれを処理した。緩衝液及び水はRNAse不含であった。すべての容器はRNAse不含であった。
RNAストック溶液は、凍結融解せずに実験を開始するまで-80℃に保たれた。
製剤は、カチオン性脂質が窒素を含み、RNAがリン酸を含む、8:1のN:P(窒素:リン酸)比で作製された。1μgのRNAには3ナノモル(nmole)のリン酸が含まれる。その割合が維持された。したがって、例えば、120ナノモルのリン酸は、8:1のN:P比で960ナノモルの窒素に対応した。
脂質ストック溶液の調製には、RNAse不含のガラスバイアルを使用した。
RV39、DSPC、及びコレステロールを別々のバイアルで計量し、エタノールで可溶化して10mg/mlの溶液を得た。PEG2Kはエタノールに4mg/mlで可溶化した。各脂質に対して最低1mLのストック溶液を作製した。
バイアルを1分間、超音波処理し、次に、170rpmで37℃にて5分間、水浴中で加熱した。
1000μlの脂質混合物の調製では、計算された体積の脂質ストック及びエタノールを添加した。表1を参照されたい。
表の列2〜5は、各脂質の分子量、各脂質に対して選択されたモルパーセンテージ、対象とするモルパーセンテージにおける、RV39を960ナノモルとした場合の各脂質の等価ナノモル;及び対象とするモルパーセンテージでの各脂質のミリグラムを示す。列6〜8は、対象とするモルパーセントでの10mg/mLの総脂質を有する脂質ストック溶液を生成するための、各成分のストック溶液濃度、及び各ストック+エタノールのマイクロリットルを示す。
RNA混合物は、1.5mlから15mlのRNAse不含コニカルチューブ中で調製された。計算された体積のRNAストック溶液(N:P比を節約するため)は、100mMクエン酸緩衝液（pH6）で希釈された。RNA混合物は、マイクロ流体工学の直前にエクステンポ（ex-tempo）で調製された。
マイクロ流体工学
マイクロ流体工学システムを使用する前に、クリーニングステップを行った。エタノールは、シリンジをエタノールで満たし、エタノールをマイクロチップに送達して、システムを完全に洗浄することにより、両方のポート(RNA及び脂質ポート)に充填された。これを2回繰り返した。次に、RNAポートはクエン酸緩衝液で充填され、脂質ポートは、シリンジを適切な溶液で満たし、次に、マイクロチップに水溶液又は有機溶液のいずれかを送達することによって、エタノールで充填された。これを2回繰り返した。
次に、システムは、RNA及び脂質で充填された。右のシリンジは、有機/脂質溶液で満たされ、左のシリンジはRNA水溶液で満たされた。選択された比率に適合させるために必要とされる流量がソフトウェアにプログラムされ、ナノ沈殿プロセスを開始した。
LNPは、以下のように回収された。最初の0.2〜0.5mlを廃棄した(マイクロチップ内に気泡がない状態で良好な渦が可視化されるまで)。LNPは、RNAse不含のコニカル容器に回収され、緩衝液交換ステップまで氷上に置かれた。(典型的には30分以内)。
マイクロ流体工学システム後のクリーニングは、上記で提供されたプレマイクロ流体工学プロセスと同じであった。
緩衝液交換
処方されたLNPは、PD10カラムを使用して、所望の製剤緩衝液に交換された。カラムを10mMのTris緩衝液(25ml)で平衡化した。サンプルは、カラムあたり最大容量2.5mlで充填された。溶出は、10mMのTris HCL緩衝液の12×0.5mlで行われた。0.5ml画分を1.5mlエッペンドルフに回収した。画分のUVネフェロスター検出は、96ウェルのCostar 100μlマイクロプレートで行われた。LNPを含む画分をプールし、4℃で保存した。
滅菌濾過
滅菌濾過は、Millipore Millex-GP(商標)0.2μm PES33mm SLGP033RSフィルター(PES膜-0.2μm)33mmで行った。
LNP特性決定
DLS(Zetasizer(商標))によるサイズ測定。LNPサンプルは、0.22μmの濾過されたPBS又はクエン酸緩衝液で1:500に希釈された。40μLの各サンプルを40μLの使い捨てマイクロキュベット(Malvern ZEN0040(商標))に添加した。5回測定し、平均を計算した。
RNA LNPリボグリーンアッセイ。RNAリボグリーンアッセイは、Invitrogenからの市販キットQuant-It RiboGreen RNAアッセイキット(商標)を使用して実施された。
LNP Ribogreenアッセイのためのプロトコール
1.20×TE緩衝液を1×に希釈する:2mLの20×TEを38mLの水に添加する。
2.1×TE緩衝液中にTriton X-100の0.1％溶液を作製する(25mgのTritonをマスアウトし、25mLの緩衝液を添加する)。
3.サンプルを1:5(200μLを800μLの1×TE緩衝液に)、1:10(500μL希釈液 1:5を500μLの1×TE緩衝液に)、1:20(500μL希釈液 1:10を500μLの1×TE緩衝液に)に連続的に3倍希釈する。
4.二重に標準液を調製する:4μg/mLストックを調製する:20μLのRNA(100μg/mL)を480μLの1×TE緩衝液に添加する。連続的に4倍希釈する(250μLを250μLの1×TE緩衝液に添加する)。すべてのウェルの容量が100uLになるように、各ウェルに50uLの標準液及び50uLのTE又はTritonを添加する(以下の順を参照されたい)。
5.50μLのLNPサンプルを添加し(三重)、50μLの1×TE緩衝液を用いて2倍に希釈する。
6.50μLのLNPサンプルを添加し(三重)、50μLの0.1％のTriton Xを用いて2倍に希釈する。
7.25μLのRibogreenを4975μLの1×TE緩衝液に合計5mL添加することにより、Ribogreen試薬を200倍に希釈する。
8.100μLの希釈されたRibogreen試薬を100μLのサンプル又は標準液に添加する。
9.37℃で15分間、暗所にて放置する。20℃で10分間、暗所にて300rpmで冷却する。
10.Gen5プログラムを使用して、485/20、528/20、最適ゲインで蛍光を読み取る。
11.*濃度を計算する。
a.標準曲線を作成する。
b.内包された値を取得するために、Triton X値からTE値を差し引く。
c.標準曲線を使用して濃度を推定する。
d.希釈係数を掛ける。
原則は、天然サンプル中のRNA(LNP外のRNA)及びLNP Triton X(商標)処理後のRNA(総RNA)を定量化することであった。総RNAとLNP外のRNAとの差により、LNP内のRNAが得られる。RNA内包の収率は、LNP内のRNAを総RNAで除算し、パーセンテージで表して、簡単に計算することができる。
TECAN(商標)を使用してスクリプトを行い、Ribogreenアッセイを自動で実現して、オペレーターの時間を短縮した。
[実施例2]
(A)マイクロ流体工学作業域を評価するための探索的実験
作業プロセス域を評価するために、3つの探索的実験が行われた。3つの探索的実験において、本出願人は、裸のLNPを生成する可能性と、主要なパラメータとしての総流量(TFR)、N:P、及び水/有機比とを評価した。プロセスの堅牢性が評価された。
・TFR(6-12-14ml/分)
・水相と有機相との比率(2:1〜10:1)
・窒素とリン酸との比率(2:1〜8:1)
TFRの増加は、LNPのサイズの減少をもたらすことが観察された。より低いTFR(6ml/分)では、比率の増加はLNPのサイズを減少させる。
(B)RNAの添加
2番目の実験は、RNAの存在下、実験(A)で行われた観察を繰り返すために行われた。追加の濾過ステップもまた評価された。
TFRの増加はLNPのサイズを減少させ、RNA内包率を増加させることが観察された。水相:有機相比の増加は、LNPのサイズを増加させる。最大総流量(14ml/分)は、LNPが約120nmになる最良の候補であるようである。RNA回収における濾過の負の影響は観察されない。主要な作業パラメータとして同定されたTFR(総流量)。
結果は、試験された化合物の良好な再現性及び堅牢性を示唆している。SAM4-B及びSAM-5Bバッチは、異なる日に、異なる脂質/RNA溶液調製で行われた。
(C)LNPの物理化学的属性におけるマイクロ流体工学パラメータの影響の評価
(1)TFR
上記で検討したように、TFRを増加させると、LNPサイズを減少させるという影響があった。本発明者らは、TFRを最大22mlに増加させて、約100nmのLNPのサイズに到達する実行可能性を調査することに決定した。図2を参照されたい。
比率2:1(水相/有機相)で、22ml/分のTFRでの作業は、サイズが107.6nmであり、PDIが＜0.2であるRNA内包LNPを提供する。
以前に観察されたように、RNA内包収率について、TFRの増加は、内包率の増加に影響があった。TFRを最大22ml増加させる実行可能性の調査を実施した。結果を図3に示す。
(2)水性:有機比
水性:有機比の影響を調査した。実験を18ml/分のTFRで行い、結果を図4に示す。2に近い比率が観察され、上記したパラメータに最も近いサイズ及びPDIを有するLNPが得られた。内包への影響は、この実験で決定された。結果を図5に示す。2に近い比率が観察され、最高のRNA内包を有するLNPが得られる。
(3)ストック溶液濃度
LNPの規模を拡大した製造では、ストック溶液の増加により、ナノ沈殿前により少ない体積で作業できる可能性が提供される。最終製造物はより濃縮され、製剤の可撓性及び分析精度を向上させる。実験は、2:1の水性:有機比及び18mL/分の最小TFRで行われた。結果を図6及び図7に示す。これらの実験は、LNP物理化学的属性における有害な影響がない場合、ストック溶液の高濃度(最大8mg/mlの脂質で試験される)で作業する能力を実証する。
(4)マイクロ流体温度
温度制御された容器(Certomat)で2Dボルテックス機器を使用して、プロセス温度を評価した。すべての実験は、水/有機比が2:1であり、及びTFRが22ml/分で実行された(TFRが18ml/分であった10℃のバッチを除く)。結果を図8に示す。温度の上昇は、30℃でLNPのサイズを約107nmに減少させた。内包における温度の影響もまた調査した。結果を図9に示す。10℃では、RNA内包収率は、劇的に52％に減少した。22℃を超える条件では、内包収率は90％を超えた。
(5)「オールインワン」プロセス
以前の試験では、有機溶媒溶液中の1つ以上の脂質の流れを水溶液中の1つ以上のRNAの流れと混合した。この実験では、すべての脂質成分を1つの容器に合わせ、以下の表に記載したようにRNAとマイクロ流体を混合する前に溶媒で可溶化した。
脂質ストック溶液をオールインワン法で調製した場合、LNPの物理化学的属性への影響は検出されなかった。
[実施例3]
電子顕微鏡による形態学
EMネガティブ染色及び低温EM分析によるmRNAを含む脂質ナノ粒子の形態学的特性決定を行った。この実験の目的は、mRNAを含む脂質ナノ粒子の2つの方法(ネガティブ染色及び低温電子顕微鏡法)による形態学的評価を得ることである。図10及び11を参照されたい。
ネガティブ染色により観察されたLNPは、サイズ及び形状が非常に不均一であった。比較的均一なコントラストを提示するものもあったが、ほとんどの粒子は、LNPのいくつかの領域で明確な密度の差があった。同様に、一部のアモルファスな材料の凝集体が見られ、膜様の構造はほとんど見られなかった。低温EMのLNPは、サイズ及び形状が不均一であった(図10及び11)。ほとんどが不均一な非対称コントラストを提示した。繰り返すが、サンプルの濃度が低いことを考えると、観察結果は、ネガティブ染色の観察と比較して、比較的に少ないLNPに限定された。
[実施例4]
この実施例では、RNAを含むリポソームは、mRNAの送達のためにカチオン性脂質RV88を含む2-Dボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成された。
材料
RV88、DSPC、及びコレステロールはすべて、ホウケイ酸バイアルで10mg/mlの濃度でエタノール中で調製される。脂質14:0-PEG2K PEは、ホウケイ酸ガラスバイアルでも4mg/mlの濃度で調製された。ストック濃度での脂質の溶解は、エタノール中の脂質の超音波処理によって2分間達成された。次に、溶液は、37℃で10分間、170rpmに設定された軌道傾斜シェーカー上で加熱された。続いて、バイアルを26℃で最低45分間、平衡化させた。その後、脂質は、表10に示されるように、一定体積のストック脂質を添加することによって混合された。次に、溶液をエタノールで調整して、最終脂質濃度が7.92mg/mlになるようにした。
RNAは、pH6.0での75mMのクエン酸緩衝液及び1.250mg/mlのRNA濃度のストック溶液として調製された。次に、RNAの濃度は、26℃に平衡化したpH6.0の75mMのクエン酸緩衝液を用いて0.1037mg/mlに調整された。続いて、溶液を26℃で最低25分間、インキュベートした。
実施例1に記載されるように、マイクロ流体チャンバをエタノールで洗浄し、シリンジにRNA溶液を、及び別のシリンジにエタノール脂質を充填することにより、neMYSISシリンジポンプを調製した。両方のシリンジは充填され、neMESYSソフトウェアの制御下にあった。次に、溶液は、水相と有機相の比率が2であり、総流量が22ml/分(RNAの場合は14.67ml/分、脂質溶液の場合は7.33ml/分)で混合チップにアプライされた。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液は、4×1mlの画分に回収され、最初の画分を廃棄物として廃棄した。上記されるように、mRNA-リポソームを含む残りの溶液は、G-25ミニ脱塩カラムを使用して、pH7.5の10mM Tris-HCl、1mM EDTAに交換した。緩衝液の交換後、材料は、DLS分析及びRibogreenアッセイにより、それぞれサイズ及びRNA捕捉について特性決定された。
[実施例5]
この実施例では、RNA含有リポソームは、mRNAの送達用にカチオン性脂質RV94を含む2-Dボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成された。
材料
脂質は、実施例5と同様に、表12に挙げた材料量を使用して、最終脂質濃度7.92mg/mlに調製された。
mRNAの水溶液は、pH6.0で75mMクエン酸緩衝液、1.250mg/mlのmRNAを含むストック溶液として調製された。次に、RNAの濃度は、26℃に平衡化したpH6.0の75mMクエン酸緩衝液を用いて0.1037mg/mlに調整された。次に、溶液を26℃で最低25分間インキュベートした。
実施例1に記載されているように、マイクロ流体チャンバをエタノールで洗浄し、シリンジにRNA溶液を充填し、別のシリンジにエタノール脂質を充填することにより、neMYSISシリンジポンプを調製した。両方のシリンジが充填され、neMESYSソフトウェアの制御下にあった。次に、溶液は、水相と有機相の比率が2、総流量が22ml/分(RNAでは14.67ml/分、脂質溶液では7.33ml/分)で混合チップにアプライされた。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液を4×1mlの画分に回収し、最初の画分を廃棄物として廃棄した。mRNAリポソームを含む残りの溶液は、上記されるように、G-25ミニ脱塩カラムを使用して、pH7.5で10mMのTris-HCl、1mMのEDTAに交換した。緩衝液の交換後、材料は、それぞれ、サイズ、及びDLS分析とRibogreenアッセイを介したRNA捕捉について特性決定された。リポソームの生物物理学的分析を表14に示す。
[実施例6]
EC 50 の決定
リポソームを有するmRNAの活性の評価は、ハイコンテントイメージングによりインビトロで決定することができる。この実施例では、mRNA-リポソームを使用して、培養で増殖する細胞を処理することができる。この実験は、2次元培養で増殖するいくつかの型の細胞を使用することができる。この実施例では、Invitrogen(カタログ番号R700-01)から入手したベビーハムスター腎細胞(BHK)細胞を使用した。細胞は、培養培地(DMEM、5％FBS、1％Pen/Strep、1％L-Glu)に200,000細胞/ウェルの播種密度で96ウェル組織培養プレートに播種された。次に、培養プレートを4時間インキュベートして、細胞を培養プレートに付着及び接着させた。SAM-リポソームは、5％血清を含む増殖培地を用いて8希釈ステップで10ngから0.078ngのmRNAで連続希釈された。100ul容積の各希釈液を接着細胞を含む各ウェルに移した。増殖培地を培養し、細胞をPBSで洗浄し、各濃度を5ウェルの繰り返しで実行した。次に、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩戻した。翌日、SAM-リポソームを含む培地を細胞から除去し、室温で15分間、dPBS中のa％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定した。続いて、細胞を洗浄し、PBS中の0.05％TritonX-100溶液を使用して室温で15分間、透過処理した。ブロッキング後、細胞を固定し、ヤギ血清で細胞を透過処理した。次に、細胞を一次抗体及び二次抗体で染色し、二次抗体はAlexa Fluor 488で標識され、DAPIは細胞の核を染色する。続いて、細胞をPBSで洗浄し、透明フィルムで密封した。次に、ThermoFisher CellInsight CX7 HCAハイコンテントイメージャー(imaginer)(HCI)を使用して細胞を分析し、HCS Studio Cell Analysis Softwareを使用して抗原発現のパーセンテージを決定した。mRNA濃度の関数としての抗原発現細胞のパーセンテージの回帰は、統計ソフトウェア、例えば、GraphPad Prism7.00を使用して、用量応答シミュレーション(log(アゴニスト)対応答、4つのパラメータ変数勾配回帰)で実行された。
EC50の測定値は、リポソーム-RV39では0.0756ng/ウェル、リポソーム-RV88では0.098ng/ウェル、リポソームRV94では0.069ng/ウェルであった。

Claims (83)

  1. マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法であって、
    デバイス内で
    (a)溶媒及び以下の式:
    [式中、
    nは、1から3の整数であり、
    (i)R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、及びYはCであり;又は
    (ii)R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCであり;又は
    (iii)R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、及びYはOであり;
    oは、0又は1であり;
    Xは、
    (i)
    {式中、
    R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である};又は
    (iii)-CH(-R6)-R7
    {式中、
    (1)R6は、-(CH2)p-O-C(O)-R8若しくは-Cp-R8であり;
    (2)R7は、-(CH2)p'-O-C(O)-R8'若しくは-Cp'-R8'であり;
    (3)p及びp'は、独立して、0、1、2、3若しくは4であり;及び
    (4)R8及びR8'は、独立して、
    (A)オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖;
    (B)-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖;
    (C)-C6〜16飽和炭化水素鎖;
    (D)-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖;
    (E)-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖;及び
    (F)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖
    である}
    である]
    を有するイオン化可能なカチオン性脂質、DSPC、ステロール、及びPEG-PEとPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液と、
    (b)RNAを含む第2の溶液と
    を混合するステップ;並びに
    溶媒を除去するステップ
    を含む方法。
  2. マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法であって、
    デバイス内で
    (a)以下:
    からなる群から選択されるカチオン性脂質、DSPC、ステロール、及びPEG-PEとPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液と、
    (b)水及びRNAを含む第2の溶液と
    を混合するステップ;並びに
    溶媒を除去するステップ
    を含む方法。
  3. PEG化脂質がPEG-DMGである、請求項1又は2に記載の方法。
  4. RNAが自己複製性RNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. カチオン性脂質が、pKa5.5〜6.7を有するイオン化可能な脂質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. カチオン性脂質が、コア内に少なくとも1つのヒンダードエステル基、少なくとも1つのカーボネート基、又は少なくとも1つの芳香族基を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. カチオン性脂質が、非ヒンダード（unhindered）エステル基をさらに含む、請求項6に記載の方法。
  8. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第1の溶液のための1つの入口を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  9. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第1の溶液のための2つの入口を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  10. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第1の溶液のための3つ以上の入口を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  11. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第2の溶液のための1つの入口を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第2の溶液のための2つの入口を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  13. マイクロ流体デバイスが、混合チャンバへの第2の溶液のための3つ以上の入口を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  14. 各入口が0.2mm幅であり、混合チャンバの他の辺の全長に及ぶ、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 混合チャンバの断面積が25.6mm2以下である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 混合チャンバの断面積が0.1mm2以上である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 混合チャンバの断面積が0.2〜3.2mm2である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 混合チャンバの断面積が0.6〜1.2mm2、例えば約0.8mm2である、請求項17に記載の方法。
  19. 混合チャンバは、断面が実質的に長方形である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 混合チャンバの断面が1〜8mmの長辺を有する、請求項19に記載の方法。
  21. 混合チャンバの断面が1.6〜2.4mmの長辺を有する、請求項20に記載の方法。
  22. 混合チャンバの断面が2mmの長辺を有する、請求項21に記載の方法。
  23. 混合チャンバの断面が0.1〜4mmの短辺を有する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 混合チャンバの断面が0.2〜0.6mmの短辺を有する、請求項23に記載の方法。
  25. 混合チャンバの断面が0.4mmの短辺を有する、請求項24に記載の方法。
  26. 混合チャンバは、長さが1〜10cmである、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 混合チャンバは、長さが2〜3cmである、請求項26に記載の方法。
  28. 混合チャンバは、長さが2.5cmである、請求項27に記載の方法。
  29. マイクロ流体デバイスが、混合材料の回収のために、混合チャンバからの1つの出口を有する、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
  30. マイクロ流体デバイスが、混合材料の回収のために、混合チャンバからの2つ以上の出口を有する、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
  31. マイクロ流体デバイスが、断面が長方形であり、断面積が0.2〜3.2mm2であり、長辺が1.4〜3.2mmであり、短辺が0.1〜1.2mmである混合チャンバ、混合チャンバの長さが1.5〜5cmである混合チャンバの近位端に対称に配置された、第1の溶液のための1つの入口及び第2の溶液のための2つの入口、並びに混合チャンバの遠位端に位置された出口を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 混合チャンバへの総流量が8〜30mL/分/mm2である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 混合チャンバへの総流量が12〜28mL/分/mm2である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 混合チャンバへの総流量が14〜26mL/分/mm2である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 混合チャンバへの総流量が16〜24mL/分/mm2である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 混合チャンバへの総流量が約18mL/分/mm2である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 混合チャンバへの総流量が約22mL/分/mm2である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
  38. N:P比が1:1〜10:1である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
  39. N:P比が、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1から選択される、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
  40. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が10℃〜37℃である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
  41. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が以下:
    (a)15℃〜36℃;
    (b)15℃〜19℃;
    (c)19℃〜24℃;
    (d)24℃〜28℃;
    (e)28℃〜36℃
    からなる群から選択される、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
  42. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が20℃〜35℃である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
  43. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が25℃〜34℃である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
  44. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が30℃〜33℃である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
  45. マイクロ流体デバイス内の溶液の温度が約17℃、約22℃、約26℃、又は約30℃である、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 溶媒が有機アルコールを含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 溶媒が70〜100％エタノールを含む、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 水とエタノールとの比率が、1:1〜5:1、例えば、約1.4:1、約2:1、又は約3:1である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 水とエタノールとの流量の比率が、1:1〜5:1、例えば、約1.4:1、約2:1、又は約3:1である、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
  50. エタノール、カチオン性脂質、DSPC、ステロール、並びにPEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液、並びに水及びRNAを含む第2の溶液が存在する、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 溶媒を含む溶液中の総脂質の20〜80％(モルパーセント)がカチオン性である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 溶媒を含む溶液中の総脂質の30〜60％(モルパーセント)がカチオン性である、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 溶媒を含む溶液中の総脂質の約35％、約40％、約45％、約50％、約55％(モルパーセント)がカチオン性である、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 溶媒を含む溶液中の総脂質の35〜55％(モルパーセント)がコレステロールである、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
  55. 溶媒を含む溶液中の総脂質の40〜50％(モルパーセント)がコレステロールである、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
  56. 溶媒を含む溶液中の総脂質の約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％(モルパーセント)がコレステロールである、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 溶媒を含む溶液中の総脂質の0.5〜5％(モルパーセント)が、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質である、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
  58. 溶媒を含む溶液中の総脂質の1.0〜3.0％(モルパーセント)が、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質である、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 溶媒を含む溶液中の総脂質の約1.5％、約1.6％、約1.7％、約1.8％、約1.9％、約2.0％、約2.5％(モルパーセント)が、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質である、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 溶媒を含む溶液中の総脂質の5〜15％(モルパーセント)がDSPCである、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法。
  61. 溶媒を含む溶液中の総脂質の7.5〜13％(モルパーセント)がDSPCである、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 溶媒を含む溶液中の総脂質の約8％、約9％、約10％、約11％、約12％(モルパーセント)がDSPCである、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
  63. 溶媒を含む溶液が、少なくとも1mg/mL、少なくとも2mg/mL、少なくとも3mg/mL、少なくとも4mg/mL、少なくとも5mg/mL、少なくとも6mg/mL、少なくとも7mg/mL、少なくとも8mg/mL、少なくとも9mg/mL、少なくとも10mg/mL、少なくとも15mg/mL、少なくとも20mg/mLの総脂質をさらに含む、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
  64. 溶媒を含む溶液が、1〜20mg/mL、1〜15mg/mL、1〜10mg/mLの総脂質をさらに含む、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
  65. マイクロ流体デバイスが複数の混合チャンバを含む、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
  66. デバイスが2〜128個の混合チャンバを含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
  67. デバイスが、4〜32個の混合チャンバを含む、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
  68. デバイスが16個の混合チャンバを含む、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。
  69. 複数の混合チャンバ内のすべての混合チャンバが同じポンプによって供給され、すべての混合チャンバからの混合材料がさらなる処理及び/又は保存の前に回収される、請求項66〜68のいずれか一項に記載の方法。
  70. 複数の混合チャンバが、50〜2000ml/分の速度で混合材料を生成することができる、請求項66〜69のいずれか一項に記載の方法。
  71. 複数の混合チャンバが、少なくとも1gのカチオン性脂質/分の速度で混合材料を生成することができる、請求項66〜69のいずれか一項に記載の方法。
  72. 平均リポソームサイズが、140nm以下、130nm以下、120nm以下、又は100nm以下である、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。
  73. リポソーム多分散性が、0.3以下、0.2以下、又は0.1以下である、請求項1〜72のいずれか一項に記載の方法。
  74. 溶媒が、緩衝液交換、ダイアフィルトレーション、限外濾過、透析、又はそれらの組み合わせにより除去される、請求項1〜73のいずれか一項に記載の方法。
  75. 溶媒の除去が、少なくとも98％水w/wの水分含量をもたらす、請求項1〜74のいずれか一項に記載の方法。
  76. 所望の最終濃度などに希釈する追加のステップを含む、請求項1〜75のいずれか一項に記載の方法。
  77. 濾過による滅菌の追加のステップを含む、請求項1〜76のいずれか一項に記載の方法。
  78. RNAを内包するリポソームは、EC50が、2.5ng/ウェル未満、例えば2.4ng/ウェル未満、2.3ng/ウェル未満、2.2ng/ウェル未満、2.1ng/ウェル未満、2.0ng/ウェル未満、1.9ng/ウェル未満、1.8ng/ウェル未満、1.7ng/ウェル未満、1.6ng/ウェル未満、1.5ng/ウェル未満、1.4ng/ウェル未満、1.3ng/ウェル未満、1.2ng/ウェル未満、1.1ng/ウェル未満、1.0ng/ウェル未満、0.9ng/ウェル未満、0.8ng/ウェル未満、0.7ng/ウェル未満、0.6ng/ウェル未満、0.5ng/ウェル未満、0.4ng/ウェル未満、0.3ng/ウェル未満、0.25ng/ウェル未満、0.20ng/ウェル未満、0.15ng/ウェル未満、又は0.10ng/ウェル未満である、請求項1〜77のいずれか一項に記載の方法。
  79. 請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、RNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系であって、前記リポソームは、カチオン性脂質、DSPC、ステロール、PEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む、非ウイルス送達系。
  80. 溶媒、及び少なくとも1mg/mL、少なくとも2mg/mL、少なくとも3mg/mL、少なくとも4mg/mL、少なくとも5mg/mL、少なくとも6mg/mL、少なくとも7mg/mL、少なくとも8mg/mL、少なくとも9mg/mL、少なくとも10mg/mLの総脂質を含む組成物。
  81. 溶媒がエタノールである、請求項80に記載の組成物。
  82. 水をさらに含み、水とエタノールとの比率が3:7未満である、請求項80又は81に記載の組成物。
  83. マイクロ流体デバイスを使用してRNAを内包するリポソームを含む非ウイルス送達系を製造する方法であって、デバイス内で
    (a)溶媒、pKa5.5〜6.7を有するイオン化可能なカチオン性脂質、DSPC、コレステロール、並びにPEG-PE及びPEG-DMGから選択されるPEG化脂質を含む第1の溶液;並びに
    (b)水及びRNAを含む第2の溶液
    を混合するステップ;並びに溶媒を除去するステップを含み、マイクロ流体デバイスは、2〜128個の混合チャンバを含む方法。
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