CN117597144A

CN117597144A - 针对流感的免疫原性组合物

Info

Publication number: CN117597144A
Application number: CN202280047531.9A
Authority: CN
Inventors: P·S·阿伦; A·V·巴德卡尔; R·达尔瓦里; P·R·多尔米策尔; M·杜达; K·U·扬森; C·范吉恩霍芬
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2024-02-23

Abstract

本发明涉及用于核糖核酸疫苗的制备、制造和治疗用途的组合物和方法，所述核糖核酸疫苗包含编码一种或多种流感抗原(如血凝素抗原)的多核苷酸分子。

Description

针对流感的免疫原性组合物

相关申请

本申请要求以下申请中的每一个的优先权，这些申请中的每一个的公开内容在此通过引用以其整体并入：2021年5月3日提交的美国临时专利申请63/183,624；2021年5月4日提交的美国临时专利申请63/184,201；2021年6月4日提交的美国临时专利申请63/197,325；以及2021年9月28日提交的美国临时专利申请63/261,784。

技术领域

本发明涉及用于核糖核酸疫苗的制备、制造和治疗用途的组合物和方法，该核糖核酸疫苗包含编码一种或多种流感抗原(如血凝素抗原)的多核苷酸分子。

背景技术

流感病毒是正粘病毒科的成员，并且基于其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)之间的抗原差异被分类成三种类型(A、B和C)。

A型流感病毒的基因组包括八种线性、负极性、单链RNA分子(C型流感病毒为七种)，这些分子编码若干种多肽，这些多肽包括：RNA导向的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)，它们形成核衣壳；基质蛋白(M1、M2，其也是崁入在病毒膜中的表面暴露蛋白)；从脂蛋白包膜中突出来的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；以及非结构性蛋白(NS1和NS2)。

血凝素是A型和B型流感病毒的主要包膜糖蛋白，并且C型流感病毒的血凝素酯酶(HE)是与HA同源的蛋白质。

使用传统疫苗治疗和预防流感和其他感染的挑战是疫苗的广度有限，而且只能提供针对密切相关亚型的保护。另外，完成当前标准流感病毒疫苗生产过程所需的时间长度阻碍了在大流行病形势的情况下快速开发和生产适应疫苗。

需要改进的针对流感的免疫原性组合物。

发明内容

本文提供了对改进的针对流感的免疫原性组合物的未满足的需求，等等。在一个方面，本公开涉及一种免疫原性组合物，其包括：(i)第一核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码第一抗原的开放阅读框，所述抗原包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，以及(ii)第二RNA多核苷酸，其具有编码第二抗原的开放阅读框，所述第二抗原包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第一和第二RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。在一些实施方式中，该第一和第二抗原包括血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体。在一些实施方式中，该第一抗原包括来自与该第二抗原的流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段不同的流感病毒亚型的HA。在一些实施方式中，该组合物进一步包括：(iii)第三抗原，其包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第三抗原来自流感病毒，但来自与该第一和第二抗原都不同的流感病毒毒株。在一些实施方式中，该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

在一些实施方式中，该组合物进一步包括：(iv)第四RNA多核苷酸，其具有编码第四抗原的开放阅读框，所述抗原包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第四抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二和第三抗原不同的流感病毒毒株。在一些实施方式中，该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

在一些实施方式中，每种RNA多核苷酸都包括修饰的核苷酸。在一些实施方式中，该修饰的核苷酸选自假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。

在一些实施方式中，每种RNA多核苷酸都包括5’末端帽、5’UTR、3’UTR和3’聚腺苷酸化尾。在一些实施方式中，该5’末端帽包括：在一些实施方式中，该5’UTR包括SEQ ID NO:1。在一些实施方式中，该3’UTR包括SEQ IDNO:2。在一些实施方式中，该3’聚腺苷酸化尾包括SEQ ID NO:3。

在一些实施方式中，该RNA多核苷酸的完整性大于85％。在一些实施方式中，该RNA多核苷酸的纯度大于85％。

在一些实施方式中，该脂质纳米颗粒包括20-60摩尔％可电离阳离子脂质、5-25摩尔％中性脂质、25-55摩尔％胆固醇和0.5-5摩尔％PEG修饰的脂质。

在一些实施方式中，该阳离子脂质包括：

星号(*)指示手性中心。

在一些实施方式中，该PEG修饰的脂质包括：

在一些实施方式中，该第一抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且该第二抗原是来自与该第一抗原不同的H1毒株的HA或其免疫原性片段或变体。在一些实施方式中，该第一和第二抗原是来自A型流感亚型H3的HA或其免疫原性片段或变体，并且其中两种抗原来源于不同的H3流感病毒毒株。

在一些实施方式中，该第一和第二抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且该第三和第四抗原来自A型流感亚型H3或其免疫原性片段或变体，并且其中该第一和第二抗原来源于不同的H1病毒毒株，并且该第三和第四抗原来自不同的H3流感病毒毒株。

在一些实施方式中，至少该第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，该第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。

在一些实施方式中，该RNA多核苷酸中的每一种被配制在单一LNP中，其中每种单一LNP都包封编码一种抗原的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；并且该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中。在一些实施方式中，该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；并且该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中。在一些实施方式中，该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；并且该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中。

在另一方面，本公开涉及本文描述的任何免疫原性组合物，其用于引发针对流感的免疫应答。

在另一方面，本公开涉及一种引发针对流感疾病的免疫应答的方法，其包括施用有效量的本文描述的任何免疫原性组合物。

在另一方面，本公开涉及一种纯化通过体外转录合成的RNA多核苷酸的方法。该方法包括超滤和透析过滤。在一些实施方式中，该方法不包括色谱法步骤。在一些实施方式中，纯化的RNA多核苷酸基本上不含污染物，该污染物包含短流产性RNA种类(abortiveRNAspecies)、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留的质粒DNA、残留的体外转录酶、残留的溶剂和/或残留的盐。在一些实施方式中，该残留的质粒DNA为≤500ng DNA/mg RNA。在一些实施方式中，纯化的mRNA的产率为约70％至约99％。在一些实施方式中，纯化的mRNA的纯度在约60％和约100％之间。在一些实施方式中，纯化的mRNA的纯度在约85％-95％之间。

具体实施方式

本公开的实施方式提供了包括编码流感病毒抗原的多核苷酸的RNA(例如，mRNA)疫苗。如本文所提供的流感病毒RNA疫苗可以用于诱导平衡的免疫应答，其包含细胞免疫和体液免疫二者，而没有与DNA疫苗接种相关联的许多风险。

在一些实施方式中，病毒是A型流感或B型流感的毒株或其组合。

在一个方面，本公开涉及一种免疫原性组合物，其包括：(i)第一核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码第一抗原的开放阅读框，所述抗原包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，以及(ii)第二RNA多核苷酸，其具有编码第二抗原的开放阅读框，所述第二抗原包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第一和第二RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。在一些实施方式中，该第一和第二抗原包括血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体。在一些实施方式中，该第一抗原包括来自与该第二抗原的流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段不同的流感病毒亚型的HA。在一些实施方式中，该组合物进一步包括：(iii)第三抗原，其包括至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第三抗原来自流感病毒，但来自与该第一和第二抗原二者不同的流感病毒毒株。在一些实施方式中，该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

在一些实施方式中，将RNA多核苷酸以期望的比率在单一容器中混合，并且随后配制到脂质纳米颗粒中。本发明人令人惊讶地发现，以已知比率要被配制在单一LNP过程中的不同RNA多核苷酸的初始输入令人惊讶地导致LNP以与输入比率约相同的比率包封不同的RNA多核苷酸。考虑到当将RNA多核苷酸包封到LNP中时，制造过程可能有利于一种RNA多核苷酸而不利于另一种RNA多核苷酸，该结果是令人惊讶的。此类实施方式在本文中可以被称为“预混合”。因此，在一些实施方式中，第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。在一些实施方式中，第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。在一些实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五和第六RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。在一些实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。在一些实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。

在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第二RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第二RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。

在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第三RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第三RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。

在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第四RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第四RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第五RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第五RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第六RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第六RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第七RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第七RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP中之前，RNA多核苷酸的混合物中第一RNA多核苷酸与第八RNA多核苷酸的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸与第八RNA多核苷酸的摩尔比大于1:1。

在替代实施方式中，编码特定抗原的每种RNA多核苷酸被配制在单独的LNP中，使得每种LNP都包封编码相同抗原的RNA多核苷酸。此类实施方式在本文中可以被称为“后混合”。因此，在一些实施方式中，第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中；第五RNA多核苷酸被配制在第五LNP中；第六RNA多核苷酸被配制在第六LNP中；第七RNA多核苷酸被配制在第七LNP中；并且第八RNA多核苷酸被配制在第八LNP中。

在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第二LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第二LNP的摩尔比大于1:1。

在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第三LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第三LNP的摩尔比大于1:1。

在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第四LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第四LNP的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第五LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第五LNP的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第六LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第六LNP的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第七LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第七LNP的摩尔比大于1:1。在一些实施方式中，在配制到LNP之前，LNP的混合物中第一LNP与第八LNP的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在一些实施方式中，第一LNP与第八LNP的摩尔比大于1:1。

令人惊讶地，本发明人发现，不管过程如何，无论将多种RNA多核苷酸在配制在LNP中之前混合(预混合)，或无论将编码特定抗原的RNA多核苷酸配制在单独的LNP中并且将用于不同抗原的多种LNP混合(后混合)，所得到的RNA多核苷酸比率都是类似的。由于该发现，医疗专业人士可以根据流感季节来混合和施用不同比率的抗原，特别是当单独的LNP包封用于单一抗原的RNA时。

在一些实施方式中，抗原性多肽编码血凝素蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方式中，血凝素蛋白是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其免疫原性片段。在一些实施方式中，血凝素蛋白不包含头部结构域。在一些实施方式中，血凝素蛋白包含头部结构域的一部分。在一些实施方式中，血凝素蛋白不包含细胞质结构域。在一些实施方式中，血凝素蛋白包含细胞质结构域的一部分。在一些实施方式中，截短的血凝素蛋白包含跨膜结构域的一部分。

一些实施方式提供了流感疫苗，其包含一种或多种具有编码血凝素蛋白的开放阅读框的RNA多核苷酸和药物上可接受的载体或赋形剂，被配制在阳离子脂质纳米颗粒内。在一些实施方式中，血凝素蛋白选自H1、H7和H10。在一些实施方式中，RNA多核苷酸进一步编码神经氨酸酶(NA)蛋白。在一些实施方式中，血凝素蛋白来源于A型流感病毒或B型流感病毒的毒株或其组合。在一些实施方式中，流感病毒选自H1N1、H3N2、H7N9和H10N8。

在一些实施方式中，病毒是A型流感或B型流感的毒株或其组合。在一些实施方式中，A型流感或B型流感的毒株与鸟、猪、马、狗、人或非人灵长类动物相关联。在一些实施方式中，抗原性多肽编码血凝素蛋白或其片段。在一些实施方式中，血凝素蛋白是H7或H10或其片段。在一些实施方式中，血凝素蛋白包含头部结构域的一部分(HA1)。在一些实施方式中，血凝素蛋白包含细胞质结构域的一部分。在一些实施方式中，截短的血凝素蛋白。在一些实施方式中，该蛋白是包含跨膜结构域的一部分的截短的血凝素蛋白。在一些实施方式中，病毒选自H7N9和H10N8。蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被视为在所关注多肽的范围内。例如，本文提供了长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸的参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)。

在一些实施方式中，流感RNA组合物包括编码抗原性融合蛋白的RNA。因此，经编码的一种或多种抗原可以包括接合在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。替代地，与蛋白抗原融合的蛋白质不促进对自身的强免疫应答，而是促进对流感抗原的强免疫应答。在一些实施方式中，抗原性融合蛋白保留来自每种原始蛋白的功能性质。

一些实施方式提供了预防或治疗流感病毒性感染的方法，其包含将本文描述的任何疫苗施用于对象。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含T细胞应答。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含B细胞应答。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含T细胞应答和B细胞应答二者。在一些实施方式中，产生抗原特异性免疫应答的方法涉及疫苗的单一施用。在一些实施方式中，通过皮内、肌内注射、皮下注射、鼻内接种或口服施用将疫苗施用于对象。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸或其部分可以编码作为抗原的流感毒株的一种或多种多肽或其片段。

1.本公开的mRNA疫苗

一般而言，本公开涉及mRNA疫苗。在现有技术中可获得若干种mRNA疫苗平台。体外转录(IVT)mRNA的基本结构与“成熟”真核mRNA极为相似，并且包括(i)编码蛋白质的开放阅读框(ORF)，侧接的(ii)5’和3’非翻译区(UTR)，以及端侧处的(iii)7-甲基鸟苷5’帽结构和(iv)3’聚(A)尾。非编码结构特性在mRNA的药物学中起着重要作用，并且可以被单独优化以调节mRNA稳定性、翻译效率和免疫原性。通过并入修饰的核苷，可以在免疫刺激活性降低的情况下产生被称为“核苷修饰的mRNA”的mRNA转录物，并且因此可以获得改进的安全性。另外，修饰的核苷允许设计稳定性和翻译能力强烈增强的mRNA疫苗，因为它们可以避免由IFN类型诱导的直接抗病毒通路，并且被编程为降解并抑制入侵的mRNA。例如，在IVT mRNA中用假尿苷替换尿苷会降低2’-5’-寡腺苷酸合成酶的活性，该合成酶调控RNase L对mRNA的裂解。另外，测出蛋白激酶R的活性较低，蛋白激酶R是一种与mRNA翻译过程的抑制相关联的酶。

除并入修饰的核苷酸之外，还验证了其他方案也可以增加mRNA的翻译能力和稳定性。一个实例是“序列工程化mRNA”的开发。此处，通过在mRNA的ORF和UTR中进行序列优化，例如通过富集GC含量，或通过选择天然长寿命mRNA分子的UTR，可以强烈增加mRNA表达。另一方案是设计“自扩增mRNA”构建体。这些大多来源于甲病毒属，并且含有被所关注抗原替换的ORF以及编码病毒性复制酶的额外ORF。后者驱动mRNA的细胞内扩增，并且可以因此显著增加抗原表达能力。

此外，已经在mRNA的端结构处实施了若干种修饰。抗逆转帽(ARCA)修饰可以确保5’端处的正确帽定向，这产生可以高效地结合核糖体的几乎完整的mRNA级分。其他帽修饰，如硫代磷酸酯帽类似物，可以进一步改进对真核翻译起始因子4E的亲和性，并且增加对RNA去帽复合物的抗性。

相反，通过修饰mRNA的结构，可以进一步改进mRNA触发先天性免疫应答的效力，但有损于翻译能力。通过用硫代磷酸酯骨架稳定mRNA，或通过用阳离子蛋白鱼精蛋白沉淀mRNA，可以削弱抗原表达，但可以获得更强的免疫刺激能力。

在一个方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含编码作为抗原的流感毒株的一种或多种多肽或其片段的mRNA分子。

在一些实施方式中，mRNA分子包含核苷修饰的mRNA。可用于本公开的mRNA通常包括编码所关注多肽的连接核苷的第一区(例如，编码区)、位于第一区的5'-末端的第一侧翼区(例如5-UTR)、位于第一区的3'-末端的第二侧翼区(例如，3-UTR)、至少一个5'-帽区和3'-稳定区。在一些实施方式中，本公开的mRNA进一步包括聚-A区或Kozak序列(例如，在5’-UTR中)。在一些情况下，本公开的mRNA可以含有一个或多个能够从多核苷酸中切除出来的内含子核苷酸序列。在一些实施方式中，本公开的mRNA可以包括5’帽结构、链终止核苷酸、茎环、聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。核酸的任何一个区可以包括一种或多种替代组分(例如，替代核苷)。例如，3’-稳定区可以含有替代核苷，如L-核苷、反向胸苷或2'-0-甲基核苷；和/或编码区、5’-UTR、3’-UTR或帽区可以包括替代核苷，如5-取代尿苷(例如，5-甲氧基尿苷)、1-取代假尿苷(例如，1-甲基-假尿苷)和/或5-取代胞苷(例如，5-甲基-胞苷)。

本文描述的组合物包含至少一种RNA多核苷酸，如mRNA(例如，修饰的mRNA)。例如，在体外从被称为“体外转录模板”的模板DNA中转录mRNA。在一些实施方式中，体外转录模板编码5’非翻译区(UTR)，含有开放阅读框，并且编码3’UTR和聚A尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于由该模板编码的mRNA。

“5’非翻译区”(UTR)是指mRNA的区域，该区域位于起始密码子(即，mRNA转录物的由核糖体翻译的第一密码子)的直接上游(即，5’)，不编码多肽。

在优选的实施方式中，5’UTR包含SEQ ID NO:1。

“3’非翻译区”(UTR)是指mRNA的区域，该区域位于停止密码子(即，mRNA转录物的表示翻译终止的密码子)的直接下游(即，3’)，不编码多肽。

在优选的实施方式中，3’UTR包含SEQ ID NO:2。

“开放阅读框”是以起始密码子(例如，蛋氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束的连续DNA段，并且编码多肽。

“聚A尾”是mRNA的区域，该区域位于3’UTR的下游，例如直接下游(即3’)，含有多个连续的单磷酸腺苷。聚A尾可以含有10至300个单磷酸腺苷。例如，聚A尾可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方式中，聚A尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关的生物环境中(例如，在细胞中、在体内)，聚(A)尾的功能是保护mRNA例如在细胞质中免受酶降解，并且有助于转录终止、mRNA从细胞核中输出和翻译。

在优选的实施方式中，3’聚腺苷酸化尾包含SEQ ID NO:3。

在一些实施方式中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。例如，多核苷酸可以包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸)。

在一些实施方式中，LNP包括一种或多种RNA，并且该一种或多种RNA、脂质及其量可以被选择为提供特定的N:P比率。组合物的N:P比率是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸酯基团的数量的摩尔比。一般而言，较低的N:P比率是优选的。该一种或多种RNA、脂质及其量可以被选择为提供以下的N:P比率：从约2:1至约30:1，如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1。在某些实施方式中，N:P比率可以为从约2:1至约8:1。在其他实施方式中，N:P比率为从约5:1至约8:1。例如，N:P比率可以为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。例如，N:P比率可以为约5.67:1。

本公开的mRNA可以包括一种或多种天然存在的组分，其包括经典核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)中的任何一种。在一个实施方式中，包含(a)5’-UTR、(b)开放阅读框(ORF)、(c)3’-UTR，(d)聚A尾和(以上的a、b、c或d)的任何组合的所有或基本上所有的核苷酸包含天然存在的经典核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)。

本公开的mRNA可以包括如本文所描述的一种或多种替代组分，其赋予有用的性质，这些性质包括稳定性增加和/或缺少对引入有多核苷酸的细胞的先天性免疫应答的实质性诱导。例如，相对于相应的未改变的mRNA，modRNA在引入有该modRNA的细胞中可以表现出降解减少。这些替代物种可以增强蛋白质生产的效率、多核苷酸的细胞内保留和/或接触细胞的活力，而且具有降低的免疫原性。

本公开的mRNA可以包括一种或多种修饰的(例如，改变的或替代的)核碱基、核苷、核苷酸或其组合。可用于LNP的mRNA可以包括任何有用的修饰或改变，如对核碱基、糖或核苷间键(例如，对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯骨架)的修饰或改变。在某些实施方式中，改变(例如，一种或多种改变)存在于核碱基、糖和核苷间键中的每一个中。根据本公开的改变可以是核糖核酸(RNA)的改变，例如，呋喃核糖基环的2'-OH被2’-H、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNAs)或其杂交体取代。本文描述了额外的改变。

本公开的mRNA可以或可以不沿着分子的整个长度均匀地改变。例如，在mRNA中，或在其给定的预定序列区中，核苷酸的一种或多种或所有类型(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或全部)可以或可以不均匀地改变。在一些情况下，mRNA中(或其给定的序列区)中的所有核苷酸X都被改变，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任何一种，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任何一种。

不同的糖改变和/或核苷间键(例如，骨架结构)可以存在于多核苷酸的不同位置。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他改变可以位于多核苷酸的任何位置，使得多核苷酸的功能不会大幅降低。改变还可以是5'-或3'-末端改变。在一些实施方式中，多核苷酸包括3’-末端处的改变。多核苷酸可以含有从约1％至约100％的替代核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于核苷酸的一种或多种类型，即，A、G、U或C中的任何一种或更多种)或任何介于中间的百分比(例如，从1％至20％、从1％至25％、从1％至50％、从1％至60％、从1％至70％、从1％至80％、从1％至90％、从1％至95％、从10％至20％、从10％至25％、从10％至50％、从10％至60％、从10％至70％、从10％至80％、从10％至90％、从10％至95％、从10％至100％、从20％至25％、从20％至50％、从20％至60％、从20％至70％、从20％至80％、从20％至90％、从20％至95％、从20％至100％、从50％至60％、从50％至70％、从50％至80％、从50％至90％、从50％至95％、从50％至100％、从70％至80％、从70％至90％、从70％至95％、从70％至100％、从80％至90％、从80％至95％、从80％至100％、从90％至95％、从90％至100％和从95％至100％)。将理解，任何剩余的百分比都由经典核苷酸(例如，A、G、U或C)的存在来解释。

多核苷酸可以含有最小值为零至最大值为100％的替代核苷酸，或任何介于中间的百分比，如至少5％替代核苷酸、至少10％替代核苷酸、至少25％替代核苷酸、至少50％替代核苷酸、至少80％替代核苷酸或至少90％替代核苷酸。例如，多核苷酸可以含有替代嘧啶，如替代尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方式中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被替代尿嘧啶(例如5-取代尿嘧啶)替换。替代尿嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替换，或可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物替换。在一些情况下，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被替代胞嘧啶(例如5-取代胞嘧啶)替换。替代胞嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替换，或可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多种化合物替换。

在一些情况下，核酸基本上不会诱导引入有多核苷酸(例如，mRNA)的细胞的先天性免疫应答。诱导的先天性免疫应答的特性包括1)促炎性细胞因子的表达增加，2)细胞内PRR(RIG-I、MDA5等)的活化，和/或3)蛋白质翻译的终止或减少。

在一些实施方式中，mRNA包含一种或多种替代核苷或核苷酸。替代核苷和核苷酸可以包括替代核碱基。核酸的核碱基是有机碱基，如嘌呤或嘧啶或其衍生物。核碱基可以是经典碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)。这些核碱基可以被改变或全部替换，以提供具有增强的性质(例如，增加的稳定性，如对核酸酶的抗性)的多核苷酸分子。非经典或修饰的碱基可以包括例如一种或多种取代或修饰，其包括但不限于烷基、芳基、卤代、氧代、羟基、烷基氧基和/或硫代取代；一种或多种融合环或开口环；氧化；和/或减少。

在一些实施方式中，核碱基是替代尿嘧啶。具有替代尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s2U)、4-硫代-尿嘧啶(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤代-尿嘧啶(例如，5-碘代-尿嘧啶或5-溴代-尿嘧啶)、3-甲基-尿嘧啶(m U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-羟乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-羟乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿嘧啶(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(nmVu)、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnmVu)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnmVu)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸基甲基-尿嘧啶(xm5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿嘧啶(xm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(mV)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m xj/)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m\|/)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿尿嘧啶(m5D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶(acp U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acpψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(inm5s2U)、5,2'-0-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫代-2'-0_甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-0-甲基-尿苷(mem Um)、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-0-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-0-二甲基-尿苷(m Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-0-甲基-(inm5Um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-甲酯基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨基甲酰基羟甲基)-尿嘧啶、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(l-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。

在一些实施方式中，核碱基是替代胞嘧啶。具有替代胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞嘧啶、6-氮杂-胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基-胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基-胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基-胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤代-胞嘧啶(例如，5-碘代-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞嘧啶、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞嘧啶、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-1-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖胞苷(k2C)、5,2'-0-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-0-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-0-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-0-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-0-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。

在一些实施方式中，核碱基是替代腺嘌呤。具有替代腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯代-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯代-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤，7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-1-腺嘌呤(ml A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯醇)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-缩水甘油基氨基甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(t6A)，N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)，N6-乙酰基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2'-0-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-0-三甲基-腺苷(m62Am)、l,2'-0-二甲基-腺嘌呤(ml Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤。

在一些实施方式中，核碱基是替代鸟嘌呤。具有替代鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(mil)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰下的羟基怀丁苷(OHyW^*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQO)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQl)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(mlG)、N2-甲基-鸟嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-2'-0-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-0-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-0-甲基-鸟苷(mlGm)、N2,7-二甲基-2'-0-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-0-甲基-肌苷(Im)、l,2'-0-二甲基-肌苷(mllm)、1-硫代-鸟嘌呤和O-6-甲基-鸟嘌呤。

核苷酸的替代核碱基可以独立地是嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，核碱基可以是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤的替代物。在另一实施方式中，核碱基还可以包括例如碱的天然存在的和合成的衍生物，其包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代(例如，8-溴代)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[l,5-a]l,3,5三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；或1,3,5三嗪。当使用简写A、G、C、T或U来描绘核苷酸时，每个字母是指其代表性碱基和/或衍生物，例如，A包括腺嘌呤或腺嘌呤类似物，例如，7-脱氮腺嘌呤)。

mRNA可以包括5'-帽结构。多核苷酸的5'-帽结构参与核输出和增加多核苷酸稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，该蛋白通过CBP与聚-A结合蛋白相关联以形成成熟的环状mRNA物种来负责细胞中的多核苷酸稳定性和翻译能力。在mRNA剪接期间，帽进一步协助5'-近端内含子去除的去除。

内源性多核苷酸分子可以是5'-端加帽的，在多核苷酸的末端鸟苷帽残基和5'-末端转录有义核苷酸之间生成5'-ppp-5'-三磷酸酯键。然后可以将这种5'-鸟苷酸帽甲基化以生成N7-甲基-鸟苷酸残基。多核苷酸5’端的末端和/或前末端转录核苷酸的核糖也可以任选地是2'-0-甲基化的。通过鸟苷酸帽结构的水解和裂解进行的5’-去帽可以针对多核苷酸分子(如mRNA分子)以进行降解。

改变多核苷酸可以生成不可水解的帽结构，从而防止去帽，并且因此增加多核苷酸半衰期。由于帽结构水解需要裂解5'-ppp-5'磷酸二酯键，因此在加帽反应期间可以使用替代核苷酸。例如，可以根据制造商的说明，将来自New England Biolabs(Ipswich,MA)的痘苗加帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)与硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中创建硫代磷酸酯键。

可以使用额外的替代鸟苷核苷酸，如甲基-膦酸酯和硒基-磷酸酯核苷酸。额外的改变包括但不限于糖的2'-羟基基团上多核苷酸的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-0-甲基化(如上文所提及的)。多个不同的5'-帽结构可以用于生成mRNA分子的5'-帽。

帽类似物，在本文中也被称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构性或功能性帽类似物，在其化学结构上不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5'-帽，同时保留帽功能。帽类似物可以是化学地(即，非酶促地)或酶促地合成的和/与多核苷酸连接。例如，抗逆转帽类似物(ARCA)帽含有两个通过5'-5'-三磷酸酯基团连接的鸟苷，其中一个鸟苷含有N7-甲基基团以及3'-0-甲基基团(即，N7,'-0-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7G-3'ppp-G，其可以等效地被定名为3'0-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一个未改变的鸟苷的3'-0原子与加帽的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-末端核苷酸连接。N7-和3'-0甲基化的鸟苷提供了加帽的多核苷酸(例如，mRNA)的末端部分。另一示例性帽是mCAP，其与ARCA相似，但在鸟苷上具有2'-0-甲基基团(即，N7,2'-0-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。

帽可以是二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可以在不同的磷酸酯位置用硼烷磷酸酯(boranophosphate)基团或硒基膦酸酯(phophoroselenoate)基团进行修饰，如美国专利号8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，其帽结构通过引用并入本文。

替代地，帽类似物可以是本领域已知的和/或本文描述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5)ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5)ppp(5')G帽类似物(参见，例如，Kore et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中描述的各种帽类似物和帽类似物合成方法；其帽结构通过引用并入本文)。在其他情况下，可用于本公开的多核苷酸的帽类似物是4-氯代/溴代苯氧基乙基类似物。

虽然帽类似物允许在体外转录反应中伴随多核苷酸的加帽，但高达20％的转录物保持未加帽。这种现象以及帽类似物与由内源性细胞转录机制产生的多核苷酸的内源性5'-帽结构的结构差异，可能会导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。

也可以在转录后使用酶对替代多核苷酸加帽，以便生成更真实的5'-帽结构。如本文所用，短语“更真实的”是指在结构上或功能上紧密反映或模拟内源性或野生型特性的特性。也就是说，与现有技术的合成特性或类似物相比，“更真实的”特性更能代表内源性、野生型、天然或生理性细胞功能和/或结构，或在一个或多个方面优于相应的内源性、野生型、天然或生理性特性。尤其地，可用于本公开的多核苷酸的更真实的5'-帽结构的非限制性实例是与本领域已知的合成5'-帽结构(或与野生型、天然或生理性5'-帽结构)相比，对帽结合蛋白的结合增强、半衰期增加、对5'-核酸内切酶的易感性降低和/或5'-去帽减少的那些帽结构结构。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-0-甲基转移酶可以在多核苷酸的5'-末端核苷酸和鸟苷帽核苷酸之间创建经典的5'-5'-三磷酸酯键，其中帽鸟苷含有N7-甲基化，并且多核苷酸的5'-末端核苷酸含有2'-0-甲基。此种结构被称为Capl结构。这种帽与例如本领域已知的其他5'帽类似物结构相比，会导致翻译能力、细胞稳定性更高以及细胞促炎性细胞因子的活化减少。其他示例性帽结构包括7mG(5')ppp(5')N、pN2p(Cap 0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp(Cap 1)、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(Cap 2)和m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up(Cap 4)。

由于替代多核苷酸可以在转录后被加帽，并且由于这一过程更高效，因此几乎100％的mRNA可以被加帽。这与体外转录反应过程中帽类似物与多核苷酸连接时的-80％形成对比。5'-端帽可以包括内源性帽或帽类似物。5'-末端帽可以包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。在一些情况下，多核苷酸含有修饰的5'-帽。5'-帽上的修饰可以增加多核苷酸的稳定性，增加多核苷酸的半衰期，并且可以增加多核苷酸翻译效率。修饰的5’-帽可以包括但不限于以下修饰中的一种或多种：在加帽的三磷酸鸟苷(GTP)的2'-和/或3'-位置的修饰、用亚甲基部分(CH2)替换糖环氧(其产生碳环)、在帽结构的三磷酸酯桥部分的修饰或在核碱基(G)部分的修饰。

5'-UTR可以被提供为mRNA的侧翼区。5'-UTR可以与存在于多核苷酸中的编码区同源或异源。多个5'-UTR可以被包括在侧翼区中，并且可以是相同的或不同的序列。侧翼区(包括无侧翼区)的任何部分都可以是密码子优化的，并且在密码子优化之前和/或之后，任何部分都可以独立地含有一个或多个不同的结构或化学改变。

在一个实施方式中，编码本公开的抗原的ORF是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的序列中的任何一个或多个的ORF可以是密码子优化的。在一些实施方式中，密码子优化可以用于匹配目标生物体和宿主生物体中的密码子频率，以确保适当的折叠；偏置GC含量，以增加mRNA稳定性或减少二级结构；尽量减少可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加经编码的蛋白质中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或打乱蛋白质结构域；插入或删除限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各个结构域适当地折叠；或减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park Calif.)和/或专有方法的服务。在一些实施方式中，使用优化算法来优化开放阅读框(ORF)序列。为了改变mRNA的一个或多个性质，可以对与mRNA的编码区异源的5'-UTR进行工程化改造。然后可以将mRNA施用于细胞、组织或生物体，并且可以测量结果(如蛋白质水平、定位和/或半衰期)以评价异源性5'-UTR可能对mRNA具有的有益影响。可以利用5'-UTR的变体，其中一个或多个核苷酸可以被添加或去除到末端，包括A、T、C或G。也可以以本文描述的任何方式对5'-UTR进行密码子优化或改变。

mRNA可以包括茎环，如但不限于组蛋白茎环。茎环可以是长度为约25或约26个核苷酸的核苷酸序列。组蛋白茎环可以位于相对于编码区的3'-(例如，位于编码区的3'-末端)。作为非限制性实例，茎环可以位于本文描述的多核苷酸的3'-端。在一些情况下，mRNA包括超过一个茎环(例如，两个茎环)。茎环可以位于多核苷酸的第二末端区中。作为非限制性实例，茎环可以位于第二末端区中的未翻译区(例如，3'-UTR)内。在一些情况下，包括组蛋白茎环的mRNA可以通过添加3'-稳定区(例如，包括至少一种链终止核苷的3'-稳定区)来稳定。不希望受理论束缚，添加至少一种链终止核苷可以减缓多核苷酸的降解，并且因此可以增加多核苷酸的半衰期。在其他情况下，包括组蛋白茎环的mRNA可以通过对多核苷酸的3'-区进行改变来稳定，该改变可以防止和/或抑制oligio(U)的添加。在又其他情况下，包括组蛋白茎环的mRNA可以通过添加终止于3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷、3'-0-甲基核苷、3-0-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知的和/或本文描述的其他替代核苷的寡核苷酸来稳定。在一些情况下，本公开的mRNA可以包括组蛋白茎环、聚-A区和/或5'-帽结构。组蛋白茎环可以在聚-A区之前和/或之后。包括组蛋白茎环和聚-A区序列的多核苷酸可以包括本文描述的链终止核苷。在其他情况下，本公开的多核苷酸可以包括组蛋白茎环和5'-帽结构。5'-帽结构可以包括但不限于本文描述的和/或本领域已知的那些。在一些情况下，保守的茎环区可以包括本文描述的miR序列。作为非限制性实例，茎环区可以包括本文描述的miR序列的种子序列。在另一非限制性实例中，茎环区可以包括miR-122种子序列。

mRNA可以包括至少一个组蛋白茎环和聚-A区或聚腺苷酸化信号。在某些情况下，编码组蛋白茎环和聚-A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码病原体抗原或其片段。在其他情况下，编码组蛋白茎环和聚-A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码治疗性蛋白质。在一些情况下，编码组蛋白茎环和聚-A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码肿瘤抗原或其片段。在其他情况下，编码组蛋白茎环和聚-A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可以编码过敏性抗原或自身免疫性自身抗原。

mRNA可以包括聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。聚A序列可以完全地或大多地由腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物构成。聚A序列可以是相邻于核酸的3'非翻译区定位的尾部。在RNA加工期间，通常将腺苷核苷酸长链(聚-A区)添加到信使RNA(mRNA)分子中，以增加该分子的稳定性。在转录之后，立即裂解转录物的3'-端以释放3'-羟基。然后聚-A聚合酶将腺苷核苷酸链添加到RNA中。该过程被称为聚腺苷酸化，添加长度在100和250个残基之间的聚-A区。独特的聚-A区长度可以为本公开的替代多核苷酸提供某些优势。通常，本公开的聚-A区的长度为至少30个核苷酸的长度。在另一实施方式中，聚-A区的长度为至少35个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少40个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少45个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少55个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少60个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少70个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少80个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少90个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少100个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少120个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少140个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少160个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少180个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少200个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少250个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少300个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少350个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少400个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少450个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少500个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少600个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少700个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少800个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少900个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1000个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1100个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1200个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1300个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1400个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1500个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1600个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1700个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1800个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少1900个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少2000个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少2500个核苷酸。在另一实施方式中，长度为至少3000个核苷酸。在一些情况下，在本文描述的替代多核苷酸分子上，聚-A区的长度可以为80个核苷酸、120个核苷酸、160个核苷酸。在其他情况下，在本文描述的替代多核苷酸分子上，聚-A区的长度可以为20、40、80、100、120、140或160个核苷酸。在一些情况下，相对于整个替代多核苷酸的长度来设计聚-A区。这种设计可以基于替代多核苷酸的编码区的长度、替代多核苷酸(如mRNA)的特定特性或区域的长度，或基于从替代多核苷酸表达的最终产物的长度。当相对于替代多核苷酸的任何特性时(例如，除包括聚-A区的mRNA部分之外)，聚-A区的长度可以比额外特性长10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。聚-A区还可以被设计为其所属的替代多核苷酸的级分。在该背景下，聚-A区可以是构建体的总长度的10、20、30、40、50、60、70、80或90％或更多，或可以是构建体减去聚-A区的总长度。

在某些情况下，工程化结合位点和/或聚-A结合蛋白的mRNA缀合可以用于增强表达。工程化结合位点可以是传感器序列，其可以用作mRNA的局部微环境的配体的结合位点。作为非限制性实例，mRNA可以包括至少一个工程化结合位点，以改变聚-A结合蛋白(PABP)及其类似物的结合亲和性。并入至少一个工程化结合位点可以增加PABP及其类似物的结合亲和性。

另外，可以在聚-A区的3'-末端使用替代核苷酸，通过3'-端将多个不同的mRNA一起与PABP(聚-A结合蛋白)连接。可以在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和第7天通过ELISA测定蛋白质产生。作为非限制性实例，转染实验可以用于评价由于添加至少一个工程化结合位点而对PABP或其类似物结合亲和性的影响。在某些情况下，聚-A区可以用于调节翻译起始。虽然不希望受理论束缚，但聚-A区募集PABP，其转而可以与翻译起始复合物相互作用，并且因此可能对蛋白质合成至关重要。在一些情况下，聚-A区还可以用于本公开以防止3'-5'-核酸外切酶消化。在某些情况下，mRNA可以包括聚A-G四分体(Quartet)。G-四分体是可以由DNA和RNA二者中富含G的序列形成的四个鸟苷核苷酸的环状氢键合阵列。在这一实施方式中，在聚-A区的端部并入G-四分体。可以不同的时间点测定所得mRNA的稳定性、蛋白质产生和包括半衰期在内的其他参数。已经发现，聚A-G四分体导致的蛋白质产生相当于单独使用120个核苷酸的聚-A区所看到的蛋白质产生的至少75％。在一些情况下，mRNA可以包括聚-A区，并且可以通过添加3'-稳定区来稳定。具有聚-A区的mRNA可以进一步包括5'-帽结构。在其他情况下，mRNA可以包括聚-A-G四分体。具有聚-A-G四分体的mRNA可以进一步包括5'-帽结构。在某些情况下，可以用于稳定mRNA的3'-稳定区包括聚-A区或聚-A-G四分体。在其他情况下，可以与本公开一起使用的3'-稳定区包括链终止核苷，如3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-二脱氧核苷，如2',3'-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧尿苷、2',3'-二脱氧胞嘧啶、2',3'-二脱氧鸟苷、2',3'-二脱氧胸腺嘧啶、2'-脱氧核苷或O-甲基核苷。在其他情况下，包括聚A区或聚-A-G四分体的mRNA可以通过对多核苷酸的3'-区进行改变来稳定，该改变可以防止和/或抑制oligio(U)的添加。在又其他情况下，包括聚A区或聚-A-G四分体的mRNA可以通过添加终止于3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷、3-O-甲基核苷、3'-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知的和/或本文描述的其他替代核苷的寡核苷酸来稳定。

在实施方式中，本公开的mRNA疫苗包含脂质。脂质和modRNA可以一起形成纳米颗粒。脂质可以以脂质纳米颗粒(LNP)的形式包封mRNA，以辅助细胞进入和RNA/脂质纳米颗粒的稳定性。

脂质纳米颗粒可以包括脂质组分和一种或多种额外的组分，如治疗剂和/或预防剂。LNP可以被设计成用于一个或多个特定的应用或目标。LNP的要素可以基于特定的应用或目标和/或基于一种或多种要素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特性来选择。相似地，根据例如要素的特定组合的功效和毒性，LNP的特定配制剂可以被选择成用于特定的应用或目标。LNP配制剂的功效和耐受性可能受到配制剂稳定性的影响。

脂质纳米颗粒可以被设计成用于一个或多个特定的应用或目标。例如，LNP可以被设计为将治疗剂和/或预防剂(如RNA)递送到哺乳动物体内的特定的细胞、组织、器官或系统或其组中。

可以改变脂质纳米颗粒的物理化学性质，以增加对特定的身体目标的选择性。例如，可以基于不同器官的开窗尺寸来调整颗粒尺寸。LNP中包括的治疗剂和/或预防剂也可以基于期望的一个或多个递送目标来选择。例如，治疗剂和/或预防剂可以被选择成用于特定的适应症、病况、疾病或病症，和/或被选择成递送到特定的细胞、组织、器官或系统或其组中(例如，局部或特定的递送)。在某些实施方式中，LNP可以包括编码所关注多肽的mRNA，其能够在细胞内被翻译以产生所关注多肽。此种组合物可以被设计为被专门递送到特定的器官中。在一些实施方式中，组合物可以被设计为被专门递送到哺乳动物肝脏中。在一些实施方式中，组合物可以被设计为被专门递送到淋巴结中。在一些实施方式中，组合物可以被设计为被专门递送到哺乳动物脾脏中。

LNP可以包括本文描述的一种或多种组分。在一些实施方式中，本公开的LNP配制剂包括至少一种脂质纳米颗粒组分。脂质纳米颗粒可以包括脂质组分和一种或多种额外的组分，如治疗剂和/或预防剂，如核酸。LNP可以被设计成用于一个或多个特定的应用或目标。LNP的要素可以基于特定的应用或目标和/或基于一种或多种要素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特性来选择。相似地，根据例如要素的特定组合的功效和毒性，LNP的特定配制剂可以被选择成用于特定的应用或目标。LNP配制剂的功效和耐受性可能受到配制剂稳定性的影响。

在一些实施方式中，例如，聚合物可以被包括在LNP中和/或用于包封或部分地包封LNP。聚合物可以是生物可降解的和/或生物相容的。聚合物可以选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。例如，聚合物可以包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙基酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烷撑(如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷撑二醇(如聚(乙二醇)(PEG))、聚烷撑氧化物(PEO)、聚烷撑对苯二甲酸酯(如聚(对苯二甲酸亚乙酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯卤化物(如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生的纤维素(如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸的聚合物(如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)及其共聚物和混合物)、聚二恶烷酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、富马酸聚丙烯酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚原酸酯、聚(丁酸)、聚(缬酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)和聚甘油。

表面改变制剂可以包括但不限于阴离子蛋白质(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，如二甲基双十八烷基-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属(clerodendrum)、溴己新、羧甲司坦、依普拉酮、美司钠、氨溴索、索布瑞醇、多米奥醇、来托司坦(letosteine)、司替罗宁、硫普罗宁、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽β4、丹纳酸酶阿尔法(dornase alfa)、奈替克新和厄多司坦)和DNA酶(DNase)(例如，rhDNA酶)。可以将表面改变制剂安置在纳米颗粒内和/或LNP的表面上(例如，通过涂覆、吸附、共价连接或其他工艺)。

LNP还可以包含一种或多种功能化脂质。例如，脂质可以用炔烃基团功能化，当该炔烃基团在适当的反应条件下暴露于叠氮化物时，可以经受环加成反应。具体地，脂质双层可以用一个或多个可用于促进膜渗透、细胞识别或成像的基团以这种方式功能化。LNP的表面也可以与一种或多种有用的抗体缀合。可用于针对性细胞递送、成像和膜渗透的功能性基团和缀合物是本领域众所周知的。

除这些组分之外，脂质纳米颗粒还可以包括可用于药物组合物的任何物质。例如，脂质纳米颗粒可以包括一种或多种药物上可接受的赋形剂或辅助成分，如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散辅助剂、悬浮辅助剂、表面活性制剂、缓冲剂、防腐剂和其他物种。

表面活性制剂和/或乳化剂可以包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、胆固醇和卵磷脂)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯[20]、聚氧乙烯山梨醇酐[/>60]、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[/>80]、山梨醇酐单棕榈酸酯[/>40]、山梨醇酐单硬脂酸酯[/>60]、山梨醇酐三硬脂酸酯[/>65]、甘油单油酸酯、山梨醇酐单油酸酯[/>80])、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[/>45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和/>)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，/>)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚[/>30])、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、/>F 68、POL/>188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西吡氯铵(cetylpyridiniumchloride)、苯扎氯铵、多库脂钠(docusate sodium)和/或其组合。

防腐剂的实例可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、自由基清除剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。抗氧化剂的实例包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、二亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠(disodium edetate)、依地酸二钾(dipotassium edetate)、依地酸(edetic acid)、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠(sodium edetate)、酒石酸和/或依地酸三钠(trisodium edetate)。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝醇(bronopol)、溴棕三甲胺、西吡氯铵、氯己定、氯代丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、伊咪脲(imidurea)、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。抗真菌防腐剂的实例包括但不限于尼泊金丁酯(butyl paraben)、尼泊金甲酯(methylparaben)、尼泊金乙酯(ethyl paraben)、尼泊金丙酯(propyl paraben)、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯甲醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯代丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去肟(deteroxime mesylate)、溴棕三甲胺、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、二亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT 尼泊金甲酯、/>115、II、NEOLONE^TM、KATHON^TM和/或/>示例性自由基清除剂包括丁基化羟基甲苯(BHT或丁基羟基甲苯)或去铁胺。

缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲剂溶液、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖醛酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、二碱性磷酸钙、磷酸、三碱性磷酸钙、氢氧化钙磷酸盐、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、二碱性磷酸钾、单碱性磷酸钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、二碱性磷酸钠、单碱性磷酸钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氨基-磺酸盐缓冲液(例如，HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和/或其组合。

在一些实施方式中，包括LNP的配制剂可以进一步包括盐，如氯化物盐。在一些实施方式中，包括LNP的配制剂可以进一步包括糖，如二糖。在一些实施方式中，配制剂进一步包括糖而不包括盐，如氯化物盐。在一些实施方式中，LNP可以进一步包括一个或多个小的疏水性分子，如维生素(例如，维生素A或维生素E)或甾醇。碳水化合物可以包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。

LNP的特征可以取决于其组件。例如，包括胆固醇作为结构性脂质的LNP可以具有与包括不同结构性脂质的LNP不同的特征。如本文所用，术语“结构性脂质”是指甾醇，并且也是指含有甾醇部分的脂质。如本文所定义，“甾醇”是由类固醇醇类组成的类固醇的亚组。在一些实施方式中，结构性脂质是类固醇。在一些实施方式中，结构性脂质是胆固醇。在一些实施方式中，结构性脂质是胆固醇的类似物。在一些实施方式中，结构性脂质是α-生育酚。

在一些实施方式中，LNP的特征可以取决于其组分的绝对量或相对量。例如，包括较高摩尔分数的磷脂的LNP可以具有与包括较低摩尔分数的磷脂的LNP不同的特征。特征也可以取决于脂质纳米颗粒的制备方法和条件而变化。一般而言，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

磷脂部分可以例如选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂组成的非限制性组。脂肪酸部分可以例如选自月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸(myristoleic acid)、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四稀酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。特定的磷脂可以促进与膜的融合。在一些实施方式中，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一个或多个带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许含脂质组合物(例如，LNP)的一种或多种要素(例如，治疗性制剂)穿过膜，从而允许例如将一种或多种要素递送到目标组织中。还考虑了非天然磷脂物种，其包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物种。在一些实施方式中，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替换的烯基基团)功能化或与其交联。在适当的反应条件下，炔烃基团在暴露于叠氮化物时可以经受铜催化的环加成。此类反应可以用于使纳米颗粒组合物的脂质双层功能化以促进膜渗透或细胞识别，或可以用于将纳米颗粒组合物缀合到有用的组分，如目标或成像部分(例如，染料)。磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂，如神经鞘磷脂。在一些实施方式中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是DSPC的类似物或变体。

脂质纳米颗粒可以通过多种方法表征。例如，显微镜术(例如，透射电子显微镜术或扫描电子显微镜术)可以用于检查LNP的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如，电位滴定法)可以用于测量Zeta电位。还可以利用动态光散射来确定颗粒尺寸。如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)等仪器也可以用于测量LNP的多种特征，如颗粒尺寸、多分散性指数和Zeta电位。

LNP的平均尺寸可以在几十nm和几百nm之间，例如，通过动态光散射(DLS)所测量的。例如，平均尺寸可以为从约40nm至约150nm，如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方式中，LNP的平均尺寸可以为从约50nm至约100nm、从约50nm至约90nm、从约50nm至约80nm、从约50nm至约70nm、从约50nm至约60nm、从约60nm至约100nm、从约60nm至约90nm、从约60nm至约80nm、从约60nm至约70nm、从约70nm至约100nm、从约70nm至约90nm、从约70nm至约80nm、从约80nm至约100nm、从约80nm至约90nm或从约90nm至约100nm。在某些实施方式中，LNP的平均尺寸可以为从约70nm至约100nm。在特定的实施方式中，平均尺寸可以为约80nm。在其他实施方式中，平均尺寸可以为约100nm。

LNP可以是相对同质的。多分散性指数可以用于指示LNP的同质性，例如，脂质纳米颗粒的颗粒尺寸分布。小(例如，小于0.3)的多分散性指数通常指示窄的颗粒尺寸分布。LNP的多分散性指数可以为从约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方式中，LNP的多分散性指数可以为从约0.10至约0.20。

LNP的Zeta电位可以用于指示组合物的电动电位。例如，Zeta电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对较低的电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒是通常期望的，因为更高电荷的物种可能与体内的细胞、组织和其他要素不期望地相互作用。在一些实施方式中，LNP的Zeta电位可以为从约-10mV至约+20mV、从约-10mV至约+15mV、从约-10mV至约+10mV、从约-10mV至约+5mV、从约-10mV至约0mV、从约-10mV至约-5mV、从约-5mV至约+20mV、从约-5mV至约+15mV、从约-5mV至约+10mV、从约-5mV至约+5mV、从约-5mV至约0mV、从约0mV至约+20mV、从约0mV至约+15mV、从约0mV至约+10mV、从约0mV至约+5mV、从约+5mV至约+20mV、从约+5mV至约+15mV或从约+5mV至约+10mV。

治疗剂和/或预防剂的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备之后包封的或以其他方式与LNP相关联的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率是期望地高的(例如，接近100％)。包封效率可以通过例如比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可以用于测量溶液中游离的治疗剂和/或预防剂(例如，RNA)的量。对于本文描述的脂质纳米颗粒，治疗剂和/或预防剂的包封效率可以为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方式中，包封效率可以为至少80％。在某些实施方式中，包封效率可以为至少90％。

LNP可以任选地包含一种或多种涂层。例如，LNP可以被配制在具有涂层的胶囊、薄膜或片剂中。包括本文描述的组合物的胶囊、薄膜或片剂可以具有任何有用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。

可以将包含两亲性聚合物和脂质纳米颗粒的配制剂全部或部分地配制为药物组合物。药物组合物可以包括一种或多种两亲性聚合物和一种或多种脂质纳米颗粒。例如，药物组合物可以包括一种或多种两亲性聚合物和一种或多种脂质纳米颗粒，该一种或多种脂质纳米颗粒包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物可以进一步包括一种或多种药物上可接受的赋形剂或辅助成分，如本文描述的那些。药物组合物和制剂的配制和制造的一般指南可获自例如Remington's The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006。除非任何常规的赋形器或辅助成分可能与LNP的一种或多种组分或本公开的配制剂中的一种或多种两亲性聚合物不相容，否则常规的赋形剂和辅助成分可以用于任何药物组合物。如果赋形剂或辅助成分与LNP的组分或配制剂的两亲性聚合物的组合可能导致任何不希望的生物效应或其他有害效应，则赋形剂或辅助成分可能与该组分或两亲性聚合物不相容。

在一些实施方式中，一种或多种赋形剂或辅助成分可以占包括LNP的药物组合物的总质量或体积的大于50％。例如，一种或多种赋形剂或辅助成分可以占药物协定的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方式中，药物上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方式中，赋形剂被批准用于人类和用于兽用。在一些实施方式中，赋形剂获得美国食品和药物管理局(UnitedStates Food and Drμg Administration)批准。在一些实施方式中，赋形剂是药物级。在一些实施方式中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。根据本公开的药物组合物中的一种或多种两亲性聚合物、一种或或多种脂质纳米颗粒、一种或多种药物上可接受的赋形剂和/或任何额外的成分的相对量将取决于接受治疗的对象的个性、尺寸和/或病况而变化，并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可以包含在0.1％和100％(重量/重量)之间的一种或多种脂质纳米颗粒。作为另一实例，药物组合物可以包含在0.1％和15％(重量/体积)之间的一种或多种两亲性聚合物(例如，0.5％、1％、2.5％、5％、10％或12.5％重量/体积)。

在某些实施方式中，本公开的脂质纳米颗粒和/或药物组合物被冷藏或冷冻以用于储存和/或运输(例如，在4℃或更低的温度下储存，如在约-150℃和约0℃之间或在约-80℃和约-20℃之间的温度(例如，约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)下储存。例如，包含一种或多种两亲性聚合物和一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物是溶液或固体(例如，通过冻干)，其在例如约-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下被冷藏以用于储存和/或运输。在某些实施方式中，本公开还涉及一种通过添加有效量的两亲性聚合物并通过将脂质纳米颗粒和/或其药物组合物储存在4℃或更低的温度下，如在约-150℃和约0℃之间或在约-80℃和约-20℃之间的温度(例如，约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)下来增加脂质纳米颗粒的稳定性的方法。

本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的化学性质可以由多种方法表征。在一些实施方式中，电泳(例如，毛细管电泳)或色谱法(例如，反相液相色谱法)可以用于检查mRNA完整性。

产物的功效将取决于所递送的RNA的表达，这需要足够完整的RNA分子。RNA完整性是对完整的RNA进行定量的RNA质量测量。该方法还能够检测潜在的降解产物。RNA完整性优选地通过毛细管凝胶电泳来确定。初始规格被设置为确保药物产品制备剂中足够的RNA完整性。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的完整性为至少约80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的完整性为或大于约95％。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的完整性为或大于约98％。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的完整性为或大于约99％。

在优选的实施方式中，RNA多核苷酸具有临床级纯度。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的纯度在约60％和约100％之间。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的纯度在约80％和99％之间。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的纯度在约90％和约99％之间。在一些实施方式中，其中纯化的mRNA在没有进一步纯化的情况下具有临床级纯度。在一些实施方式中，临床级纯度通过包括切向流过滤(TFF)纯化在内的方法来实现。在一些实施方式中，在没有选自高效液相色谱法(HPLC)纯化、基于配体或结合的纯化和/或离子交换色谱法的进一步纯化的情况下实现临床级纯度。在一些实施方式中，产生RNA多核苷酸的方法去除长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留溶剂和/或残留盐。在一些实施方式中，短流产性转录物污染物包含少于15个碱基。在一些实施方式中，短流产性转录物污染物包含约8-12个碱基。在一些实施方式中，本发明的方法还去除RNAse抑制剂。

在一些实施方式中，如通过毛细管电泳所确定的，纯化的RNA多核苷酸包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的蛋白质污染物，或基本上不含蛋白质污染物。在一些实施方式中，通过高效液相色谱法(HPLC)确定，纯化的RNA多核苷酸包含少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％的盐污染物，或基本上不含盐污染物。在一些实施方式中，通过已知方法(如例如，高效液相色谱法(HPLC))确定，纯化的RNA多核苷酸包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的短流产性转录物污染物，或基本上不含短流产性转录物污染物。在一些实施方式中，如通过已知方法(如例如，毛细管电泳)所确定的，纯化的RNA多核苷酸的完整性为95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的LNP完整性为约20％或更高、约25％或更高、约30％或更高、约35％或更高、约40％或更高、约45％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高或约99％或更高。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的LNP完整性高于通过类似方法产生的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的LNP完整性约5％或更高、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约30倍或更多、约40倍或更多、约50倍或更多、约100倍或更多、约200倍或更多、约300倍或更多、约400倍或更多、约500倍或更多、约1000倍或更多、约2000倍或更多、约3000倍或更多、约4000倍或更多、约5000倍或更多、或约10000倍或更多。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的Txo％为约12个月或更长、约15个月或更长、约18个月或更长、约21个月或更长、约24个月或更长、约27个月或更长、约30个月或更长、约33个月或更长、约36个月或更长、约48个月或更长、约60个月或更长、约72个月或更长、约84个月或更长、约96个月或更长、约108个月或更长、约120个月或更长。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的Txo％长于通过类似方法产生的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的Txo％约5％或更高、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的T1/2为约12个月或更长、约15个月或更长、约18个月或更长、约21个月或更长、约24个月或更长、约27个月或更长、约30个月或更长、约33个月或更长、约36个月或更长、约48个月或更长、约60个月或更长、约72个月或更长、约84个月或更长、约96个月或更长、约108个月或更长、约120个月或更长。

在一些实施方式中，本公开的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的T1/2长于通过类似方法产生的LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的T1/2约5％或更高、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多。

如本文所用，“Tx”是指LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸完整性(例如，mRNA完整性)降解至用于制备LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸(例如，mRNA)的初始完整性的约X所持续的时间量。例如，“T8o％”是指LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸完整性(例如，mRNA完整性)降解至用于制备LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸(例如，mRNA)的初始完整性的约80％所持续的时间量。对于另一实例，“T1/2”是指LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸完整性(例如，mRNA完整性)降解至用于制备LNP、LNP悬浮液、冻干LNP组合物或LNP配制剂的核酸(例如，mRNA)的初始完整性的约1/2所持续的时间量。

脂质纳米颗粒可以包括脂质组分和一种或多种额外的组分，如治疗剂和/或预防剂，如核酸。LNP可以被设计成用于一个或多个特定的应用或目标。LNP的要素可以基于特定的应用或目标和/或基于一种或多种要素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特性来选择。相似地，根据例如要素的特定组合的功效和毒性，LNP的特定配制剂可以被选择成用于特定的应用或目标。LNP配制剂的功效和耐受性可能受到配制剂稳定性的影响。

LNP的脂质组分可以包括例如阳离子脂质、磷脂(如不饱和脂质，例如，DOPE或DSPC)、PEG脂质和结构性脂质。脂质组分的要素可以以特定的级分提供。

在一些实施方式中，LNP进一步包含磷脂、PEG脂质、结构性脂质或其任何组合。本文进一步公开了用于本公开的方法的合适的磷脂、PEG脂质和结构性脂质。

在一些实施方式中，LNP的脂质组分包括阳离子脂质、磷脂、PEG脂质和结构性脂质。在某些实施方式中，脂质纳米颗粒的脂质组分包括约30摩尔％至约60摩尔％阳离子脂质、约0摩尔％至约30摩尔％磷脂、约18.5摩尔％至约48.5摩尔％结构性脂质和约0摩尔％至约10摩尔％的PEG脂质，条件是总摩尔％不超过100％。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒的脂质组分包括约35摩尔％至约55摩尔％阳离子脂质化合物、约5摩尔％至约25摩尔％磷脂、约30摩尔％至约40摩尔％结构性脂质和约0摩尔％至约10摩尔％的PEG脂质。在特定的实施方式中，脂质组分包括约50摩尔％所述阳离子脂质、约10摩尔％磷脂、约38.5摩尔％结构性脂质和约1.5摩尔％的PEG脂质。在另一实施方式中，脂质组分包括约40摩尔％所述阳离子脂质、约20摩尔％磷脂、约38.5摩尔％结构性脂质和约1.5摩尔％的PEG脂质。在一些实施方式中，磷脂可以是DOPE或DSPC。在其他实施方式中，PEG脂质可以是PEG-DMG和/或结构性脂质可以是胆固醇。

LNP中治疗剂和/或预防剂的量可以取决于脂质纳米颗粒的尺寸、组成、期望的目标和/或应用或其他性质，而且取决于治疗剂和/或预防剂的性质。例如，可用于LNP的RNA的量可以取决于RNA的尺寸、序列和其他特征。LNP中治疗剂和/或预防剂(即药物物质)和其他要素(例如，脂质)的相对量也可以变化。在一些实施方式中，LNP中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的重量/重量比率可以为从约5:1至约60:1，如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。例如，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的重量/重量比率可以为从约10:1至约40:1。在某些实施方式中，重量/重量比率为约20:1。LNP中治疗剂和/或预防剂的量可以例如使用吸收光谱法(例如，紫外-可见光谱法)来测量。

在一些实施方式中，可电离脂质是式(I)的化合物：

或其N-氧化物或其盐或异构体，其中：

Ri选自C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；R2和R3独立地选自H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或R2和R3与它们所附接的原子一起形成杂环或碳环；R4选自氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-0(CH2)nN(R)2、-C(0)0R、-0C(0)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(0)N(R)2、-N(R)C(0)R、-N(R)S(0)2R、-N(R)C(0)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)Re、N(R)S(0)2R8、-0(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-0C(0)N(R)2J-N(R)C(0)0R、-N(0R)C(0)R、-N(0R)S(0)2R、-N(0R)C(0)0R、-N(0R)C(0)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(0)N(R)0R和-C(R)N(R)2C(0)0R，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；每个R5独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；每个Re独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；M和M'独立地选自-C(0)0-、-OC(O)-、-0C(0)-M”-C(0)0-、-C(0)N(R’)-、-N(R’)C(0)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(0)(0R’)0-、-S(0)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；R7选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；Re选自C3-6碳环和杂环；R9选自H、CN、NO2、Ci-6烷基、-OR、-S(0)2R、-S(0)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；每个R独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基和H；每个R’独立地选自Ci-is烷基、C2-is烯基、-R*YR”、-YR”和H；每个R”独立地选自C3-15烷基和C3-15烯基；每个R*独立地选自Ci-i2烷基和C2-i2烯基；每个Y独立地是C3-6碳环；每个X独立地选自F、Cl、Br和I；并且m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHRR或-CQ(R)2时，则(i)当N是1、2、3、4或5时Q不是-N(R)2，或(ii)当N是1或2时Q不是5、6或7元杂环烷基。在一些实施方式中，可电离脂质是：

在一些实施方式中，化合物具有以下结构(I)：

或其药物上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L1或L2中的一个是—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NRaC(═O)—、—C(═O)NRa—、NRaC(═O)NRa—、—OC(═O)NRa—或—NRaC(═O)O—，并且L1或L2中的另一个是—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NRaC(═O)—、—C(═O)NRa—、NRaC(═O)NRa—、—OC(═O)NRa—或—NRaC(═O)O—或直接键；G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、—C(═O)OR4、—OC(═O)R4或—NR5C(═O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x是0、1或2。在优选的实施方式中，可电离脂质是：

星号(*)指示手性中心。

脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，如PEG脂质或PEG修饰的脂质。此类物种可以被替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可以选自非限制性组，其包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。在一些实施方式中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。如本文所用，术语“PEG脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerCl4或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的l,2-二酰基氧基丙烷-3-胺。此类脂质也被称为PEG化脂质。在一些实施方式中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。在一些实施方式中，PEG修饰的脂质是PEG DMG的修饰形式。在一些实施方式中，PEG修饰的脂质是具有式(IV)的PEG脂质：

其中R8和R9各自独立地是含有从10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链，其中该烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w的平均值在从30至60的范围内。

RNA(例如，mRNA)疫苗可以在各种环境中使用，这取决于感染的流行率或未满足的医疗需求的程度或水平。RNA疫苗可以用于治疗和/或预防各种基因型、毒株和分离株的流感病毒。RNA疫苗通常具有优越的性质，因为它们产生更大的抗体滴度，并且比可商购获得的抗病毒治疗性治疗更早产生应答。虽然不希望受理论束缚，但据信，由于mRNA多核苷酸，RNA疫苗被更好地设计为在翻译时产生适当的蛋白质构象，因为RNA疫苗利用了天然细胞机制。与离体制造的并可能会触发不希望的细胞应答的传统疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更原生的方式呈现给细胞系统。

在某些情况下，人们可能面临感染超过一种流感病毒毒株的风险。RNA(例如，mRNA)治疗性疫苗因为许多因素而特别适于组合疫苗接种方案，这些因素包括但不限于制造速度、快速定制疫苗以适应感知到的地理威胁的能力等。此外，由于该疫苗利用人体产生抗原性蛋白，因此该疫苗适于产生更大、更复杂的抗原性蛋白，从而允许在人对象中进行适当的折叠、表面表达、抗原呈递等。为了预防超过一种流感毒株，可以施用组合疫苗，该组合疫苗包括编码第一流感病毒或生物体的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA(例如，mRNA)，并且进一步包括编码第二流感病毒或生物体的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA。RNA(例如，mRNA)可以例如被共同配制在单一脂质纳米颗粒(LNP)中，或可以被配制在单独的LNP中，以用于共同施用。

本公开的一些实施方式提供了流感病毒(流感)疫苗(或组合物或免疫原性组合物)，其包括至少一种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种流感抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导对流感的免疫应答的免疫原性片段)。

在一些实施方式中，至少一种抗原性多肽是HA的定义的抗原性亚结构域(被称为HA1、HA2)中的一种或HA1和HA2的组合，以及选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)的至少一种抗原性多肽。

在一些实施方式中，至少一种抗原性多肽是HA或其衍生物，其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列以及至少一种选自NA、NP、M1、M2、NS1和NS2的抗原性多肽。

在一些实施方式中，至少一种抗原性多肽是HA或其衍生物，其包含来自HA1和/或HA2的抗原性序列以及至少两种选自NA、NP、M1、M2、NS1和NS2的抗原性多肽。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码流感病毒蛋白或其免疫原性片段。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码多种流感病毒蛋白或其免疫原性片段。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，至少一种HA1、HA2或二者的组合)。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，至少一种HA1、HA2或二者的组合，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种或任何一种或所有的组合)，以及至少一种具有开放阅读框的其他RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码选自从流感病毒获得的NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的蛋白质。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种中的至少一种或任何一种或所有的组合)，以及至少两种具有两种开放阅读框的其他RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该两种开放阅读框编码选自从流感病毒获得的NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的两种蛋白质。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种中的至少一种或任何一种或所有的组合)，以及至少三种具有三种开放阅读框的其他RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该三种开放阅读框编码选自从流感病毒获得的NP蛋白、NA蛋白、M蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的三种蛋白质。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种中的至少一种或任何一种或所有的组合)，以及至少四种具有四种开放阅读框的其他RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该四种开放阅读框编码选自从流感病毒获得的NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的四种蛋白质。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种中的至少一种或任何一种或所有的组合)，以及至少五种具有五种开放阅读框的其他RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该五种开放阅读框编码选自从流感病毒获得的NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白和NS2蛋白的五种蛋白质。

在一些实施方式中，疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码HA蛋白或其免疫原性片段(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和/或H18中的任何一种中的至少一种或任何一种或所有的组合)、从流感病毒获得的NP蛋白或其免疫原性片段、NA蛋白或其免疫原性片段、M1蛋白或其免疫原性片段、M2蛋白或其免疫原性片段、NS1蛋白或其免疫原性片段和NS2蛋白或其免疫原性片段。

本公开的一些实施方式提供了以下新型流感病毒多肽序列：H1HA10-Foldon_ΔNgly1；H1HA10TM-PR8(H1 A/Puerto Rico/8/34HA)；H1HA10-PR8-DS(H1 A/Puerto Rico/8/34HA；pH1HA10-Cal04-DS(H1A/California/04/2009HA)；来自California 04的大流行病H1HA10；pH1HA10-铁蛋白；HA10；来自California 04的大流行病H1HA10；来自California04毒株的大流行病H1HA10/没有foldon并具有用于三聚的K68C/R76C突变；来自A/PuertoRico/8/34毒株的H1HA10，没有foldon并具有用于三聚的Y94D/N95L突变；来自A/PuertoRico/8/34毒株的H1HA10，没有foldon并具有用于三聚的K68C/R76C突变；H1N1 A/VietNam/850/2009；H3N2 A/Wisconsin/67/2005；H7N9(A/Anhui/1/2013)；H9N2 A/Hong Kong/1073/99；H10N8 A/JX346/2013。

本公开的一些实施方式提供了流感病毒(流感)疫苗，其包括至少一种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该开放阅读框编码上文描述的新型流感病毒多肽序列中的至少一种流感抗原性多肽或免疫原性片段(例如，能够诱导对流感的免疫应答的免疫原性片段)。在一些实施例中，流感疫苗包含至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种流感抗原性多肽，该至少一种流感抗原性多肽包含与上文描述的新型流感病毒序列的氨基酸序列具有至少75％(例如，在75％和100％之间的任何数，包括端点值，例如，70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)同一性的修饰的序列。该修饰的序列可以与上文描述的新型流感病毒序列的氨基酸序列至少75％(例如，在75％和100％之间的任何数，包括端点值，例如，70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)相同。

本公开的一些实施方式提供了一种包含编码上文描述的新型流感病毒多肽序列的序列的分离的核酸；一种包含该核酸的表达载体；以及一种包含该核酸的宿主细胞。本公开还提供了一种产生上文描述的新型流感病毒序列中的任何一种的多肽的方法。方法可以包括在允许上文描述的新型流感病毒序列的核酸表达的条件下在培养基中培养宿主细胞，以及从培养的细胞或细胞的培养基中纯化新型流感病毒多肽。本公开还提供了针对新型流感病毒序列的抗体分子，其包括全长抗体和抗体衍生物。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗的开放阅读框是密码子优化的。在一些实施方式中，编码流感多肽或其片段的开放阅读框是密码子优化的。一些实施方式提供了流感疫苗的用途，该流感疫苗包括至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种流感抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该开放阅读框中至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％、100％)的尿嘧啶具有化学修饰，任选地其中该疫苗被配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰在尿嘧啶的5-位置中。在一些优选的实施方式中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗进一步包含佐剂。

在一些实施方式中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种附接于细胞受体的流感抗原性多肽。

在一些实施方式中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种导致病毒膜和细胞膜的融合的流感抗原性多肽。

在一些实施方式中，至少一种RNA多核苷酸编码至少一种负责病毒与被感染的细胞的结合的流感抗原性多肽。

本公开的一些实施方式提供了一种疫苗，其包括至少一种核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5’末端帽和至少一种化学修饰，被配制在脂质纳米颗粒内。

在一些实施方式中，5’末端帽是7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。在一些优选的实施方式中，5’帽包含：

在一些实施方式中，至少一种化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷，2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。在一些实施方式中，化学修饰在尿嘧啶的5-位置中。在一些实施方式中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，化学修饰是N1-乙基假尿苷。

在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和非阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质是可电离阳离子脂质并且非阳离子脂质是中性脂质，并且甾醇是胆固醇。在一些实施方式中，阳离子脂质选自2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油烯基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-(4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、(12Z,15Z)—N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)和N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺(L530)。

本公开的一些实施方式提供了一种疫苗，其包括至少一种具有开放阅读框的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种流感抗原性多肽，其中该开放阅读框中至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)的尿嘧啶具有化学修饰，任选地其中该疫苗被配制在脂质纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和非阳离子脂质)中。

在一些实施方式中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰在尿嘧啶的5-位置中。在一些实施方式中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，开放阅读框中100％的尿嘧啶在尿嘧啶的5-位置中具有N1-甲基假尿苷。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸的开放阅读框编码至少一种流感抗原性多肽。在一些实施方式中，开放阅读框编码至少两种、至少五种或至少十种抗原性多肽。在一些实施方式中，开放阅读框编码至少100种抗原性多肽。在一些实施方式中，开放阅读框编码1-100种抗原性多肽。

在一些实施方式中，疫苗包含至少两种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，每种多核苷酸都具有编码至少一种流感抗原性多肽的开放阅读框。在一些实施方式中，疫苗包含至少五种或至少十种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，每种多核苷酸都具有编码至少一种流感抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框。在一些实施方式中，疫苗包含至少100种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，每种多核苷酸都具有编码至少一种抗原性多肽的开放阅读框。在一些实施方式中，疫苗包含2-100种RNA(例如，mRNA)多核苷酸，每种多核苷酸都具有编码至少一种抗原性多肽的开放阅读框。

本文还提供了前述段落中任一段落的被配制在纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的流感RNA(例如，mRNA)疫苗。

在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径为50-200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和非阳离子脂质。脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20-60％的阳离子脂质、0.5-15％的PEG修饰的脂质、25-55％的甾醇和25％的非阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质是可电离阳离子脂质并且非阳离子脂质是中性脂质，并且甾醇是胆固醇。

在一些实施方式中，纳米颗粒的多分散性值小于0.4(例如，小于0.3、0.2或0.1)。

在一些实施方式中，纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗是多价的。

本公开的一些实施方式提供了在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，该方法包含将如本文所提供的RNA(例如，mRNA)疫苗中的任何一种以能有效地产生抗原特异性免疫应答的量施用于对象。在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗是流感疫苗。在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗是包含流感疫苗的组合的组合疫苗(广谱流感疫苗)。

在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含T细胞应答或B细胞应答。

在一些实施方式中，产生抗原特异性免疫应答的方法包含将本公开的流感RNA(例如，mRNA)疫苗的单一剂量(无加强剂量)施用于对象。

在一些实施方式中，方法进一步包含向将本公开的流感RNA(例如，mRNA)疫苗的第二(加强)剂量施用于对象。可以施用流感RNA(例如，mRNA)疫苗的额外剂量。

在一些实施方式中，对象在疫苗的第一剂量或第二(加强)剂量之后表现出至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)的血清转换率。血清转换是指特异性抗体在血液中产生并变得可检测到的时间段。在血清转换发生之后，可以在用于抗体的血液测试中检测到病毒。在感染或免疫接种期间，抗原进入血液，并且免疫系统开始产生抗体作为应答。在血清转换之前，抗原本身可能是或可能不是可检测到的，但抗体被认为是不存在的。在血清转换期间，抗体是存在的，但尚未是可检测到的。在血清转换之后的任何时间，都可以在血液中检测到抗体，这指示先前或当前的感染。

在一些实施方式中，通过皮内注射、肌内注射或通过鼻内施用将流感RNA(例如，mRNA)疫苗施用于对象。在一些实施方式中，通过肌内注射将流感RNA(例如，mRNA)疫苗施用于对象。

本公开的一些实施方式提供了在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，该方法包括将流感RNA(例如，mRNA)疫苗以有效量施用于对象以在对象中产生抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，可以通过在将本公开的流感RNA(例如，mRNA)疫苗中的任何一种施用于对象之后对抗体滴度(对与流感抗原性多肽结合的抗体的滴度)进行测定来确定对象中的抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加了至少1log。在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加了1-3log。

在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加至少2倍。在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加至少5倍。在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加至少10倍。在一些实施方式中，在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相对于对照增加2-10倍。

在一些实施方式中，对照是在未被施用本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗的对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。在一些实施方式中，对照是在已被施用活减毒或灭活流感的对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度，或其中对照是在已被施用重组或纯化流感蛋白质疫苗的对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。在一些实施方式中，对照是在已被施用流感病毒样颗粒疫苗的对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。

将本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗以有效量(能有效地诱导免疫应答的量)施用于对象。在一些实施方式中，有效量为相当于重组流感蛋白质疫苗的关怀标准剂量减少至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍的剂量，其中在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相当于在被施用重组流感蛋白质疫苗、纯化流感蛋白质疫苗，活减毒流感疫苗、灭活流感疫苗或流感VLP疫苗的关怀标准剂量的对照对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。在一些实施方式中，有效量为相当于重组流感蛋白质疫苗的关怀标准剂量减少2-1000倍的剂量，其中在对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度相当于在被施用重组流感蛋白质疫苗、纯化流感蛋白质疫苗，活减毒流感疫苗、灭活流感疫苗或流感VLP疫苗的关怀标准剂量的对照对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。

在一些实施方式中，对照是在已被施用包含流感的结构性蛋白的病毒样颗粒(VLP)疫苗的对象中产生的抗抗原性多肽抗体滴度。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗以有效量配制以在对象中产生抗原特异性免疫应答。

在一些实施方式中，有效量为25μg至1000μg或50μg至1000μg的总剂量。在一些实施方式中，有效量为100μg的总剂量。在一些实施方式中，有效量为施用于对象的25μg的剂量，总共两次。在一些实施方式中，有效量为施用于对象的100μg的剂量，总共两次。在一些实施方式中，有效量为施用于对象的400μg的剂量，总共两次。在一些实施方式中，有效量为施用于对象的500μg的剂量，总共两次。

在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗的功效(或有效性)大于60％。在一些实施方式中，疫苗的RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码至少一种流感抗原性多肽。

疫苗功效可以使用标准分析来评估。例如，疫苗功效可以通过双盲、随机、临床对照试验来测量。疫苗功效可以表示为未接种疫苗(ARU)研究队列和接种疫苗(ARV)研究队列之间疾病攻击率(AR)的成比例降低，并且可以使用以下公式根据接种疫苗组中疾病的相对风险(RR)来计算：

功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；以及功效＝(1-RR)×100。

同样地，疫苗有效性可以使用标准分析来评估。疫苗有效性是对疫苗(其可能已被证明具有高疫苗功效)如何减少群体疾病的评估。这种测量可以在自然现场条件下而不是在对照临床试验中评估疫苗接种程序的益处和负面影响的净平衡，而不仅仅是评估疫苗本身。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成比例，但也受到群体中目标组的免疫情况的影响，而且受到影响住院治疗、门诊或费用的“现实世界”结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可以使用回顾性病例对照分析，其中比较一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可以表示为比率差异，使用尽管进行了疫苗接种但仍发生感染的比值比(OR)：有效性＝(1-OR)×100。在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗的功效(或有效性)为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。

在一些实施方式中，疫苗使对象对流感免疫长达2年。在一些实施方式中，疫苗使对象对流感免疫超过2年、超过3年、超过4年或5-10年。

在一些实施方式中，对象约5岁或更小。例如，对象的年龄可以在约1岁和约5岁之间(例如，约1、2、3、5或5岁)，或在约6个月和约1岁之间(例如如，约6、7、8、9、10、11或12个月)。在一些实施方式中，对象约12个月或更小(例如，12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个月或1个月)。在一些实施方式中，对象约6个月或更小。

在一些实施方式中，对象足月出生(例如，约37-42周)。在一些实施方式中，对象例如在妊娠约36周或更早(例如，约36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25周)时早产出生。例如，对象可能在妊娠约32周或更早时出生。在一些实施方式中，对象在妊娠约32周和约36周之间早产出生。在此类对象中，RNA(例如，mRNA)疫苗可以在以后的生活中施用，例如，在约6个月至约5岁或更大年龄时施用。

在一些实施方式中，对象是年龄在约20岁和约50岁之间(例如，约20、25、30、35、40、45或50岁)的年轻成年人。

在一些实施方式中，对象是约60岁、约70岁或更大年龄(例如，约60、65、70、75、80、85或90岁)的老年人对象。

在一些实施方式中，对象已经暴露于流感(例如，沙眼衣原体)；对象感染了流感(例如，沙眼衣原体)；或对象面临感染流感(例如，沙眼衣原体)的风险。

在一些实施方式中，对象已经暴露于β冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)；对象感染了β冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)；或对象面临感染β冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)的风险。

在一些实施方式中，面临伴随地、同时地或在本文公开的任何一种针对流感的免疫原性组合物的12-48小时内感染β-冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的风险，对象已经接受了至少一个剂量的针对β冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的免疫原性组合物，其例如选自Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273COVID-19疫苗和Janssen COVID-19疫苗中的任何一种；对象已经接受了至少两个剂量的针对β冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的免疫原性组合物；对象正在接受至少一个剂量的针对β冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的免疫原性组合物，其例如选自/>Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273COVID-19疫苗和Janssen COVID-19疫苗中的任何一种；或对象正在被施用针对β冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的免疫原性组合物，其例如选自Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273COVID-19疫苗和Janssen COVID-19疫苗中的任何一种。

在一些实施方式中，对象免疫功能低下(具有受损的免疫系统，例如，患有免疫紊乱或自身免疫性紊乱)。

在一些实施方式中，本文描述的核酸疫苗是化学修饰的。在其他实施方式中，核酸疫苗是未修饰的。

又其他方面提供了用于给对象接种疫苗的组合物和方法，其包含将核酸疫苗施用于对象，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸不包括稳定要素，并且其中佐剂不与疫苗共同配制或共同施用。

在其他方面，本发明是一种用于给对象接种疫苗的组合物或方法，其包含将核酸疫苗施用于对象，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中将用量在10μg/kg至400μg/kg之间的核酸疫苗施用于对象。在一些实施方式中，RNA多核苷酸的用量为1-5μg、5-10μg、10-15μg、15-20μg、10-25μg、20-25μg、20-50μg、30-50μg、40-50μg、40-60μg、60-80μg、60-100μg、50-100μg、80-120μg、40-120μg、40-150μg、50-150μg、50-200μg、80-200μg、100-200μg、120-250μg、150-250μg、180-280μg、200-300μg、50-300μg、80-300μg、100-300μg、40-300μg、50-350μg、100-350μg、200-350μg、300-350μg、320-400μg、40-380μg、40-100μg、100-400μg、200-400μg或300-400μg/剂量。在一些实施方式中，通过皮内或肌内注射将核酸疫苗施用于对象。在一些实施方式中，在第零天将核酸疫苗施用于对象。在一些实施方式中，在第二十一天将核酸疫苗的第二剂量施用于对象。

在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为25微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为100微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为50微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为75微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为150微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为400微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，在施用于对象的核酸疫苗中包括用量为200微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，与远端淋巴结相比，RNA多核苷酸以高100倍的水平累积在局部淋巴结中。在其他实施方式中核酸疫苗是化学修饰的，并且在其他实施方式中核酸疫苗不是化学修饰的。

本公开的各方面提供了一种核酸疫苗，其包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸不包括稳定要素，以及药物上可接受的载体或赋形剂，其中在该疫苗中不包括佐剂。在一些实施方式中，稳定要素是组蛋白茎环。在一些实施方式中，稳定要素是相对于野生型序列具有增加的GC含量的核酸序列。

本公开的各方面提供了核酸疫苗，其包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸存在于用于体内施用于宿主的配制剂中，这为可接受百分比的人对象赋予优于用于第一抗原的血清保护标准的抗体滴度。在一些实施方式中，由本公开的mRNA疫苗产生的抗体滴度是中和性抗体滴度。在一些实施方式中，中和性抗体滴度大于蛋白质疫苗。在其他实施方式中，由本公开的mRNA疫苗产生的中和性抗体滴度大于添加佐剂的蛋白质疫苗。在又其他实施方式中，由本公开的mRNA疫苗产生的中和性抗体滴度为1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和性滴度通常表示为实现斑块数量减少50％所需的最高血清稀释度。

还提供了核酸疫苗，其包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸存在于用于体内施用于宿主的配制剂中，以用于引发比由具有稳定要素或与佐剂一起配制并编码第一抗原性多肽的mRNA疫苗引发的抗体滴度更持久的高抗体滴度。在一些实施方式中，RNA多核苷酸被配制为在单一施用的一周内产生中和性抗体。在一些实施方式中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激性核酸。在一些实施方式中，阳离子肽是鱼精蛋白。

各方面提供了核酸疫苗，其包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地不含修饰的核苷酸，该开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中该RNA多核苷酸存在于用于体内施用于宿主的配制剂中，使得宿主中的抗原表达水平显著地超过由具有稳定要素或与佐剂一起配制并编码第一抗原性多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达水平。

其他方面提供了核酸疫苗，其包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地不含修饰的核苷酸，该开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中该疫苗具有的RNA多核苷酸比未修饰的mRNA疫苗产生等效抗体滴度所需的少至少10倍。在一些实施方式中，RNA多核苷酸以25-100微克的用量存在。

本公开的各方面还提供了一种使用单位疫苗，其包含10μg和400μg之间的一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地不含修饰的核苷酸，该开放阅读框编码第一抗原性多肽，以及药物上可接受的载体或赋形剂，被配制成用于递送到人对象中。在一些实施方式中，疫苗进一步包含阳离子脂质纳米颗粒。

本公开的各方面提供了在个体或个体的群体中创建、维持或恢复对病毒毒株的抗原性记忆的方法，该方法包含将包含以下各项的抗原性记忆加强核酸疫苗施用于所述个体或群体：(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地不含修饰的核苷酸并且包含两种或更多种密码子优化的开放阅读框，所述开放阅读框编码一组参考抗原性多肽，以及(b)任选的药物上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，通过选自肌内施用、皮内施用和皮下施用的途径将疫苗施用于个体。在一些实施方式中，施用步骤包含使对象的肌肉组织与适合于注射组合物的装置接触。在一些实施方式中，施用步骤包含使对象的肌肉组织与适合于与电穿孔组合注射组合物的装置接触。

在一些方面，提供了在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法。该方法包括将流感RNA组合物以能有效地产生抗原特异性免疫应答的量施用于对象。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含T细胞应答或B细胞应答。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包含T细胞应答和B细胞应答。在一些实施方式中，产生抗原特异性免疫应答的方法涉及疫苗的单一施用。在一些实施方式中，方法进一步包括将疫苗的加强剂量施用于对象。在一些实施方式中，通过皮内或肌内注射将疫苗施用于对象。

本公开的各方面提供了给对象接种疫苗的方法，该方法包含将单一用量在25μg/kg和400μg/kg之间的核酸疫苗以有效量施用于对象以给对象接种疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。

其他方面提供了核酸疫苗，其包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该多核苷酸包含至少一种化学修饰，该开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中该疫苗具有的RNA多核苷酸比未修饰的mRNA疫苗产生等效抗体滴度所需的少至少10倍。在一些实施方式中，RNA多核苷酸以25-100微克的用量存在。

其他方面提供了核酸疫苗，其包含LNP配制的具有开放阅读框的RNA多核苷酸，该多核苷酸不包含核苷酸修饰(未修饰的)，该开放阅读框编码第一抗原性多肽，其中该疫苗具有的RNA多核苷酸比未被配制在LNP中的未修饰的mRNA疫苗产生等效抗体滴度所需的少至少10倍。在一些实施方式中，RNA多核苷酸以25-100微克的用量存在。

实施例中呈现的数据证实，使用本公开的配制剂显著增强了免疫应答。根据本发明，化学修饰的和未修饰的RNA疫苗都是有用的。令人惊讶地，与优选地使用被配制在载体中的化学未修饰的mRNA来产生疫苗的现有技术报道相比，本文描述的化学修饰的mRNA-LNP疫苗所需要的有效mRNA剂量比未修饰的mRNA要低得多，即，比被配制在除LNP之外的载体时的未修饰的mRNA低十倍。本公开的化学修饰的和未修饰的RNA疫苗都比被配制在不同的脂质载体中的mRNA疫苗产生更好的免疫应答。

在其他方面，本发明涵盖一种治疗60岁或更大年龄的老年对象的方法，该方法包含将核酸疫苗以有效量施用于对象以给对象接种疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。

在其他方面，本发明涵盖一种治疗17岁或更小年龄的年轻人对象的方法，该方法包含将核酸疫苗以有效量施用于对象以给对象接种疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。

在其他方面，本发明涵盖一种治疗成年人对象的方法，该方法包含将核酸疫苗以有效量施用于对象以给对象接种疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码病毒抗原性多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。

在一些方面，本发明是一种用包括至少两种编码抗原的核酸序列的组合疫苗给对象接种疫苗的方法，其中该疫苗的用量是组合治疗用量，其中编码抗原的每种单独的核酸的用量是亚治疗用量。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中25微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中100微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中50微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中75微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中150微克的RNA多核苷酸。在一些实施方式中，组合用量是施用于对象的核酸疫苗中400微克的RNA多核苷酸。

在优选的方面，本公开的疫苗(例如，LNP包封的mRNA疫苗)在接种疫苗的对象的血液或血清中产生预防上和/或治疗上有效水平、浓度和/或滴度的抗原特异性抗体。如本文所定义，术语抗体滴度是指在对象(例如，人对象)中产生的抗原特异性抗体的量。在示例性实施方式中，抗体滴度表示为仍然给出阳性结果的最大稀释度(在连续稀释中)的倒数。在示例性实施方式中，抗体滴度通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定或测量。在示例性实施方式中，抗体滴度通过中和测定(例如，通过微量中和测定)来确定或测量。在某些方面，抗体滴度测量表示为比率，如1:40、1:100等。

在本公开的示例性实施方式中，有效的疫苗产生大于1:40、大于1:100、大于1:400、大于1:1000、大于1:2000、大于1:3000、大于1:4000、大于1:500、大于1:6000、大于1:7500、大于1:10000的抗体滴度。在示例性实施方式中，在疫苗接种之后10天、在疫苗接种之后20天、在疫苗接种之后30天、在疫苗接种之后40天或在疫苗接种之后50天或更多天产生或达到该抗体滴度。在示例性实施方式中，在将疫苗的单一剂量施用于对象之后产生或达到该滴度。在其他实施方式中，在多个剂量之后(例如，在第一和第二剂量(例如，加强剂量)之后)产生或达到该滴度。在本公开的示例性方面，抗原特异性抗体以μg/ml为单位测量，或以IU/L(国际单位/升)或mIU/ml(毫国际单位/ml)为单位测量。在本公开的示例性实施方式中，有效的疫苗产生>0.5μg/ml、>0.1μg/ml、>0.2μg/ml、>0.35μg/ml、>0.5μg/ml、>1μg/ml、>2μg/ml、>5μg/ml或>10μg/ml。在本公开的示例性实施方式中，有效的疫苗产生>10mIU/ml、>20mIU/ml、>50mIU/ml、>100mIU/ml、>200mIU/ml、>500mIU/ml或>1000mIU/ml。在示例性实施方式中，在疫苗接种之后10天、在疫苗接种之后20天、在疫苗接种之后30天、在疫苗接种之后40天或在疫苗接种之后50天或更多天产生或达到抗体水平或浓度。在示例性实施方式中，在将疫苗的单一剂量施用于对象之后产生或达到该水平或浓度。在其他实施方式中，在多个剂量之后(例如，在第一和第二剂量(例如，加强剂量)之后)产生或达到该水平或浓度。在示例性实施方式中，抗体水平或浓度通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定或测量。在示例性实施方式中，抗体水平或浓度通过中和测定(例如，通过微量中和测定)来确定或测量。

实施例

实施例1：药物产品组合物

药物产品组合物是针对Wisconsin 2021/2022血凝素的流感modRNA药物物质。

表1流感疫苗药物产品的即用型(RTU)展示的配制组成

在一些实施方式中，包含一种脂质纳米粒子包封的编码HA的mRNA分子的免疫原性组合物是单价的，并且具有选自1μg mRNA、2μg RNA、5μg RNA和20μg RNA中的任何一种的剂量。

在一些实施方式中，免疫原性组合物包含一种脂质纳米颗粒包封的编码HA的mRNA分子、第二脂质纳米颗粒包封的编码HA的mRNA分子、第三脂质纳米颗粒包封的编码NA的mRNA分子和第四脂质纳米颗粒包封的编码NA的mRNA分子，其中总剂量高达20μg RNA。

在一些实施方式中，对象的年龄为30-50岁。

实施例2：运输和容器封闭件信息

药物产品在干冰上冷冻运输。主要的容器封闭件是具有13mm塞的2mL 1型玻璃小瓶。药物产品应储存在-60至-90℃下。

实施例3：剂型

PF-07252220流感modRNA免疫原性组合物候选者包括3种不同剂型中的一种，这些不同剂型选自2种单价形式和一种四价形式，每种形式都并入有不同的mRNA构建体。

modRNA的四种构建体：

·Wisconsin modRNA(Wisc2019 HA)

·Phuket modRNA(Phuk2013 HA)

·Washington modRNA(Wash2019 HA)

·Cambodia modRNA(Camb2020 HA)

因此，有2种单价免疫原性组合物(在本文中也被称为药物产品(DP))和一种四价免疫原性组合物。

1.包括Wisconsin modRNA的单价免疫原性组合物

2.包括Phuket modRNA的单价免疫原性组合物

3.包括Wisconsin modRNA、Phuket modRNA、Washington modRNA和CambodiamodRNA的四价免疫原性组合物

将免疫原性组合物供应在用氯丁基橡胶塞子和具有可翻转塑料帽的铝密封件密封的2mL玻璃小瓶中(0.3mL的标称体积)。

4.2.免疫原性组合物的组分

免疫原性组合物包括编码毒株特异性全长、密码子优化的HA包膜糖蛋白的modRNA，该糖蛋白负责病毒与目标细胞的结合并介导细胞进入。

免疫原性组合物是LNP在用于IM施用的水性低温保护剂缓冲液中的无菌分散液，不含防腐剂。将免疫原性组合物在10mM Tris缓冲液、300mM蔗糖、pH 7.4中以0.1mg/mL RNA配制为具有0.5mL/小瓶填充体积和0.3mL标称体积的单一剂量小瓶。

4.2.1.药物物质

药物物质(modRNA)中的特异性构建体(即，Wisconsin modRNA[Wisc2019 HA]和Phuket modRNA[Phuk2013 HA])或构建体(四价：Wisconsin modRNA、Phuket modRNA、Washington modRNA和Cambodia modRNA)是DP中唯一的活性成分。将药物物质配制在pH7.0的10mM HEPES缓冲液、0.1mM EDTA中，并且储存在20±5℃下的HDPE瓶EVA柔性容器中。

除编码抗原的密码子优化序列之外，RNA还含有被优化成用于介导高RNA稳定性和翻译效率的常见结构性要素(5'-帽、5'UTR、3'-UTR、聚(A)-尾；参见下文的表和序列)。此外，固有信号肽(sec)是开放阅读框的一部分，并且被翻译为N-末端肽。RNA不含有任何尿苷；在RNA合成中使用修饰的N1-甲基假尿苷代替尿苷。

特异性构建体各自包含以下要素：

下文示出了用于产生含有帽1结构的RNA的5’-帽类似物(m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG)

通过在体外转录期间使用相应的帽类似物将帽1结构(即，在RNA链5’端的倒数第二个核苷上含有2’-O-甲基基团)并入到药物物质中。对于具有修饰的尿苷核苷酸的RNA，帽1结构优于其他帽结构，因为帽1不被细胞因子(如IFIT1)识别，并且因此，帽1依赖性翻译不被与真核翻译起始因子4E的竞争抑制。在IFIT1表达的背景下，具有帽1结构的mRNA给出更高的蛋白质表达水平。

表2元件表

序列

Ψ＝1-甲基-3'-假尿苷

制造过程包含通过体外转录(IVT)步骤进行的RNA合成、随后进行的DNase I和蛋白酶K消化步骤、通过超滤/透析过滤(UFDF)进行的纯化，以及最终进行的过滤和分配。在四种modRNA药物物质的生产中使用了用于IVT、消化和纯化过程步骤的平台方案。

以37.6L规模的IVT起始体积制备mRNA药物物质临床批次。DNase I消化步骤的主要目的是减少线性DNA模板的尺寸，以使得能够随后在超滤/透析过滤步骤期间去除。在最终的IVT孵育结束时添加DNase I溶液。在这一步骤期间维持来自IVT步骤的温度和搅动速率。蛋白酶K消化步骤的主要目的是减少反应混合物中蛋白质的尺寸，以便随后在超滤/透析过滤步骤期间去除。将蛋白酶K溶液添加到反应容器中并孵育预定量的时间。在这一步骤期间维持在IVT和DNase消化步骤期间实施的温度和搅动速率。所有材料通过单一2阶段超滤(UF)和透析过滤(DF)(UFDF)来纯化，以产生RNA药物物质。UFDF步骤去除小的与过程相关的杂质和浓缩物，并且缓冲液将RNA交换到最终的DS配制剂中。

基于在透析过滤2之后确定的滞留物RNA浓度，如果需要的话，然后将透析过滤的滞留物浓缩，并且通过双层过滤器回收到柔性容器中。随后将UFDF系统漂洗，并且通过相同的双层过滤器添加到滞留物池中。可以添加配制剂缓冲液。然后通过第二双层过滤器将最终的池过滤到HDPE瓶中。

表3流感modRNA疫苗Wisconsin药物物质的批次结果

规格仅适用于临床供应

缩写：NTU＝比浊法浊度单位；NT＝未测试；ddPCR＝数字液滴聚合酶链式反应；RP-HPLC＝反相高效液相色谱法；qPCR＝定量聚合酶链式反应；LAL＝鲎变形细胞溶解物；EU＝内毒素单位；CFU＝集落形成单位

表4

表4Wisconsin临床药物产品的批次分析

规格仅适用于临床供应

表5

流感modRNA疫苗Phuket药物物质的批次结果

/>

规格仅适用于临床供应

表6 Phuket临床药物产品的批次分析

表6Phuket临床药物产品的批次分析

表7

流感modRNA疫苗Cambodia药物物质的批次结果

规格仅适用于临床供应

表8

流感modRNA疫苗Washington药物物质的批次结果

规格仅适用于临床供应

用于脂质纳米颗粒的形成和稳定的过程参数总结在表10中。

表10.用于LNP的形成和稳定的过程参数

过程参数可接受范围

水相温度15-25℃

有机相温度15-25℃

用于水相制备的柠檬酸盐缓冲液与稀释的药物物质的流动速率比率4:1^a

用于稳定的LNP悬浮液与柠檬酸盐缓冲液的流动速率比率2:1^a

LNP收集容器温度2-25℃

^aLNP形成期间的目标设置点。比率可以根据输入流动速率来计算。

脂质纳米颗粒(LNP)形成和稳定

为了形成LNP，将柠檬酸盐缓冲液与稀释的药物物质以4:1的流动速率比率在线组合以创建水相。将有机相和水相进料到一个或多个T型混合器中以形成LNP。LNP悬浮液形成后，通过用柠檬酸盐缓冲液以LNP悬浮液与柠檬酸盐缓冲剂的2:1比率进行在线稀释来稳定LNP，然后将其收集在温度维持在2-25℃的容器中。

缓冲液交换和浓缩

为了准备缓冲液交换和浓缩操作，将切向流动过滤(TFF)膜用Tris缓冲液冲洗以进行平衡。

通过切向流动过滤(TFF)单元操作来处理LNP并将其浓缩，然后用2个双体积tris缓冲液进行缓冲液交换，以从悬浮液中去除乙醇。然后进一步浓缩LNP，并且用≥8个额外的双体积Tris缓冲液进行缓冲液交换。

表9药物产品制造期间的过程中控制

4.2.2.赋形剂

存在于LNP药物产品中的赋形剂氨丁三醇(Tris碱)和Tris盐酸盐(HCl)是用于药物的缓冲液组分，并且适合于实现期望的产品pH。蔗糖也包括在内，之所以被选择，是因为它具有稳定作用，以使得能够在使用点分发和冷藏之前作为冷冻组合物储存。免疫原性组合物中的4种脂质赋形剂是用作modRNA平台的一部分的功能性脂质和结构性脂质。

4.3.用量和施用

在单价组合物的施用或二价组合物的组合之前，根据需要用生理盐水稀释免疫原性组合物，或通过小瓶中稀释或通过注射器到注射器混合将其稀释。

对于单价给药，免疫原性组合物的给药范围为3.75至30μg/剂量，注射体积为0.3mL。除30μg的剂量之外，用0.9％无菌氯化钠(生理盐水)稀释是给药所需要的。4种剂量水平为：

·3.75μg mRNA

·7.5μg mRNA

·15μg mRNA

·30μg mRNA

Wisconsin免疫原性组合物也作为二价疫苗与Phuket免疫原性组合物组合以0.3mL的总递送体积给药。二价免疫原性组合物中Wisconsin(W)免疫原性组合物与Phuket(P)免疫原性组合物的拟议给药范围(总RNA)和比率为：

·15μg(7.5μg A+7.5μg B)，1W:1P

·30μg(15μg A+15μg B)，1W:1P

·22.5μg(7.5μg A+15μg B)，1W:2P

·18.75μg(3.75μg A+15μg B)，1W:4P

对于四价给药，免疫原性组合物用0.3mL的注射体积给药，该注射体积含有4种modRNA序列中的每一种，总剂量高达30μg。四价免疫原性组合物容器封闭件系统的施用不需要稀释。

I型硼硅酸盐玻璃小瓶符合对I型玻璃容器耐水解性的USP<660>、Ph.Eur.3.2.1和JP 7.01药典要求。氯化丁基橡胶弹性塞子符合对弹性封闭件的USP＜381＞、Ph.Eur.3.2.9和JP 7.03药典化学测试要求。

4.4.药物产品的储存、运输、标签和包装

将免疫原性组合物冷冻并储存在超低温(ULT)(-90℃至60℃)下以进行长期储存。

流感modRNA免疫原性组合物由一种或多种核苷修饰的mRNA构成，该mRNA编码来源于季节性人流感毒株的全长HA糖蛋白。将modRNA与2种功能性脂质和2种结构性脂质一起配制，这些脂质保护modRNA免遭降解，并且使得能够在IM注射之后将modRNA转染到宿主细胞中。流感HA是A型和B型流感病毒粒子表面上最丰富的包膜糖蛋白。

在体外和体内的非临床研究中对流感modRNA免疫原性组合物的主要药物学进行评价。体外和体内研究证实了流感modRNA免疫原性组合物的作用机制，该免疫原性组合物编码流感HA，其诱导由强功能性抗体应答以及Th1型CD4+和IFNg+CD8+T细胞应答二者表征的免疫应答。来自流感modRNA疫苗的HA糖蛋白的高效体外表达在培养细胞中得到了证实。小鼠和大鼠免疫原性研究证实，流感modRNA疫苗引发强烈的功能性和中和性抗体应答以及CD4+和CD8+T细胞应答。与获得许可的、添加佐剂的灭活流感疫苗进行基准测试，对小鼠进行免疫原性研究，其结果也支持多价流感modRNA免疫原性组合物配制剂针对4种不同流感病毒毒株的潜在用途。

脂质纳米颗粒包封的、编码作为疫苗抗原的流感HA的RNA免疫原性组合物

流感modRNA免疫原性组合物基于modRNA平台技术。单链5’-加帽的modRNA含有编码HA疫苗抗原的开放阅读框，并且特别具有被优化成用于RNA的高功效的结构性要素。ModRNA还含有1-甲基-假尿苷对每个尿苷的取代，以降低先天性免疫传感器(如TLR 7和8)对疫苗RNA的识别，从而导致先天性免疫激活降低和蛋白质翻译增加。modRNA被包封在用于递送到目标细胞中的LNP中。配制剂含有2种功能性脂质ALC-0315和ALC-0159，以及2种结构性脂质DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱)和胆固醇。4种脂质的物理化学性质和结构示出在下文的表中。

表10配制剂中的脂质

CAS＝化学文摘社(Chemical Abstracts Service)；DSPC＝1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱

被选择成用于初步临床测试的流感modRNA疫苗候选者将含有来自被建议在2021-2022年北半球流感季节使用的4种基于细胞的病毒毒株的HA糖蛋白的全长密码子优化编码序列。

·A/Wisconsin/588/2019(H1N1)

·A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)

·B/Phuket/3073/2013(B Yamagata)

·B/Washington/02/2019(B Victoria)

在另一实施方式中，以白色至灰白色无菌冷冻液体的形式供应注射用PF-07252220(IRV)悬浮液疫苗，该液体被包装在具有橡胶塞子、铝封条和可翻转帽的2mL透明玻璃小瓶中。溶液是白色至灰白色乳光液体，其可能含有白色至灰白色不透明无定形颗粒。小瓶含有0.5 mL，其中可提取体积为0.3 mL，以用于通过注射器混合进行进一步稀释。对于小瓶中稀释，小瓶内容物(0.5 mL)应计入最终的给药溶液。每个小瓶包括在pH 7.4的300mM蔗糖和10 mM Tris中的含0.1mg/mL PF-07252220的脂质纳米颗粒(LNP)构建体。配制剂中没有微生物生长抑制剂。

PF-07252220由五种变化形式组成；四种单价毒株呈现形式和一种四价毒株呈现形式。

可以进一步在使用点将单价呈现形式混合到二价和四价给药溶液中。下文呈现的稳定性数据适用于所有的呈现形式和混合物。

·注射用PF-07836259(Phuket)流感mod RNA悬浮液，0.1 mg/mL

·注射用PF-07829855(Wisconsin)流感mod RNA悬浮液，0.1 mg/mL

·注射用PF-07836261(Washington)流感mod RNA悬浮液，0.1 mg/ml

·注射用PF-07836258(Cambodia)流感mod RNA悬浮液，0.1 mg/ml

·注射用PF-07841697四价流感mod RNA悬浮液，0.1 mg/mL

在使用之前，必须将活性临床研究性产品储存在-90至-60℃(-130至-76℉)下。应该将小瓶在室温(不超过30℃/86℉)下解冻大约30分钟，然后通过轻轻倒置小瓶10次进行混合。临床研究性产品将通过肌内注射施用。

表11

^*流感mod RNA PF-07252220的稀释不限于本表中描述的制备剂。本文件中提供的制备剂说明书旨在支持特定的临床设计，然而剂量制备剂不限于这些特定的说明书集。验证浓度范围内的活性剂量是可接受的。

表12

^*二价剂量可以由任何2种单价毒株(被定名为毒株1和毒株2)制造。

表13

表14

表15

^*四价剂量可以由任何4种单价毒株(被定名为毒株1、2、3和4)制造。

实施例4：非临床研究

使用编码来自A/California/07/2009(H1N1)的HA序列的流感modRNA免疫原性组合物进行初步的小鼠免疫原性研究。由于毒株差异，这种HA序列与将用于临床研究的H1N1HA抗原不同，但modRNA与相同的临床LNP组合物一起配制，并且为平台提供支持性数据。

在第0天和第28天，用1μg的LNP配制流感modRNA疫苗对BALB/c小鼠进行IM免疫。在第28天和第49天获得的血清的ELISA示出了高水平的HA结合IgG。早在第一剂量之后14天获得的血清对A/California/07/2009流感病毒具有高中和滴度，并且到第49天(第二剂量之后21天)，血清流感中和滴度超过1×104。在第49天提取的血清中测得的针对A/California/07/2009的HAI滴度大大超过通常被认为可以保护人免受流感的影响的40滴度。用1μg的疫苗候选者对BALB/c小鼠进行两次IM免疫。通过ELISA测量HA特异性IgG。通过流感病毒微量中和测量抗体的功能性。使用在第49天收获并用抗原特异性肽刺激的脾细胞的IFNγELISpot示出了强烈的CD4+和CD8+T细胞应答。这些数据确认，与LNP一起配制的modRNA引发Th1表型T细胞应答。BALB/c小鼠接受了2次用1μg的编码HA的modRNA进行的IM免疫。使用抗原特异性肽刺激从脾脏中回收的T细胞来分析T细胞应答。在肽刺激之后，使用ELISpot测定来测量IFNγ释放。

用于测量疫苗诱导的对流感的免疫应答的主要血清学测定是血凝抑制测定或HAI。HAI定量地测量血清中的功能性抗体，该功能性抗体防止HA介导的红血细胞在反应中的凝集，该反应含有受体破坏酶预处理的血清样品、流感病毒和来源于火鸡或豚鼠的红血细胞。HAI滴度是导致HA活性损失的最高血清稀释度的倒数，当微量滴定板倾斜时，被可视化为泪滴形状。来自每个样品多次测定的滴度被报告为几何平均滴度(GMT)。≥1:40的HAI滴度通常被认为对人具有保护作用。已经为4种流感毒株(A/Wisconsin/588/2019(H1N1)、A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)、B/Phuket/3073/2013(BYamagata)和B/Washington/02/2019(B Victoria))中的每一种开发了HAI测定。

流感病毒微量中和测定或MNT定量地测量血清中中和流感病毒活性的功能性抗体，从而防止宿主细胞单层的生产性感染。当流感病毒与血清样品一起孵育时，会发生中和反应；然后将这种反应混合物应用于Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的单层，以测量中和的程度。MNT滴度被报告为与无血清对照相比时导致感染减少50％的稀释度的倒数。

评价具有预混合药物物质(RNA)的二价modrNA HA流感疫苗形成LNP和后混合LNP臂的可行性的研究

如本文所用，除非另有陈述，否则“预混合”药物物质是指一种组合物，其中将表达HA或NA的RNA以期望的比率混合，随后将单一配制剂包封到到LNP中。“后混合”药物产品是指一种组合物，其中将表达HA或NA的每种RNA都包封在LNP中，然后将所得的包封RNA的LNP以期望的比率混合。

在施用有如以下表中所描述的配制剂的小鼠中检测血凝抑制(HAI)抗体滴度。

研究设计表：

表16

Wisconsin HA modRNA在剂量1后3周诱导出高HAI滴度。

二价组中的HAI略微更高。

0.2μg剂量的二价预混合配制剂中的HAI更高。参见下文的表17-18。

表17剂量1后3周的GMT(Wisconsin)

表18剂量1后3周的GMT(Phuket)

还观察到，在预混合和后混合药物产品之间，50％中和性抗体滴度是类似的。参见下文的表19-22。

表19剂量1后3周(针对Wisconsin)

GMT	165	14319	9393	24043	5221
						样品：	生理盐水	二价预混合	二价预混合	二价后混合	二价后混合
RNA剂量(μg)	--	2	0.4	2	0.4

表20剂量2后2周(针对Wisconsin)

表21剂量1后3周(针对Phuket)

表22剂量2后2周(针对Phuket)

在预混合与后混合药物产品之间，HAI滴度是类似的。参见下文的表23-26。

表23剂量1后3周(针对Wisconsin)

表24剂量2后2周(针对Wisconsin)

表25剂量1后3周(针对Phuket)

表26剂量2后2周(针对Phuket)

实施例5：四价药物产品的描述

四价药物产品是液态纳米颗粒(LNP)在用于肌内施用的水性低温保护剂缓冲液中的无菌分散液，不含防腐剂。药物产品以0.1mg/mL RNA配制在10mM Tris缓冲液、300mM蔗糖、pH 7.4中。

将药物产品供应在用氯丁基橡胶塞子和具有可翻转塑料帽的铝密封件密封的2mL玻璃小瓶中(0.3mL的最大标称体积)。

表27

FIH药物物质的建议储存温度为-20±5℃。

FIH药物产品的建议长期储存温度为-60至-90℃。可以在使用点将药物产品储存在2-8℃下。

表28四价临床药物产品的批次分析

表29四价临床药物产品的批次分析

实施例6：LNP流感HA modRNA四价研究

以下实施例描述了LNP流感HA modRNA四价的研究，其中小鼠被施用如下文的表中所详细说明的不同LNP流感HA modRNA材料。通过血清学测试(HAI和中和)评价在已接触抗原后第21天和在第42天(加强后14天)收集的血清。

表30

在第21天，在预混合与后混合药物产品之间，HAI滴度是类似的，参见以下表31-35。

表31剂量1后3周的GMT(Wisconsin)

GMT：	10	686	343	485	299
						样品：	生理盐水(第1组)	预混合	预混合	后混合	后混合
RNA剂量(μg)	--	4	0.8	4	0.8

表32剂量1后3周的GMT(Cambodia)

表33剂量1后3周的GMT(Cambodia)

表34剂量1后3周的GMT(Washington)

GMT：	14	26	21	30	23
						样品：	生理盐水(第1组)	预混合	预混合	后混合	后混合
RNA剂量(μg)	--	4	0.8	4	0.8

表35剂量1后3周的GMT(Phuket)

GMT：	10	61	36	--	53
						样品：	生理盐水(第1组)	预混合	预混合	后混合	后混合
RNA剂量(μg)	--	4	0.8	4	0.8

H1N1 A/Wisconsin：观察到，在预混合和后混合之间，50％中和滴度是类似的。H3N2A/Cambodia：观察到，在预混合和后混合之间，50％中和滴度是类似的。By/Phuket：观察到，在预混合和后混合之间，50％中和滴度是类似的。Bv/Washington：还观察到，在预混合和后混合之间，50％中和滴度是类似的。

实施例7：多价流感modRNA疫苗小鼠的免疫原性数据，续

为了评价modRNA流感疫苗的多价配制剂的可行性，生成了编码4种不同HA蛋白和4种不同神经氨酸酶(NA)蛋白的modRNA。将由用编码单一毒株特异性HA或NA的LNP配制modRNA接种的小鼠引发的免疫应答与用八价HA/NA modRNA配制剂接种的组进行比较。通过单独地将每种表达HA或NA的modRNA配制在LNP中，然后将八种LNP以相等的比率混合在一起，或通过预混合八种modRNA，随后单一共配制在LNP中，来比较八价配制方法。

在第0天和第28天，用2μg的每种表达HA和NA的modRNA(在LNP中，作为单价或八价疫苗配制剂)对BALB/c小鼠进行IM免疫。LNP配制modRNA对所有的HA和NA组分都引发了强大的抗体和T细胞应答，其水平与获得许可的疫苗对照物相似或更高。在第49天(第二次加强之后21天)，对于针对A型流感毒株的单个HA和八价配制剂，观察到相似的HAI和中和性应答。针对NA测量的抗体示出了与HA相似的趋势(数据未示出)。与获得许可的、添加佐剂的灭活流感疫苗进行基准测试，对小鼠进行免疫原性研究，其结果支持多价流感modRNA疫苗配制剂针对至少四种不同流感病毒毒株的潜在用途。对小鼠进行的初步免疫原性研究表明，与单价对照疫苗相比，八价HA/NA modRNA疫苗对A型流感毒株没有干扰，并且对B型流感毒株表现出抗体应答。这些初步的小鼠免疫原性数据支持多价modRNA配制剂的使用。

条款

1.一种流感病毒疫苗，其包含：至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，该多核苷酸具有编码至少一种流感疫苗抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框，被配制在脂质纳米颗粒中。

2.根据条款1所述的流感疫苗，其中该RNA进一步包含5’帽类似物。

3.根据条款2所述的流感疫苗，其中该5’帽类似物包含m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG。

4.根据条款1所述的流感疫苗，其中该RNA进一步包含修饰的核苷酸。

5.根据条款4所述的流感疫苗，其中该修饰的核苷酸包含N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸酯(m1ΨTP)。

6.根据条款1所述的流感疫苗，其中该至少一种抗原多肽是流感血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、HA1或HA2的免疫原性片段或前述中的任何两种或更多种的组合。

7.根据条款1所述的流感疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA1、HA2或HA1和HA2的组合，并且至少一种抗原性多肽选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)。

8.根据条款1所述的流感疫苗，其中至少一种抗原性多肽是HA1、HA2或HA1和HA2的组合，并且至少一种抗原性多肽是神经氨酸酶(NA)。

9.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含a)至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码流感血凝素1(HA1)；b)至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码流感血凝素2(HA2)；c)至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)的抗原性多肽；以及d)至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码至少一种选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)的抗原性多肽。

10.根据条款5所述的流感疫苗，其中该开放阅读框是密码子优化的。

11.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物进一步包含阳离子脂质。

12.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含涵盖mRNA分子的脂质纳米颗粒。

13.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含a)涵盖至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的脂质纳米颗粒，该开放阅读框编码流感血凝素1(HA1)；b)涵盖至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的脂质纳米颗粒，该开放阅读框编码流感血凝素2(HA2)；c)涵盖至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的脂质纳米颗粒，该开放阅读框编码至少一种选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)的抗原性多肽；以及d)涵盖至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的脂质纳米颗粒，该开放阅读框编码至少一种选自神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构性蛋白1(NS1)和非结构性蛋白2(NS2)的抗原性多肽。

14.根据条款13所述的流感疫苗，其中该脂质纳米颗粒的尺寸为至少40nm。

15.根据条款13所述的流感疫苗，其中该脂质纳米颗粒的尺寸为至多180nm。

16.根据条款13所述的流感疫苗，其中该组合物中至少80％的总RNA被包封。

17.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含

18.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含ALC-0315(4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)。

19.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。

20.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

21.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含胆固醇。

22.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含0.9-1.85mg/mL ALC-0315；0.11-0.24mg/mL ALC-0159；0.18-0.41mg/mL DSPC；以及0.36-0.78mg/mL胆固醇。

23.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含Tris。

24.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含蔗糖。

25.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物不进一步包含氯化钠。

26.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含10mM Tris。

27.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物包含300mM蔗糖。

28.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物的pH为7.4。

29.根据条款1所述的流感疫苗，其中组合物的细菌内毒素小于或等于12.5EU/mL。

30.根据条款1所述的流感疫苗，其中该RNA多核苷酸包含5'帽、5'UTR、3'UTR、组蛋白茎环和聚-A尾。

31.根据条款30所述的流感疫苗，其中该5’UTR包含序列AATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC(5’WHO UTR1)(SEQ ID No:4)。

32.根据条款30所述的流感疫苗，其中该5’UTR包含序列GAGAAΨAAACΨAGΨAΨΨCΨΨCΨGGΨCCCCA CAGACΨCAGA GAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)

33.根据条款30所述的流感疫苗，其中该5’UTR包含序列AGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC(5’WHO UTR1)。(SEQ ID NO:6)

34.根据条款30所述的流感疫苗，其中该3’UTR包含序列CUCGAGCΜGGUACΜGCAΜGCACGCAAΜGCUAGCΜGCCCCUUUCCCGUCCΜGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAΜGCUCCCACCUCCACCΜGCCCCACUCACCACCUCΜGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAΜGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGΜGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUΜGGUCAAUUUCGΜGCCAGCCACACCCΜGGAGCUAGC(3’WHO UTR2)。(SEQ ID NO:7)

35.根据条款30所述的流感疫苗，其中该3’UTR包含序列CΨCGAGCΨGGΨACΨGCAΨGCACGCAAΨGCΨAGCΨGCCCCΨΨΨCCCGΨCCΨGGGΨACCCCGAGΨCΨCCCCCGACCΨCGGGΨCCCAGGΨAΨGCΨCCCACCΨCCACCΨGCCCCACΨCACCACCΨCΨGCΨAGΨΨCCAGACACCΨCCCAAGCACGCAGCAAΨGCAGCΨCAAAACGCΨΨAGCCΨAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGΨGAΨΨAACCΨΨΨAGCAAΨAAACGAAAGΨΨΨAACΨAAGCΨAΨACΨAACCCCAGGGΨΨGGΨCAAΨΨΨCGΨGCCAGCCACACCCΨGGAGCΨAGC(3’WHOΨTR2)。(SEQ ID NO:8)。

36.一种免疫原性组合物，其包含：(i)第一核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码第一抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，以及(ii)第二RNA多核苷酸，其具有编码第二抗原的开放阅读框，所述第二抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第一和第二RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。

37.根据条款36所述的免疫原性组合物，其中该第一和第二抗原包含血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体。

38.根据条款36或37所述的免疫原性组合物，其中该第一抗原包含来自与该第二抗原的流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段不同的流感病毒亚型的HA。

39.根据条款36至38中任一项所述的免疫原性组合物，其中该第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

40.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第三抗原，其包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第三抗原来自流感病毒，但来自与该第一和第二抗原二者不同的流感病毒毒株。

41.根据条款40所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

42.根据条款41所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

43.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(iv)第四RNA多核苷酸，其具有编码第四抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第四抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二和第三抗原不同的流感病毒毒株。

44.根据条款43所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

45.根据条款44所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

46.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(v)第五RNA多核苷酸，其具有编码第五抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第五抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二、第三和第四抗原不同的流感病毒毒株。

47.根据条款46所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

48.根据条款47所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

49.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(vi)第六RNA多核苷酸，其具有编码第六抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第六抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二、第三、第四和第五抗原不同的流感病毒毒株。

50.根据条款49所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

51.根据条款50所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

52.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(vii)第七RNA多核苷酸，其具有编码第七抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第七抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二、第三、第四、第五和第六抗原不同的流感病毒毒株。

53.根据条款52所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

54.根据条款53所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

55.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(viii)第八RNA多核苷酸，其具有编码第八抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第八抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七抗原不同的流感病毒毒株。

56.根据条款55所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

57.根据条款56所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

58.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其进一步包含：(v)第五RNA多核苷酸，其具有编码第五抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中该第五抗原来自流感病毒，但来自与该第一、第二、第三和第四抗原不同的流感病毒毒株。

59.根据条款58所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三、第四和第五RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

60.根据条款59所述的免疫原性组合物，其中该RNA多核苷酸以约相等的比率存在。

61.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中每种RNA多核苷酸包含修饰的核苷酸。

62.根据条款61所述的免疫原性组合物，其中该修饰的核苷酸选自假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。

63.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中每种RNA多核苷酸包含5’末端帽、5’UTR、3’UTR和3’聚腺苷酸化尾。

64.根据条款63所述的免疫原性组合物，其中该5’末端帽包含：

65.根据条款63所述的免疫原性组合物，其中该5’UTR包含SEQ ID NO:1。

66.根据条款63所述的免疫原性组合物，其中该3’UTR包含SEQ ID NO:2。

67.根据条款63所述的免疫原性组合物，其中该3’聚腺苷酸化尾包含SEQ ID NO:3。

68.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该RNA多核苷酸的完整性大于85％。

69.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该RNA多核苷酸的纯度大于85％。

70.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该脂质纳米颗粒包含20-60摩尔％可电离阳离子脂质、5-25摩尔％中性脂质、25-55摩尔％胆固醇和0.5-5摩尔％PEG修饰的脂质。

71.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该阳离子脂质包含：

72.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该PEG修饰的脂质包含：

73.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且该第二抗原是来自与该第一抗原不同的H1毒株的HA或其免疫原性片段或变体。

74.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一和第二抗原是来自A型流感亚型H3的HA或其免疫原性片段或变体，并且其中两种抗原来源于不同的H3流感病毒毒株。

75.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一和第二抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且该第三和第四抗原来自A型流感亚型H3或其免疫原性片段或变体，并且其中该第一和第二抗原来源于不同的H1病毒毒株，并且该第三和第四抗原来自不同的H3流感病毒毒株。

76.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中至少该第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

77.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

78.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

79.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其中该第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。

80.根据条款36至75中任一项所述的免疫原性组合物，其中该RNA多核苷酸中的每一种被配制在单一LNP中，其中每种单一LNP都包封编码一种抗原的RNA多核苷酸。

81.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；并且该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中。

82.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；并且该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中。

83.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；并且该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中。

84.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中；并且该第五RNA多核苷酸被配制在第五LNP中。

85.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中；该第五RNA多核苷酸被配制在第五LNP中；并且该第六RNA多核苷酸被配制在第六LNP中。

86.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中；该第五RNA多核苷酸被配制在第五LNP中；该第六RNA多核苷酸被配制在第六LNP中；并且该第七RNA多核苷酸被配制在第七LNP中。

87.根据条款80所述的免疫原性组合物，其中该第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；该第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；该第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；该第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中；该第五RNA多核苷酸被配制在第五LNP中；该第六RNA多核苷酸被配制在第六LNP中；该第七RNA多核苷酸被配制在第七LNP中；并且该第八RNA多核苷酸被配制在第八LNP中。

88.根据任何前述条款所述的免疫原性组合物，其用于引发针对流感的免疫应答。

89.一种引发针对流感疾病的免疫应答的方法，其包含施用有效量的根据条款0至0中任一项所述的免疫原性组合物。

90.一种纯化通过体外转录合成的RNA多核苷酸的方法，其包含超滤和透析过滤。

91.根据条款90所述的方法，其中该方法不包括色谱法步骤。

92.根据条款90所述的方法，其中纯化的RNA多核苷酸基本上不含污染物，该污染物包含短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留的质粒DNA、残留的体外转录酶、残留的溶剂和/或残留的盐。

93.根据条款90所述的方法，其中该残留的质粒DNA为≤500ng DNA/mg RNA。

94.根据条款90所述的方法，其中纯化的mRNA的纯度在约60％和约100％之间。

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含：(i)第一核糖核酸(RNA)多核苷酸，其包含编码第一抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，以及(ii)第二RNA多核苷酸，其包含编码第二抗原的开放阅读框，所述第二抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中所述第一和第二RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原包含血凝素(HA)或其免疫原性片段或变体。

3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原各自包含来自不同的流感病毒亚型的HA或其免疫原性片段。

4.权利要求1至3中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含：(iii)第三RNA多核苷酸，其包含编码抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中所述第三抗原来自不同于所述第一和第二抗原的流感病毒毒株的流感病毒。

5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

6.权利要求5的免疫原性组合物，其进一步包含：(iv)第四RNA多核苷酸，其包含编码第四抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，其中所述第四抗原来自流感病毒，但来自与所述第一、第二和第三抗原不同的流感病毒毒株。

7.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中。

8.权利要求1至7中任一项的免疫原性组合物，其中所述RNA多核苷酸以约相等的比率存在。

9.权利要求1至8中任一项的免疫原性组合物，其中每种RNA多核苷酸包含修饰的核苷酸。

10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述修饰的核苷酸选自假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。

11.权利要求1至11中任一项的免疫原性组合物，其中每种RNA多核苷酸包含5’末端帽、5’UTR、3’UTR和3’聚腺苷酸化尾。

12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述5’末端帽包含：

13.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:1。

14.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述3’UTR包含SEQ ID NO:2。

15.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述3’聚腺苷酸化尾包含SEQ ID NO:3。

16.权利要求1至15中任一项的免疫原性组合物，其中所述RNA多核苷酸的完整性大于85％。

17.权利要求1至16中任一项的免疫原性组合物，其中所述RNA多核苷酸的纯度大于85％。

18.权利要求1至17中任一项的免疫原性组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含20-60摩尔％可电离阳离子脂质、5-25摩尔％中性脂质、25-55摩尔％胆固醇和0.5-5摩尔％PEG修饰的脂质。

19.权利要求1至18中任一项的免疫原性组合物，其中所述阳离子脂质包含：

20.权利要求1至19中任一项的免疫原性组合物，其中所述PEG修饰的脂质包含：

21.权利要求1至20中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且所述第二抗原是来自与所述第一抗原不同的H1毒株的HA或其免疫原性片段或变体。

22.权利要求1至21中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是来自A型流感亚型H3的HA或其免疫原性片段或变体，并且其中两种抗原来源于不同的H3流感病毒毒株。

23.权利要求6至22中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一和第二抗原是来自A型流感亚型H1的HA或其免疫原性片段或变体，并且所述第三和第四抗原来自A型流感亚型H3或其免疫原性片段或变体，并且其中所述第一和第二抗原来源于不同的H1病毒毒株，并且所述第三和第四抗原来自不同的H3流感病毒毒株。

24.权利要求1至23中任一项的免疫原性组合物，其中至少所述第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

25.权利要求1至24中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一和第二RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

26.权利要求4至25中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一、第二和第三RNA多核苷酸被配制在单一脂质纳米颗粒中。

27.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一、第二、第三和第四RNA多核苷酸被配制在单一LNP中。

28.权利要求1至23中任一项的免疫原性组合物，其中所述RNA多核苷酸中的每一种被配制在单一LNP中，其中每种单一LNP包封编码一种抗原的RNA多核苷酸。

29.权利要求28的免疫原性组合物，其中所述第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；并且所述第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中。

30.权利要求28的免疫原性组合物，其中所述第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；所述第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；并且所述第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中。

31.权利要求28的免疫原性组合物，其中所述第一RNA多核苷酸被配制在第一LNP中；所述第二RNA多核苷酸被配制在第二LNP中；所述第三RNA多核苷酸被配制在第三LNP中；并且所述第四RNA多核苷酸被配制在第四LNP中。

32.权利要求1至31中任一项的免疫原性组合物，其用于在对象中引发针对流感的免疫应答。

33.一种在对象中引发针对流感疾病的免疫应答的方法，其包括施用有效量的权利要求1至32中任一项的免疫原性组合物。

34.一种纯化通过体外转录合成的RNA多核苷酸的方法，所述RNA多核苷酸包含编码第一抗原的开放阅读框，所述抗原包含至少一种流感病毒抗原性多肽或其免疫原性片段，所述方法包括超滤和透析过滤。

35.权利要求34的方法，其中所述方法不包括色谱法步骤。

36.权利要求34的方法，其中纯化的RNA多核苷酸基本上不含污染物，所述污染物包含短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留的质粒DNA、残留的体外转录酶、残留的溶剂和/或残留的盐。