BR112019025104A2 - Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição - Google Patents

Abstract

Métodos para fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico e composições para o uso no mesmo são providos.

Description

1 / 83

MÉTODO DE FABRICAR UM SISTEMA DE ENTREGA NÃO VIRAL CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere à métodos para fabricar uma nanopartícula lipídica compreendendo um lipídeo catiônico e uma molécula de ácido nucleico usando um dispositivo microfluídico e aos aspectos relacionados.

FUNDAMENTOS PARA A INVENÇÃO

[002] A entrega de ácidos nucleicos para imunizar animais tem sido uma meta durante diversos anos. Vários métodos foram testados, incluindo o uso de DNA ou RNA, de veículos de entrega viral ou não viral (ou mesmo nenhum veículo de entrega, em uma vacina “nua”), de replicar ou não replicar vetores ou de vetores virais ou não virais. Os veículos de entrega não viral incluem lipossomas.

[003] Lipossomas podem ser fabricados por uma variedade de métodos, por exemplo, misturando-se uma solução etanólica dos lipídeos com uma solução aquosa do ácido nucleico e tampão. Os métodos para misturar podem incluir um processo em que correntes de alimentação de solução aquosa de ácido nucleico são combinadas em uma única zona de mistura com uma corrente de uma solução de lipídeo-solvente.

[004] Permanece uma necessidade quanto a novos métodos de fabricação que possibilite a produção segura, conveniente e barata de ácido nucleico encapsulado em lipossoma em uma escala comercialmente viável enquanto preserva as características físico-químicas que mantêm o desempenho imunológico que surge dos métodos de fabricação convencionais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Os métodos para fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico e composições para o uso nisso são providos. Os métodos e

2 / 83 microfluídico e composições para o uso nisso são providos. Os métodos e dispositivo microfluídico podem ser usados para fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA em uma escala comercialmente viável.

[006] Em algumas modalidades, os métodos de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico compreende as etapas de: misturar no dispositivo uma primeira solução compreendendo um solvente e um lipídeo catiônico; e uma segunda solução compreendendo água e o RNA; e remover o solvente. Em algumas modalidades, métodos de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico compreende as etapas de: misturar no dispositivo uma primeira solução compreendendo um solvente, um lipídeo catiônico, DSPC, um esterol e um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG-PE e PEG-DMG; e uma segunda solução compreendendo água e o RNA; e remover o solvente.

[007] Em algumas modalidades, os métodos utilizam uma solução de carga compreendendo um solvente e 1 a 10 mg/mL de lipídeo. Em algumas modalidades, o solvente compreende etanol. Em algumas modalidades, a solução de carga compreende adicionalmente água, em que a razão de água para etanol é menor do que 3:7. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[008] A FIG 1 mostra o projeto do dispositivo microfluídico utilizado nos exemplos.

[009] A FIG 2 mostra o impacto de TFR sobre o tamanho de LNP e PDI.

[0010] A FIG 3 mostra o impacto de aumentar TFR na encapsulação.

[0011] A FIG 4 mostra o impacto da razão de aquoso:orgânico sobre o tamanho de LNP e PDI.

3 / 83

[0012] A FIG 5 mostra o impacto da razão de aquoso/orgânico sobre a encapsulação de RNA.

[0013] A FIG 6 mostra o impacto da concentração da solução de carga no tamanho de LNP e PDI.

[0014] A FIG 7 mostra o impacto da concentração da solução de carga sobre o rendimento da encapsulação de RNA.

[0015] A FIG 8 mostra o impacto de T° no tamanho de LNP e PDI.

[0016] A FIG 9 mostra o impacto de T° sobre o rendimento da encapsulação de RNA.

[0017] FIG 10. Seta A: LNP com contraste homogêneo. Seta B: Cristais de gelo. Seta C: Bordas dos furos. Seta D: LNP com densidade de material heterogênea.

[0018] FIG 11. Seta A: LNP com contraste homogêneo. Seta D: LNP com densidade de material heterogênea.

[0019] FIG 12. Determinação de EC50 de RV39- (círculos), RV88- (quadrados) e lipossomas com base em RV94 (triângulos) entregando o mRNA codificando o antígeno da proteína G da raiva.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0020] Por “grupo éster impedido” é pretendido um ambiente estericamente lotado em torno do C(═O) devido à presença de substituintes volumosos, tais como porções cíclicas ou ramificadas.

[0021] Por “lipídeo” é pretendido uma classe de compostos orgânicos que são ácidos graxos ou seus derivados e são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos, incluindo óleos naturais, ceras e esteroides (por exemplo, esteróis, incluindo colesterol).

[0022] Por “lipossoma” é pretendido uma microvesícula composta de uma ou mais bicamadas de moléculas anfipáticas lipídicas que podem incluir um ou mais compartimentos aquosos.

4 / 83 Sistemas de entrega não virais Lipossomas

[0023] Os métodos de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA utilizam um dispositivo microfluídico escalável como aqui descrito em outro lugar. A invenção utiliza lipossomas dentro dos quais RNA codificando polipeptídeo é encapsulado. Assim o RNA é (como em um vírus natural) separado de qualquer meio externo. A encapsulação dentro do lipossoma foi verificada proteger o RNA da digestão pela RNase. Os lipossomas podem incluir algum RNA externo (por exemplo, na sua superfície), mas pelo menos metade do RNA (tal como pelo menos 75%, pelo menos 90% e idealmente todo dele) é encapsulada no núcleo do lipossoma. A encapsulação dentro de lipossomas é distinta, por exemplo, dos complexos de RNA onde o RNA é misturado com lipossomas pré-formados.

[0024] Os lipossomas são usualmente divididos em três grupos: vesículas multilamelares (MLV); vesículas unilamelares pequenas (SUV); e vesículas unilamelares grandes (LUV). As MLVs têm bicamadas múltiplas em cada vesícula, formando diversos compartimentos aquosos separados. As SUVs e LUVs têm uma única bicamada encapsulando um núcleo aquoso; SUVs tipicamente têm um diâmetro ≤ 50 nm e LUVs têm um diâmetro > 50 nm. Os lipossomas aqui são idealmente LUVs com um diâmetro na faixa de 60 a 180 nm e preferivelmente na faixa de 80 a 160 nm. Para uma composição compreendendo uma população de LUVs com diâmetros diferentes: (i) pelo menos 80% em número devem ter diâmetros na faixa de 20 a 220 nm, (ii) o diâmetro médio (Zav, em intensidade) da população é idealmente menor do que 140 nm, e/ou (iii) um índice de polidispersividade < 0,3. Se os lipossomas aqui não forem esféricos, o termo “diâmetro” se refere a um diâmetro na seção transversal maior do lipossoma.

[0025] Os lipossomas úteis para encapsular RNA pode ser formado de

5 / 83 um único lipídeo ou de uma mistura de lipídeos, contanto que pelo menos um dos lipídeos tenha um pKa na faixa de 5,0 a 7,6 (e, preferivelmente, uma amina terciária). Dentro desta faixa de pKa, os lipídeos preferidos têm um pKa de 5,5 a 6. O pKa é o pH no qual 50% dos lipídeos são carregados, situando a meio caminho entre o ponto onde os lipídeos são completamente carregados e o ponto onde os lipídeos são completamente descarregados. O mesmo pode ser medido de vários modos, mas é preferivelmente medido usando o método divulgado abaixo na seção intitulada “medição do pKa”. O pKa tipicamente deve ser medido quanto ao lipídeo sozinho ao invés de quanto ao lipídeo no contexto de uma mistura que também inclui outros lipídeos.

[0026] Onde um lipossoma aqui é formado a partir de uma mistura de lipídeos, é preferido que a proporção destes lipídeos que têm um pKa dentro da faixa desejada deva estar entre 20 e 80% da quantidade total de lipídeos por exemplo, entre 30 e 70% ou entre 40 e 60%. O resto pode ser composto de por exemplo, colesterol (por exemplo, 35 a 55% de colesterol); e/ou DMG (opcionalmente PEGuilado) ou DMG PE; e/ou DSPC. Tais misturas são usadas abaixo. Estes valores de % são porcentagens em mol.

[0027] Como mencionado acima, um lipossoma pode incluir um lipídeo anfifílico cuja porção hidrofílica é PEGuilada (isto é modificada pela fixação covalente de um polietileno glicol). Esta modificação pode aumentar a estabilidade e prevenir adsorção não específica dos lipossomas. Por exemplo, lipídeos podem ser conjugados ao PEG usando técnicas conhecidas na técnica. PEG provê os lipossomas com um revestimento que pode conferir características farmacocinéticas favoráveis. A combinação de encapsulação eficiente de um RNA (particularmente um RNA autorreplicante), um lipídeo catiônico tendo um pKa na faixa de 5,0 a 7,6 e uma superfície PEGuilada, permite a entrega eficiente a tipos múltiplos de célula (incluindo tanto células imunes quanto não imunes), evocando deste modo uma resposta imune mais

6 / 83 forte e melhor do que quando do uso de aminas quaternárias sem PEGuilação. Vários comprimentos de PEG podem ser usados por exemplo, entre 0,5 e 8 kDa, incluindo, por exemplo, um PEG2K (PEG2000), isto é, uma molécula de PEG de aproximadamente 2 kDaltons.

[0028] Os lipídeos usados com a invenção podem ser saturados ou não saturados. O uso de pelo menos um lipídeo não saturado para preparar lipossomas é preferido. Se um lipídeo não saturado tem duas caudas, ambas as caudas podem ser não saturadas ou podem ter uma cauda saturada e uma cauda não saturada.

[0029] Em algumas modalidades, os lipossomas compreenderão um lipídeo catiônico que compreende um grupo principal com uma amina terciária (um lipídeo catiônico ionizável). Em algumas modalidades, os lipídeos catiônicos aqui compreendem ainda pelo menos um grupo éster impedido; pelo menos um grupo carbonato; ou pelo menos um grupo aromático no núcleo. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico compreende adicionalmente um grupo éster não impedido.

[0030] Os requerentes observaram que a atividade biológica de RNA encapsulado em lipossomas compreendendo certos lipídeos catiônicos ionizáveis é diversas vezes mais alta do que o mesmo RNA encapsulado em lipossomas compreendendo outros lipídeos catiônicos ionizáveis. Assim, a seleção de lipídeo catiônico ionizável é um parâmetro importante para gerar RNA encapsulado em lipossomas tendo atividade biológica satisfatória. A atividade de RNA encapsulado em lipossomas pode ser medida determinando-se a expressão de antígeno in vitro usando imageamento de alto teor como aqui descrito em detalhes em outro lugar. Em resumo, a regressão da porcentagem de células expressando antígeno como uma função da concentração de RNA é realizada para produzir um valor EC50, a concentração de RNA que produz resposta meia máxima. Em algumas modalidades, os lipídeos catiônicos ionizáveis adequados para o uso aqui

7 / 83 produzirão um RNA encapsulado em lipossoma tendo uma EC50 de menos do que 2,5 ng/poço, tal como menos do que 2,4 ng/poço, menos do que 2,3 ng/poço, menos do que 2,2 ng/poço, menos do que 2,1 ng/poço, menos do que 2,0 ng/poço, menos do que 1,9 ng/poço, menos do que 1,8 ng/poço, menos do que 1,7 ng/poço, menos do que 1,6 ng/poço, menos do que 1,5 ng/poço, menos do que 1,4 ng/poço, menos do que 1,3 ng/poço, menos do que 1,2 ng/poço, menos do que 1,1 ng/poço, menos do que 1,0 ng/poço, menos do que 0,9 ng/poço, menos do que 0,8 ng/poço, menos do que 0,7 ng/poço, menos do que 0,6 ng/poço, menos do que 0,5 ng/poço, menos do que 0,4 ng/poço, menos do que 0,3 ng/poço, menos do que 0,25 ng/poço, menos do que 0,20 ng/poço, menos do que 0,15 ng/poço ou menos do que 0,10 ng/poço.

[0031] Em algumas modalidades, os lipídeos catiônicos aqui compreendem a estrutura da Fórmula I: Fórmula I em que n = um número inteiro de 1 a 3 e (i) R1 é CH3, R2 e R3 são ambos H e Y é C; ou R1 e R2 são coletivamente CH2-CH2 e juntos com o nitrogênio formam um heterocicloalquila de cinco, seis ou sete membros, R3 é CH3 e Y é C; ou R1 é CH3, R2 e R3 são ambos ausentes e Y é O; em que o é 0 ou 1; em que X é:

8 / 83 (i) , em que R4 e R5 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto C10-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; ou -CH(-R6)-R7, em que (1) R6 é -(CH2)p-O-C(O)-R8 ou -Cp-R8; (2) R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’ ou -Cp’-R8’, (3) p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e (4) R8 e R8’ são independentemente um (A) cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; (B) uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6- 12 saturada ou não saturada; (C) cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; (D) cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; (E) cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O- C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e (F) -cadeia de hidrocarboneto C6-16 saturada ou não saturada.

[0032] Em algumas modalidades, R1 é CH3, R2 e R3 são ambos H e Y é C. Em algumas modalidades, R1 e R2 são coletivamente CH2-CH2 e juntos com o nitrogênio formam um heterocicloalquila de cinco, seis ou sete membros, R3 é CH3 e Y é C. Em algumas modalidades, R1 é CH3, R2 e R3 são ambos ausentes e Y é O.

9 / 83

[0033] Em algumas modalidades, X é em que R4 e R5 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto C10-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0034] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0035] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0036] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0037] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis

10 / 83 alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0038] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0039] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0040] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0041] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O- C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0042] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

11 / 83

[0043] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)- C6-16 saturada ou não saturada.

[0044] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O- C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0045] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0046] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0047] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0048] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0049] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O-

12 / 83 C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0050] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0051] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0052] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0053] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0054] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0055] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não

13 / 83 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0056] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O- C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0057] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0058] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0059] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3- C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0060] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0061] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O-

14 / 83 C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(- C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0062] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C- O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0063] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)- C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0064] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0065] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0066] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0067] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O-

15 / 83 C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0068] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0069] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -(CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0070] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0071] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0072] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

16 / 83

[0073] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0074] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0075] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0076] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0077] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0078] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não

17 / 83 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0079] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0080] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O- C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0081] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0082] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0083] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0084] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

18 / 83

[0085] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0086] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0087] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0088] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0089] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0090] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0091] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é

19 / 83 uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[0092] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0093] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[0094] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[0095] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O- C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[0096] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[0097] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O-

20 / 83 C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)- C6-16 saturada ou não saturada.

[0098] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O- C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[0099] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00100] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00101] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00102] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00103] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O-

21 / 83 C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00104] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00105] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -(CH2)p-O- C(O)-R8, R7 é -Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00106] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00107] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00108] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00109] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é -

22 / 83 (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00110] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00111] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00112] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00113] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00114] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

23 / 83

[00115] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00116] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O- C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00117] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00118] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00119] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00120] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00121] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é -

24 / 83 (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00122] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00123] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00124] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00125] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00126] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00127] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é

25 / 83 uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00128] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00129] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00130] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00131] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O- C6-12 saturada ou não saturada.

[00132] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00133] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

26 / 83

[00134] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C- O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00135] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00136] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00137] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00138] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00139] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00140] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma

27 / 83 cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00141] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - (CH2)p’-O-C(O)-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00142] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00143] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00144] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C6-16 saturada.

[00145] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00146] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é -

28 / 83 Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00147] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto - C6-16 saturada ou não saturada.

[00148] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00149] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00150] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00151] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00152] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de

29 / 83 hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00153] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00154] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00155] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3- C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00156] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00157] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(- C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00158] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C- O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00159] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é -

30 / 83 Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00160] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00161] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00162] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00163] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00164] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00165] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma

31 / 83 cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00166] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00167] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00168] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00169] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00170] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O- C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00171] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não

32 / 83 saturada.

[00172] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C8-20 tendo um ou dois grupos cis alqueno em uma ou outra ou ambas das posições ômega 6 e 9.

[00173] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C1-3-C(-O-C6-12)-O-C6-12 saturada ou não saturada.

[00174] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada.

[00175] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C(-C6-16)-C6-16 saturada ou não saturada.

[00176] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C[-C-O-C(O)-C4-12]-C-O-C(O)-C4-12 saturada ou não saturada.

[00177] Em algumas modalidades, X é -CH(-R6)-R7, R6 é -Cp-R8, R7 é - Cp’-R8’, p e p’ são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; e R8 é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada; e R8’ é uma cadeia de hidrocarboneto -C6-16 saturada ou não saturada.

[00178] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV28 tendo a seguinte estrutura:

33 / 83

[00179] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV31 tendo a seguinte estrutura:

[00180] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV33 tendo a seguinte estrutura:

[00181] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV37 tendo a seguinte estrutura:

[00182] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV39 tendo a seguinte estrutura: RV39

34 / 83

[00183] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV42 tendo a seguinte estrutura:

[00184] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV44 tendo a seguinte estrutura:

[00185] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV73 tendo a seguinte estrutura:

[00186] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV75 tendo a seguinte estrutura:

[00187] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV81 tendo a seguinte estrutura:

35 / 83

[00188] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV84 tendo a seguinte estrutura:

[00189] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV85 tendo a seguinte estrutura:

[00190] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV86 tendo a seguinte estrutura:

36 / 83

[00191] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV88 tendo a seguinte estrutura:

[00192] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV91 tendo a seguinte estrutura:

[00193] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV92 tendo a seguinte estrutura:

37 / 83

[00194] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV93 tendo a seguinte estrutura:

[00195] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV94 tendo a seguinte estrutura:

[00196] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV95 tendo a seguinte estrutura:

[00197] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV96 tendo a seguinte estrutura:

38 / 83

[00198] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV97 tendo a seguinte estrutura:

[00199] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV99 tendo a seguinte estrutura:

[00200] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico exemplar é RV101 tendo a seguinte estrutura:

39 / 83

[00201] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é selecionado do grupo consistindo em: RV39, RV88 e RV94.

[00202] Composições e métodos para a síntese de compostos tendo a Fórmula I e RV28, RV31, RV33, RV37, RV39, RV42, RV44, RV73, RV75, RV81, RV84, RV85, RV86, RV88, RV91, RV92, RV93, RV94, RV95, RV96, RV97, RV99 e RV101 podem ser encontrados na PCT/US2014/070882 (número de publicação WO/2015/095340) e PCT/US2014/070891 (número de publicação WO/2015/095346), depositado em 17 de dezembro de 2014; assim como PCT/US2015/048535 (número de publicação WO/2016/037053), depositado em 4 de setembro de 2015.

[00203] Os lipossomas tipicamente compreenderão adicionalmente lipídeos auxiliares. Os lipídeos auxiliares úteis incluem lipídeos zwitteriônicos, tais como DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfocolina, 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) e 1,2-difitanoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE); esteróis, tais como colesterol; e lipídeos PEGuilados, tais como PEG-DMPE (1,2-dimiristoil-Sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[metóxi-(polietileno glicol)] conjugado com PEG) ou PEG-DMG (1,2-Dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietileno Glicol conjugado com PEG). Em algumas modalidades, úteis lipídeos PEGuilados podem ser PEG2K-DMPE (1,2-dimiristoil-Sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi(polietileno glicol)-2000] conjugado com PEG) ou PEG2K-DMG (1,2-Dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietileno Glicol-2000 conjugado com PEG).

40 / 83

[00204] Em algumas modalidades, os métodos aqui utilizam lipídeos compreendendo (i) um lipídeo catiônico ionizável tendo um pKa na faixa de 5,0 a 7,6, (ii) DSPC, (iii) um esterol e (iv) um lipídeo PEGuilado. Em algumas modalidades, os métodos aqui utilizam lipídeos consistindo essencialmente de (i) um lipídeo catiônico ionizável tendo um pKa na faixa de 5,0 a 7,6, (ii) DSPC, (iii) um esterol e (iv) um lipídeo PEGuilado. Em algumas modalidades, o lipídeo PEGuilado é selecionado de PEG-PE e PEG- DMG. Em algumas modalidades, os lipídeos compreendem (i) um lipídeo catiônico tendo a Fórmula I, (ii) DSPC, (ii) um esterol e (iv) um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG-PE e PEG-DMG. Em algumas modalidades, os lipídeos consistem essencialmente de (i) um lipídeo catiônico tendo a Fórmula I, (ii) DSPC, (ii) um esterol e (iv) um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG-PE e PEG-DMG. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico ionizável tem um pKa na faixa de 5,5 a 6,7, 5,7 a 6,6, 5,9 a 6,5, 6,0 a 6,4. Em algumas modalidades, os lipídeos compreendem (i) um lipídeo catiônico ionizável em que o lipídeo catiônico compreende pelo menos um grupo éster impedido; pelo menos um grupo carbonato; ou pelo menos um grupo aromático no núcleo, (ii) DSPC, (iii) um esterol e (iv) um PEG selecionado de PEG-PE e PEG-DMG. Em algumas modalidades, os lipídeos consistem essencialmente de (i) um lipídeo catiônico ionizável em que o lipídeo catiônico compreende pelo menos um grupo éster impedido; pelo menos um grupo carbonato; ou pelo menos um grupo aromático no núcleo, (ii) DSPC, (iii) um esterol e (iv) um PEG selecionado de PEG-PE e PEG-DMG. Em algumas modalidades, o esterol é colesterol. Em algumas modalidades, os lipídeos compreendem um lipídeo catiônico tendo a Fórmula I, DSPC, colesterol e PEG-DMG. Em algumas modalidades, os lipídeos compreendem um lipídeo catiônico selecionado do grupo consistindo em: RV39, RV88 e RV94, DSPC, colesterol e PEG-DMG.

[00205] Os lipídeos utilizados nos métodos aqui podem ser preparados

41 / 83 pela solubilização de lipídeos individuais em solvente e combinação da quantidade apropriada para produzir uma solução de carga dos lipídeos totais compreendendo a porcentagem, razão ou peso calculados de cada lipídeo. Alternativamente, os lipídeos utilizados nos métodos aqui podem ser preparados pela combinação da quantidade apropriada de cada lipídeo e depois solubilizando-os em solvente.

[00206] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados entre 20 e 80%, 30 e 70% ou 40 e 60% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são catiônicos. Em algumas modalidades, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são catiônicos.

[00207] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados entre 35 e 55% ou entre 40 e 50% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são colesteróis. Em algumas modalidades, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são colesteróis.

[00208] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados entre 0,5 e 5% ou entre 1,0 e 3,0% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são de um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG- PE e PEG-DMG. Em algumas modalidades, cerca de 1,5%, cerca de 1,6%, cerca de 1,7%, cerca de 1,8%, cerca de 1,9%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são de um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG-PE e PEG-DMG.

[00209] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados entre 5 e 15% ou entre 7,5 e 13% (porcento em mol) dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são DSPC. Em algumas modalidades, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12% (porcento em mol)

42 / 83 dos lipídeos totais na solução compreendendo solvente são DSPC.

[00210] Em algumas modalidades, a razão de lipídeo catiônico:(colesterol + lipídeo PEGuilado + DSPC) (mol:mol) está entre 1:5 e 4:5; entre 3:10 e 7:10; entre 2:5 e 3:5. Em algumas modalidades, a razão de colesterol:(lipídeo catiônico + lipídeo PEGuilado + DSPC) (mol:mol) está entre 7:20 e 11:20; ou entre 2:5 e 1:2. Em algumas modalidades, a razão de lipídeo PEGuilado:(lipídeo catiônico + colesterol + DSPC) (mol:mol) está entre 1:200 e 1:20; ou entre 1:100 e 3:100. Em algumas modalidades, a razão de DSPC:(lipídeo catiônico + colesterol + lipídeo PEGuilado) (mol:mol) está entre 1:20 e 3:20; ou entre 15:200 e 13:100.

[00211] A solução de carga dos lipídeos mais solvente para o uso aqui é preparada em uma concentração conveniente dos lipídeos. Vantajosamente, aumentando-se a concentração da solução de carga pode-se trabalhar em um volume mais baixo antes da nanoprecipitação e o produto final pode ser mais concentrado. Em algumas modalidades, a solução compreendendo solvente compreende adicionalmente pelo menos 1 mg/mL; pelo menos 2 mg/mL; pelo menos 3 mg/mL; pelo menos 4 mg/mL; pelo menos 5 mg/mL; pelo menos 6 mg/mL; pelo menos 7 mg/mL; pelo menos 8 mg/mL; pelo menos 9 mg/mL; pelo menos 10 mg/mL; pelo menos 15 mg/mL; pelo menos 20 mg/mL de lipídeo total. Em algumas modalidades, nas quais a solução compreendendo solvente compreende adicionalmente entre 1 e 20 mg/mL; 1 e 15 mg/mL; 1 e 10 mg/mL de lipídeo total, porém não mais do que 50 mg/mL de lipídeo total.

[00212] O solvente utilizado na solução dos lipídeos é compatível com os lipídeos e miscível com a solução aquosa. Em algumas modalidades, o solvente na solução dos lipídeos pode ser um solvente Classe 3, incluindo ácido acético, heptano, acetona, acetato de isobutila, anisol, acetato de isopropila, 1-butanol, acetato de metila, 2-butanol, 3-metil-1-butanol, acetato de butila, metiletil cetona, éter terc-butilmetílico, 2-metil-1-propanol, sulfóxido de dimetila, pentano, etanol, 1-pentanol, acetato de etila, 1-

43 / 83 propanol, éter etílico, 2-propanol, formiato de etila, acetato de propila, ácido fórmico e trietilamina. Em algumas modalidades, o solvente na solução dos lipídeos pode ser um álcool orgânico. Em algumas modalidades, o solvente compreende entre 70 e 100% etanol. Em algumas modalidades, o solvente tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de álcool orgânico. Em algumas modalidades, o solvente tem menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 4%, menos do que 3%, menos do que 2%, menos do que 1%, menos do que 0,5% de água. Em algumas modalidades, o solvente na solução dos lipídeos é selecionado do grupo consistindo em isopropanol e etanol. Em algumas modalidades, o solvente compreende entre 70 e 100% de etanol. Em algumas modalidades, o solvente tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de etanol. Em algumas modalidades, o etanol tem menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 4%, menos do que 3%, menos do que 2%, menos do que 1%, menos do que 0,5% de água. Em algumas modalidades, o solvente é 100% etanol.

O RNA

[00213] A invenção é útil para a entrega in vivo de RNA que codifica um imunógeno. O RNA é traduzido pelas células não imunes no local de entrega, levando à expressão do imunógeno. As células não imunes também podem secretar interferons tipo I e/ou citocinas pró-inflamatórias em resposta ao RNA, como podem as células imunes quando presentes, que podem prover um efeito adjuvante local.

[00214] O RNA é de filamento + e assim pode ser traduzido pelas células não imunes sem precisar de nenhuma etapa de replicação interveniente tal como transcrição reversa. O mesmo também pode se ligar aos receptores TLR 7 expressos pelas células imunes, iniciando deste modo um efeito adjuvante.

[00215] Os RNAs de filamento + preferidos são autorreplicantes. Uma

44 / 83 molécula de RNA autorreplicante (replicon) pode, quando liberada a uma célula de vertebrado mesmo sem qualquer proteína, levar à produção de RNAs filhas múltiplas pela transcrição de si mesma (via uma cópia de antissentido que a mesma gera de si mesma). Uma molécula de RNA autorreplicante é assim tipicamente uma molécula de filamento + que pode ser diretamente traduzida depois da entrega a uma célula e esta tradução provê uma RNA polimerase dependente de RNA que depois produz transcritos tanto de antissentido quanto de sentido a partir do RNA entregue. Assim o RNA entregue leva à produção de RNAs filhas múltiplos. Estes RNAs filhas, assim como transcritos subgenômicos colineares, podem ser traduzidos eles próprios para prover a expressão in situ de um imunógeno codificado ou podem ser transcritos para prover transcritos adicionais com o mesmo sentido como o RNA entregue que é traduzido para prover a expressão in situ do imunógeno. Os resultados globais desta sequência de transcrições é uma amplificação enorme no número introduzido de replicons de RNA e assim o imunógeno codificado torna-se um produto de polipeptídeo principal das células.

[00216] Como mostrado abaixo, uma atividade de autorreplicação não é requerida para um RNA prover um efeito adjuvante, embora o mesmo possa realçar a secreção pós-transfecção de citocinas. A atividade de autorreplicação é particularmente útil para se obter expressão de alto nível do imunógeno pelas células não imunes. A mesma também pode realçar a apoptose das células não imunes.

[00217] Um sistema adequado para a obtenção da autorreplicação é usar um replicon de RNA com base no alfavírus. Estes replicons de filamento + são traduzidos depois da entrega a uma célula para dar uma replicase (ou replicase-transcriptase). A replicase é traduzida como uma poliproteína que se autocliva para prover um complexo de replicação que cria cópias genômicas do filamento -/- do RNA de filamento +/- entregue. Estes transcritos de filamento -/- podem eles próprios ser transcritos para dar cópias adicionais do

45 / 83 RNA precursor de filamento +/- e também dar um transcrito subgenômico que codifique o imunógeno. A tradução do transcrito subgenômico assim leva à expressão in situ do imunógeno pelas células infectadas. Os replicons de alfavírus adequados podem usar uma replicase de um vírus sindbis, um vírus da floresta semliki, um vírus da encefalite equina oriental, um vírus da encefalite equina venezuelana, etc. Sequências de vírus mutante ou do tipo selvagem podem ser usadas por exemplo, o mutante TC83 atenuado de VEEV foi usado nos replicons.

[00218] Uma molécula de RNA autorreplicante preferida assim codifica (i) uma RNA polimerase dependente de RNA que pode transcrever RNA a partir da molécula de RNA autorreplicante e (ii) um imunógeno. A polimerase pode ser uma replicase de alfavírus por exemplo, compreendendo uma ou mais das proteínas do alfavírus nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4.

[00219] Considerando que os genomas naturais de vírus de RNA autorreplicante codificam proteínas estruturais de vírion além da poliproteína de replicase não estrutural, é preferido que uma molécula de RNA autorreplicante da invenção não codifique proteínas estruturais. Assim um RNA autorreplicante preferido pode levar à produção de cópias de RNA genômico de si mesmo em uma célula, mas não à produção de vírions contendo RNA. A incapacidade para produzir estes vírions significa que, diferente de um vírus do tipo selvagem, tal como um alfavírus, a molécula de RNA autorreplicante não pode perpetuar a si mesmo na forma infecciosa. As proteínas estruturais de alfavírus que são necessárias para a perpetuação em vírus do tipo selvagem estão ausentes dos RNAs autorreplicantes da invenção e seu lugar é tomado pelo(s) gene(s) codificando o imunógeno de interesse, tal que o transcrito subgenômico codifique o imunógeno ao invés das proteínas estruturais de vírion.

[00220] Assim uma molécula de RNA autorreplicante útil com a invenção pode ter dois quadros de leitura aberta. O primeiro quadro de leitura

46 / 83 aberta (5’) codifica um replicase; o segundo quadro de leitura aberta (3’) codifica um imunógeno. Em algumas modalidades o RNA pode ter matrizes de leitura aberta adicionais (por exemplo, a jusante) por exemplo, para codificar imunógenos adicionais (ver abaixo) ou para codificar polipeptídeos acessórios.

[00221] Uma molécula de RNA autorreplicante pode ter uma sequência 5’ que é compatível com a replicase codificada.

[00222] As moléculas de RNA autorreplicante podem ter vários comprimentos, mas eles têm tipicamente 5000 a 25000 nucleotídeos de comprimento por exemplo, 8000 a 15000 nucleotídeos ou 9000 a 12000 nucleotídeos. Assim o RNA é mais longo do que observado na entrega de siRNA.

[00223] Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um capuz 5’ (por exemplo, uma 7-metilguanosina). Este capuz pode realçar a tradução in vivo do RNA.

[00224] O nucleotídeo 5’ de uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um grupo 5’ trifosfato. Em um RNA encapuzado este pode ser ligado a uma 7-metilguanosina via uma ponte 5’-para-5’. Um 5’ trifosfato pode realçar a ligação de RIG-I e assim promover efeitos adjuvantes.

[00225] Uma molécula de RNA pode ter uma cauda 3’ poli-A. A mesma também pode incluir uma sequência de reconhecimento da poli-A polimerase (por exemplo, AAUAAA) próximo da sua extremidade 3’.

[00226] Uma molécula de RNA útil com a invenção tipicamente será de filamento único. Os RNAs de filamento único podem geralmente iniciar um efeito adjuvante pela ligação ao TLR7, TLR8, RNA helicases e/ou PKR. O RNA entregue na forma de filamento duplo (dsRNA) pode ligar-se ao TLR3 e este receptor também pode ser deflagrado pelo dsRNA que é formado durante a replicação de um RNA de filamento único ou dentro da estrutura secundária de um RNA de filamento único.

47 / 83

[00227] Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ser convenientemente preparada pela transcrição in vitro (IVT). A IVT pode usar um padrão (cDNA) criado e propagado na forma de plasmídeo em bactérias ou sinteticamente criado (por exemplo pelos métodos de engenheiramento de síntese de gene e/ou reação da cadeia da polimerase (PCR)). Por exemplo, uma RNA polimerase dependente de DNA (tal como as RNA polimerases de bacteriófago T7, T3 ou SP6) pode ser usada para transcrever o RNA a partir de um padrão de DNA. O encapuzamento e as reações de adição de poli-A apropriados podem ser usados como requerido (embora a poli-A do replicon seja usualmente codificada dentro do padrão de DNA). Estas RNA polimerases podem ter exigências severas para o(s) nucleotídeo(s) 5’ transcritos e em algumas modalidades estas exigências devem ser casadas com as exigências da replicase codificada, para garantir que o RNA transcrito por IVT possa funcionar eficientemente como um substrato para a sua replicase autocodificada.

[00228] O RNA autorreplicante pode incluir (além de qualquer estrutura de capuz 5’) um ou mais nucleotídeos tendo uma nucleobase modificada. Assim o RNA pode compreender m5C (5-metilcitidina), m5U (5- metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Urn(2’-0- metiluridina), mlA (l-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2’-0- metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6- isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6-isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cis- hidroxi-isopentenil)adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonilcarbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A (N6.-30-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6- hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); Ar(p) (2’-0-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); mIl (1-metilinosina); m’Im (1,2’-0-dimetilinosina); m3C (3-

48 / 83 metilcitidina); Cm (2T-0-metilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4- acetilcitidina); f5C (5-fonnilcitidina); m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); mIG (1-metilguanosina); 35 m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2’-0-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2’-0-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2’-0-trimetilguanosina); Gr(p) (2’-0-ribosilguanosina (fosfato)); yW (vibutosina); o2yW (peroxivibutosina); OHyW (hidroxivibutosina); OHyW* (hidroxivibutosina submodificada); imG (viosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosilqueuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7-ciano-7- desazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-desazaguanosina); G (archaeosina); D (di-hidrouridina); m5Um (5,2’-0-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2’-0- metiluridina); acp3U (3-(3- amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5- metoxiuridina); cmo5U (ácido uridina 5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico do ácido uridina 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxi-hidroximetil)uridina)); mchm5U (éster metílico de 5-(carboxi-hidroximetil)uridina); mcm5U (5- metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O- metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5- aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5- metilaminometil-2-tiouridina); mnm5 se2U (5-metilaminometil-2- selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetiluridina); ncm5Um (5- carbamoilmetil-2’-0-metiluridina); cmnm5U (5- carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetil-aminometil-2- LOmetiluridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2’-0-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-0-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3- metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-0- dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,0-2-trimetiladenosina); m2’7G (N2, 7 -

49 / 83 dimetilguanosina); m2’2’7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-0- dimetiluridina); m5D (5-metildi-hidrouridina); f5Cm (5-formil-2’-0- metilcitidina); ml Gm (1,2’-0-dimetilguanosina); m’Am (1,2-0-dimetil adenosina)irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina); imG-l4 (4-desmetilguanosina); imG2 (isoguanosina); ou ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados dos mesmos 7-substituídos, di-hidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5- (alquila C1-C6)-uracila, 5 -metiluracila, 5-alquenila (C2-C6)-uracila, 5- (alquinila C2-C6)-uracila, 5-(hidroximetil)uracila, 5-clorouracila, 5- fluorouracila, 5-bromouracila, 5 -hidroxicitosina, 5-alquila (C1-C6)-citosina, 5-metilcitosina, 5-alquenila (C2-C6)-citosina, 5-alquinila (C2-C6)-citosina, 5- clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7- desazaguanina, 8-azaguanina, 7-desaza-guanina 7-substituída, 7-desaza- 7alquinila (C2-C6) guanina, 7-desaza-guanina 8-substituída, 8- hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6- cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7- desazapurina substituída, 7-deaza-purina 7-substituída, 7-deaza-purina 8- substituída ou um nucleotídeo abásico. Por exemplo, um RNA autorreplicante pode incluir uma ou mais nucleobases de pirimidina modificada, tais como resíduos de pseudouridina e/ou 5-metilcitosina. Em algumas modalidades, entretanto, o RNA não inclui nenhuma nucleobase modificada e pode não incluir nenhum nucleotídeo modificado, isto é, todos dos nucleotídeos no RNA são ribonucleotídeos padrão A, C, G e U (exceto para qualquer estrutura de capuz 5’, que pode incluir uma 7’-metilguanosina). Em outras modalidades outras modalidades, o RNA pode incluir um capuz 5’ compreendendo uma 7’- metilguanosina e os primeiros 1, 2 ou 3 ribonucleotídeos 5’ podem ser metilados na posição 2’ da ribose.

[00229] Um RNA usado com a invenção idealmente inclui apenas ligações de fosfodiéster entre nucleosídeos, mas em algumas modalidades

50 / 83 pode conter ligações de fosforamidato, fosforotioato e/ou metilfosfonato.

[00230] Idealmente, um lipossoma inclui menos do que 10 espécies diferentes de RNA por exemplo, 5, 4, 3 ou 2 espécies diferentes; o mais preferivelmente, um lipossoma inclui uma espécie de RNA único, isto é, todas as moléculas de RNA no lipossoma têm a mesma sequência e o mesmo comprimento.

[00231] A quantidade de RNA por lipossoma pode variar. O número de moléculas de RNA autorreplicante individuais por lipossoma é tipicamente ≤50 por exemplo, <20, <10, <5 ou 1 a 4 por lipossoma.

[00232] As moléculas de RNA usadas com a invenção codificam um polipeptídeo imunógeno. Depois da administração dos lipossomas o RNA é traduzido in vivo e o imunógeno pode evocar uma resposta imune no receptor. O imunógeno pode evocar uma resposta imune contra uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita (ou, em algumas modalidades, contra um alérgeno; e em outras modalidades outras modalidades, contra um antígeno de tumor). A resposta imune pode compreender uma resposta de anticorpo (usualmente incluindo IgG) e/ou uma resposta imune mediada por célula (por exemplo, uma resposta de célula T CD4 e/ou CD8). O imunógeno de polipeptídeo tipicamente evocará uma resposta imune que reconhece o polipeptídeo bacteriano, viral, fúngico ou parasítico correspondente (ou alérgeno ou tumor), mas em algumas modalidades o polipeptídeo pode atuar como um mimótopo para evocar uma resposta imune que reconheça um sacarídeo bacteriano, viral, fúngico ou parasítico. O imunógeno tipicamente será um polipeptídeo superficial por exemplo, uma adesina, uma hemaglutinina, uma glicoproteína de envelope, uma glicoproteína de pico, etc.

[00233] As moléculas de RNA autorreplicante podem codificar um único imunógeno de polipeptídeo ou polipeptídeos múltiplos. Imunógenos múltiplos podem estar presentes como um único polipeptídeo imunógeno (polipeptídeo de fusão) ou como polipeptídeos separados. Se imunógenos são

51 / 83 expressos como polipeptídeos separados então um ou mais destes podem ser providos com um IRES a montante ou um elemento promotor viral adicional. Alternativamente, imunógenos múltiplos podem ser expressos a partir de uma poliproteína que codifica imunógenos individuais fundidos a uma protease autocatalítica curta (por exemplo, proteína 2ª do vírus da febre aftosa) ou como inteínas.

[00234] Em algumas modalidades dos métodos aqui, o RNA é um mRNA de pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1500 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2500 nucleotídeos, pelo menos 3000 nucleotídeos, pelo menos 3500 nucleotídeos, pelo menos 4000 nucleotídeos, pelo menos 4500 nucleotídeos, pelo menos 5000 nucleotídeos, pelo menos 5500 nucleotídeos, pelo menos 6000 nucleotídeos, pelo menos 6500 nucleotídeos, pelo menos 7000 nucleotídeos, pelo menos 7500 nucleotídeos, pelo menos 8000 nucleotídeos, pelo menos 8500 nucleotídeos, pelo menos 9000 nucleotídeos ou mais. Em algumas modalidades dos métodos aqui, o RNA é um RNA autorreplicante de pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1500 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2500 nucleotídeos, pelo menos 3000 nucleotídeos, pelo menos 3500 nucleotídeos, pelo menos 4000 nucleotídeos, pelo menos 4500 nucleotídeos, pelo menos 5000 nucleotídeos, pelo menos 5500 nucleotídeos, pelo menos 6000 nucleotídeos, pelo menos 6500 nucleotídeos, pelo menos 7000 nucleotídeos, pelo menos 7500 nucleotídeos, pelo menos 8000 nucleotídeos, pelo menos 8500 nucleotídeos, pelo menos 9000 nucleotídeos ou mais.

[00235] O RNA para o uso aqui é preparado em uma solução aquosa compreendendo água. A solução aquosa pode compreender ainda excipientes adequados para o uso com RNA. Em algumas modalidades, a solução de RNA compreende tampão de citrato. Parâmetros Gerais para Produzir Lipossomas Encapsulando RNA

52 / 83

[00236] Como mencionado acima, um processo para preparar um lipossoma contendo RNA pode compreender as etapas de: (a) misturar RNA com um lipídeo em um pH que esteja abaixo do pKa do lipídeo, mas esteja acima de 4,5; depois (b) aumentar o pH para estar acima do pKa do lipídeo. Assim um lipídeo catiônico é positivamente carregado durante a formação de lipossoma na etapa (a), mas a mudança do pH depois disso significa que a maioria (ou todos) dos grupos positivamente carregados tornam-se neutros. Este processo é vantajoso para preparar lipossomas encapsulando RNA. Evitando-se um pH abaixo de 4,5 durante a etapa (a) a estabilidade do RNA encapsulado é melhorada. O pH na etapa (a) está acima de 4,5 e está idealmente acima de 4,8. Usar um pH na faixa de 5,0 a 6,0 ou na faixa de 5,0 a 5,5, pode prover lipossomas adequados. O pH aumentado na etapa (b) está acima do pKa do lipídeo. O pH é idealmente aumentado para um pH menor do que 9 e preferivelmente menor do que 8. Dependendo do pKa do lipídeo, o pH na etapa (b) pode assim ser aumentado para estar dentro da faixa de 6 a 8 por exemplo, até o pH 6,5 ± 0,3. O aumento do pH da etapa (b) pode ser obtido transferindo-se os lipossomas dentro de um tampão adequado por exemplo, em solução salina tamponada com fosfato. O aumento de pH da etapa (b) é idealmente realizado depois que a formação de lipossoma ocorreu. O RNA usado na etapa (a) pode estar em solução aquosa, para misturar com uma solução orgânica do lipídeo (por exemplo, uma solução etanólica. A mistura pode ser depois diluída para formar lipossomas, depois do que o pH pode ser aumentado na etapa (b).

[00237] A escolha de dispositivo para misturar pode impactar os limites do diâmetro médio alcançados (Zav, pela intensidade) da população e/ou índice de polidispersividade. Certos dispositivos também impactam a capacidade para produção segura, conveniente e barata de ácido nucleico encapsulado em lipossoma em uma escala comercialmente viável enquanto preservando as características físico-químicas que mantêm o desempenho

53 / 83 imunológico. Dispositivos microfluídicos

[00238] Um dispositivo microfluídico é um aparelho de manipulação de fluidos em que tipicamente pelo menos um aspecto tem uma dimensão em uma escala sub-mm e tipicamente a mistura ocorre através de meios passivos (isto é através do contato de correntes de fluido e sem mover partes dentro da câmara de mistura). O dispositivo microfluídico compreenderá uma câmara de mistura dentro da qual a primeira solução e a segunda solução são misturadas.

[00239] A câmara de mistura tipicamente terá uma área da seção transversal que tem 25,6 mm2 ou menos, tal como 12,8 mm2 ou menos, adequadamente 6,4 mm2 ou menos, especialmente 3,2 mm2 ou menos e em particular 1,6 mm2 ou menos. A câmara de mistura tipicamente terá uma área da seção transversal que tem 0,1 mm2 ou mais, adequadamente 0,2 mm2 ou mais, especialmente 0,3 mm2 ou mais e em particular 0,4 mm2 ou mais. Em algumas modalidades a câmara de mistura terá uma área da seção transversal que tem 0,2 a 3,2 mm2, tal como 0,4 a 1,6 mm2, especialmente 0,6 a 1,2 mm2 e em particular 0,7 a 1,0 mm2 (por exemplo, 0,8 mm2).

[00240] A seção transversal da câmara de mistura pode ser de qualquer formato, embora seja tipicamente simétrica. A seção transversal pode ser substancialmente retangular (tal como quadrada). A seção transversal pode ser alongada por natureza, com a dimensão maior sendo pelo menos duas vezes aquela da dimensão perpendicular, tal como pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes. A dimensão maior pode ser não mais do que dez vezes aquela da dimensão perpendicular, tal como não mais do que oito vezes ou não mais do que seis vezes. A dimensão maior usualmente será duas a dez vezes aquela da dimensão perpendicular, tal como três a oito vezes, especialmente quatro a seis vezes, em particular cinco vezes.

[00241] Uma seção transversal retangular pode ter um lado longo de 1

54 / 83 a 8 mm, tal como 1 a 4 mm, por exemplo 1,4 a 3,2 mm, especialmente 1,6 a 2,4 mm, em particular 1,8 a 2,2 mm (por exemplo, 2 mm). Uma seção transversal retangular pode ter um lado curto de 0,1 a 4 mm, por exemplo, 0,1 a 2 mm, opcionalmente 0,1 a 1,2 mm, tal como 0,1 a 0,8 mm, especialmente 0,2 a 0,6 mm, em particular 0,3 a 0,5 mm (por exemplo, 0,4 mm).

[00242] O dispositivo microfluídico terá pelo menos uma entrada (tal como uma entrada) para a câmara de mistura para a entrega da primeira solução. O dispositivo pode ter uma pluralidade de entradas para a câmara de mistura para a entrega da primeira solução, tal como duas entradas.

[00243] O dispositivo microfluídico terá pelo menos uma entrada para a câmara de mistura para a entrega da segunda solução. O dispositivo pode ter uma pluralidade de entradas para a câmara de mistura para a entrega da segunda solução, tal como duas entradas.

[00244] Para facilitar mistura adequada, o número de entradas para a primeira solução e segunda solução pode ser aumentado para as câmaras de mistura com áreas transversais maiores.

[00245] A seção transversal das entradas pode ser de qualquer formato, embora seja tipicamente simétrica. A seção transversal pode ser retangular (tal como quadrada).

[00246] Cada entrada tipicamente terá uma área da seção transversal que seja de 1,28 mm2 ou menos, adequadamente 0,64 mm2 ou menos, especialmente 0,32 mm2 ou menos e em particular 0,16 mm2 ou menos. Cada entrada tipicamente terá uma área da seção transversal que seja de 0,01 mm2 ou mais, adequadamente 0,02 mm2 ou mais, especialmente 0,03 mm2 ou mais e em particular 0,04 mm2 ou mais. Em algumas modalidades cada entrada terá uma área da seção transversal que seja de 0,02 a 0,32 mm2, tal como 0,04 a 0,16 mm2, especialmente 0,06 a 0,12 mm2 e em particular 0,07 a 0,10 mm2 (por exemplo, 0,8 mm2).

[00247] A área da seção transversal total de todas as entradas

55 / 83 adequadamente será menor do que 70% da área da seção transversal da câmara de mistura, tal como menos do que 60% e especialmente menos do que 50%.

[00248] Convenientemente, as entradas podem transpor o comprimento total de um lado da câmara de mistura.

[00249] O formato e tamanho de cada entrada podem ser variados independentemente. Entretanto, tipicamente entradas para a primeira solução serão idênticas no formato e tamanho e as entradas para a segunda solução serão idênticas no formato e tamanho. Convenientemente, todas as entradas são idênticas no formato e tamanho. Um projeto de entrada particular é retangular no formato, 0,2 mm de largura e transpondo o comprimento total do outro lado da câmara de mistura (por exemplo, 0,4 mm de altura)

[00250] As entradas tipicamente estarão localizadas tal que a direção de fluxo da primeira solução e segunda solução dentro da câmara de mistura seja substancialmente paralela (por exemplo, dentro de 15 graus, tal como dentro de 10 graus, em particular dentro de 5 graus), tal como paralela, para a direção geral de fluxo através da câmara de mistura. Dispositivos microfluídicos como aqui descritos assim não incluem aparelhos nos quais as direções de fluxo da primeira solução e segunda solução dentro da câmara de mistura sejam opostas, tais como uma junção T ou misturador T.

[00251] O dispositivo microfluídico terá pelo menos uma saída da câmara de mistura para a recuperação do material misturado. O dispositivo pode ter uma pluralidade de saídas da câmara de mistura para a recuperação do material misturado, tal como duas ou três saídas, que são mais tarde combinadas. Adequadamente o dispositivo terá uma única saída da câmara de mistura para a recuperação do material misturado.

[00252] A seção transversal das saídas pode ser de qualquer formato, entretanto é tipicamente simétrica. A seção transversal pode ser retangular (tal como quadrada), tipicamente tendo uma área de 0,2 a 1 mm2, tal como 0,3 a

56 / 83 0,6 mm2, por exemplo 0,4 a 0,5 mm2. Em outros exemplos a saída pode ser de seção transversal (por exemplo, tendo um diâmetro de 0,5 a 1 mm, tal como 0,6 a 0,8 mm, por exemplo 0,75 mm).

[00253] A área da seção transversal total de todas as saídas adequadamente será menor do que 70% da área da seção transversal da câmara de mistura, tal como menos do que 60% e especialmente menos do que 50%.

[00254] A câmara de mistura deve ser de comprimento adequado para permitir que a mistura seja substancialmente completa no momento em que o líquido atinge a(s) saída(s). Tipicamente, a câmara terá 1 a 10 cm no comprimento, tal como 1,5 a 5 cm, especialmente 1,8 a 4 cm, em particular 2 a 3 cm, por exemplo 2,5 cm.

[00255] Em uma modalidade o dispositivo compreende uma câmara de mistura que seja retangular na seção transversal, tendo uma área da seção transversal de 0,2 a 3,2 mm2 (por exemplo, 0,6 a 1,0 mm2), um lado longo de 1,4 a 3,2 mm (por exemplo, 1,6 a 2,4 mm), um lado curto de 0,1 a 1,2 mm (por exemplo, 0,32 a 0,48 mm), uma entrada para a primeira solução e duas entradas para a segunda solução que são simetricamente dispostas na extremidade proximal da câmara de mistura, um comprimento de câmara de mistura de 1,5 a 5 cm (por exemplo, 2 a 3 cm) e uma saída localizada na extremidade distal da câmara de mistura. Adequadamente as entradas são 0,16 a 0,24 mm de largura e transpõem o comprimento total do outro lado da câmara de mistura.

[00256] O dispositivo microfluídico pode ser formado de qualquer material adequado, a saber um que seja tolerante dos componentes usados na primeira solução e segunda solução e que seja acessível para fabricar. Os materiais adequados incluem silício e vidro. Os dispositivos podem ser preparados a partir de tais materiais pela decapagem, por exemplo, dispositivos de silício podem ser preparados pela Decapagem de Íon Reativo

57 / 83 Profunda (DRIE ou decapagem plasmática) e os dispositivos de vidro podem ser preparados pela decapagem úmida (decapagem com HF).

[00257] Para se obter uma duração de rodada de lote que é um período de tempo controlável (por exemplo, 240 minutos ou menos, especialmente 120 minutos ou menos) é necessário para o sistema obter um nível suficiente de produtividade. Adicionalmente, ajudar a consistência de lote para lote pela redução do impacto dos efeitos de partida e paralização é necessário que o tempo de condução seja de duração adequada (por exemplo, pelo menos 30 minutos, especialmente pelo menos 60 minutos). Métodos para Produzir Lipossomas Encapsulando RNA pela Microfluídica

[00258] A presente invenção provê métodos para fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico. Em algumas modalidades, os métodos envolvem misturar uma primeira solução de lipídeo compreendendo um solvente com uma segunda solução aquosa de RNA, depois remover o solvente. Em algumas modalidades, os métodos envolvem misturar uma solução de lipídeo/RNA compreendendo solvente e depois remover o solvente.

[00259] Em algumas modalidades, os métodos de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico, compreende as seguintes etapas: (a) misturar no dispositivo uma solução compreendendo um solvente, água, o RNA, um lipídeo catiônico ionizável tendo um pKa de 5,5 a 6,7, DSPC, um esterol, um lipídeo PEGuilado selecionado do grupo consistindo em PEG-PE e PEG-DMG; e (b) remover o solvente; em que o dispositivo microfluídico compreende 2 a 128 câmaras de mistura.

[00260] Em algumas modalidades, os métodos de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico, compreende as seguintes etapas: (a)

58 / 83 misturar no dispositivo (i) uma primeira solução compreendendo um solvente, um lipídeo catiônico ionizável tendo pKa 5,5 a 6,7, DSPC, colesterol e um lipídeo PEGuilado selecionado de PEG-PE e PEG-DMG; e (ii) uma segunda solução compreendendo água e o RNA; e (b) remover o solvente; em que o dispositivo microfluídico compreende 2 a 128 câmaras de mistura.

[00261] Os componentes utilizados nos métodos aqui podem ser misturados nas proporções que produzem com êxito LNP tendo características físico-químicas aceitáveis. Além disso, os métodos aqui podem ser utilizados em temperaturas e/ou taxas de fluxo específicas para realçar as características físico-químicas dos LNPs produzidos.

[00262] Por exemplo, o lipídeo catiônico contém nitrogênio e o RNA contém fosfato. Um μg de RNA contém três nmoles de fosfato. Em algumas modalidades, a razão de nitrogênio:fosfato (N:P) está entre 1:1 e 10:1; entre 2:1 e 9:1; entre 3:1 e 8:1; entre 4:1 e 8:1; entre 5:1 e 8:1. Em algumas modalidades, a razão N:P é selecionada de cerca de 1:1; cerca de 2:1; cerca de 3:1; ou cerca de 4:1; cerca de 5:1; cerca de 6:1; cerca de 7:1; cerca de 8:1; cerca de 9:1; cerca de 10:1. Em algumas modalidades a razão N:P é 8:1. Em uma modalidade onde a razão N:P é 8:1, se o RNA está presente a 40 µg/mL (120 nmoles), então o lipídeo catiônico estaria presente a 960 nmoles.

[00263] A razão de componentes aquosos para orgânicos aqui usados pode ser ajustada para produzir com êxito LNP tendo características físico- químicas aceitáveis. Em algumas modalidades, a razão de água (isto é, solução aquosa) para solvente orgânico está entre 1:1 e 5:1 v/v; entre 1,25:1 e 4:1 v/v; entre 1,5 e 3:1 v/v. Em algumas modalidades, a razão de água para solvente orgânico é de cerca de 1,4:1 v/v; cerca de 2:1 v/v; ou cerca de 3:1 v/v. Em algumas modalidades, a razão de água para solvente orgânico é de cerca de 2:1 v/v. Em algumas modalidades, o solvente orgânico é etanol e a razão de água para etanol está entre 1:1 e 5:1 v/v; entre 1,25:1 e 4:1 v/v; entre 1,5 e 3:1 v/v. Em algumas modalidades, a razão de água para etanol é de cerca

59 / 83 de 1,4:1; cerca de 2:1; ou cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a razão de água para etanol é de cerca de 2:1.

[00264] Controlando-se a vazão total (TFR) no dispositivo microfluídico, pode-se produzir bem sucedidamente LNP tendo características físico-químicas aceitáveis. Os dispositivos microfluídicos como aqui descritos são capazes de produzir LNP tendo características físico-químicas aceitáveis enquanto orientados para taxas de fluxo comercialmente significantes (maiores do que 1,0 ml/min/mm2) e assim não incluem aparelho tal como uma junção T ou misturador T. Em algumas modalidades, uma TFR no dispositivo de mais do que 8 ml/min/mm2 produz com êxito LNP tendo características físico-químicas aceitáveis. Em algumas modalidades, a TFR está entre 8 e 30 mL/min/mm2, 12 e 28 mL/min/mm2, 14 e 26 mL/min/mm2, 16 e 24 mL/min/mm2 ou cerca de 18 mL/min/mm2 ou cerca de 22 mL/min/mm2.

[00265] A temperatura da solução ou soluções dentro do dispositivo também pode ser ajustada para produzir com êxito LNP tendo características físico-químicas aceitáveis. Em algumas modalidades, a temperatura da solução no dispositivo microfluídico está entre 10°C e 37°C, tal como entre 15°C e 36°C, entre 15°C e 36°C; entre 15°C e 19°C; entre 19°C e 24°C; entre 24°C e 28°C; entre 28°C e 36°C, entre 20°C e 35°C, entre 25°C e 34°C, entre 30°C e 33°C, cerca de 17°C, cerca de 22°C, cerca de 26°C ou cerca de 30°C.

[00266] Controlando-se a razão da vazão de solvente aquoso para orgânico no dispositivo microfluídico enquanto mantém a TFR como descrito acima, pode-se produzir com êxito LNP tendo características físico-químicas aceitáveis. Em algumas modalidades, a razão da vazão de solvente aquoso para a vazão de solvente orgânico está entre 1:1 e 5:1, tal como cerca de 1,4:1; cerca de 2:1; ou cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a razão da vazão solvente aquoso para vazão de solvente orgânico é de cerca de 2:1. Em algumas modalidades, o solvente aquoso é água compreendendo um tampão e o solvente orgânico é etanol e a razão da vazão de água para etanol está entre

60 / 83 1:1 e 5:1, tal como cerca de 1,4:1; cerca de 2:1; ou cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a razão da vazão de água para a vazão de etanol é de cerca de 2:1.

[00267] Em algumas modalidades, o uso dos métodos acima produz um lipossoma com um tamanho médio de 140 nm ou mais baixo, 130 nm ou mais baixo, 120 nm ou mais baixo ou 100 nm ou mais baixo. Em algumas modalidades, o uso dos métodos acima produz um lipossoma com uma polidispersividade de 0,3 ou mais baixo, 0,2 ou mais baixo ou 0,1 ou mais baixo. Ampliação de Dispositivo Microfluídico

[00268] De modo a facilitar a produção de lipossoma encapsulando um RNA em uma escala industrial (por exemplo, uma escala de pelo menos 0,5 g de lipídeo catiônico por minuto, tal como pelo menos 1 g por minuto, em particular pelo menos 2 g por minuto e especialmente pelo menos 4 g por minuto), câmaras de mistura grandes podem ser usadas ou uma pluralidade de câmaras de mistura podem ser operadas em paralelo. Por exemplo, 2 ou mais câmaras de mistura, em particular 4 ou mais, especialmente 8 ou mais, tal como 16 ou mais (por exemplo, 16). A pluralidade de câmaras de mistura operadas em paralelo pode ser 128 ou menos, tal como 64 ou menos, em particular 32 ou menos. Consequentemente, em algumas modalidades a pluralidade de câmaras de mistura é 2 a 128, tal como 4 a 64, por exemplo 8 a

32.

[00269] Em algumas circunstâncias cada câmara de mistura da pluralidade de câmaras de mistura pode ser operada independentemente, com provisão da primeira solução e segunda solução para a câmara de mistura por bombas independentes (isto é cada bomba não provendo concorrentemente solução para nenhuma outra câmara de mistura). A primeira solução e/ou segunda solução podem ser armazenadas em recipientes independentes (isto é recipientes não fornecendo concorrentemente a primeira solução e/ou a

61 / 83 segunda solução a mais do que uma câmara de mistura) ou a primeira solução e/ou a segunda solução podem ser armazenadas em um recipiente para o uso em mais do que uma câmara de mistura (tal como todas as câmaras de mistura). O material misturado de cada câmara de mistura pode ser recuperado individualmente e armazenado/processado, opcionalmente sendo combinado em um estágio posterior ou pode ser combinado (por exemplo, de todas as câmaras de mistura) antes do processamento adicional e/ou armazenagem.

[00270] Convenientemente todas as câmaras de mistura na pluralidade de câmaras de mistura são supridas pelas mesmas bombas e o material misturado de todas as câmaras de mistura é coletado antes do processamento adicional e/ou armazenagem.

[00271] Otimamente as câmaras de mistura, entradas e saídas, suprimento da primeira solução, segunda solução e coleta de material misturado de múltiplas câmaras de mistura são configurados tal que em operação desempenhem de modo substancialmente idêntico.

[00272] Cada câmara de mistura da pluralidade de câmaras de mistura pode ser configurada como um chip individual ou por conveniência várias câmaras de mistura podem ser combinadas em um único chip (por exemplo, contendo 8 câmaras de mistura). Vários de tais chips podem ser usados em paralelo para prover a pluralidade de câmaras (por exemplo, dois chips cada um dos quais contendo 8 câmaras de mistura para prover um total de 16 câmaras de mistura a serem operadas em paralelo).

[00273] Adequadamente a pluralidade de câmaras de mistura é capaz de produzir material misturado em uma taxa total de 50 a 2000 ml/min, tal como 100 a 1000 ml/min, em particular 200 a 500 ml/min. Em algumas modalidades, a pluralidade de câmaras de mistura é capaz de produzir material misturado em uma taxa de pelo menos 1 g de lipídeo catiônico por minuto. Em algumas modalidades, todas as câmaras de mistura na pluralidade

62 / 83 de câmaras de mistura são supridas pelas mesmas bombas e o material misturado de todas as câmaras de mistura é coletado antes do processamento adicional e/ou armazenagem. Etapas após o processo microfluídico

[00274] Em algumas modalidades, o solvente é removido pela troca de tampão, diafiltração, ultrafiltração, diálise ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a remoção do solvente resulta em um teor de água de pelo menos 95%; pelo menos 96%; pelo menos 97%; pelo menos 98%; pelo menos 99% pelo menos 99,5% de água v/v. Em algumas modalidades, os métodos descritos acima são seguidos por uma etapa adicional de diluir, tal como a uma concentração final desejada. Em algumas modalidades, os métodos descritos acima são seguidos pela etapa adicional de esterilização pela filtração. Composições Farmacêuticas

[00275] Os lipossomas da invenção são úteis como componentes em composições farmacêuticas para imunizar sujeitos contra várias doenças. Estas composições tipicamente incluirão um carreador farmaceuticamente aceitável além dos lipossomas. Uma composição farmacêutica da invenção pode incluir uma ou mais moléculas imunopotenciadoras pequenas. Por exemplo, a composição pode incluir um agonista de TLR2 (por exemplo, Pam3CSK4), um agonista de TLR4 (por exemplo, um fosfato de aminoalquil glicosaminida, tal como E6020), um agonista de TLR7 (por exemplo, imiquimod), um agonista de TLR8 (por exemplo, resiquimod (também um agonista de TLR7)) e/ou um agonista de TLR9 (por exemplo, IC31). Qualquer um de tais agonistas idealmente tem um peso molecular de <2000 Da. Em algumas modalidades tal(is) agonista(s) também é/são encapsulado(s) com o RNA em lipossomas, mas em outras modalidades ele(s) não é/são encapsulado(s). As composições farmacêuticas da invenção podem incluir os lipossomas em água normal (por exemplo, w.f.i.) ou em um tampão por

63 / 83 exemplo, um tampão de fosfato, um tampão Tris, um tampão de borato, um tampão de succinato, um tampão de histidina ou um tampão de citrato. Os sais de tampão tipicamente serão incluídos na faixa de 5 a 20 mM. As composições farmacêuticas da invenção podem ter um pH entre 5,0 e 9,5 por exemplo, entre 6,0 e 0. As composições da invenção podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para dar tonicidade. Uma concentração de 10 ± 2 mg/ml de NaCl é típica por exemplo, de cerca de 9 mg/mL.

[00276] As composições da invenção podem incluir queladores de íon metálico. Estes podem prolongar a estabilidade do RNA pela remoção de íons que podem acelerar a hidrólise de fosfodiéster. Assim uma composição pode incluir um ou mais de EDT A, EGT A, BAPT A, ácido pentético, etc. Tais queladores estão tipicamente presentes entre 10 e 500 mM por exemplo, 0,1 mM. Um sal de citrato, tal como citrato de sódio, também pode atuar como um quelador, enquanto vantajosamente também fornecendo atividade de tamponamento.

[00277] As composições farmacêuticas da invenção podem ter uma osmolalidade dentre 200 mOsm/kg e 750 mOsm/kg, por exemplo, entre 240 e 360 mOsm/kg ou entre 290 e 310 mOsm/kg. As composições farmacêuticas da invenção podem ser hipotônicas ou brandamente hipertônicas. As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais conservantes, tais como tiomersal ou 2-fenoxietanol. As composições livres de mercúrio são preferidas e vacinas livres de conservante podem ser preparadas.

[00278] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estéreis. As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente não pirogênicas por exemplo, contendo <1 ED (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e preferivelmente <0,1 EU por dose. As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente livres de glúten. As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas

64 / 83 na forma de dose unitária. Em algumas modalidades uma dose unitária pode ter um volume dentre 0,1 e 1,0 ml por exemplo, cerca de 0,5 ml.

[00279] As composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões. A composição pode ser preparada para administração pulmonar por exemplo, por um inalador, usando uma pulverização fina. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular por exemplo, como pulverização ou gotas. Injetáveis para administração intramuscular são típicos. As composições compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de lipossomas, assim como quaisquer outros componentes, como necessário. Por ‘quantidade imunologicamente eficaz’, é intencionado que a administração desta quantidade a um indivíduo, em uma dose única ou como parte de uma série, é eficaz para o tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), da capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do médico assistente da situação médica e outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de testes de rotina. O teor de lipossoma e RNA das composições da invenção geralmente será expresso em termos da quantidade de RNA por dose. Uma dose preferida tem 20 ≤ 100 g de RNA (por exemplo, de 10 a 100 µg, tal como de cerca de 10 µg, 25 µg, 50 µg, 75 µg ou 100 µg), mas a expressão pode ser observada em níveis muito mais baixos por exemplo, ≤ 1 µg/dose, ≤ 100 ng/dose, ≤ 10 ng/dose, ≤ 1 ng/dose, etc.

[00280] A invenção também provê um dispositivo de entrega (por exemplo, seringa, nebulizador, pulverizador, inalador, emplastro dérmico, etc.) contendo uma composição farmacêutica da invenção. Este dispositivo pode ser usado para administrar a composição a um sujeito vertebrado. Os

65 / 83 lipossomas da invenção não contêm ribossomas. Métodos de tratamento e usos médicos

[00281] Lipossomas e composições farmacêuticas da invenção são para o uso in vivo para evocar uma resposta imune contra um imunógeno de interesse ou para a terapia de gene. Como aqui divulgado, métodos para aumentar uma resposta imune em um vertebrado compreendendo a etapa de administrar uma quantidade eficaz de um lipossoma ou composição farmacêutica da invenção são providas. A resposta imune é preferivelmente protetiva e preferivelmente envolve anticorpos e/ou imunidade mediada por célula. O método pode aumentar uma resposta de reforço.

[00282] A invenção também provê um lipossoma ou composição farmacêutica da invenção para o uso em um método para aumentar uma resposta imune em um vertebrado. A invenção também provê um lipossoma ou composição farmacêutica da invenção para o uso em um método de terapia de gene em um vertebrado.

[00283] A invenção também provê o uso de um lipossoma da invenção na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imune em um vertebrado.

[00284] Aumentando-se uma resposta imune no vertebrado por estes usos e métodos, o vertebrado pode ser protegido contra várias doenças e/ou infecções por exemplo, contra doenças bacterianas e/ou virais como debatido acima. Os lipossomas e composições são imunogênicas e são mais preferivelmente composições de vacina. As vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (isto é para prevenir infecção) ou terapêutica (isto é para tratar infecção), mas tipicamente será profilática.

[00285] O vertebrado é preferivelmente um mamífero, tal como um ser humano ou um mamífero veterinário grande (por exemplo, cavalos, gado bovino, cervo, cabras e porcos). Onde a vacina é para o uso profilático, o ser humano é preferivelmente uma criança (por exemplo, um bebê ou criança) ou

66 / 83 um adolescente; onde a vacina é para o uso terapêutico, o ser humano é preferivelmente um adolescente ou um adulto. Uma vacina pretendida para crianças também pode ser administrada aos adultos por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc.

[00286] As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças quanto adultos. Assim um paciente humano pode ter menos do que 1 ano de idade, menos do que 5 anos de idade, 1 a 5 anos de idade, 5 a 15 anos de idade, 15 a 55 anos de idade ou pelo menos 55 anos de idade. Os pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, ~50 anos de idade, ~60 anos de idade e preferivelmente ~65 anos), o jovem (por exemplo, ~5 anos de idade), pacientes hospitalizados, funcionários dos serviços de saúde, forças armadas e pessoal militar, mulheres grávidas, os pacientes cronicamente enfermos ou imunodeficientes. As vacinas não são adequadas unicamente para estes grupos, entretanto e podem ser usadas mais geralmente em uma população.

[00287] As composições da invenção geralmente serão administradas diretamente a um paciente. A entrega direta pode ser realizada pela injeção parenteral (por exemplo, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, intradermicamente ou ao espaço intersticial de um tecido. As vias de entrega alternativas incluem a retal, oral (por exemplo, tablete, pulverização), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica ou transcutânea, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucósica. As administrações intradérmica e intramuscular são duas vias preferidas. A injeção pode ser via uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas a injeção livre de agulha pode ser alternativamente usada. Uma dose intramuscular típica é de 0,5 mL.

[00288] A invenção pode ser usada para evocar imunidade sistêmica e/ou mucósica, preferivelmente para evocar uma imunidade sistêmica e/ou mucósica realçada.

67 / 83

[00289] A dosagem pode ser por um programa de dose única ou um programa de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser usadas em um programa de imunização primária e/ou em um programa de imunização de reforço. Em um programa de dose múltipla as várias doses podem ser dadas pelas mesmas vias ou diferentes por exemplo, uma imprimação parenteral e reforço mucósico, uma imprimação mucósica e reforço parenteral, etc. as doses múltiplas tipicamente serão administradas pelo menos 1 semana distanciadamente (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.). Em uma modalidade, doses múltiplas podem ser administradas aproximadamente 6 semanas, 10 semanas e 14 semanas depois do nascimento, por exemplo, em uma idade de 6 semanas, 10 semanas e 14 semanas, como frequentemente usado no World Health Organisation’s Expanded Program on Immunisation (“EPI”). Em uma modalidade alternativa, duas doses primárias são administradas cerca de dois meses distanciadamente, por exemplo, cerca de 7, 8 ou 9 semanas distanciadamente, seguidas por uma ou mais doses de reforço cerca de 6 meses a 1 ano depois da segunda dose primária, por exemplo, cerca de 6, 8, 10 ou 12 meses depois da segunda dose primária. Em uma modalidade adicional, três doses primárias são administradas cerca de dois meses distanciadamente, por exemplo, cerca de 7, 8 ou 9 semanas distanciadamente, seguidas por uma ou mais doses de reforço cerca de 6 meses a 1 ano depois da terceira dose primária, por exemplo, cerca de 6, 8, 10 ou 12 meses depois da terceira dose primária. Geral

[00290] A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual está divulgação pertence. Os termos singulares “um,” “uma,” e “o/a”

68 / 83 incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Similarmente, a palavra “ou” é pretendida incluir “e” a menos que o contexto claramente indique de outro modo. O termo “pluralidade” se refere a dois ou mais. Adicionalmente, as limitações numéricas dadas com respeito às concentrações ou níveis de uma substância, tais como concentrações de componente de solução ou razões das mesmas e condições de reação tais como temperaturas, pressões e tempos de ciclo são pretendidas ser aproximadas. O termo “cerca de” aqui usado é pretendido significar a quantidade ± 10%. A menos que de outro modo especificado, onde uma faixa numérica é provida, a mesma é inclusiva, isto é, os pontos finais são incluídos.

[00291] A invenção será descrita ainda por referência às seguintes figuras e exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00292] Os princípios da nanoprecipitação instantânea foram aplicados ao problema de desenvolver métodos de fabricação que permitam a produção segura, conveniente e barata de ácido nucleico encapsulado em lipossoma em uma escala comercialmente viável enquanto preserva as características físico- químicas que mantenham o desempenho imunológico que surge dos métodos de fabricação convencionais. A nanoprecipitação instantânea envolve dois fluidos miscíveis que são misturados dentro de um microchip para induzir uma precipitação. Os lipídeos são solubilizados em uma fase orgânica (solvente) e misturados com mRNA na fase com base em água (antissolvente) de modo a fabricar partículas. O processo de nanoprecipitação instantânea descrito nestes exemplos está fundamentado nas condições de mistura que impactam a precipitação do DSPC, RV39, colesterol e PEG-lipídeo (C14:0- PEG2K) no solvente orgânico quando misturado com o RNA na fase aquosa (antissolvente).

69 / 83 Materiais Material e Instrumento Fornecedor Catálogo # Tubos de Microcentrífuga livres de RNase (0,5 mL, Ambion/Life-technologies AM12350; 1,5 mL, 2 mL AM12400; AM12425 Tubos cônicos de 15 mL livres de RNase (atingido) Ambien/Life-technologies AM12500 Coluna de Dessalinização PD-10 GE-Healthcare GE17-0851-01

VWR Etanol p.a., ACS reagente, álcool absoluto, sem Sigma-Aldrich 02860 aditivo, A15 o1, ≥99,8% Tampão de Citrato QB, 100 mM, pH 6,0 Teknova Q2446 Lipídeo catiônico - RV39 GSK Pharma DSPC CordenPharma LP-R4-076 Colesterol Sigma Aldrich C3045-5G 14:0-PEG2K PE Avanti 880150P Solução 1M de Hidróxido de Sódio Sigma Aldrich 71463-1L Solução de RNase Zap® Ambien AM9780 10X PBS livre de Rnase Ambien/Life-technologies AM9625 Água livre de nuclease Ambien AM9937 Tabela 1. Materiais. Equipamento

[00293] O esquemático para um microchip (da Micronit Microtechnologies®) usado nos exemplos aqui é mostrado na FIG. 1. Duas bombas de média pressão Nemesys® foram conectadas ao microchip por intermédio de um suporte de chip disponível da MicroNit. As conexões de tubulação tiveram o diâmetro: IDEX 1528L 1/16 x 0,030ft (1,5 mm x). Uma foi usada para a fase orgânica contendo a mistura de lipídeo (conectada ao canal central do microfluídico). A segunda foi usada para a fase aquosa contendo tampão de citrato e o RNA (conectada aos canais externos)

[00294] As bombas Nemesys foram controladas pelo “neMESYS Userinterface®” instalado em um computador. Parâmetros experimentais, preparação, soluções de carga

[00295] Os seguintes volumes foram utilizados para a primeira avaliação: ▪ fase orgânica: 1 a 5 ml em seringa de vidro Cetoni® de 1 ml a 5 ml ▪ fase aquosa: 2,5 a 10 ml em seringa de vidro Cetoni® de 2,5 a 10 ml

70 / 83 ▪ tempo de condução: dependendo da vazão testada.

[00296] O primeiro 0,5 ml saindo do microchip foi descartado. (Purga do sistema) Os 2 a 3 ml seguintes foram coletados.

[00297] As áreas de trabalho foram tratadas com Solução de Descontaminação de RNase (RnaseZap®). O operador usava luvas e tratou as mesmas com uma Solução de Descontaminação de RNase. O tampão e água foram livres de RNAse. Todos os recipientes foram livres de RNAse.

[00298] A solução de carga de RNA foi mantida a -80°C até o princípio dos experimentos sem congelamento descongelamento.

[00299] As formulações foram feitas em uma razão de um N:P (Nitrogênio: Fosfato) de 8:1, onde o lipídeo catiônico conteve nitrogênio e o RNA conteve fosfato. 1 μg de RNA contém 3 nmoles de fosfato. A proporção foi mantida. Assim, por exemplo: 120 nmoles de fosfato corresponderam a 960 nmoles de nitrogênio na razão N:P 8:1.

[00300] Para a preparação das soluções de carga de lipídeos frascos de vidro livres de RNAse foram usados.

[00301] RV39, DSPC e colesterol foram pesados em frascos separados e solubilizados pelo etanol para obter uma solução a 10 mg/ml. PEG2K foi solubilizado em 4 mg/ml em Etanol. Um mínimo de 1 mL de solução de carga foi feito para cada lipídeo.

[00302] Os frascos foram sonicados 1 min e depois aquecidos em banho de água a 37°C durante 5 min a 170 rpm.

[00303] Para a preparação de 1000 μl de mistura de lipídeo, os volumes calculados dos cargas de lipídeos e etanol foram adicionados, ver a Tabela 1. Composição PM % nmoles mg Carga (mg/mL) μL Etanol (μL) RV39 750,1940% 960 0,72 10 96,0 DSPC 790,1510% 240 0,19 10 25,3 776,3 Colesterol 386,6748% 1152 0,45 10 59,3 14:0-PEG2K PE2693,3 2% 48 0,13 4 43,1 Tabela 2.

[00304] As colunas 2 a 5 da tabela mostram o peso molecular para

71 / 83 cada lipídeo, as porcentagens em mol selecionadas para cada lipídeo, equivalente em nmoles para cada lipídeo dados os 960 nmoles de RV39 nas porcentagens em mol relevantes; e miligramas de cada lipídeo nas porcentagens em mol relevantes. As colunas 6 a 8 mostram a concentração da solução de carga de cada componente e os microlitros de cada carga mais etanol de modo a produzir uma solução de carga de lipídeo tendo 10 mg/mL de lipídeo total na porcentagem em mol relevante.

[00305] A mistura de RNA foi feita em tubos cônicos livres de RNAse de 1,5 ml a 15 ml. Os volumes calculados de solução de carga de RNA (para conservar a Razão N:P) foram diluídos em 100 mM de Tampão de Citrato, pH

6. A mistura de RNA foi preparada ex-tempo exatamente antes da antes microfluídica. Microfluídica

[00306] Uma etapa de limpeza foi feita antes de usar o sistema microfluídico. Etanol foi carregado em ambos orifícios (orifício de RNA e Lipídeo) pelo enchimento de uma seringa com etanol e entregando o etanol para o microchip para enxaguar o sistema completamente. Isto foi repetido duas vezes. Depois o orifício do RNA foi carregado com tampão de citrato e o orifício do lipídeo com etanol pelo enchimento de uma seringa com a solução relevante e depois entregando a solução aquosa ou orgânica para o microchip. Isto foi repetido duas vezes.

[00307] O sistema foi depois carregado com RNA e lipídeos. A seringa da direita foi enchida com solução orgânica/lipídeos e a seringa esquerda foi enchida com solução de RNA aquosa. A vazão necessária de modo a satisfazer com a razão escolhida foi programada no software e o processo de nanopreciptação foi iniciado.

[00308] Os LNPs foram colhidos como segue. Os primeiros 0,2 a 0,5 ml foram descartados (até que um bom turbilhão fosse visualizado sem nenhuma bolha no microchip). Os LNPs foram colhidos em um recipiente

72 / 83 cônico livre de RNAse e colocados no gelo até a etapa de troca de tampão. (Tipicamente não mais do que 30 min).

[00309] A pós limpeza do sistema microfluídico foi a mesma como o pré-processo microfluídico provido acima. Troca de Tampão

[00310] Os LNPs formulados foram trocados no tampão de formulação desejado usando-se uma coluna PD10. A coluna foi equilibrada com 10 mM de tampão Tris (25 ml). As amostras foram carregadas com um volume máximo de 2,5 ml por coluna. A elução foi feita com 12 X 0,5 ml de tampão Tris HCL 10 mM. Frações de 0,5 ml foram colhidas em Eppendorf de 1,5 ml. A detecção pelo UV nephelostar de frações foi feita em microplaca de 96 poços Costar de 100 μl. As frações contendo LNP foram reunidas e armazenadas a 4°C. Filtração Estéril

[00311] A filtração estéril foi realizada com filtro Millex-GP® 0,2 µm PES 33 mm SLGP033RS da Millipore (membrana de PES - 0,2 μm) 33 mm. Caracterização de LNP

[00312] A medição do tamanho pela DLS (Zetasizer®). As amostras de LNP foram diluídas 1:500 em PBS ou tampão de citrato filtradas em 0,22 μm. 40 μL de cada amostra foram adicionados em microcubetas descartáveis de 40 μL (Malvern ZEN0040®). Cinco medições são feitas e a média foi calculada.

[00313] Ensaio ribogreen de RNA LNP. O ensaio ribogreen de RNA foi realizado usando o kit comercial Quant-It RiboGreen RNA Assay Kit® da Invitrogen. Protocolo para o Ensaio Ribogreen de LNP

[00314] 1. Diluir 20X Tampão TE até 1X: Adicionar 2 mL de 20X TE a 38 mL de água.

[00315] 2. Fazer uma solução a 0,1% de Triton X-100 em 1X tampão TE (massa 25 mg de Triton e adicionar 25 mL de tampão).

73 / 83

[00316] 3. Diluir em série 3 vezes a sua amostra 1:5 (200 μL em 800 μL de 1X Tampão TE), 1:10 (500 μL dil 1:5 em 500 μL de 1X Tampão TE, 1:20 (500 μL dil 1:10 em 500 μL) em 1X tampão TE.

[00317] 4. Preparar padrões em duplicata: Preparar um carga a 4 μg/mL: adicionar 20 μL de RNA (a 100 μg/mL) a 480 μL de 1X tampão TE. Diluir em série 4 vezes (250 μL em 250 μL de 1X Tampão TE). Adicionar 50 μL de padrão e 50 μL de TE ou Triton a cada poço (ver ordem abaixo) de modo que todos os poços tenham 100 μL de volume.

[00318] 5. Adicionar 50 μL de amostras de LNP (em triplicata) e diluir 2 vezes usando 50 μL de 1X tampão TE.

[00319] 6. Adicionar 50 μL de amostras LNP (em triplicata) e diluir 2 vezes usando 50 μL de Triton X a 0,1%.

[00320] 7. Diluir o reagente Ribogreen 200 vezes pela adição de 25 μL de Ribogreen a 4975 μL de 1X tampão TE para total de 5 mL.

[00321] 8. Adicionar 100 μL de reagente Ribogreen diluído a 100 μL de amostra ou padrão.

[00322] 9. Deixar repousar no escuro a 37°C durante 15 min. Deixar esfriar no escuro a 20°C durante 10 min 300 rpm.

[00323] 10. Ler a fluorescência a 485/20, 528/20, ganho ótimo, usando o programa Gen5.

[00324] 11. *Calcular a concentração.

[00325] a. Fazer a curva padrão.

[00326] b. Subtrair o valor TE do valor de Triton X para obter o valor encapsulado.

[00327] c. Extrapolar a concentração usando a curva padrão. d. Multiplicar pelo fator de diluição. Material e Instrumento Fornecedor Catálogo # Kit de Ensaio de RNA Quant-It RiboGreen Invitrogen R11490 Placa de 96 poços chatos pretas de fundo chato EPPENDORF H 0030 601 700 Água livre de nuclease Ambien AM9937 Triton X-100 Sigma Aldrich T8787

74 / 83 Tabela 3. Materiais para o ensaio RiboGreen.

[00328] O princípio foi quantificar o RNA na amostra nativa (RNA fora do LNP) e o RNA depois do tratamento com LNP TritonX® (RNA total). A diferença entre o RNA total e o RNA fora do LNP dá o RNA dentro do LNP. O rendimento da encapsulação de RNA pode ser facilmente calculado tomando o RNA dentro do LNP dividido pelo RNA total e o expresso em porcentagem.

[00329] Um roteiro foi feito com TECAN® para realizar o ensaio Ribogreen em um modo automático e menos consumo de time para o operador. Exemplo 2 (A) Experimentos exploratórios para avaliar a zona de trabalho do microfluídico

[00330] Três experimentos exploratórios foram feitos para avaliar a zona de processo de trabalho. Em três experimentos exploratórios os Requerentes avaliaram a possibilidade de produzir LNP simples e a vazão total (TFR), N:P e a Razão Aquoso/Orgânico como parâmetros chave. A robustez do processo foi avaliada.

[00331] ▪ TFR (6-12-14 ml/min) ▪ Razão aquosa para Fase orgânica (2:1 a 10:1) ▪ Razão Nitrogênio para Fosfato. (2:1 a 8:1) Nome da Amostra Fase aquosa TFR Razão Z-Médio PdI ml/minFase aquosa/orgânica d.nm SAM1-A Tampão citrato 12 2 140,8 0,055 SAM1-B Tampão citrato 12 5 131,8 0,051 SAM1-C Tampão citrato 12 10 136,4 0,056 SAM1-D Tampão citrato 6 2 202,3 0,078 SAM1-E Tampão citrato 6 5 180,3 0,131 SAM1-F Tampão citrato 6 10 179,1 0,144 SAM1-G Tampão citrato 14 2 128,2 0,062 Tabela 4. Investigação de TFR, razão aquoso:orgânico, razão N:P.

[00332] Foi observado que um aumento de TFR resulta em uma diminuição no tamanho de LNP. Em TFR mais baixo (6 ml/min) o aumento da razão diminui o tamanho de LNP.

75 / 83 (B) Adição de RNA

[00333] O segundo experimento foi feito para repetir as observações feitas no experimento (A) na presença de RNA. Uma etapa de filtração adicional também foi avaliada. Nome da Razão Quantidade de Rendimento de TFR Razão tamanho Amostra N:P encapsulação de RNA encapsulação de RNA (fase ml/mi aquosa/ (μg/ml) nm PDI n orgânica) 0,06 SAM2-A 2 NA 163 5 2 12 0,08 SAM2-E 2 1,56 13% 160 7 125, 0,06 SAM2-B 14 2 8,72 74% 3 9 159, 0,10 SAM2-C 8 12 2 6,65 56% 8 2 196, 0,16 SAM2-G 12 5 5,21 35% 4 8 Tabela 5. TFR, Razão (Fase Aquosa/orgânica), Razão N:P.

[00334] Foi observado que aumentar TFR diminui o tamanho de LNP e aumenta a taxa de encapsulação de RNA. Aumentar a razão da fase aquosa:orgânica aumenta o tamanho de LNP. A vazão total máxima (14 ml/min) parece ser a melhor candidata para ter LNP em torno de 120 nm. Nenhum impacto negativo da filtração sobre a recuperação do RNA é observado. TFR (vazão total) identificado como parâmetro de trabalho chave. Nome da AmostraTeor de RNARendimento de encapsulação de RNA Tamanho μg/ml % nm PDI SAM4-B 8,56 72% 140,10,21 SAM5-B 8,48 80% 140,20,20 Tabela 6. Avaliação da robustez interexperimento.

[00335] Os resultados sugeriram boa reprodutibilidade e robustez com os compostos testados. Os lotes SAM4-B e SAM-5B foram conduzidos em dias diferentes e com preparação de solução de lipídeos/RNA diferentes. (C) Avaliação do impacto de parâmetros microfluídicos sobre os atributos físico-químicos de LNP (1) TFR

[00336] Como debatido acima, aumentar a TFR teve o impacto de

76 / 83 diminuir o tamanho de LNP. Nós decidimos investigar a praticabilidade para aumentar TFR até 22 ml para atingir um tamanho de LNP em torno de 100 nm. Ver a FIG 2.

[00337] Na razão 2:1 (Fase aquosa /orgânica), trabalhar em uma TFR de 22 ml/min provê LNP encapsulando RNA com um tamanho de 107,6 nm e um PDI < 0,2.

[00338] Para o rendimento de encapsulação de RNA, como anteriormente observado, aumentar a TFR teve o impacto de aumentar a taxa de encapsulação. Uma investigação da praticabilidade de aumentar TFR até 22 ml foi realizada. Os resultados são mostrados na FIG 3. (2) Razão Aquoso:Orgânico

[00339] O efeito da razão aquoso:orgânico foi investigado. Experimentos foram conduzidos a 18 ml/min de TFR e os resultados são mostrados na FIG 4. Razões próximas a 2 são observadas para produzir LNP tendo o tamanho mais próximo e PDI para os parâmetros descritos acima. O efeito sobre a encapsulação foi determinado para este experimento. Os resultados são mostrados na FIG 5. Razões próximas a 2 são observadas para produzir LNP tendo a encapsulação de RNA mais alta. (3) Concentração da Solução de Carga

[00340] Para aumentar a fabricação de LNP, solução de carga aumentada oferece o potencial para trabalhar em um volume mais baixo antes da nanoprecipitação. O produto final seria mais concentrado, permitindo maior flexibilidade de formulação e precisão analítica. Os experimentos foram realizados em uma razão aquoso:orgânico de 2:1 e uma TFR mínima de 18 mL/min. Os resultados são mostrados na FIG 6 e FIG 7. Estes experimentos demonstram a capacidade para trabalhar em concentrações mais altas na solução de carga (testada até 8 mg/ml dos lipídeos) ausente de impacto deletério sobre os atributos físico-químicos de LNP. (4) Temperatura do Microfluídico.

77 / 83

[00341] A temperatura de processo foi avaliada usando o equipamento de turbilhão 2D em um recipiente com temperatura controlada (Certomat). Todos os experimentos foram conduzidos na razão aquoso/orgânico 2:1 e TFR de 22 ml/min (com a exceção do lote de 10°C onde a TFR foi 18 ml/min). Os resultados são mostrados na FIG 8. Aumentar a temperatura diminuiu o tamanho de LNP para cerca de 107 nm a 30°C. O efeito da temperatura sobre a encapsulação também foi investigado. Os resultados são mostrados na FIG 9. A 10°C, o rendimento de encapsulação de RNA foi diminuído drasticamente para 52%. Para condições acima de 22°C, o rendimento de encapsulação foi acima de 90%. (5) Processo “tudo em um”.

[00342] Os testes anteriores envolveram misturar uma ou mais correntes dos lipídeos em uma solução de solvente orgânico com uma ou mais correntes de RNA em uma solução aquosa. Neste experimento, todos os componentes lipídicos foram combinados em um vaso e solubilizado com solvente antes da mistura microfluídica com RNA como apresentado na tabela seguinte. Quantidade de Método de preparação Rendimento pelo TAMANHO PDI RNA pelo da solução de carga Ribogreen Ribogreen Individual 116,7 0,15 31,7 91% Tudo em um 123,5 0,154 34,4 88% Tabela 7. Impacto de componentes na preparação de carga sobre os atributos físico-químicos de LNP.

[00343] Nenhum impacto foi detectado sobre os atributos físico- químicos de LNP quando a solução de carga de lipídeo é preparada com o método tudo em um. Exemplo 3 Morfologia pela Microscopia Eletrônica

[00344] A caracterização morfológica de nanopartículas lipídicas contendo mRNA pelo tingimento negativo pela EM e análise crio-EM foi realizada. O objetivo deste experimento é obter uma avaliação da morfologia

78 / 83 pelos dois métodos (tingimento negativo e microscopia crioeletrônica) de nanopartícula lipídicas contendo mRNA. Ver as FIGs 10 e 11. Amostras Quantidades de lipídeo Quantidade de Tampão (mg/ml) encapsulação de RNA (μg/ml) SAM5-D Tris 1,6 34,7 10mM pH 7,5 Tabela 8. Amostra testada quanto à morfologia pela microscopia eletrônica.

[00345] O LNP observado pelo tingimento negativo foram muito heterogêneos no tamanho e formato. Embora alguns exibissem um contraste relativamente homogêneo, a maioria das partículas teve uma clara diferença de densidade em diversas áreas do LNP. Alguns agregados de material amorfo e poucas estruturas tipo membrana também foram observadas. LNP em crio-EM foram heterogêneos no tamanho e formato (FIG 10 e 11). A maioria exibiu um contraste assimétrico heterogêneo. Mais uma vez, dada a baixa concentração da amostra, as observações foram limitadas a relativamente poucos LNP comparado àqueles com tingimento negativo. Exemplo 4

[00346] Neste exemplo o lipossoma contendo RNA foi sintetizado usando o chip microfluídico de turbilhão 2-D com o lipídeo catiônico RV88 para a entrega de mRNA.

Materiais Materiais e Instrumento Fornecedor Cat # Tris-HCl 1 M, pH 8,0, Estéril Teknova T1080 Solução 5 M de Cloreto de Sódio Teknova S0250 Tampão citrato QB, pH 6,0 (100 mM) Teknova Q2446 Água livre de nuclease Ambion AM9937 Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML RV88 GVK bio DSPC Lipoid 556500 Colesterol Sigma C3045-5G PEG2K Avanti Polar Lipides 880150

79 / 83 Materiais e Instrumento Fornecedor Cat # Etanol Acros Organic 615090010 mRNA GSK TRD group Frascos de vidro de borossilicato de 5 mL Thermo Scientific ST5-20 Colunas de Dessalinização PD MiniTrap G-25 GE Healthcare VWR Cat. #95055-984 Kit de Ensaio de RNA Quant-iT RiboGreen Molecular Probes/ Life R11490 Technologies Microplacas Pretas de 96 poços Greiner 655900 Tabela 9.

[00347] RV88, DSPC e colesterol todos sendo preparados em etanol em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de borossílica. O lipídeo 14:0- PEG2K PE foi preparado em uma concentração de 4 mg/ml também em um frasco de vidro de borossílica. A dissolução dos lipídeos nas concentrações de carga foi atingida pela sonicação dos lipídeos em etanol durante 2 min. As soluções foram depois aquecidas em um agitador de inclinação orbital ajustado a 170 rpm a 37°C durante 10 min. Os frascos foram depois equilibrados a 26°C durante um mínimo de 45 min. Os lipídeos foram depois misturados pela adição de volumes de lipídeo de carga como mostrado na Tabela 10. A solução foi depois ajustada com etanol tal que a concentração de lipídeo final fosse de 7,92 mg/ml Composição PM % nmoles mg Carga (mg/ml) μl Etanol (μl) RV88 794,2 40% 7200 5,72 10 571,8 DSPC 790,15 10% 1800 1,42 10 142,2 155,3 Colesterol 386,67 48% 8640 3,34 10 334,1 PEG2K 2693,3 2% 360 0,97 4 242,4 Tabela 10: Componentes Lipídicos usados para fabricar lipossomas com o lipídeo catiônico RV88 e mRNA.

[00348] O RNA foi preparado como uma solução de carga com 75 mM de Tampão citrato no pH 6,0 e uma concentração de RNA a 1,250 mg/ml. A concentração do RNA foi depois ajustada para 0,1037 mg/ml com 75 mM de Tampão citrato no pH 6,0, equilibrada a 26°C. A solução foi depois incubada a 26°C durante um mínimo de 25 min.

[00349] A câmara microfluídica foi limpa com etanol como descrito no exemplo 1 e bombas de seringa neMYSIS foram preparadas carregando-se uma seringa com a solução de RNA e uma outra seringa com o lipídeo

80 / 83 etanólico. Ambas as seringas foram carregadas e sob o controle do software neMESYS. As soluções foram depois aplicadas ao chip de mistura em uma razão de fase aquosa para orgânica de 2 e uma vazão total de 22 ml/min (14,67 ml/min para RNA e 7,33 ml/min para a solução de lipídeo. Ambas as bombas foram iniciadas sincronizadamente. A solução do misturador que fluiu do chip microfluídico foi coletada em frações de 4x1 ml com a primeira fração sendo descartada como resíduo. A solução remanescente contendo os lipossomas de mRNA foi trocada usando-se colunas de dessalinização G-25 mini para 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, no pH 7,5, como descrito acima. A seguir da troca de tampão, os materiais foram distinguidos quanto ao tamanho e aprisionamento de RNA através da análise de DLS e ensaios Ribogreen, respectivamente. Rendimento de Nome da Razão Quantidade de encapsulação de Amostra N:P TFR Razão encapsulação de RNA RNA Tamanho (fase ml/min aquosa/orgânica (μg/ml) % d.nm PDI ) SAM- 8 22 2 35,87 96,42 105,97 0,09 RV88 Tabela 11: Descrição da síntese de lipossoma RV88 e caracterização biofísica Exemplo 5

[00350] Neste exemplo lipossomas contendo RNA foram sintetizados usando o chip microfluídico de turbilhão 2-D com o lipídeo catiônico RV94 para a entrega de mRNA.

Materiais Materiais e Instrumento Fornecedor Cat # Tris-HCl 1M, pH 8,0, Estéril Teknova T1080 Solução 5M de Cloreto de Sódio Teknova S0250 Tampão citrato QB, pH 6,0 (100 mM) Teknova Q2446 Água livre de nuclease Ambion AM9937 Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML

81 / 83 Materiais e Instrumento Fornecedor Cat # RV94 GVKbio DSPC Lipoid 556500 Colesterol Sigma C3045-5G PEG2K Avanti Polar Lipídeos 880150 Etanol Acros Organic 615090010 mRNA GSK TRD grupo Frascos de vidro de borossilicato de 5 mL Thermo Scientific ST5-20 Colunas de Dessalinização PD MiniTrap G-25 GE Healthcare VWR Cat. #95055-984 Kit de Ensaio de RNA Quant-iT RiboGreen Molcular Probes/Life R11490 Technologies Microplacas pretas de Black 96 poços Greiner 655900 Tabela 12.

[00351] Os lipídeos foram preparados como no Exemplo 5 usando as quantidades de material designadas na Tabela 12 para uma concentração de lipídeo final de 7,92 mg/ml. Carga(mg/m Composição PM % nmoles mg l) μl Etanol (μl) RV94 808,22 40% 2880 2,33 10 232,8 DSPC 790,15 10% 720 0,57 10 56,9 155,3 Colesterol 386,67 48% 3456 1,34 10 133,6 PEG2K 2693,3 2% 144 0,39 4 97,0 Tabela 13: Materiais lipídicos usados para fabricar lipossomas com base em RV94.

[00352] A solução aquosa de mRNA foi preparada como uma solução de carga com 75 mM de Tampão citrato no pH 6,0 o mRNA a 1,250 mg/ml. A concentração do RNA foi depois ajustada para 0,1037 mg/ml com 75 mM de Tampão citrato no pH 6,0, equilibrada a 26°C. A solução foi depois incubada a 26°C durante um mínimo de 25 min.

[00353] A câmara microfluídica foi limpa com etanol como descrito no exemplo 1 e bombas de seringa neMYSIS foram preparadas carregando-se uma seringa com a solução de RNA e uma outra seringa com o lipídeo etanólico. Ambas as seringas foram carregadas e sob o controle do software neMESYS. As soluções foram depois aplicadas ao chip de mistura em uma razão de fase aquosa para orgânica de 2 e uma vazão total de 22 ml/min (14,67 ml/min para a solução de RNA e 7,33 ml/min para a de lipídeo. Ambas as bombas foram iniciadas sincronizadamente. A solução do misturador que

82 / 83 fluiu do chip microfluídico foi coletada em frações de 4 x 1 ml com a primeira fração sendo descartada como resíduo. A solução remanescente contendo os mRNA-lipossomas foi trocada usando-se colunas de dessalinização G-25 mini para 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, no pH 7,5, como descrito acima. A seguir da troca de tampão, os materiais foram distinguidos quanto ao tamanho e o aprisionamento de RNA através da análise de DLS e ensaios Ribogreen, respectivamente. A análise biofísica dos lipossomas é mostrada na Tabela 14. Quantidade de Rendimento da Nome da Razão encapsulação de encapsulação de Amostra N:P TFR Razão RNA RNA Tamanho (fase ml/min aquosa/orgânic (μg/ml) % d.nm PDI a) SAM- 8 22 2 31,46 86,9 113,1 0,12 RV94 Tabela 14: Descrição da Síntese de Lipossoma RV94 e caracterização biofísica. Exemplo 6 Determinação de EC50

[00354] A avaliação da atividade de lipossomas carreando mRNA pode ser determinada in vitro pelo imageamento de alto teor. Neste exemplo o mRNA-lipossomas pode ser usado para tratar células crescentes em cultura. Este experimento pode usar diversos tipos de células crescentes em uma cultura 2-D. Para este exemplo, células renais de hamster bebê (BHK) obtidas da Invitrogen (Cat# R700-01) foram usadas. As células foram semeadas em placa de cultura de tecido de 96 poços com uma densidade de semeadura de

200.000 células/poço em meio de cultura (DMEM, 5% de FBS, 1% de Pen/Estrep, 1% de L-Glu). A placa de cultura foi depois incubada 4 horas permitindo que as células fixassem e aderissem à placa de cultura. Os SAM- lipossomas foram diluídos em série de 10 ng a 0,078 ng de mRNA em 8 etapas de diluição com meio de crescimento contendo 5% de soro. Um volume de 100 μl de cada diluição foi transferido pata os respectivos poços

83 / 83 com células aderentes. Os meios de crescimento foram cultivados as células foram depois lavadas com PBS e cada concentração foi conduzida em repetições de 5 poços. As células foram depois retornadas ao incubador de cultura de célula durante a noite. No dia seguinte os meios com SAM- lipossoma foram removidos das células e as células foram fixadas com uma % de solução de paraformaldeído em dPBS durante 15 min na temperatura ambiente. As células foram depois lavadas e permeabilizadas usando uma solução a 0,05% de Triton X-100 em PBS durante 15 min na temperatura ambiente. Depois do bloquear as células as células foram fixadas e permeabilizadas com soro de cabra. As células foram depois tingidas com Ab primário e secundário, onde o Ab secundário é rotulado com Alexa Fluor 488 e DAPI para tingir os núcleos das células. As células foram depois lavadas em PBS e seladas com película transparente. As células foram depois analisadas usando um imageador de alto teor CellInsight CX7 HCA (HCI) da ThermoFisher e a porcentagem de expressão de antígeno foi determinada usando o Software HCS Studio Cell Analysis. A Regressão da Porcentagem de células expressando antígeno como uma função da concentração de mRNA foi realizada com simulação de dose resposta (log(agonista) vs resposta – regressão de inclinação variável de quatro parâmetros) usando um software estatístico tal como GraphPad Prism 7.00.

[00355] As determinações de EC50 foram 0,0756 ng/poço para lipossoma-RV39, 0,098 ng/poço para lipossoma-RV88 e 0,069 ng/poço para lipossoma-RV94.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA usando um dispositivo microfluídico, o dispositivo microfluídico compreendendo (i) uma câmara de mistura; (ii) pelo menos uma entrada para a câmara de mistura para entrega de uma primeira solução compreendendo um solvente e um lipídeo catiônico ionizável; e (iii) pelo menos uma entrada para a câmara de mistura para entrega de uma segunda solução compreendendo o RNA; em que a direção de fluxo da primeira solução e da segunda solução para a câmara de mistura está dentro de 15 graus para a direção de fluxo através da câmara de mistura; o dito método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) misturar no dispositivo (a) a primeira solução e; (b) a segunda solução em que a vazão total para a câmara de mistura é de 8 a 30 mL/min/mm²; e (ii) remover o solvente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipossoma tem uma polidispersividade de 0,3 ou menos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipídio catiônico é um lipídio ionizável tendo um pKa de 5,5 a 6,7.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de mistura é retangular.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende pelo menos um grupo éster impedido; pelo menos um grupo carbonato; ou pelo menos um grupo aromático no núcleo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende adicionalmente um grupo éster não impedido.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipossoma encapsulando o RNA é coletado antes de processamento adicional.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo microfluídico tem uma entrada para a primeira solução para a câmara de mistura.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo microfluídico tem duas entradas para a primeira solução para a câmara de mistura.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA é um RNA autorreplicante.

11. Método de fabricar um sistema de entrega não viral compreendendo um lipossoma encapsulando um RNA codificando um imunógeno usando um dispositivo microfluídico, o dito dispositivo microfluídico compreendendo: (i) uma pluralidade de câmaras de mistura, cada câmara de mistura compreendendo adicionalmente: (a) pelo menos uma entrada para a câmara de mistura para entrega de uma primeira solução compreendendo um solvente e um lipídeo catiônico ionizável; e (b) pelo menos uma entrada para a câmara de mistura para entrega de uma segunda solução compreendendo o RNA;

em que (A) a direção de fluxo da primeira solução e da segunda solução para cada câmara de mistura está dentro de 15 graus para a direção de fluxo através da câmara de mistura e (B) todas as câmaras de mistura são supridas por um conjunto comum de bombas; o dito método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) misturar no dispositivo (a) a primeira solução e; (b) a segunda solução em que a vazão total para a câmara de mistura é de 8 a 30 mL/min/mm²; e (ii) remover o solvente.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o lipossoma tem uma polidispersividade de 0,3 ou menos.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o lipídio catiônico é um lipídio ionizável tendo um pKa de 5,5 a 6,7.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a câmara de mistura é retangular.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende pelo menos um grupo éster impedido; pelo menos um grupo carbonato; ou pelo menos um grupo aromático no núcleo.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende adicionalmente um grupo éster não impedido.

17. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o lipossoma encapsulando o RNA é coletado antes de processamento adicional.

18. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dispositivo microfluídico tem uma entrada para a primeira solução para a câmara de mistura.

19. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dispositivo microfluídico tem duas entradas para a primeira solução para a câmara de mistura.

20. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o RNA é um RNA autorreplicante.

camada de vidro camada de silicone 1/12 profundidade do canal canal de entrada (3x) comprimento 9,9 mm comprimento direto 2 mm seção lateral impacto de TFR sobre o tamanho de LNP e PDI tamanho (nm)

tamanho nm impacto de TFR no rendimento de encapsulação de RNA % de RNA encapsulado rendimento de encapsulação de RNA impacto da razão sobre o tamanho e PDI tamanho (nm)

tamanho nm razão 1 razão 1.4 razão 2 razão 5 impacto da razão sobre o rendimento de encapsulação de RNA rendimento de encapsulação de RNA razão 1 razão 1.4 razão 2 razão 3 razão 5 impacto da solução de carga sobre o tamanho e PDI tamanho (nm)

tamanho (em nm)

impacto da solução de carga sobre o rendimento de encapsulação de RNA rendimento de encapsulação de RNA impacto T° sobre o tamanho e PDI tamanho (nm)

tamanho impacto T° sobre o rendimento de encapsulação de RNA recuperação de RNA determinação da EC50 de lipossomas % de células positivas lipossoma-RV94 lipossoma-RV88 lipossoma-RV39

Log[RNA(ng/poço)]