CN110988373A - 微流体分析的方法、组合物和系统 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于分析样品中的颗粒的方法和设备以及其他方面。在一些方面，颗粒可以是分析物、细胞、核酸或蛋白质，与标签接触，分配到等分试样，由分级装置检测，并分离。本文提供的方法和设备可包括微流体芯片。在一些方面，所述方法和设备可用于定量样品中的罕见颗粒，例如癌细胞或用于疾病诊断、预后或治疗的其他罕见细胞。

Description

微流体分析的方法、组合物和系统
交叉参考
本申请要求2013年7月5日提交的美国临时申请号61/843,252和2013 年10月23日提交的美国临时申请号61/894,788的权益，其通过引用全文纳 入本文用于所有目的。
有关联邦资助的研究的声明
本发明是基于国立卫生研究院提供的CA147831政府资助。政府对本发 明享有某些权利。
背景
循环肿瘤细胞(CTC)从原发肿瘤脱落进入血流并且是癌症转移的重要方面 。已经在许多不同类型的癌症，例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌和胰腺癌中检 测到CTC。CTC的数量与转移患者的临床结局直接相关，提供了有助于管理 临床护理的有价值的预后信息。
发明概述
本文描述了用于分离和分析颗粒以及实施分析的方法、设备、系统和装 置。
在许多方面，提供了鉴定流体内的分析物上存在的多种标记物的方法， 所述方法包括：(a)检测来自采用照射源的第一标签的信号，其中所述第一标 签附连至结合所述分析物上的第一标记物的第一结构；(b)基于所述第一标签 的存在分配所述分析物；(c)降低所述第一标签的信号的强度；(d)使所述分 析物与结合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构附连至第二标 签；以及(e)检测第二标签。
在许多方面，提供了检测分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：使所述分析物与第一标签接触，其中所述分析物包括第一标记物且所 述第一标签对所述第一标记物具有亲和性；检测所述第一标签发射的第一信 号，其中所述第一信号的存在指示所述第一标记物的存在；基于所述第一信 号的存在分配包含所述分析物的流体；降低所述第一信号的强度；使所述分 析物与第二标签接触，其中所述分析物包括第二标记物且所述第二标签对所 述第二标记物具有亲和性；以及检测所述第二标签发射的第二信号，其中所述第二信号的存在指示所述第二标记物的存在。
在各个方面，提供了从包含第一细胞类型和第二细胞类型的样品中分离 细胞的方法，所述方法包括：(a)通过管道组将样品引入微流体芯片，其中所 述微流体芯片包括(i)流体连接至所述管道组的至少一个通道；(ii)被构造成检 测所述至少一个通道内的细胞的信号的检测器；和(iii)流体连接至所述至少一 个通道的至少一个腔室；(b)使样品的一部分流过检测器；(c)使用检测器检 测所述样品部分内第一细胞类型的存在与否；(d)如果在所述样品部分内检测 到第一细胞类型，则将所述样品的等分试样引导到腔室内，其中所述等分试 样包含第一细胞类型；和(e)重复步骤(b),(c)和(d)，从而在腔室中分离多个等 分试样，使得腔室包含大于80％样品内的第一细胞类型的总量以及小于5％样 品内的第二细胞类型的总量。
在各个方面，提供了用于从样品分离细胞的方法，所述方法包括：(a) 将样品引入微流体芯片，其中所述样品包含第一细胞类型和第二细胞类型， 所述微流体芯片包括：通道；被构造成检测通道内发射的信号的检测器；与 所述通道流体连通的腔室；(b)使样品的一部分流过所述通道，其中所述样品 部分包含多个第一细胞类型、多个第二细胞类型或其组合；(c)使用检测器检 测所述样品部分内第一细胞类型的存在与否；(d)如果所述样品部分内存在第 一细胞类型则将所述部分引导到腔室内；和(e)重复(b),(c)和(d)足够的次数，使得所述腔室包含超过80％所述样品内存在的第一细胞类型的总数和不到 5％所述样品内存在的第二细胞类型的总数。
在各种方面，提供设备用于分配源自流体的样品中表达特定生物标记物 概况的细胞，其中：所述设备包括连接至微流体芯片的管道组，所述微流体 芯片具有至少一个通道和腔室；和所述设备能够分离腔室中的细胞，其中， 分离后，所述腔室包含超过80％表达特定生物标记物概况的样品中的总细胞 群，以及分离后，所述腔室包含不到5％表达不同生物标记物概况的样品中的 总细胞群。
在各个方面，提供了鉴定分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：(a)通过使分析物流过包含多个微穴或微插片的基板分配多个分析物， 其中，大多数微穴或微插片能够容纳不超过一个分析物，所述微穴或微插片 位于微流体装置上；(b)在所述微穴或微插片中，每个分析物与能够结合第一 标记物的第一结构接触，其中所述第一结构连接至第一标签；(c)检测来自第 一标签的信号；(d)降低所述第一标签的信号的水平；(e)使所述分析物与结合 第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构连接至第二标签；以及(f)检 测第二标签。
在各个方面，提供了检测分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：通过使流体流过包含微穴或微插片的基板将分析物分离到微穴或微插 片中，其中所述流体包含分析物；使所述分析物与第一标签接触，其中所述 分析物包括第一标记物且所述第一标签对所述第一标记物具有亲和性；检测 所述第一标签发射的第一信号，其中所述第一信号的存在表明所述第一标记 物的存在；降低所述第一信号的强度；使所述分析物与第二标签接触，其中 所述分析物包括第二标记物且所述第二标签对所述第二标记物具有亲和性；以及检测所述第二标签发射的第二信号，其中所述第二信号的存在指示所述 第二标记物的存在。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的颗粒的系统，该系统包括：微 流体芯片，包括输入通道、第一输出通道、第二输出通道和定向流动通道； 阀，所述阀可以从所述微流体芯片分离，其中：所述阀调节定向流动通道中 第一流体的流动；所述定向流动通道中第一流体的流动使得来自输入通道的 第二流体流动至第一输出通道、第二输出通道或其组合；检测器，其被配置 成检测输入通道中第二流体的一部分发射的信号；和处理器，被配置为：基 于所述信号对所述部分赋值；和操纵所述阀。在一些方面，阀是电驱动阀。
在各个方面，提供用于检测流体样品中的颗粒的系统，该系统包括：(a) 微流体芯片，包括至少一个样品输入通道、至少一个定向流动通道和至少两 个输出通道，其中所述至少一个定向流动通道与所述样品输入通道相交；(b) 电驱动阀，位于不是微流体芯片的一部分的装置上，其中所述电驱动阀通过 控制与至少一个定向流动通道或者至少两个输入通道中的至少一个相交的输 入通道来控制流体的流动；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品的等分试 样中的一种或多种分析物；和(d)处理器，能够基于等分试样中分析物的存在 、不存在、身份、组成或数量对所述等分试样赋值，其中所述处理器与所述 检测器和电驱动阀连通。
在各个方面，提供了用于在微流体芯片内分离流体样品的等分试样的方 法，其中，所述等分试样包含罕见颗粒，所述方法包括以下步骤：(a)检测等 分试样中罕见颗粒的存在与否；(b)基于罕见颗粒的存在与否对所述等分试样 赋值；和(c)基于赋值通过打开电驱动阀引导等分试样的流动，其中所述电驱 动阀位于所述微流体芯片之外的装置上。在一些方面，所述微流体芯片包括 样品输入通道、至少两个输出通道和至少一个定向流动通道，其中所述电驱 动阀控制所述定向流动通道内流体的流动。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的罕见颗粒的装置，该装置包 括：输入通道；第一输出通道；第二输出通道；检测器，配置成检测流体样 品的一部分中颗粒的存在与否；用于基于颗粒的存在与否将该部分的流动从 输入通道引导到第一输出通道、第二输出通道、或其组合的机制；和与所述 第一输出通道流体连通的过滤器。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的罕见颗粒的装置，该装置包 括：(a)至少一个样品输入通道；(b)至少两个输出通道，其中所述两个输出通 道中至少一个与孔阵列流体连通；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品等 分试样中的一种或多种罕见颗粒；和(d)用于通过将包含一种或多种罕见颗粒 的等分试样的流动引导通过第一输出通道来分选所述一种或多种罕见颗粒的 机制。
在各个方面，提供用于进行分析的集成系统，该系统包括：包含颗粒的 流体样品，其中所述颗粒包含标记物；输入通道；第一输出通道；第二输出 通道；第一检测器，配置成检测流体样品的一部分中颗粒的存在与否，所述 部分设置在输入通道内；基于颗粒的存在与否将所述部分的流动从输入通道 引导到第一输出通道的机制；微穴，所述微穴与所述第一输出通道流体连通 并且被配置成捕集颗粒；和第二检测器，配置成检测微穴中标记物的存在与 否。
通过引用纳入
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就 好像将各篇单独的发表物、专利和专利申请特别和单独地通过引用纳入本文 那样。
附图简要说明
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下说明和附图 更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实 施方式：
图1描绘了采用根据本发明的一个方面的流体微流体芯片的免疫染色和 光漂白。
图2描绘了采用根据本发明的一个方面的eDAR设备的免疫染色和光漂 白。
图3描绘了采用根据本发明的一个方面的单一分析物阵列的免疫染色和 光漂白。
图4描绘了根据本发明一个方面的eDAR。
图5显示了根据本发明一个方面的eDAR微流体芯片的微制造的工艺流 程的一个例子。
图6显示了8种示例性的流体动力学分选方案。
图7显示了根据本发明一个方面的微流体芯片和集合eDAR的流体动力 学转换方案。
图8显示了根据本发明一个方面由高速照相机记录的当前流体方案的转 换时间的例子。
图9显示了根据本发明一个方面的eDAR的表征和分析性能。
图10显示了根据本发明一个方面捕获的CTC的微缝和多色荧光成像。
图11显示了根据本发明一个方面的“双捕获”eDAR的一般结构。
图12显示了血流的三种状态的亮场图像。
图13提供了根据本发明一个方面的顺序免疫染色和光漂白测试的一般方 案和过程。
图14显示了根据本发明一个方面捕集在eDAR微流体芯片上的六种癌细 胞的顺序免疫染色和光漂白结果。
图15描绘了根据本发明一个方面暴露于不同功率的光源的抗-EpCAM- PE标记的MCF-7细胞的光漂白曲线的例子。
图16显示了根据本发明一个方面具有Her2+/MUC1-特征的捕获在eDAR 上的四种癌细胞的荧光图像。
图17显示了根据本发明一个方面的单一分析物阵列的示意图。
图18显示了根据本发明一个方面具有捕集密度和尺寸的装置的示意图。
图19描绘了根据本发明一个方面的平行流动阻力阱。
图20显示了用于构建一些本发明所述装置的过程的示意图。
图21显示了根据本发明一个方面用于产生平行流动阻力阱的微制造方法 的例子。
图22描绘了根据本发明一个方面顺序流动阻力阱和平行流动阻力阱收集 、离散化和读取生物来源样品的步骤。
图23显示了根据本发明一个方面基于亮场和荧光显微镜的微孔和侧室的 阵列的检测和读取方案。
图24显示了根据本发明一个方面用于捕集用于分析和释放的生物颗粒/ 细胞的阵列的顺序。
图25显示了根据本发明一个方面能够用本文所述方法分析的15个对照 样品和10个胰腺癌样品的分布。
图26显示了根据本发明一个方面来自胰腺癌样品的具有低上皮细胞粘附 标记物(EpCAM)表达的CTC簇。
发明详述
本发明提供了常常与微流体装置联用的检测、分离和分析流体样品(例如 血液)中的颗粒(例如细胞)的方法、系统和装置。颗粒可以是罕见颗粒(例如罕 见细胞)。本文提供的许多微流体设备可用于对流体样品执行集合决策等分分 级(Ensemble DecisionAliquot Ranking(eDAR))，将流体样品分成等分试样后分 析流体样品。
在一些方面，eDAR设备可用于(i)检测流体样品的等分试样中罕见颗粒(例如罕见细胞)的存在与否，(ii)例如通过将诸如非零或零的术语分配给等分 试样，根据罕见颗粒的存在与否对等分试样进行分级；和(iii)采用诸如流体动 力学转换方案的方案，基于分配的分级指导等分试样的流动或收集。等分试 样可以是总的需要分析的流体样品的总体积的一部分。在一些方面，等分试 样占据三维空间，等分试样内的颗粒可以随机分布。
在一些方面，本发明提供了以非常高的效率、灵敏度和/或回收率对流体 样品进行eDAR的设备和方法。例如，本文提供的eDAR设备可以从流体样 品(例如血液、全血、尿液等)回收大于95％的特别罕见的细胞类型。eDAR设 备的假阳性率可以小于10％，小于5％，或者甚至是0％。假阳性率可以超过 多个样品，例如大于10个样品，或者大于15个样品。eDAR设备的速度也 可以非常快。例如，整个样品可以在不到25分钟，例如小于20分钟等时间 内得到处理。
通常，本文提供的eDAR设备可以包括微流体芯片，该微流体芯片包括 (a)通道；(b)腔室；(c)过滤器；(d)检测器和/或(e)阀。微流体芯片可以是更 大系统的一部分，所述系统包括(a)用于容纳缓冲液的容器；(b)芯片外(off- chip)阀(例如，电磁阀)；(c)光源和检测器；(d)管道；(e)样品入口；(f)数字处理 器和/或其他特征。过滤器和微缝或微孔(例如，微缝阵列)可用于进一步纯化 样品。在这里，术语“微缝”和“微孔”可互换使用，并且微缝或微孔也可 包括柱杆阵列，其中柱杆间的间隔可用于执行过滤。柱杆间的间隔可以是均一的或者是变化的。在一些方面，将样品引入eDAR设备，然后通过流体动 力学转换方案执行主动分选。流体动力学转换方案可包括具有特定几何形状 的通道，如下文进一步所述。
在一些方面，本发明提供了用于捕获样品内多于一种类型的分析物(例如 罕见细胞)，或者分析物群内多于一种亚群的分析物(例如罕见细胞)的方法和 设备。样品可以用各种检测试剂进行标记，从而检测各种分析物(例如罕见细 胞)。例如，样品可以是混合样品并且包含混合的罕见细胞群。混合的罕见 细胞群可以包括上皮细胞和间充质细胞以及其他细胞类型。采用不同的检测 试剂，一种检测试剂可以结合到上皮细胞的上皮标记物上，而不同的试剂结 合到间充质细胞的间充质细胞标记物上。
混合样品可以在输入通道引入微流体芯片设备。设备上的侧通道可用于 控制混合样品的流动的流体动力学转换。流体的流动可以通过两个电磁阀控 制，将多个分析物分成微流体芯片的两个不同的区域。在一些方面，分析物 可以在微流体芯片上被进一步纯化，例如通过使流体通过过滤器或微缝阵列 。分析物可以在过滤器或者微缝阵列上收集。
本发明还提供了可与eDAR偶联、或者可以与其他微流体装置联用的染 色和洗涤系统的方法。染色和洗涤系统的方法可以是直列式的。直列式的染 色和洗涤方法提供了分离单独的分析物(例如细胞)和检测生物标记物的自动化 方法。该方法也可降低检测分析物上不同的标记物所需的检测试剂(例如抗体) 的量。该方法还可以尽可能减小系统的死体积。此外，设备可包括用于避免 将气泡引入设备的机制。
eDAR可以与下游的表征和分析方法偶联。这些方法包括罕见细胞的细 胞和分子分析。在一些方面，可利用免疫染色来确定罕见细胞上某些生物标 记物的表达。本文表述了用于免疫染色的半自动方法和系统。
本发明还提供了用于流体样品的单一分析物阵列的系统、方法和设备。 单一分析物阵列可包括多个孔或微孔，它们经配置使得流体样品中不超过一 个分析物将占据一个具体的孔。在一些方面，微孔可以是微穴。单一分析物 阵列可包括多个插片(patches)或微插片，它们经配置使得流体样品中不超过一 个分析物将占据一个具体的插片。包含分析物的流体样品可以引入阵列和分 析物(例如细胞)并且可以分配成至少80％装置的微孔或微插片包含不超过一 个分析物。在一些方面，单一分析物阵列可以与微流体系统联用。在一些方 面，微流体系统可以是eDAR装置。
在一些方面，单一分析物阵列涉及一种方法，包括以下步骤：当细胞在 液相转运时限制或物理捕集单一细胞，并且沿着液相的流路，转运至物理限 制位置，由于后续基于流动力或者表面粘附力而保留在该限制位置。在另一 种情况下，随着流体流路相对于入口到出口的顺序，细胞相继被捕集。在另 一种情况下，由于入口到出口之间细胞同时经历多个流路，多个流体流路以 及相应的多个单一细胞以平行方式被捕集/隔离。
本发明所述的方法、系统、设备和装置可以在生物学和病理学的多种应 用中使用，用于隔离、浓缩/或分离分析物(例如罕见细胞)。例如，一些应用 可包括但不限于：从流体(流入体液)捕获罕见细胞(例如，癌细胞、癌性干细 胞、感染疟疾的红细胞、干细胞、胚胎细胞、免疫细胞、感染细胞)用于疾病 的诊断和预后；分离单细胞寄生物(例如，贾第虫属、隐孢子虫属)用于水质监 测；分离感染细胞(例如淋巴细胞、粒细胞)用于监测疾病进程(例如，HIV, AIDS,癌症)；母体血液中的胎儿细胞用于筛选(例如，疾病、遗传性异常)； 干细胞用于治疗应用；感染朊病毒的细胞用于朊病毒相关疾病(例如疯牛病)筛 选；以及其他。
在一个具体的方面，罕见颗粒是罕见细胞。罕见细胞可以成核或未成核 。罕见细胞包括但不限于：表达恶性表型的细胞；胎儿细胞，例如母体外周 血中的胎儿细胞，肿瘤细胞，例如从肿瘤转移至血液或其他体液的肿瘤细 胞；受到病毒感染的细胞，例如被HIV感染的细胞，被感兴趣基因转染的细 胞；患有自体反应性疾病的对象的外周血中存在的T-细胞或B-细胞的异常亚 型。
如文所述，“集合决策”是指基于检测颗粒的集合，或者组中特征的存 在与否作出的决策。组可以包括至少三种颗粒、分析物和/或细胞。在一些方 面，集合决策将基于包含多个颗粒的流体样品的等分试样中单一独特颗粒的 存在与否来作出。重要的是，基于单一颗粒的存在与否作出的集合决策将应 用于整个等分试样(即等分试样中存在的所有颗粒)。
如本文所用，“等分试样”是指需要分析的流体样品的总体积的一部分 。等分试样可以包含至少一种颗粒、分析物或细胞。等分试样可包含一组颗 粒、分析物或细胞。等分试样占据三维空间，其中的颗粒无组织随机分布。 等分试样具有有限的深度，颗粒可以沿着深度分布而没有可辨别的层。在本 申请的内容中，以其整体分析等分试样而不分割。
如本文所用，短语“分配流体”是指从流体样品的总体积分隔或以其他 方式重新定向一部分或者等分试样的流体。
在某些方面，等分试样由较大的流体样品的一部分组成，例如，约1/2 的流体样品，或者约1/3,1/4,1/5,1/6,1/7,1/8,1/9,1/10，或者更少的流体样品 。在某些方面，例如，等分试样由约10％的流体样品组成，或者约9％,8％, 7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,0.001％，或者更少的 流体样品组成。这样，需要通过本文所述的eDAR方法检查或处理的流体可 以分成(例如)至少约2个等分试样，或者至少约3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,110,120,130, 140,150,175,200,225,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900,1,000, 1,100,1,200,1,300,1,400,1,500,1,600,1,700,1,800,1,900,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500,5,000,6,000,7,000,8,000,9,000,10,000,20,000,30,000, 40,000,50,000,60,000,70,000,80,000,90,000,100,000,200,000,300,000, 400,000,500,000,600,000,700,000,800,000,900,000,1百万,2百万,3百万,4 百万,5百万,6百万,7百万,8百万,9百万,一千万,或更多等分试样。本领域 技术人员将理解，流体样品分配成的等分试样的数量将取决于流体中预期的 罕见颗粒的数量和流体样品的总体积。
在某些方面，等分试样可包括较大的流体样品的一部分，例如1/2的流 体样品，或者1/3,1/4,1/5,1/6,1/7,1/8,1/9,1/10,或更少的流体样品。在某些 方面，等分试样可包括例如10％的流体样品，或者9％,8％,7％,6％,5％,4％, 3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,0.001％,或更少的流体样品。这样，需 要通过本文所述的eDAR方法检查或处理的流体可以分成(例如)至少2个等分 试样，或者至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30, 35,40,45,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,175,200,225,250,300, 350,400,450,500,600,700,800,900,1,000,1,100,1,200,1,300,1,400,1,500, 1,600,1,700,1,800,1,900,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500,5,000,6,000, 7,000,8,000,9,000,10,000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,70,000,80,000, 90,000,100,000,200,000,300,000,400,000,500,000,600,000,700,000,800,000, 900,000,1百万,2百万,3百万,4百万,5百万,6百万,7百万,8百万,9百万, 一千万,或更多等分试样。本领域技术人员将理解，流体样品分配成的等分试 样的数量将取决于流体中预期的罕见颗粒的数量和流体样品的总体积。
在某些方面，例如，等分试样的体积可以是约0.1nL至约10mL，或者 约1nL至约1mL，或者约1nL至约100μL，或者约1nL至约10μL，或者 约1nL至约1μL，或者约1nL至约100nL，或者约0.1nL至约10nL。
在某些方面，例如，等分试样的体积可以是约0.1nL-10mL，或约1nL- 1mL，或约1nL-100μL，或约1nL-10μL，或约1nL-1μL，或约1nL-100 nL，或约0.1nL-10nL。
如本文所用，术语“分级”是指通过分类评估等分试样的定量性质、定 性性质、或者重要性。一方面，等分试样可以分级为零(例如，等分试样中没 有检测到罕见颗粒)，或者非零(例如，等分试样中检测到至少一个罕见颗粒) 。一方面，分级可以是二元的。在其他方面，等分试样可以根据其他分类法 进行分级，例如，与等分试样中罕见颗粒的浓度，等分试样中罕见颗粒的身 份，等分试样中多个不同的罕见颗粒的身份等相关。在这种方式中，可以基 于浓度范围，例如约1-10，约11-20，约1-50，约51-100，约1-100，约101- 201等，分配任意的分类数量。在一些方面，可以基于浓度范围，例如1- 10，11-20，1-50，51-100，1-100，101-201等，分配分类数量。这些分级可 以分配对应于各种预定的定量或定性分类的数字之一的任意数字(例如，0,1, 2,3,4,5等)，或对应于等分试样中罕见颗粒的数量或大致数量的实际值的数 。
如本文所用，术语“微流体芯片”可以与术语芯片、流体芯片、微芯片 或流体微芯片互换使用。
如本文所用，“计算机”是指至少一种数字处理器。数字处理器可以 是，但不限于，如现场可编程门阵列(FGPA)、专用集成电路(ASIC)或实时(RT) 处理器。
进行分析的装置、设备和方法
本发明所述方法可用于分离和检测流体样品中的分析物。在一些方面， 该方法包括使用第一标签或第一组标签检测分析物上的分子，降低标签发射 的信号，以及使用第二标签或第二组标签检测分析物上的另一组分子。在一 些方面，该方法可以使用从样品分离的分析物进行。在一些方面，该方法可 以与微流体装置联用。微流体装置可用于从样品分离分析物。在一些方面， 称为免疫染色和漂白的方法可以在用于从样品分离分析物的微流体装置上进 行。
图1显示了免疫染色和光漂白方法的示例的概念图。该免疫染色和光漂 白方法可以在微流体装置100以及检测方案155上进行。微流体装置100可 置于光源180和照射源175上面或下面的显微镜的平台160上。分析物可以 引入微流体装置100，在110进行eDAR以从流体样品分离分析物。分析的 分析物可以引导到分阶腔室115，在这里分析物保留到免疫染色和光漂白方法 的持续时间。分析物可以与一种或多种标签接触120。照射源175可以照射 分析物上的一种或多种标签125，一种或多种标签发射的信号可以检测130。 照射源175可以源自激光，或发光二极管(LED)，或灯190。可以使用光源 180降低标签发射的信号135。在降低信号135期间，可使用数字处理器(例 如，计算机)和软件165和电荷耦合器件(CCD)170检测标签发射的信号的持 续时间130。在一些方面，带标签的分析物对光照源的暴露时间可以持续到 标签发射的信号消失。步骤120,125,130和135包括一个免疫染色和光漂白循环。免疫染色和光漂白循环140可以重复一直到完成多个循环。最终一轮 光漂白135可以在或不在最终循环期间进行。检测分析物130之后，进行最 终循环以分析标签发射的信号150。
图2显示了可以与免疫染色和光漂白方法290联用的eDAR设备200的 示例的概念图。流体样品储库225和通道230可连接至流体样品入口245。 缓冲液储库215可通过管线235连接至加压气体源205。缓冲液入口250可 连接至流体样品入口245。过滤区域270可连接至缓冲液入口250，流体样品 入口245，出口275和废液腔室280。流体样品可以进入eDAR设备200，分 析物或多个分析物可以被捕集到过滤平台270上。过滤平台可以包含多个腔室，在这里每个腔室可以含有单一的分析物。免疫染色和光漂白方法290可 以在包含过滤平台270的微流体芯片260的一部分上进行。
本发明提供了一种利用单一分析物阵列进行的顺序的免疫染色和光漂白 的方法。该单一分析物阵列允许隔离、捕集、操控和检测单一分析物(例如细 胞)。细胞常常被流体流动产生的力、引力、表面粘附力、化学力或光学力捕 集。在一些方面，单一分析物阵列各孔可以用能够与捕集的细胞结合(例如共 价、离子等方式)的元素功能化。捕集的细胞可以与化学试剂接触。化学试 剂可以是用于检测外部分子的标记，或者穿透细胞膜并标记细胞内分子。标 记细胞可以成像并进一步分析。
图3显示了与免疫染色方法联用的单一分析物阵列的示例的概念图。流 体单一分析物阵列315可以是微流体芯片或者结构的一部分并且放置在微流 体平台310上。免疫染色方法可以在流体单一分析物阵列315以及检测方案 350上进行。微流体芯片平台310可以放置在光源370和照射源375上面或 下面的显微镜的平台355上。流体样品中的分析物可以引入到流体单一分析 物阵列300。分离的分析物可以引导到流体单一分析物阵列区域320，在这里 捕集的单一分析物可以保留到免疫染色方法的持续时间。分析物可以使用各 种方法制备325，包括但不限于，透化和/或固定。分析物可以与一种或多种 标签接触330。照射源375可以照射335分析物上的一种或多种标签，一种 或多种标签发射的信号可以被检测340。照射源375可以源自激光380。分 析物可以经过进一步加工处理和分析345。可使用数字处理器(例如计算机)和 软件360以及,电荷耦合器件(CCD)365检测标签发射的信号。
对于顺序的免疫染色和光漂白，可以使用光源370降低标签发射的信号 。在信号降低期间，可使用计算机和软件360以及电荷耦合器件(CCD)365 检测标签发射的信号的强度。带标签的分析物对照射源的暴露时间可以持续 到标签发射的信号消失。步骤330,335,340和345包括一个免疫染色和光漂 白循环。循环可以重复一直到完成多个循环。
eDAR设备可用于鉴定和分离分析物(例如罕见细胞)。eDAR可以处理等 分试样中的样品，通过流体动力学转换方案控制的主动分选步骤在通道或腔 室中收集罕见细胞。可使用本文中称为微流体芯片的“集成(all-in-one)微流 体芯片”以及通道和腔室来分选罕见细胞。微流体芯片可以部分地由功能区 域微制造过滤器组成。eDAR可用于快速(例如，小于或等于12.5分钟/1毫升) 分析含有混合的分析物群的流体(例如大于或等于1毫升的全血)，回收率高 (例如，大于或等于90％)，假阳性率低(例如，接近零)。
微流体芯片的一般结构以及eDAR的示意性构造如图7A所示。底部左 侧通道可用于收集分选的等分试样并且可用于将它们转移到后续的纯化(例如 纯化腔室)区域(例如20,000微缝)。用虚线方块标记的区域进一步如图7B-D 所示。在没有阳性等分试样分级时示例性的流动条件如图7B所示。血液流 动可以转换至收集通道，分选的等分试样可以通过图7C中的第二个窗口证实 。图7D显示了分选等分试样之后转换回去的血液流动。
设备可以具有多个流速。流速是指流体流动通过eDAR设备和该设备附 连的任意组件的速率。在一些方面，示例性的流速可以小于约5微升/分钟、 10微升/分钟、20微升/分钟、25微升/分钟、30微升/分钟、35微升/分钟、40 微升/分钟、41微升/分钟、42微升/分钟、43L/分钟、44微升/分钟、45微升/ 分钟、46微升/分钟、47微升/分钟、48微升/分钟、49微升/分钟、50微升/分 钟、51微升/分钟、52微升/分钟、53微升/分钟、54微升/分钟、55微升/分钟、56微升/分钟、57微升/分钟、58微升/分钟、59微升/分钟、60微升/分钟、 61微升/分钟、62微升/分钟、63微升/分钟、64微升/分钟、65微升/分钟、66 微升/分钟、67微升/分钟、68微升/分钟、69微升/分钟、70微升/分钟、71微 升/分钟、72微升/分钟、73微升/分钟、74微升/分钟、75微升/分钟、76微升/ 分钟、77微升/分钟、78微升/分钟、79微升/分钟、80微升/分钟、81微升/分 钟、82微升/分钟、83微升/分钟、84微升/分钟、85微升/分钟、86微升/分钟 、87微升/分钟、88微升/分钟、89微升/分钟、90微升/分钟、91微升/分钟、 92微升/分钟、93微升/分钟、94微升/分钟、95微升/分钟、96微升/分钟、97 微升/分钟、98微升/分钟、99微升/分钟、100微升/分钟、105微升/分钟、110 微升/分钟、115微升/分钟、120微升/分钟、125微升/分钟、130微升/分钟、 140微升/分钟、150微升/分钟、160微升/分钟、170微升/分钟、180微升/分 钟、190微升/分钟、200微升/分钟、225微升/分钟、250微升/分钟、275微升 /分钟、300微升/分钟、350微升/分钟、400微升/分钟、450微升/分钟、500 微升/分钟、600微升/分钟、700微升/分钟、800微升/分钟、900微升/分钟或 1000微升/分钟。
在一些方面，流速可以约为5微升/分钟-30微升/分钟、15微升/分钟-50 微升/分钟、25微升/分钟-75微升/分钟、40微升/分钟-80微升/分钟、50微升/ 分钟-90微升/分钟、60微升/分钟-100微升/分钟、800微升/分钟-160微升/分 钟、90微升/分钟-180微升/分钟、100微升/分钟-200微升/分钟、150微升/分 钟-300微升/分钟、200微升/分钟-400微升/分钟、300微升/分钟-500微升/分 钟、400微升/分钟-600微升/分钟、500微升/分钟-700微升/分钟、600微升/分 钟-800微升/分钟、700微升/分钟-900微升/分钟或800微升/分钟-1000微升/分 钟。
在一些方面，示例性的流速可以小于5微升/分钟、10微升/分钟、20微 升/分钟、25微升/分钟、30微升/分钟、35微升/分钟、40微升/分钟、41微升/ 分钟、42微升/分钟、43L/分钟、44微升/分钟、45微升/分钟、46微升/分钟 、47微升/分钟、48微升/分钟、49微升/分钟、50微升/分钟、51微升/分钟、 52微升/分钟、53微升/分钟、54微升/分钟、55微升/分钟、56微升/分钟、57 微升/分钟、58微升/分钟、59微升/分钟、60微升/分钟、61微升/分钟、62微 升/分钟、63微升/分钟、64微升/分钟、65微升/分钟、66微升/分钟、67微升/ 分钟、68微升/分钟、69微升/分钟、70微升/分钟、71微升/分钟、72微升/分 钟、73微升/分钟、74微升/分钟、75微升/分钟、76微升/分钟、77微升/分钟 、78微升/分钟、79微升/分钟、80微升/分钟、81微升/分钟、82微升/分钟、 83微升/分钟、84微升/分钟、85微升/分钟、86微升/分钟、87微升/分钟、88 微升/分钟、89微升/分钟、90微升/分钟、91微升/分钟、92微升/分钟、93微 升/分钟、94微升/分钟、95微升/分钟、96微升/分钟、97微升/分钟、98微升/ 分钟、99微升/分钟、100微升/分钟、105微升/分钟、110微升/分钟、115微 升/分钟、120微升/分钟、125微升/分钟、130微升/分钟、140微升/分钟、150 微升/分钟、160微升/分钟、170微升/分钟、180微升/分钟、190微升/分钟、 200微升/分钟、225微升/分钟、250微升/分钟、275微升/分钟、300微升/分 钟、350微升/分钟、400微升/分钟、450微升/分钟、500微升/分钟、600微升 /分钟、700微升/分钟、800微升/分钟、900微升/分钟或1000微升/分钟。
在一些方面，流速可以约为5微升/分钟-30微升/分钟、15微升/分钟-50 微升/分钟、25微升/分钟-75微升/分钟、40微升/分钟-80微升/分钟、50微升/ 分钟-90微升/分钟、60微升/分钟-100微升/分钟、800微升/分钟-160微升/分 钟、90微升/分钟-180微升/分钟、100微升/分钟-200微升/分钟、150微升/分 钟-300微升/分钟、200微升/分钟-400微升/分钟、300微升/分钟-500微升/分 钟、400微升/分钟-600微升/分钟、500微升/分钟-700微升/分钟、600微升/分 钟-800微升/分钟、700微升/分钟-900微升/分钟或800微升/分钟-1000微升/分 钟。
设备可以具有多种分选效率。分选效率是指感兴趣分析物的回收率。在 一些方面，示例性的分选效率可以大于约5％,10％,20％,25％,30％,35％,40％, 41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％, 55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％, 69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％, 83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％,99％或100％。在一些方面，分选效率可以约为5％-30％,15％- 50％,25％-75％,40％-80％,50％-90％或60％-100％。
在一些方面，示例性的分选小于可以大于5％,10％,20％,25％,30％,35％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％, 54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％, 68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％, 82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％, 96％,97％,98％,99％或100％。在一些方面，分选效率可以是5％-30％,15％- 50％,25％-75％,40％-80％,50％-90％或60％-100％。
eDAR设备可以具有多个回收率。回收率是指感兴趣分析物的回收率。 在一些方面，回收率可以大于约5％,10％,20％,25％,30％,35％,40％,41％, 42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％, 56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％, 70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％, 84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％, 98％,99％或100％。在一些方面，回收率可以约为5％-30％,15％-50％,25％- 75％,40％-80％,50％-90％或60％-100％。
在一些方面，回收率可以大于5％,10％,20％,25％,30％,35％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％, 56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％, 70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％, 84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％, 98％,99％或100％。
在一些方面，回收率可以是5％-30％,15％-50％,25％-75％,40％-80％, 50％-90％或60％-100％。
在一些方面，可以使用eDAR设备或方法从第二细胞类型分离第一细胞 类型。在一些方面，分离的样品包含大于5％,10％,20％,25％,30％,35％, 40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％, 54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％, 68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％, 82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％, 96％,97％,98％,99％或100％的第一细胞类型的总量。在一些方面，分离的样 品包含小于1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％, 15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45,50％,60％,70％,80％ 或90％的第二细胞类型的总量。
eDAR设备包括显微镜，配备有用于激发的照射源(例如激光)和检测模 式，光源(例如光漂白)，计时器，管道，废液收集装置，用于带标签的分析物 (例如细胞)成像的照相机，控制微流体芯片流体流入和流出的泵，控制主动分 选步骤的数字处理器以及用于处理图像的数字处理器(例如计算机系统)。数 字处理器可以是计算机。
在一些方面，eDAR平台可包括用于捕获多于一种分析物(例如罕见细胞) 的设备。“双捕获”eDAR可以从混合样品分离多种罕见细胞。混合样品(例 如流体样品)可以用检测反应试剂进行标记，在主通道进入“双捕获”设备的 顶部。两侧通道可用于控制混合样品的流动的流体动力学转换。在一些方 面，可以使用两个螺线管来控制流动。两种罕见细胞的亚群可以被分离和捕 集到相同的微流体芯片的两个不同的过滤区域。
在各种方面，提供用于分配源自流体的样品中表达特定生物标记物概况 的细胞的设备，其中：设备包括与微流体芯片连接的管道组，具有至少一个 通道和腔室；设备能够分离腔室中的细胞，分离之后，腔室包含大于80％样 品中表达特定生物标记物概况的细胞群总量，分离之后，腔室包含小于5％样 品中表达不同生物标记物概况的细胞群总量。
在一些方面，表达特定生物标记物概况的细胞的分离过程不到20分钟。 在一些方面，流体样品中特定生物标记物概况的含量不到5％的细胞。在某 些方面，流体是血。在其他方面，流体是分离的的全血。在其他方面，流体 是全血的核化细胞馏分。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的颗粒的系统，该系统包括：微 流体芯片，包括输入通道、第一输出通道、第二输出通道、和定向流动通 道；阀，所述阀与所述微流体芯片可分离，其中：所述阀调节第一流体在定 向流动通道中的流动；在定向流动通道中的第一流体的流动将第二流体从输 入通道引导到第一输出通道、第二输出通道、或它们的组合；检测器，其被 配置成检测输入通道中第二流体的一部分发射的信号；和处理器，配置成基 于所述信号对所述部分赋值和操纵阀。在一些方面，阀是电驱动阀。
在各个方面，提供用于检测流体样品中的颗粒的系统，该系统包括：(a) 微流体芯片，包括至少一个样品输入通道，至少一个定向流动通道和至少两 个输出通道，其中所述至少一个定向流动通道与样品输入通道相交；(b)电驱 动阀，位于不是微流体芯片的一部分的装置上，其中所述电驱动阀通过控制 与至少一个定向流动通道或者至少两个输出通道中的至少一个相交的输入通 道来控制流体流动；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品等分试样中的一 种或多种分析物；和(d)处理器，能够基于等分试样中分析物的存在、不存在 、身份、组成或量对等分试样赋值，其中所述处理器与检测器和电驱动阀连 通。
在一些方面，电驱动阀是电磁阀。在某些方面，电驱动阀控制至少一个 定向流动通道中流体的流动。在其他方面，电驱动阀通常关闭，在接收到来 自处理器的信号之后电驱动阀打开。在其他方面，电驱动阀通常开放，在接 收到来自处理器的信号之后电驱动阀关闭。
在一些方面，至少一个定向流动通道包括至少两个端口，所述电驱动阀 控制通过端口之一的流体的流动。在某些方面，电驱动阀直接控制至少一个 定向流动通道中流体的流动。在某些方面，电驱动阀直接控制送料到至少一 个定向流动通道的通道中的流体的流动。在某些方面，电驱动阀直接控制仅 一个定向流动通道中流体的流动。在其他方面，电驱动阀直接控制输出通道 中流体的流动。在其他方面，电驱动阀直接控制送料到输出通道的通道中的 流体的流动。在一些方面，电驱动阀是压电阀。
在一些方面，定向流动通道与输出通道在连接处相交。在某些方面，检 测器位于不是输出通道的至少一个通道上。在一些方面，该装置包括验证激 光。在某些方面，验证激光位于不是输入通道的至少一个通道上。在其他方 面，系统包括第二检测器。在其他方面，至少一个通道与过滤器流体连通。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的罕见颗粒的装置，该装置包 括：输入通道；第一输出通道；第二输出通道；检测器，配置成检测流体样 品的一部分中颗粒的存在与否；用于基于颗粒的存在与否将该部分的流动从 输入通道引导到第一输出通道、第二输出通道、或其组合的机制；和与所述 第一输出通道流体连通的过滤器。在一些方面，过滤器包括孔阵列。在某些 方面，阵列中每个孔的最小尺寸小于颗粒的最小尺寸。
在各种方面，提供装置用于检测流体样品中的罕见颗粒，该装置包括： (a)至少一个样品输入通道；(b)至少两个输出通道，其中所述两个输出通道中 至少一个与孔阵列流体连通；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品等分试 样中的一种或多种罕见颗粒；和(d)用于通过将包含一种或多种罕见颗粒的等 分试样的流动引导通过第一输出通道来分选所述一种或多种罕见颗粒的机制 。
在一些方面，装置包括第一输出通道和第二输出通道。在某些方面，如 果等分试样不含罕见颗粒，机制将等分试样的流动引导到第二输出通道。在 某些方面，用于分选的机制包括电极，磁性元素、声波元素或电驱动元素。
在一些方面，孔阵列位于输入通道和输出通道之间。在某些方面，孔阵 列位于和输入通道和输出通道相同的平面。在其他方面，孔阵列位于第一输 出通道内。在其他方面，孔阵列位于与第一输出通道流体连通的腔室中。在 一些方面，孔阵列被配置成罕见颗粒无法通过孔但至少一种其他颗粒能够通 过孔。在某些方面，孔阵列被配置成罕见颗粒能够通过孔而至少一种其他颗 粒无法通过孔。在其他方面，孔阵列包括大于1000孔。
在某些方面，检测器选自：照相机，电子倍增器，电荷耦合器件(CCD) 图像感应器；光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极管(APD)，单光子雪崩二极管 (SPAD)，光电倍增管(SiPM)，和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像感应器。
在各个方面，提供用于进行分析的集成系统，该系统包括：包含颗粒的 流体样品，其中，所述颗粒包含标记物；输入通道；第一输出通道；第二输 出通道；第一检测器，配置成检测流体样品的一部分中颗粒的存在与否，该 部分设置在输入通道内；基于颗粒的存在与否将该部分的流动从输入通道引 导到第一输出通道的机制；与所述第一输出通道流体连通的微穴，并且被配 置成捕集颗粒；和第二检测器，配置成检测微穴中标记物的存在与否。
微流体芯片设计和制造
可以制造微流体芯片以提供有效的主动分选方案和后续的纯化(例如纯化 腔室)方案。微流体芯片可以由位于硅母版上的两层组成，采用一步复型模制 制造成聚二甲基硅氧烷(PDMS)。微流体芯片可以粘结到玻璃基板进行精整。
在一些方面，硅母板可以采用两种光刻工艺制造(图5)。可以采用标准 软件(例如AutoCAD,Autodesk,San Rafael,CA)设计特征并且可以写在铬掩模 上。在这些情况下，可采用正性胶光刻和深度反应性离子刻蚀(DRIE)来形成 第一层(图5)。第一层可以是微滤器特征。在一些方面，正性胶光刻(例如 AZ 1512)通过包括DRIE工艺的过程来实现。DRIE工艺可以实现适合各种特 征的深度(例如4.5-5μm)。
在一些方面，eDAR微流体芯片特征的第二层可以采用负性光刻胶(例如 来自马萨诸塞州牛顿市微化学公司(MicroChem)的SU-8-3050)，该特征的高度 可以控制(例如50μm)。母版可以采用例如十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅 烷(密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))硅烷化。硅 烷化的母版和硅晶片可以涂覆未固化的PDMS并烘烤(例如在70℃保持2小时) 。在一些方面，具有所需微特征的PDMS片可以从硅母版剥离，然后采用等 离子氧化的标准工艺粘结一片盖玻片以完成eDAR微流体芯片的制造。
微流体芯片可包含包括染色区域、光漂白区域、成像区域和其他区域的 专门化区域。在一些方面，这些区域可以是相同的区域，用于至少一种目的 。在其他情况下，区域可以是用于一种目的的不同区域。在其他情况下，区 域可以是用于至少一种目的的不同区域。每个区域可用于超过一种目的。在 一些方面，eDAR微流体芯片包括通过标准光刻方法制造的集成的过滤区域。 在一些方面，微流体芯片可具有两个集成的功能区域，eDAR分选区域和基于 狭缝结构的过滤单元。
微流体芯片中的通道
本发明描述了用于检测流体样品中的分析物(例如罕见颗粒)的设备，该 设备包括：(a)至少一个第一输入通道；(b)至少两个出口通道；(c)至少一个 检测器，能够检测生物流体的等分试样中的一种或多种罕见颗粒；(d)用于引 导等分试样的流动的机制；和(e)分级装置，能够基于等分试样中罕见颗粒的 存在、不存在、身份、组成或量对等分试样赋值，其中，数字处理器(例如计 算机)与检测器和用于引导等分试样的流动的机制连通。
在一些方面，本文所述的设备可包括由壁封闭和/或在基板上微制造的流 动通道，设计特征以使对分析物(例如罕见细胞)的不经意损伤最小。降低对 罕见细胞的不经意损伤可以降低导致错误的患者诊断或预后的假阴性率。流 动通道可以进一步包括具有流体动力学设计孔以排除应力或损伤最小的生物 细胞的通道。流动通道可参见美国专利申请2007/0037172和2008/0248499。 这些通道在上述专利申请中被称为具有一纬(“1-D”)孔的通道，能够降低细 胞排除过程期间细胞经历的流体动力学压力，因而降低细胞溶解的可能。具 有1-D孔的通道可以基于美国专利2008/0318324所述的“溢流过滤”构造在 阵列中战略性排布，以进一步更改、分配、缓冲或分散流动，结果降低在排 除时刻细胞经历的冲击力。封闭流动通道的壁可以根据PCT/US2009/02426 中描述的方法采用UV固化工艺，由生物相容的基板材料，即医用装置级别 的聚合物制造，使得eDAR设备符合管理医用装置制造的规定。
可用于将流体引入分选连接处的分选区域中的主通道可具有特定的高度 (例如，50μm)和特定的宽度(例如，150μm)。在大多数情况下，其他通道(例 如，四个)可具有特定的高度(例如，50μm)和特定的宽度(例如，200μm)。过 滤单元中基于狭缝结构的过滤器可具有特定的高度(例如，5μm)和特定的宽度 (例如，5μm)。微流体芯片在狭缝结构中可包含最多达并且可包括50,000狭 缝。
在一些方面，eDAR设备可进一步包括基于所述分级引导所述等分试样 的通道。通道可以用以下物质进行处理：抗凝血化合物、优先结合分析物(例 如罕见生物颗粒)的化合物、防止罕见生物颗粒团聚的化合物、或它们的组合 。
在一些方面，本文所述的eDAR设备包括多个流动通道，包括一个或多 个输入流动通道(例如，将等分试样引导到检测体积的通道)以及一个或多个输 出通道(例如，将等分试样从检测体积带出来的通道)。在一些方面，本文所 述的eDAR设备可包括至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100或更多输入通道以及至少约 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45, 50,60,70,80,90,100或更多输出通道的组合。在一些方面，本文所述的 eDAR设备可包括至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100或更多输入通道以及至少1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70, 80,90,100或更多输出通道的组合。在一些方面，设备可包括连接至主通道 的多个流动通道以注射额外的流体以改变局部速度。
在一些方面，流体从作为微流体芯片的一部分的通道传送到与通道流体 连通但是位于微流体芯片外部的腔室。在一些方面，腔室是小瓶。在其他方 面，腔室是单一孔或孔板中的孔。在其他方面，腔室是微量离心管。在其他 方面，腔室是微量离心管，其中所述微量离心管是Eppendorf管。对于小瓶 可以是任何合适的结构，本领域普通技术人员容易鉴定适用于本发明的合适 的腔室。
在一些方面，流体经管道或者用于运输流体的其他合适的结构从通道传 送到与通道流体连通的腔室。管道可包括由生物相容的聚合物构成的材料。 在其他方面，腔室可以经毛细管(例如熔融二氧化硅毛细管)与通道流体连通， 例如用于执行毛细管电泳。适用于使通道与腔室流体连通的其他类型的管道 是本领域普通技术人员容易明白的。
如本文所用，术语“流体连通”(及其变体)是指组件之间流体路径的存 在。流体连通既不是暗示，也是不排斥任何中间结构或组件的存在。两个组 件可以流体连通，即使在一些情况下，它们之间的路径被阻塞和/或流体没有 在它们之间流动。因此，在某些方面，在流体连通的地方考虑间歇性流体流 动。
在一些方面，本文所述的设备可包括由以下材料制造的壁封闭的流动通 道或腔室，包括但不限于：聚合物材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨酯-甲 基丙烯酸酯(PUMA),聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚乙烯,聚酯(PET),聚四氟乙 烯(PTFE),聚碳酸酯,聚对二甲苯,聚氯乙烯,氟乙基丙烯,Lexan,聚苯乙烯,环 烯烃共聚物,聚氨酯,聚酯碳酸酯,聚丙烯,聚丁烯,聚丙烯酸酯,聚已酸内酯,聚 酮,聚邻苯二甲酰胺,乙酸纤维素,聚丙烯腈,聚砜,环氧聚合物,热塑塑料,氟聚 合物,和聚偏乙烯氟化物,聚酰胺,聚酰亚胺),无机材料(玻璃、石英、硅、 GaAs、氮化硅),熔融二氧化硅,陶瓷,玻璃(有机),金属和/或其他材料以及它们 的组合。
在一些方面，壁材料可以由以下材料构成：多孔膜、羊毛的织造或非织 造纤维(例如布或网)、金属(例如不锈钢或莫内尔合金)、玻璃、纸、或合成 材料(例如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯以及各种聚酯)、烧结的不 锈钢和其他金属、和多孔无机材料如氧化铝、氧化硅或碳。
在一些方面，本文所述的设备可包括已用化学或生物学分子预处理的流 动通道或腔室。例如，通道或腔室可以用以下物质处理：抗凝血化合物以防 止或减少流体样品中分析物(例如罕见颗粒或细胞)的缔合，优先结合分析物 (例如罕见颗粒或细胞)的化合物，或者防止或减少流体样品中分析物(例如罕 见颗粒或细胞)的团聚或凝聚的化合物。
在一些方面，通道或腔室表面可以用以下物质处理：抗凝血化合物、优 先结合循环的肿瘤细胞的化合物，或防止细胞粘着的化合物。
在一些方面，通道或腔室表面可经化学修饰以提升润湿性或者有助于选 择细胞、颗粒或分子的吸附。表面修饰化学物质可包括但不限于：硅烷，例 如三甲基氯硅烷(TMCS),六甲基二硅氮烷(HMDS)，(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基) 三氯硅烷，氯二甲基辛基硅烷，十八烷基三氯硅烷(OTS)或γ-甲基丙烯酰氧 基丙基三甲氧基硅烷；聚合物，如丙烯酸，丙烯酰胺，二甲基丙烯酰胺 (DMA)，2-羟乙基丙烯酸酯，聚乙烯醇(PVA)，聚(乙烯基吡咯烷酮(PVP)，聚 (乙烯亚胺)(PEI)，聚乙二醇(PEG)，环氧聚(二甲基丙烯酰胺)(EPDMA)，或 PEG单甲氧基丙烯酸酯；表面活性剂，如普流罗尼克表面活性剂，聚(乙二醇) 基(PEG)表面活性剂，十二烷基硫酸钠(SDS)，十二烷基三甲基氯化铵 (DTAC)，十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，或凝聚胺(PB)；纤维素衍生物，如 羟丙基纤维素(HPC)，或羟丙基甲基纤维素(HPMC)；胺，如乙胺，二乙胺， 三乙胺，或三乙醇胺，含氟化合物，如含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟隆的化合 物。
过滤
本文所述的eDAR设备可进一步包括过滤元件。在一些方面，过滤元件 可以是以下形式：微柱，微屏障，微碰撞器，微筛，具有比生物颗粒更小的 孔的通道，生物颗粒无法进入孔但流体可以围绕生物颗粒通过孔继续流动的 具孔通道(“1-D通道”)，微珠，多孔膜，壁上的突起，粘附涂层，羊毛的织 造或非织造纤维(例如布或网)，金属(例如不锈钢或莫内尔合金)，玻璃， 纸，或合成材料(例如尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和聚酯)，烧结 的不锈钢或其他金属，或多孔无机材料如氧化铝、氧化硅。
在一些方面，过滤元件中的孔阵列被配置成感兴趣颗粒(例如罕见颗粒或 细胞)不能通过过滤元件的孔，而至少一种其他颗粒能够通过过滤元件的孔。 在一些方面，过滤元件中的孔阵列被配置成感兴趣颗粒(例如罕见颗粒或细胞) 能够通过过滤元件的孔，而至少一种其他颗粒未能通过过滤元件的孔。
在一些方面，eDAR微流体芯片可以制造有微缝(图10a)。微缝可用于捕 获罕见细胞而不会保留任何其他非特异性颗粒(例如血红细胞、RBC)。微缝 的尺寸可以变化。在一些方面，微缝的高度可以小于或等于约0.1μm,0.5μm, 1μm,5μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm,50μm,75μm或 100μm。在一些方面，微缝的高度可以约为0.1-5μm,1-10μm,5-15μm,10- 30μm,15-40μm,20-50μm,30-75μm和50-100μm。在一些方面，微缝的宽 度可以小于或等于约0.1μm,0.5μm,1μm,5μm,10μm,15μm,20μm,25μm, 30μm,35μm,40μm,50μm,75μm或100μm。在一些方面，微缝的宽度可以 约为0.1-5μm,1-10μm,5-15μm,10-30μm,15-40μm,20-50μm,30-75μm和 50-100μm。例如，微缝的高度为5μm，宽度为5μm(图10b)。
在一些方面，微缝的高度可以小于或等于0.1μm,0.5μm,1μm,5μm,10 μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm,50μm,75μm或100μm。在一 些方面，微缝的高度可以为0.1-5μm,1-10μm,5-15μm,10-30μm,15-40μm, 20-50μm,30-75μm和50-100μm。在一些方面，微缝的宽度可以小于或等于0.1μm,0.5μm,1μm,5μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm, 50μm,75μm或100μm。在一些方面，微缝的宽度可以为0.1-5μm,1-10μm, 5-15μm,10-30μm,15-40μm,20-50μm,30-75μm和50-100μm。
在一些方面，微流体芯片可具有100,200,300,400,500,600,700,800, 900,1000,5000,20,000,30,000,40,000或50,000个孔或微缝。在其他方面， 微流体芯片可以具有超过100，超过200，超过300，超过400，超过500，超 过600，超过700，超过800，超过900，超过1000，超过5000，超过 20,000，超过30,000，超过40,000或者超过50,000个孔或微缝。在一些方 面，对于具有更多微缝的微流体芯片，压力可以较低。例如，在两侧-缓冲液 通道上具有20,000个狭缝的eDAR微流体芯片需要的压力小于4psi以平衡流 体动力学转换过程。在一些方面，横跨微滤器较低的压力可以尽可能减小分 离的罕见细胞上的应力和变形。
微缝可用作过滤源。在一些方面，微缝可以由允许分选且不会导致成像 期间象差的任意材料制成(例如PDMS)，与一片盖玻片粘结而与成像系统联用 (图10c和10D)。在一些方面，微缝可以是微滤器。
在一些方面，使用过滤目的的微缝可以改善成像准确性和捕集的细胞的 计数。在一些方面，微缝可提高捕集的罕见细胞上第二轮标记的速度和效率 。例如，用抗-EpCAM-PE标记的两种癌细胞可以在微缝上捕集(图10e)。细 胞可以固定，渗透化，并用抗-细胞角蛋白-Alexa488,抗-CD45-Alexa700,抗- Her2-Alexa647和赫斯特(Hoechst)标记。
流体动力学分选
有助于eDAR平台的特征和性能的两个关键因素是(1)有效的主动分选方 案和(2)后续的高效纯化(例如纯化腔室)方案。微流体芯片和流体动力学转换 方案的分析性能可以优化到特定的回收效率(例如95％)，特定的假阳性率(例 如，0)和特定的处理量(例如，4.8mL全血/小时)。
在一些方面，根据罕见颗粒的身份、组成或数量，介导流动的机制将包 含罕见颗粒的等分试样的流动介导到多个出口通道中的一个。介导等分试样 的流动的机制可以进入第一出口通道(如果等分试样含有罕见颗粒)，或者第二 出口通道(如果等分试样不含罕见颗粒)。
在一些方面，介导等分试样流动的机制可以包含电极、磁性元件、声波 元件、电驱动元件、电场、压电阀、或磁场。在其他情况下，介导等分试样 的流动的机制可以包括一个或多个电驱动阀或活塞，所述阀或活塞控制在第 一连接处与第一输入通道和两个出口通道相交的至少一个第一定向流动通道 中液体的流动。
在一些方面，本文所述的设备可包括一个或多个电极，用于追踪和/或操 控颗粒、等分试样或流体样品的轨迹或流动。在一些方面，本文所述的设备 可包括一个或多个电极，用于追踪和/或操控颗粒或等分试样的总体或组的轨 迹或流动。在这种情况下，基于这种介电电泳或电解提取现象，电极可提高 等分试样的分离。
在其他情况下，本文所述的设备可进一步包括磁性元件，用于分离粘结 至磁性颗粒或者通过磁性颗粒粘结的罕见颗粒(例如细胞)。在其他情况下， 本文所述的设备可进一步包括磁性元件，用于分离粘结至至少一种磁性颗粒 或者通过至少一种磁性颗粒粘结的罕见颗粒(例如细胞)的总体或组。在一些 方面，基于细胞或附连至颗粒或细胞的微米磁性或纳米磁性颗粒的磁化率， 磁性元件可提升等分试样、颗粒或细胞的分离。在一些方面，基于细胞或附 连至至少一种颗粒或细胞的微米磁性或纳米磁性颗粒的磁化率，磁性元件可提升颗粒或细胞总体或组的分离。
eDAR设备可具有位于收集侧上的第二线共聚焦检测窗以实时监测流体 动力学转换的效率。在一些方面，eDAR设备可以与共聚焦成像配对。
在一些方面，流体动力学转换可以通过螺线管以及两侧缓冲液管线中的 压降控制。螺线管可以位于罕见细胞收集通道中。在一些方面，该螺线管在 左侧处于关闭位置，“阴性”等分试样流入右侧的废液通道(图4A)。当螺线 管打开时，包含缓冲液的两侧通道之间的压降将血流从废液通道转换至收集 侧。这种转换可以在不到10毫秒内发生(例如，2-3ms)以收集罕见颗粒(例如 细胞)。
在一些方面，可使用各种流体动力学分选方案。本发明提供了8种不同 的流体动力学分选方案(图6)。流体样品(例如血液)可以从主通道注入，如深 黑色流路所示。缓冲液(微流体芯片中的浅灰色)可流入两侧通道，罕见细胞 可以收集到底部左侧通道，废液可以引导到底部右侧通道。矩形块代表螺线 管(参见“螺线管”)。螺线管可以设置成正常开放(N.O.)或正常关闭(N.C.)，分 别如深灰色或浅灰色矩形块所示(图6)。
微流体芯片的通道可以在连接处相交。在一些方面，一个通道与不同的 通道在连接处相交。在一些方面，一个通道与超过一个不同的通道在连接处 相交。在一些方面，一个通道与1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个不 同的通道在连接处相交。在一些方面，超过一个通道与不同的通道在连接处 相交。在一些方面，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个不同的通道与 一个不同的通道在连接处相交。
微流体芯片的通道可以在连接处不相交。在一些方面，一个通道在微流 体芯片上不是连接处的位置与不同的通道相交。在一些方面，一个通道在微 流体芯片上不是连接处的位置与超过一个不同的通道相交。在一些方面，一 个通道在微流体芯片上不是连接处的位置与1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或 100个不同的通道相交。在一些方面，超过一个通道在微流体芯片上不是连 接处的位置与不同的通道相交。在一些方面，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90, 95或100个不同的通道在微流体芯片上不是连接处的位置与一个不同的通道 相交。
螺线管和调节流动
eDAR设备包括螺线管以控制流体流动和流体动力学分选方案。在一些 方面，螺线管可以是活塞。例如，螺线管活塞是电驱动的电磁阀的亚组件。 在一些方面，电驱动的电磁阀可以是压电阀。在一些方面，螺线管活塞可以 通过模塑嵌入设备。在一些方面，螺线管可以是阀。例如，嵌入的螺线管活 塞可以由经管道流体连通的电磁阀代替。
在一些方面，eDAR设备可以包括一个螺线管。在其他情况下，eDAR 设备可以包括超过一个螺线管。例如，eDAR设备可以包括超过1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,35,40,45或50个螺线管。在一些方面，至少一个螺线管可以是开放的。 例如，开放的螺线管可用于允许流动从微流体装置的一部分到微流体装置的 另一部分。在一些方面，超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45或50个螺线管可以是开放的。在一些方面，一部分可以是样品进入点。在一些方面，一部分可 以是废液通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。在一些方面，至少一 个螺线管可以是正常开放的(N.O.)。在一些方面，超过1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35, 40,45或50个螺线管可以是正常开放的。
在一些方面，螺线管可以是关闭的。例如，关闭的螺线管可用于防止从 微流体装置的一部分流动到微流体装置的不同部分。在一些方面，至少一个 螺线管是关闭的。在一些方面，超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45或50个螺线 管可以是关闭的。在一些方面，一部分可以是样品进入点。在一些方面，一 部分可以是废液通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。在一些方面， 至少一个螺线管可以是正常关闭的(N.C.)。在一些方面，超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 35,40,45或50个螺线管可以是正常关闭的。
在一些方面，螺线管可以从开放转换为关闭。例如，关闭开放的螺线管 可用于防止从微流体装置的一部分流动到微流体装置的不同部分。在一些方 面，至少一个螺线管可以从开放转换为关闭。在一些方面，超过1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,35,40,45或50个螺线管从开放转换为关闭。在一些方面，一部分可以是 样品进入点。在一些方面，一部分可以是废液通道。在一些方面，一部分可 以是分选腔室。
在一些方面，螺线管可以从关闭转换为开放。例如，打开关闭的螺线管 可用于允许流体从微流体装置的一部分到微流体装置的不同部分。在一些方 面，至少一个螺线管可以从关闭转换为开放。在一些方面，超过1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,35,40,45或50个螺线管可以从关闭转换为开放。在一些方面，一部分可 以是样品进入点。在一些方面，一部分可以是废液通道。在一些方面，一部 分可以是分选腔室。
在一些方面，可用于eDAR的流体微流体芯片的结构以及相应的流体动力 学分选的方案如图6所示。当单个通道上存在出口或入口时可以标记螺线管 的位置。流入，在图6F中，第二螺线管的位置可以是“中央废液”，表示其 位于废液收集通道的中央出口。在每个方案中，除了图6G所示，当检测到 “阳性”事件时，施加到螺线管上的DC电压可以改变以触发分选，一段时 间后可回到正常状态。在一些方面，可使用四个单独的步骤来控制分选(例如，图6G所示的方案)。两个螺线管均可关闭，流体可流至废液通道。触发 分选，打开收集侧上的螺线管以执行转换步骤。收集细胞之后，另一个螺线 管可以打开以执行转换回去的步骤。当流体流动完全转换回去以恢复到正常 状态之后，可同时关闭两个螺线管。8种不同的流体动力学分选方案的流体 构造和性能的总结如下表1所示。在一些方面，可使用两个螺线管(例如，图 6C,6E和6G所示)。
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表1：8种分选方案的流体构造和性能的总结。
在一些方面，可使用芯片外螺线管。对于大多数方法而言，芯片外螺线 管可以是关闭的。为了打开芯片外螺线管，可施加电压(例如5V DC电压)。 芯片外螺线管可以快速打开(例如，小于或等于三毫秒)。如果使用芯片外螺 线管，可以调整微流体芯片的制备，螺线管可以用微通道连接。在一些方 面，可使用芯片上螺线管。对于大多数方法而言，芯片上螺线管可以是关闭 的。为了打开芯片上螺线管，可施加电压(例如5V DC电压)。芯片上螺线管可以快速打开(例如，小于或等于三毫秒)。如果使用芯片上螺线管，可以调 整微流体芯片的制备，螺线管可以用微通道连接。
例如，在该方案中，使用芯片外螺线管。采用注射泵将标记的流体样品 注入微流体芯片的顶部通道(图7a)。可使用缓冲液流经的两侧通道来控制主 动分选步骤。两个端口位于右侧通道，它们均连接至加压缓冲液源。芯片外 螺线管可连接至分选连接处附近的端口以控制流体动力学转换。采用芯片外 螺线管的转换过程是稳定的，可以在105次开关循环期间维持稳定。
在一些方面，在线的螺线管可以放置在缓冲液管线上，以防止流体样品 接触螺线管。这可消除样品衰变和交叉感染的可能。使用eDAR设备和方法 期间罕见细胞收集通道内可存在缓冲液恒流。芯片上螺线管可改善后续纯化 (例如纯化腔室)步骤的效率并可防止细胞聚集体的形成。
在一些方面，eDAR设备中流体的流动可以采用检测体积上游或下游的 以下器件之一进行调节：螺线管、阀、气泡、电场、磁场、光场、气动压力 源、固体颗粒、膜、不混溶的液滴、重力差分或涂层，以改变通道的表面张 力。当细胞通过检测体积时，流动可以停止、减速、或加速。
在一些方面，检测期间可以维持流体样品的连续流动通过流动通道。在 一些方面，单独的等分试样可以不是物理分离的，而是由光检测步骤和/或分 选步骤限定的。
例如，流动可以引导至用于收集废液的通道内(图7b)。分选连接处之后 存在两个通道。左侧通道可收集阳性的等分试样，将它们传递至过滤和收集 区域用于进一步纯化(例如纯化腔室)；右侧通道收集废液(例如阴性的等分试 样)。在这种情况下，当等分试样分级为“阴性”时，螺线管不施加电压并保 持关闭(图7b)。No.1和3缓冲液源之间的初始压降之后可发生流动方式的改 变(图7a)。第一检测窗口可检测到阳性事件。在这种情况下，对螺线管施 加DC电压(例如5V)，打开来自缓冲液储库的缓冲液流(例如No.2)。右侧上 缓冲液通道的流动阻力降低可以产生较高的流速。流体流动可以从右侧推送 到左侧以收集阳性等分试样(图7c)。收集等分试样并通过第二检测窗口进行 验证。在一些方面，螺线管可以关闭以将流体流动转换回到废液收集通道(图 7d)。来回转换所需的时间可以小于20毫秒，在一个示例性的情况下，时间 为2-3毫秒(表1和图8；帧速＝1,918帧/秒)。在一些方面，可以重复采用的条 件超过105次开关循环。
在一些方面，流动可以通过例如引导流体动力学流体压力的方法和装置 来传递，包括但不限于基于以下原理进行操作的方法和装置：机械原理(例 如，外部注射泵、气体膜泵、振动膜泵、真空装置、离心力和毛细管作用)； 电或磁原理(例如，电渗流、电运动泵压电/超声泵、磁流体(ferrofluidic)栓塞 、电流体动力学泵和磁流体动力学泵)；热动力学原理(例如，气泡产生/相改 变诱导的体积扩展)；表面润湿原理(例如，电润湿、化学、热、照射诱导的表 面张力梯度)。
在其他情况下，流体可以通过以下方式提供的流体驱动力进行传递或引 导：重力供料、表面张力(例如毛细管作用)、静电力(电动力学流动)、离心流 (位于光盘上的基板并旋转)、磁力(震荡离子导致流动)、磁流体动力学力以及 真空或压差。
在一些方面，流体流动控制装置，例如参照引导流体动力学流体压力或 流体驱动力的方法和装置列举的那些，可以偶联至本发明的输入端口或输出 端口。在一些方面，在入口和出口之一或者两者均提供多个端口，并且一个 或多个端口可以偶联至流体流动控制装置。
通行时间
分析物(例如罕见细胞或者循环的肿瘤细胞(CTC))可以从第一检测窗口流 动至第二检测窗口。在第一窗口中记录决策APD峰和检测验证信号之间流逝 的时间是用于分选分析物的通行时间。在一些方面，通行时间可以变化。在 一些方面，线性流速可影响通行时间。在一些方面，微通道的层流可影响通 行时间。在一些方面，体积流速设定为40微升/分钟(图9b)。在一些方面， 体积流速可以约为1微升/分钟、2微升/分钟、3微升/分钟、4微升/分钟、5 微升/分钟、6微升/分钟、7微升/分钟、8微升/分钟、9微升/分钟、10微升/分 钟、11微升/分钟、12微升/分钟、13微升/分钟、14微升/分钟、15微升/分钟 、16微升/分钟、17微升/分钟、18微升/分钟、19微升/分钟、20微升/分钟、 21微升/分钟、22微升/分钟、23微升/分钟、24微升/分钟、25微升/分钟、30 微升/分钟、35微升/分钟、40微升/分钟、45微升/分钟、50微升/分钟、55微 升/分钟、60微升/分钟、65微升/分钟、70微升/分钟、75微升/分钟、80微升/ 分钟、85微升/分钟、90微升/分钟、95微升/分钟、100微升/分钟或200微升/ 分钟。
在一些方面，流速可以约为1微升/分钟-5微升/分钟、3微升/分钟-10微 升/分钟、5微升/分钟-15微升/分钟、10微升/分钟-20微升/分钟、15微升/分 钟-30微升/分钟、20微升/分钟-40微升/分钟、30微升/分钟-50微升/分钟、40 微升/分钟-60微升/分钟、50微升/分钟-70微升/分钟、60微升/分钟-80微升/分 钟、70微升/分钟-90微升/分钟、80微升/分钟-100微升/分钟、90微升/分钟- 100微升/分钟或90微升/分钟-200微升/分钟。在其他情况下，体积流速设定 为80微升/分钟(图9b)。
在一些方面，体积流速为1微升/分钟、2微升/分钟、3微升/分钟、4微 升/分钟、5微升/分钟、6微升/分钟、7微升/分钟、8微升/分钟、9微升/分钟 、10微升/分钟、11微升/分钟、12微升/分钟、13微升/分钟、14微升/分钟、 15微升/分钟、16微升/分钟、17微升/分钟、18微升/分钟、19微升/分钟、20 微升/分钟、21微升/分钟、22微升/分钟、23微升/分钟、24微升/分钟、25微 升/分钟、30微升/分钟、35微升/分钟、40微升/分钟、45微升/分钟、50微升/ 分钟、55微升/分钟、60微升/分钟、65微升/分钟、70微升/分钟、75微升/分 钟、80微升/分钟、85微升/分钟、90微升/分钟、95微升/分钟、100微升/分 钟或200微升/分钟。
在一些方面，流速为1微升/分钟-5微升/分钟、3微升/分钟-10微升/分 钟、5微升/分钟-15微升/分钟、10微升/分钟-20微升/分钟、15微升/分钟-30 微升/分钟、20微升/分钟-40微升/分钟、30微升/分钟-50微升/分钟、40微升/ 分钟-60微升/分钟、50微升/分钟-70微升/分钟、60微升/分钟-80微升/分钟、 70微升/分钟-90微升/分钟、80微升/分钟-100微升/分钟、90微升/分钟-100微 升/分钟或90微升/分钟-200微升/分钟。可采用较高的流速来实现较低的通行 时间(图9c)。
检测
本发明提供了可配备有检测系统的采用微流体芯片的用于eDAR的设备 。在一些方面，检测系统可包括线共聚焦检测方案。在线共聚焦检测方案 中，采用一系列分色镜、柱面透镜和分束器，两个激光源(例如488和633nm) 形成检测窗口(例如，2个)。第一检测窗口可具有同时重叠的两个激光 束，可用于检测来自标记的罕见细胞(例如CTC)的荧光信号。第二检测窗口 可用于验证分选的等分试样中罕见细胞的身份或罕见细胞的缺乏。第二检测 窗口可进一步用于监测分选效率。
在一些方面，可同时检测两种罕见颗粒。每种罕见颗粒可以与独特的检 测试剂接触，每种检测试剂通过两个检测装置之一进行检测。而且，检测试 剂包括荧光部分，可使用在对应于不同荧光部分的激发波长的不同波长处产 生照射的两个询问装置(例如两个激光)。各自的荧光照射可以通过两种不同 的检测装置进行检测。在一些方面，检测试剂可以通过在不同波长处的荧光 进行区分。
在一些方面，可以连续检测两种或更多种罕见颗粒。例如，该方法可包 括在eDAR设备的第一位置检测第一罕见颗粒以及在eDAR设备的第二位置 检测第二罕见细胞。在这种情况下，第一检测步骤之后，第二检测步骤之 后，或者两个检测步骤之后，包含第一和第二罕见颗粒的等分试样可以引导 到新的位置。
在某些方面，检测事件可以以常规频率进行。频率可涉及检测体积的尺 寸和流体样品的流速。一个具体设备的检测体积可以是0.1-100微升(例如10 微升)，流体样品可以以以下范围的流速通过设备：1-1000微升/秒(例如100 微升/秒)，每0.001–1秒(例如0.1秒)一次，或者以1-100Hz(例如10Hz)的 速率检测不同的等分试样。
在一些方面，设备的几何形状和需要处理的流体的体积可能影响速率。 例如，等分试样以0.1kHz到100MHz的速率通过检测体积。在一些方面， 等分试样以10Hz到10MHz或约10MHz的速率通过检测体积。在一些方 面，等分试样以0.1kHz到100MHz或约100MHz，或者1kHz或约1kHz到 10MHz或约10MHz的频率，或者约1kHz到5MHz或约5MHz的频率，或 者1kHz或约1kHz到1MHz或约1MHz的频率通过检测体积。在一些方 面，等分试样通过检测体积的频率可以至少约为0.1kHz，或者至少约0.2,0.3, 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50, 60,70,80,90,100,125,150,200,250,300,400,500,600,700,800或900kHz， 或至少约1MHz，或至少约2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50, 60,70,80,90或100MHz。在一些方面，等分试样通过检测体积的频率可以 至少为0.1kHz，或者至少0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,125,150,200,250,300, 400,500,600,700,800或900kHz，或至少1MHz，或至少2,3,4,5,6,7,8,9, 10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90或100MHz。
在一些方面，流体样品的等分试样中分析物(例如细胞)总体的特征的检 测可以是同时或随时间累积的。例如，可以同时检测含分析物总体的大等分 试样中的特征。在同时模式期间，颗粒可以通过可变速度的流动负载。在其 他情况下，当颗粒通过检测体积时，颗粒通过稳定流动负载。
在各个方面，eDAR设备和方法允许同时检测来自多个分析物(例如多个 细胞)的信号。在一些方面，基于从等分试样中存在的多个分析物同时检测到 的信号对等分试样分级。
在其他情况下，所述方法提供了检测在单个细胞的数量级上的小检测体 积随时间散发的细胞总体的特征(累积)，而多个细胞在流动的帮助下通过检测 体积。eDAR的累积模式区别于从单个生物颗粒散发的连续信号或帧的时间 推移叠加；单个生物颗粒的时间推移叠加不会构成生物颗粒的总体。在同时 和累积模式中，只有当检测到来自细胞总体的特征之后才产生决策。
在一些方面，检测器选自：照相机，电子倍增器，电荷耦合器件(CCD) 图像感应器；光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极管(APD)，单光子雪崩二极管 (SPAD)，光电倍增管(SiPM)，和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像感应器。 在一些方面，本文所述的eDAR设备可包括照片、电、声波或磁检测器以追 踪选择细胞的运动或列举等分试样中存在的选择颗粒或细胞。
在一些方面，本文提供的设备或方法可包括各种构造的荧光(单色或多色) 显微镜成像，包括但不限于：亮场，EPI，共聚焦，反式，DIC(微分干涉对 比)，黑场，霍夫曼，或相差。
在一些方面，本文提供的设备可包括多个检测装置，例如至少2,3,4,5, 6,7,8,9,10或更多个检测装置。多个检测装置对于执行本发明的方法是有用 的，例如，流体样品中存在超过一种罕见颗粒或细胞，使用超过一种细胞标 记物来区分不同的细胞类型，或者同时检测多种检测试剂。在一些方面，检 测装置可包括验证激光。例如，验证激光可用于询问分选的等分试样。在一 些方面，验证激光检测的分选的等分试样可以是阳性等分试样并且在分选后 保留。在一些方面，通过验证激光检测的分选的等分试样可以是阴性等分试 样并且在分选后丢弃。例如，验证激光可用作第二检测方法以控制eDAR分 选方案的准确性。
照射源和装置
本发明提供了用于eDAR的设备，可包括检测装置或成像装置和分级装 置(例如计算机)。在一些方面，激光(或超过一种激光)可用作询问装置。带 有光电二极管、光电倍增管或照相机的倒置显微镜可用作检测装置。掩模可 放置在通道和检测装置之间的路径中。
在一些方面，询问装置(例如488nm固态二极管泵送的激光和633nm HeNe激光)可引导到倒置显微镜。两种激光束可采用圆柱形光学或衍射光学 成形，以形成纵横比10:1的准直的椭圆形光束，然后进入显微镜物镜。采用 半波片和偏振分束器的组合，可以调节每个光束的强度，而镜面独立转向光 以创造空间共定位激发区域。来自生物颗粒的荧光可以通过两个分色镜分成 三个波带，然后通过带通滤波器并重新聚焦到三个单光子雪崩二极管(SPAD) 上。一个SPAD可收集波长范围560-610nm的荧光，第二SPAD可收集波长 范围645-700nm的荧光，第三SPAD可收集波长范围500-540nm的荧光。 SPAD输出可引导到带有计数器/计时器板的数字处理器(例如计算机)并用多种 算法进行分析。
在一些方面，数字处理器接收来自检测装置的信号并通过算法对等分试 样进行分级。数字处理器可以基于分级的值(例如，流体样品中罕见颗粒的存 在、不存在、数量、身份、或者组成)将等分试样引导到合适的通道。eDAR 可以由一个、两个、三个、四个、五个或六个检测装置以及一个、两个、三 个、四个、五个或六个询问装置，或多个检测装置和询问装置构成。
双捕获eDAR
本发明还提供了用于eDAR的“双捕获”版本的设备。双捕获设备可以 从混合的流体的同一样品中分离出两个不同的罕见细胞亚群。这可以在单一 微流体芯片上同时进行。两个亚群还可以被单独捕集到微流体芯片上的两个 不同区域。
微流体eDAR装置的双捕获版本的一般结构如图11所示。可以用偶联独 特荧光标签的至少两个独特的抗体标记样品。例如，可以用与结合样品中的 分析物上的标记物(例如上皮,抗-EpCAM-PE)的独特的荧光团偶联的第一标签 以及与结合样品中的分析物上的标记物(例如间充质,抗-EGFR或抗-波形蛋白) 的独特的荧光团偶联的第二标签标记样品(例如血)，其中每个荧光团可具有不 同的发射波长(例如FITC)。标记的血样可以注入微流体芯片。表达EpCAM 的罕见细胞可以采用线-共聚焦方案(如上所述)进行检测，在黄色通道中检测 峰。可以触发分选事件以将特定的等分试样收集到收集通道(例如收集通道 #1)。在一些方面，等分试样可以对间充质标记物分级为阳性，然后将罕见细 胞分选到不同的收集通道(例如收集通道#2)。两个罕见细胞的亚群可以分别 捕集并富集到双捕获eDAR微流体芯片上。
双捕获eDAR设备可以采用流体转换方案(图11)。标记的样品可引入顶 部的主通道。缓冲液流入两侧通道，采用两个螺线管控制血流的流体动力学 转换。在一些方面，双捕获eDAR的过滤区域可以采用微缝(如上所述)建立 。两个CTC的亚群可以分离并捕集到同一微流体芯片上的两个不同的过滤区 域。
双捕获eDAR设备可包括螺线管。在一些方面，当等分试样分级为阴性 时，两个螺线管可以均关闭(图12)。如果在两个通道中平衡压力，样品可以 流动到底部中央通道，作为废液收集。在其他情况下，当等分试样仅相对于 两个标记物中的一个(例如上皮)分级为阳性时，螺线管#2打开，样品流入左 侧的收集通道(图12B)。收集等分试样之后，螺线管#2可重新关闭，样品的 流动回到中央通道。在一些方面，等分试样可以分级为仅对一个标记物(例如 上皮)阳性，螺线管#1打开，样品流动至右侧通道(图12C)。在一些方面，双 捕获eDAR设备中用于两种类型的分选事件的响应时间非常快(例如小于或等 于3毫秒)。
微流体芯片中的免疫染色和漂白
本发明提供了采用微流体装置的顺序免疫染色和漂白方法的方案。该方 法可采用PCT WO 2010/120818所述的eDAR设备，本文所述的设备，或者本 领域已知的设备。在一些方面，该方案可以偶联eDAR。在一些方面，该方 案可以偶联直列式染色和洗涤系统以尽可能减小死体积；降低使用的抗体的 量；避免引入气泡；和自动化分离、染色和漂白罕见细胞的过程。
可采用eDAR捕获分析物(例如，罕见细胞)。罕见细胞可以富集到微流 体芯片的小区域上(例如腔室)。小区域可用于快速成像标记的细胞并尽可能 减小使用的反应试剂的量(例如抗体、缓冲液等)。微流体芯片可以设计具有 开放的可接近结构。开放结构允许对单细胞的进一步操控(例如，拣出感兴趣 细胞或将某些反应试剂传递至细胞)。
在一些方面，可通过激光检测束、体积流速以及分选速度的组合获取虚 拟的等分试样。基于这些因素，标记的样品可以虚拟分成等分试样(例如1毫 升样品分成500,000，每个等分试样2nL)。在一些方面，线-共聚焦检测方法 可检测每个细胞发射的荧光。虚拟等分试样可基于标记方案进行分级。如果 标记，等分试样为“阳性”，如果未标记，等分试样为“阴性”。在一些方 面，阴性等分试样可丢弃(图4A)。
在一些方面，根据等分试样分级，自动的反馈机制可触发流动的流体动 力学转换。转换可将“阳性”等分试样收集和转移至微流体芯片的区域用于 进一步纯化(例如纯化腔室)和分析。在一些方面，分选的等分试样可以转移 至微流体芯片上可以捕集罕见细胞(例如循环的肿瘤细胞)和丢弃血细胞的区 域(图4A)。在一些方面，捕集的细胞可以成像和用识别生物标记物的一种或 多种标签(例如标记的抗体)标记。
分析物(例如罕见细胞)的标记和成像可以在微流体芯片(例如eDAR设备) 上发生。在一些方面，微流体芯片上的两个端口可置于开放位置，以进行灌 注标记和洗涤步骤(图13A)。剩余的三个端口可保持关闭。蠕动泵可以将洗 涤缓冲液(例如Isoton(美国加利福尼亚州晒诺的克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))和标记反应试剂传递至微流体芯片。可以采用六通阀将加压的缓 冲液源偶联至泵和微流体芯片。在一些方面，六通阀上的另外三个端口可以 关闭以防止渗漏和/或污染。
该方法提供了对分离的分析物(例如罕见细胞)上的标记物进行染色(图 13B)。该方法可使用抗体(例如，小于或等于10纳克)和孵育步骤(例如，小于 或等于30分钟)进行。为了进行免疫染色和光漂白方法，将六通阀朝着加压 缓冲液打开用于流体动力学转换的稳定控制。六通阀可以朝着蠕动泵打开， 将特定量的反应试剂注入微流体芯片。蠕动泵可用于传递标记试剂和洗涤缓 冲剂(图13)。横杆表示相应的端口可以是关闭的。在一些方面，阀可以防止 气泡进入微流体芯片系统。
在一些方面，该方法可用于进行细胞内标记物染色。在该方法中，捕获 的细胞可以在微流体芯片上固定并使用透化试剂透化，例如洗涤剂(例如 Triton,Surfynol 465表面活性剂等)，然后免疫染色。该方法进一步描述了对 单独的细胞的多轮免疫染色，洗涤染色的细胞，细胞中的标记物成像以及结 合到单独的细胞的标记物的光漂白。这些步骤可以按顺序重复多轮。
在一些方面，分离的细胞可以固定。固定可以采用灌注(例如手动或自动) 或者扩散(例如手动或者自动)方法进行。在一些方面，固定可以在微流体芯 片上进行或者在样品从微流体芯片移除之后在微流体芯片外进行。在一些方 面，样品或分离的颗粒可以不固定。在这种情况下，样品可以包含活颗粒(例 如哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞等)。样品可包括能够通过 固定破坏的结构。
在一些方面，分离的颗粒可以透化。透化可以采用灌注(例如手动或自动) 或者扩散(例如手动或者自动)进行。在一些方面，透化可以在微流体芯片上 进行或者在样品从微流体芯片移除之后在微流体芯片外进行。在一些方面， 样品或分离的颗粒可以不透化。在这种情况下，样品可包含标记物(例如，细 胞外、细胞缔合的标记物等)。样品可包括能够通过透化破坏的结构。
与标签接触的分析物可以光漂白。光漂白的过程可以降低与分析物接触 的标签发射的信号。在一些方面，可用于光漂白的装置包括：激光、发光二 极管、电弧灯、白炽灯、荧光灯、紫外灯或卤素灯。在一些方面，电弧灯可 选自但不限于以下类型的电弧灯：氖、氩、氪、氙、钠、金属卤化物、汞或 碳。
在一些方面，分析物可以与标签接触，标签可以化学漂白。在一些方 面，标签可生成可由检测器读取的信号。例如，信号可以由荧光团发射。在 一些方面，可以使用化学物质化学猝灭或漂白信号，化学物质包括但不限于 氧化剂、卤素离子、还原剂、或任何其他合适的荧光猝灭剂。在一些方面， 还原剂是二硫苏糖醇。在其他情况下，采用合适的反应试剂，可识别生物标 记物的标签(例如抗体)可以高效地从结合位点化学解离。在一些方面，漂白试剂可以是含有2％SDS，20mM二硫苏糖醇(DTT)和60mM Tris pH 6.8的 Tris基缓冲液。
该方法可包括每个成像步骤之后的光漂白。采用的参数可以传递高效、 快速处理量的光漂白过程(图14和表2)。在标记的细胞暴露于不同功率的光 漂白光源之后可以产生针对生物标记物(例如抗-EpCAM-PE)的标签标记的细 胞(例如MCF-7)的光漂白曲线(图15A)。可以采用针对同一抗体的多个偶联物 (例如，Alexa 647,Alexa488,FITC,PE)产生其他曲线(图15B)。
标记和光漂白的步骤可以重复多次以研究几组生物标记物。例如，可以 将两种感兴趣生物标记物与阳性对照标记物(例如核染色)和阴性对照标记物 (例如CD45)组合产生组。一个组可以在每轮中进行研究，然后光漂白，然后 进行第二轮免疫染色。在一些方面，顺序免疫染色和光漂白的方法可用于确 定分析物上不同蛋白标记物的表达。例如，微流体芯片上捕集的分析物(例如 罕见细胞、癌细胞等)是EpCAM,细胞角蛋白和赫斯特阳性但CD45阴性(下表 2)。
Figure BDA0002266495660000391
Figure BDA0002266495660000401
表2：显示四轮免疫染色和光漂白的实验细节。
在一些方面，在第一轮免疫染色中可仅使用一个针对生物标记物的第一 标签。在这种情况下，第一标签可以光漂白。在下一轮免疫染色中可使用针 对不同生物标记物的不同的第二标签。所述不同的第二标签可以光漂白。
在一些方面，在第一轮免疫染色中可仅使用一个针对生物标记物的第一 标签。在这种情况下，第一标签可以光漂白。在下一轮免疫染色中可使用针 对不同生物标记物的相同的第二标签。所述相同的第二标签可以光漂白。
在一些方面，在第一轮免疫染色中可仅使用一个针对生物标记物的第一 标签。在这种情况下，第一标签可以光漂白。在下一轮免疫染色中可使用针 对不同生物标记物的不同的第二标签。所述第二不同的标签可以光漂白。
在一些方面，在第一轮免疫染色中可仅使用一个针对生物标记物的第一 标签。在这种情况下，第一标签可以光漂白。在下一轮免疫染色中可使用针 对相同的生物标记物的不同的第二标签。所述第二不同的标签可以光漂白。
在一些方面，多个标签包括第一组，其中每一个可以在第一轮免疫染色 中用于针对独特的生物标记物。在这种情况下，第一组的多个标签光漂白。 针对不同的独特的生物标记物的组的不同的第二组的多个标签可用于下一轮 的免疫染色。第二组的不同的标签可以光漂白。在一些方面，第一组中使用 的一些标签也可用于第二组。在一些方面，第一组中标签靶向的一些生物标 记物也可以被第二组中的标签靶向。在一些方面，第二组的生物标记物可以 与第一组的生物标记物相同。在一些方面，第二组的标签可以与第一组的标签相同。在一些方面，第二组的标签可以包含与第一组标签重叠的标签。在 一些方面，第二组的生物标记物可以包含与第一组的生物标记物重叠的生物 标记物。
在另一种情况下，六种(例如多种)单独的细胞(例如癌细胞)可以被捕集到 微流体芯片上(图14)。8种生物标记物可包括两种对照生物标记物(例如，一 种阳性对照和一种阴性对照)，每轮可观察到四种生物标记物(例如EpCAM/细 胞角蛋白,MUC1/Her2,CD44/CD24和CD166/EGFR)。在一些方面，阳性对 照生物标记物(例如，赫斯特核染色)可以不被光漂白。阴性对照生物标记物 (例如CD45)可以光漂白，且每一轮的免疫染色可包括新的标签。每轮的四种 生物标记物可包括两种对照和两种其他标记物。每轮可包括免疫染色、成像 和光漂白(表2)。
直列式免疫染色和光漂白系统可以偶联用于分析物(例如罕见细胞)的标 记和荧光成像的免疫染色和光漂白的方法。在采用多轮时，直列式系统可提 高免疫染色和光漂白方法的速度和效率。系统可包括用一组与不同的荧光团 偶联的抗体标记罕见细胞(例如CTC)然后光漂白。光漂白之后，罕见细胞可 以用针对其他生物标记物的不同的荧光抗体重新标记。
在一些方面，采用eDAR微流体芯片设备分离的罕见细胞可以用缓冲液 洗涤。缓冲液可以是任何适用于该应用的缓冲液。分离的细胞可以保留在微 流体芯片上，通过关闭直列式阀来关闭主通道、侧通道和废液通道。
该方法提供了采用装置来检测标签发射的信号或者一些标签发射的信号 。在一些方面，装置是显微镜。显微镜(例如共聚焦、倒置等)可以配备有光 源和荧光检测器。在其他情况下，装置可以是用于检测标签发射的信号的本 领域技术人员已知的一些装置中的一个。
在一些方面，检测可以结合光漂白进行，在光漂白之后进行，或者在光 漂白开始之前进行。检测可以用于确定来自标签的可检测信号的发射的终点 。在一些方面，检测可以与免疫染色结合进行。检测可以在洗涤步骤之后进 行，在洗涤步骤之前进行，在洗涤步骤期间进行，或者没有洗涤步骤下进行 。在一些方面，检测也可以在透化步骤之后进行，在透化步骤之前进行，在 透化步骤期间进行，或者没有透化步骤下进行。在一些方面，检测可以在固 定步骤之后进行，在固定步骤之前进行，在固定步骤期间进行，或者没有固 定步骤下进行。
该方法包括标签发射的信号的成像。用于成像的装置已有表述，参见 PCTWO20120/120818，或者是本领域技术人员已知的。例如，可以在光漂白 步骤之前和之后收集荧光图像。图像可包括来自所有发射通道的数据。在一 些方面，发射通道可包括：黄色(555-605nm),蓝色(435-485nm),绿色(510-540 nm)和红色(665-695nm)。在一些方面，分离的分析物可以采用亮场或 Nomarski显微镜成像。
在一些方面，可以分析图像的多种生物标记物的表达。eDAR捕获的与 标签接触以检测生物标记物(例如，Her2和MUC1)和阳性对照标记物(例如， 赫斯特)的单独的细胞(例如四种)可以采用荧光成像(图16)。数字处理器(例如 计算机)和软件可用于将多个图像合并成单个多色图像(图16D)。
该方法进一步提供了分析物(例如颗粒)的收集。收集的颗粒(例如罕见细 胞)可经受免疫染色和光漂白。在一些方面，捕集的罕见细胞可以经受微流体 芯片外的额外的免疫染色和光漂白。在一些方面，可以收集罕见细胞用于进 一步处理。收集可涉及将罕见细胞置于储库中(例如管道、平板、阵列等)。 罕见细胞可以在收集后进行固定。在一些方面，罕见细胞可以是活细胞并在 细胞培养中维持。
在一些方面，本文所述方法可以在分离分析物之后进一步偶联分析方案 。可以与本文所述方法偶联的分析的非限制性例子包括：基于核酸的方法， 例如RNA提取(含或不含扩增),cDNA合成(逆转录),基因微阵列,DNA提取, 聚合酶链式反应(PCR)(单独,巢式,定量实时,或接头-衔接子),或DNA-甲基化 分析；细胞计数方法，例如荧光原位杂交(FISH)、激光捕获显微切割技术， 流式细胞术，荧光激活细胞分选(FACS)，细胞培养，或比较基因组杂交 (CGH)研究；化学分析方法，例如电泳，Southern印迹分析或酶联免疫吸 附试验(ELISA)；确定微小RNA和siRNA含量的分析；确定DNA/RNA 含量的分析；确定脂质含量的分析；确定糖含量的分析；确定代谢物含量的 分析；确定蛋白含量的分析；和功能细胞分析(例如，凋亡分析，细胞迁移分 析，细胞增殖分析，细胞分化分析等)，等等。
标记类型
免疫染色和光漂白的方法可以包括使用标签或标记来鉴定捕集的分析物 (例如颗粒)上的生物标记物。在一些方面，可以采用本文所述的eDAR设备 或者本领域技术人员已知的被构造用于检测标签的其他设备进行检测。在一 些方面，可以采用本文所述设备的组件或者采用本领域技术人员已知的光漂 白装置对标签进行光漂白。在一些方面，可以采用可能导致颗粒损伤的设备 对标签进行光漂白。在其他情况下，可以不对标签进行光漂白。
在一些方面，标签可用作免疫染色的标记。标签可以通过光谱、光化学 、生化、免疫化学、化学或其他物理方法进行检测。例如，有用的标签可包 括但不限于：放射性核素，荧光染料(如荧光素，荧光素异硫氰酸酯 (FITC)，俄勒冈绿TM，罗丹明，德克萨斯红，异硫氰酸四罗丹明(TRITC)， Cy3，Cy5等)，荧光标记物(如绿色荧光蛋白(GFP)，藻红蛋白(PE)等)，由肿瘤相关的蛋白酶激活的自淬灭荧光化合物，酶(例如，荧光素 酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)，纳米颗粒，生物素，地高辛，等等 。在一些方面，标签可以在图像中发射光谱可检测的颜色。颜色可包括红 色，蓝色，黄色，绿色，紫色，橙色等。
在一些方面，标签可以灌注以选择性标记或重点标记分离的细胞。这类 反应试剂的例子包括但不限于：荧光，免疫荧光，染料偶联分子(如抗体， Fab片段，适体，聚合物，配体，激动剂，拮抗剂，或它们的组合)，磁，电 活性，生物活性或光活性化合物。一个例子是使用与细胞角蛋白(即上皮癌细 胞中细胞骨架的整体组件)反应的染剂。其他染料例子包括：荧光素异硫氰酸 酯(FITC)-偶联的小鼠抗-人上皮抗体(HEA)和藻红蛋白(PE)-偶联的抗-CD45。 染料偶联抗体的其他例子包括但不限于：泛-细胞角蛋白抗体A45B/B3, AE1/AE3,或CAM5.2(识别细胞角蛋白8(CK8),细胞角蛋白18(CK18),或细 胞角蛋白19(CK19)的泛-细胞角蛋白抗体以及针对以下抗原的泛-细胞角蛋白 抗体：乳腺癌抗原NY-BR-1(也称为B726P,ANKRD30A,锚蛋白重复结构域 30A)；B305D同种型A或C(B305D-A或B305D-C；也称为抗原B305D)； Hermes抗原(也称为抗原CD44,PGP1)；E-钙粘着蛋白(也称为桑椹胚黏着蛋白(Uvomorulin),钙粘着蛋白-1,CDH1)；癌胚抗原(CEA；也称为CEACAM5或癌 胚抗原相关细胞粘附分子5)；β-人绒毛膜促性腺素(β-HCG；也称为CGB,慢性 促性腺激素,β多肽)；组织蛋白酶D(也称为CTSD)；神经肽Y受体Y3(也称为 NPY3R；脂多糖相关蛋白3,LAP3,融合；趋化因子(CXC基序,受体4)；CXCR4)； 癌基因ERBB1(也称为c-erbB-1,表皮生长因子受体,EGFR)；Her-2 Neu(也称 为c-erbB-2或ERBB2)；GABA受体A,pi(π)多肽(也称为GABARAP,GABA-A 受体,pi(π)多肽(GABA A(π),γ-氨基丁酸A型受体pi(π)亚基),或GABRP)； ppGalNac-T(6)(也称为β-1-4-N-乙酰基-氨基半乳糖基-转移酶6,GalNAc转移 酶6,GalNAcT6,UDP-N-乙酰基-d-半乳糖胺:多肽N-乙酰基氨基半乳糖基转移 酶6,或GALNT6)；CK7(也称为细胞角蛋白7,Sarcolectin,SCL,角蛋白7,或 KRT7)；CK8(也称为细胞角蛋白8,角蛋白8,或KRT8)；CK18(也称为细胞角 蛋白18,角蛋白18,或KRT18)；CK19(也称为细胞角蛋白19,角蛋白19,或KRT19)；CK20(也称为细胞角蛋白20,角蛋白20,或KRT20)；Mage(也称为黑 素瘤抗原家族A亚型或MAGE-A亚型)；Mage3(也称为黑素瘤抗原家族A 3, 或MAGA3)；肝细胞生长因子受体(也称为HGFR乳头状肾细胞癌2,RCCP2, 原癌基因met,或MET)；粘蛋白-1(也称为MUC1,癌抗原15.3,(CA15.3),癌抗 原27.29(CA 27.29)；CD227抗原,Episialin,上皮膜抗原(EMA),多态上皮粘蛋 白(PEM),花生反应性泌尿粘蛋白(PUM),肿瘤相关糖蛋白12(TAG12))；巨囊性病的液状蛋白(也称为GCDFP-15,促乳素诱导的蛋白,PIP)；尿激酶受体(也称为 uPR,CD87抗原,纤溶酶原激活物受体尿激酶型,PLAUR)；PTHrP(副甲状腺激 素相关蛋白；也称为PTHLH)；BS106(也称为B511S,小乳腺上皮粘蛋白,或 SBEM)；前列腺蛋白样亲脂蛋白(Lipophilin)B(LPB,LPHB；也称为抗原BU101, 分泌珠蛋白(Secretoglobin)家族1-D成员2,SCGB1-D2)；乳腺珠蛋白 (Mammaglobin)2(MGB2；也称为乳腺珠蛋白B,MGBB,泪液珠蛋白(Lacryglobin)(LGB)亲脂蛋白C(LPC,LPHC),分泌珠蛋白家族2A成员1,或 SCGB2A1)；乳腺珠蛋白(MGB；也称为乳腺珠蛋白1,MGB1,乳腺珠蛋白A, MGBA,分泌珠蛋白家族2A成员2,或SCGB2A2)；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂 (Maspin,也称为丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂进化支B(卵清蛋白)成员5, 或SERPINB5)；前列腺上皮特异性Ets转录因子(PDEF；也称为含有无菌α基序 指定结构域的ets转录因子,或SPDEF)；肿瘤相关钙信号转导蛋白1(也称为结肠直肠癌抗原CO17-1A,上皮糖蛋白2(EGP2),上皮糖蛋白40kDa(EGP40),上 皮细胞粘附分子(EpCAM),上皮特异性抗原(ESA),胃肠道肿瘤相关抗原733-2 (GA733-2),KS1/4抗原,染色体4表面标记物1的膜组分(M4S1),MK-1抗原, MIC18抗原,TROP-1抗原,或TACSTD1)；端粒末端转移酶逆转录酶(也称为 端粒末端转移酶催化亚基,或TERT)；三叶肽(Trefoil)因子1(也称为乳腺癌雌 激素可诱导的序列,BCEI,胃肠三叶肽蛋白,GTF,pS2蛋白,或TFF1)；叶酸盐/ 酯；或三叶肽因子3(也称为肠三叶肽因子,ITF,p1.B；或TFF3),等等。
标记物/生物标记物
本方法提供了可以由位于分析物(例如捕集的颗粒)上或者分析物附近， 或者由分析物表达的多种生物标记物。可以由本发明所述进行检测的所述多 种生物标记物可以在捕集的颗粒上经受多轮免疫染色和光漂白。每一轮的免 疫染色可以不包括标签，包括1个标签,2个标签,3个标签,4个标签,5个标签, 6个标签,7个标签,8个标签,9个标签或10个标签。每一轮免疫染色的标签 的范围可包括1-10个标签(例如4)。
在一些方面，通过标签发射的信号表明标记物(例如生物标记物)的存 在，其中标签具有对标记物的亲和力。如本文所用，短语“亲和力”广泛地 涵盖了标签对标记物的直接分子结合亲和力，以及标签和标记物通过涉及一 个或多个其他结构的分子络合的相互作用的间接亲和力。例如，在一些方 面，标签可以是对标记物具有直接亲和力的一抗，而在其他方面，标签可以 是对标记物具有间接亲和力的二抗。
在一些方面，基于特定的标记物或生物标记物概况来分离细胞，使得给 定的细胞显示独特和/或可鉴定的标记物或生物标记物概况。在某些方面，标 记物或生物标记物概况是可用于限定和鉴定细胞或细胞类型的一种或多种， 两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多 种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种，或十种或更多种标记物 或生物标记物的特定组合。在一些方面，标记物或生物标记物概况可用于鉴 定细胞作为具有特定性质系列的特定细胞群的一部分。
在一些方面，生物标记物是细胞外的。在其他情况中，生物标记物是细 胞内，胞质，胞浆内，细胞表面，核外，核内，溶酶体，线粒体，内质网等 。在其他方面，生物标记物可附连于颗粒但不是反向。
在一些方面，生物标记物可以是氨基酸、肽、多肽、蛋白质、变性蛋白 。在这些情况下，结构可以是天然或变性的。
在一些方面，是无边无际可以是核酸、寡核酸、核糖核酸、转移核糖核 酸、信使核糖核酸、微型核糖核酸或脱氧核糖核酸。在这些情况下，酸可以 是单链或双链。
在其他情况下，罕见颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白复合物、核酸、核 蛋白复合体，碳水化合物、代谢物，分解代谢物等等。在一些方面，罕见颗 粒是细胞。在一些方面，细胞可以是癌细胞，循环的肿瘤细胞(CTC)、癌干 细胞、显示癌表面抗原的癌细胞，例如选自下组的抗原：CD44,CD2,CD3, CD10,CD14,CD16,CD24,CD44,CD2,CD3,CD10,CD14,CD16,CD24.CD31, CD45,CD64,CD140b或其组合。
在一些方面，细胞是胎儿细胞。在一些方面，胎儿细胞在母体流体内。 母体流体可包括：全血，分离的血，血清，血浆，汗水，泪水，耳流体， 痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流体，粪便，经子宫 颈的灌洗，脑脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房水，皮脂，内淋巴 (endolympth)，腹膜液，胸膜液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道、肠道和泌 尿生殖道的分泌物。
在一些方面，分析物是不与其他细胞或细胞外基质相连，或者嵌入组织 的分离细胞。
在一些方面，可通过灌注选择性结合生物标记物的其他试剂将癌干细胞 与普通癌细胞分离开来，这些生物标记物可包括但不限于CD44,CD2,CD3, CD10,CD14,CD16,CD24,CD31,CD45,CD64,CD140b或CD166。
例如，标签被设计成检测EGFR和CD166的表达以显示肿瘤细胞的间充 质细胞特征。其他相关的标记物，例如波形蛋白和钙粘蛋白可用于该组。
在其他情况中，可使用指示颗粒活力的生物标记物。在这些情况下，可 使用指示凋亡、坏死、有丝分裂、有丝分裂阶段、减数分裂等的生物标记物 。
在一些方面，每个系列的标记物可包括核染剂(赫斯特)作为阳性对照生 物标记物，偶联FITC的CD45作为阴性对照生物标记物，以及偶联PE或 Alexa 647的两种蛋白质生物标记物。在一些方面，赫斯特染剂可以不进行光 漂白。在这种情况下，赫斯特是阴性对照。在这种情况下，赫斯特可以不用 标准光源进行光漂白。在这种情况下，可使用UV暴露来漂白染剂。
光漂白
该方法提供了免疫染色之后的光漂白。光漂白可涉及使用光来去除或降 低来自分析物的标签的可检测部分发射的信号的强度。标签可以通过淬灭标 签或标记发射的信号来去除。在一些方面，光漂白可以在一轮免疫染色之后 或者在顺序的多轮免疫染色之后进行。
在一些方面，光漂白可以采用LED或氙弧灯(加利福尼亚州诺瓦托的萨 特仪器公司(Sutter instrument,Novato,CA))作为光源进行。采用氙弧灯，每个 光漂白步骤可进行1-59秒，1-30分钟或者15分钟。
在一些方面，出于安全考虑可以将LED氙弧灯的最大功率锁定为1- 20mW或者10mW或者100mW或者1W，取决于光源的功率密度(例如W/m2) 。可考虑采用保护方法，例如戴上防护眼镜或者用黑色盒子覆盖光漂白区域 。
在一些方面，可漂白荧光团的荧光发射(例如PE,FITC和Alexa 488)。漂 白信号(例如，至小于10％)可以在短时间内发生(例如，在不到5分钟内)。与 采用较短波长相比，采用较长波长的激光(例如,610-660nm)可具有较长的光 漂白持续时间(图17B)。在一些方面，使用各种波长的多种激光时，光漂白 时间高于一种激光的最小需要(例如15分钟)以实现具有可接受的通量的高漂 白效率。
例如，图15A显示了使用抗EpCAM-PE标记并置于No.2盖玻片上的 MCF-7细胞，采用不同暴露功率的光漂白的曲线。可使用不同的功率设定(例 如，三种)来漂白细胞。在一些方面，在高功率(例如超过2mW)下，可减少暴 露时间(例如，小于10分钟)以实现高(例如95％)的漂白效率。
样品
在本发明中，样品可包括流体样品。流体样品可源自各种来源。在一些 方面，来源可以是人、哺乳动物、动物、微生物、细菌、真菌、酵母、病毒 、啮齿类、昆虫、两栖动物和鱼。
本发明提供的流体样品可以是含有或不含感兴趣的罕见颗粒的液体。在 一些方面，样品可以是环境流体样品，例如来自湖、河、海洋、池塘、溪流 、喷泉、沼泽、水库等。在其他情况中，该样品可以是水样品，例如来自脱 盐植物、水处理植物、水库、喷泉、溪流、冰川水流体、水塔或可视作可饮 用水来源的其他水源。
在一些方面，本发明提供了分析物，包括含有罕见颗粒的分析物。罕见 颗粒可以是以低水平存在于流体样品中的细胞或大分子。在某些方面，罕见 颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白复合物、核酸、核蛋白复合体，碳水化合物 、代谢物，分解代谢物等等。在某些方面，以流体中的总颗粒群计，如果流 体样品中存在的颗粒的浓度小于约10％，或者小于约9％,8％,7％,6％,5％, 4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或者更小，颗粒可视作罕见。在其 他情况下，流体样品中存在的罕见颗粒可以是每103流体中的总颗粒群小于约1份，或者每104,105,106,107,108,109,1010,1011,1012或更多流体中的总颗粒 群小于约1份。在某些方面，以流体中的总颗粒群计，如果流体样品中存在 的颗粒的浓度小于10％，或者小于9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或者更小，颗粒可视作罕见。在其他情况下，流体 样品中存在的罕见颗粒可以是每103流体中的总颗粒群小于1份，或者每104, 105,106,107,108,109,1010,1011,1012或更多流体中的总颗粒群小于1份。
在一些方面，流体样品可包含一定百分比的水和/或其他元素。例如， 流体样品可以是包含血浆和其他物质的血液。通常，血浆大部分是水并且可 包含蛋白质、离子、维生素、酶、激素和体内的其他化学物质。
在一些方面，流体样品可以是体液。体液常常是液体中的生物颗粒的复 合悬液。例如，体液可以是血液。在一些方面，血液可包含血浆和/或细胞 (例如，红细胞、白细胞、循环的罕见细胞)和血小板。在一些方面，55％的血 液流体体积是细胞。在一些方面，血液样品可浓缩，使得至少30％，至少 40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的血液是细胞 。在一些方面，血液样品包含已经去除一种或多种细胞类型的血液。在一些方面，血液样品包含富含一种或多种细胞类型的血液。在一些方面，血液样 品可稀释，使得至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至 少80％或至少90％的血液是细胞。在一些方面，血液样品可包含细胞的异质 、同质或近同质混合物。
体液可包括但不限于：全血，分离的血，血清，血浆，汗水，泪水，耳 流体，痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流体，粪便， 经子宫颈的灌洗，脑脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房水，皮脂，内 淋巴，腹膜液，胸膜液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道、肠道和泌尿生殖 道的分泌物。在一些方面，体液可以与含有细胞和生物颗粒的混合物的各种器官(例如肺)接触。
在一些方面，体液可包含罕见颗粒。在一些方面，罕见颗粒是罕见细胞 。罕见细胞可以具核或无核。罕见细胞包括但不限于：表达恶性表型的细 胞；胎儿细胞，例如母体外周血中的胎儿细胞，肿瘤细胞，例如从肿瘤转移 至血液或其他体液的肿瘤细胞；受到病毒感染的细胞，例如被HIV感染的细 胞，被感兴趣基因转染的细胞；患有自体反应性疾病的对象的外周血中存在 的T-细胞或B-细胞的异常亚型。
在一些方面，体液可以是血液并且包含罕见细胞。罕见细胞可以是：红 细胞、血白细胞、白细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、单核细胞 、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、干细胞、红细胞、癌 细胞、肿瘤细胞或从起源于内胚层、中胚层、外胚层的任何组织或神经嵴组 织分离的细胞。罕见细胞可源自原发性来源或继发性来源(例如细胞系)。
特定的体液(例如血液)中存在的细胞和生物颗粒的类型和量可揭示关于 器官健康的信息。例如，患有癌症的对象的体液中可存在癌细胞。来自感染 的对象的样品可包含指示感染的升高数量的免疫细胞(例如淋巴细胞、中性粒 细胞、B细胞、T细胞、树突细胞等)或者含有致病物质如微生物细胞或核酸 。来自妊娠妇女的样品可包含指示胎儿基因型或核型的胎儿细胞。
与正常数量相比，一些细胞或生物颗粒在体液中可以是罕见量。这些罕 见细胞可包括循环的肿瘤细胞、癌干细胞等。这些细胞可以由身体区域中发 生的事件(例如癌症)导致在体液中出现。细胞可来来源于含有体液的器官或 体液附近的器官。例如，罕见的乳腺癌细胞可以在位于乳腺附近的血液或淋 巴液中存在。在一些方面，细胞来源于更远的器官。例如，来源于睾丸肿瘤 的细胞可以存在于从手臂提取的血样中。
分析
本发明提供了可进行分析的方法。在一些方面，分析可包括询问等分试 样的源。在其他情况下，如果等分试样含有固有地显示化学发光或者生物发 光的分析物(例如罕见细胞)，设备可能不需要用于询问等分试样的源。
在一些方面，分级装置可选自：计算机、处理器、控制器、带有集成电 路的芯片、电路板、电子元件、软件、算法或它们的组合。在一些方面，处 理器可以是数字处理器(例如FGPA,ASIC或RT)。在一些方面，计算机接收 来自检测装置的信号并通过算法分级等分试样。分级装置可基于分级的值(例 如流体样品中罕见颗粒的存在、不存在、数量、身份、或组成)将等分试样引 导到合适的通道内。
在一些方面，可分析来自第一检测器的信息。可分析来自第一检测器的 信息，结果显示分析物为阳性。在一些方面，可分析来自检测器的信息，结 果显示分析物为阴性。在一些方面，读出阳性或阴性分析物的分级装置将信 号传送至流体动力学转换元件(例如电磁阀)以分选分析物。在一些方面，阳 性分析物可移动至微流体芯片的独特通道。在一些方面，阳性分析物可移动 至微流体芯片的独特腔室。在一些方面，阳性分析物可移动至微流体芯片的 废液腔室。在一些方面，阴性分析物可移动至微流体芯片的独特通道。在一 些方面，阴性分析物可移动至微流体芯片的独特腔室。在一些方面，阴性分 析物可移动至微流体芯片的废液腔室。在一些方面，阳性分析物可以与阴性 分析物分开。
在一些方面，可采用第二检测器转述的信息进行分析。第二检测器可用 于证实采用第一检测器获得的信息。在一些方面，第二检测器可位于微流体 芯片上。在一些方面，第二检测器可不在微流体芯片上。在一些方面，第二 检测器获得来自基于第一检测器检测的信号分选的细胞的信号。在一些方 面，第二检测器接收来自分选细胞的检测信号并能够将关于信号的信息传送 至计算机。计算机可用于确定是否对合适的细胞进行分选。
在一些方面，可进行对免疫染色方法期间获得的信息的分析。分析物的 免疫染色的方法在微流体芯片的腔室中进行。在该腔室，检测器可检测来自 第一轮染色的一种或多种信号。在一些方面，一种或多种信号可以光漂白。 检测器可监测发射的信号的持续时间和强度。在一些方面，分析物可进行第 二轮染色。检测器可检测第二轮染色之后分析物发射的信号。在一些方面， 一种或多种信号可以光漂白。检测器可监测发射的信号的持续时间和强度。 在一些方面，免疫染色和光漂白的循环可以重复多个循环。计算机可用于(例如)将免疫染色的分析物的一种或多种信号与第一轮免疫染色进行比较以确保 光漂白的发生。
单一分析物阵列装置和方法
本发明提供了用于从液相捕获单一分析物的方法和设备。在一些方面， 分析物可以是颗粒。在其他情况下，分析物可以是细胞。分析物可捕集在腔 室中。在其他情况下，分析物可以捕集在孔中。在其他情况下，分析物可以 捕集在插片中。在一些方面，腔室或孔可以以线性模式排布。在其他情况 下，腔室或孔可以以阵列模式排布。
装置可设计成各种模式。例如，可产生二维(2D)装置。在一些方面，2D 装置可具有轴向线流(图17B)。轴向线流可以是顺序流设计。在一些方面， 可产生三维(3D)装置。例如，3D装置可具有栅格排布的腔室(图17C)。如果 需要可存在一些可选的设计，用于2D或3D策略。
2D装置可具有带有各种潜在尺寸的通道和腔室。尺寸可影响顺序流动 阻力阱设计。图18显示了具有潜在的阱密度和尺寸的装置的示意图，插图中 显示了装置的放大区域。在一些方面，潜在的尺寸可包括，主通道的宽度， 缢痕的宽度，主通道缢痕入口到主通道缢痕出口的长度，横跨缢痕的长度， 以及主通道、缢痕和缢痕腔室的高度。
在一些方面，顺序流动阻力阱可以与微流体装置配对。装置可以由入口 和出口构成，在入口处引入样品(左侧)，而在出口处去除过量的液相(右侧)。 装置中间可具有高的可掺入的流动阻力阱密度。图18B显示了图18C的放大 区域。在一些方面，流动阻力阱可构成装置的功能部分。
3D装置可具有带有各种潜在尺寸和形状的腔室。尺寸和形状可影响平 行流动阻力阱设计。在一些方面，3D装置的腔室可以是孔。装置可以从溶 液捕集单一颗粒/细胞(例如，珠、细胞等)，多个孔可以平行排布以形成装置 。3D装置上孔的横截面侧视图显示了潜在的形状变化(图19)。在一些方 面，孔设计可包括：螺旋、椭圆、抛物线、双曲线、多边形、无限边形、一 千边形、十边形、九边形、(古戈尔边形)googolgon、一百边形、七边形、 十一边形、六边形、一百万边形、万边形、八边形、五边形、四边形、三角 形、梯形、圆柱形、超平面、平面、正多面体、十二面体、六面体、二十面 体、八面体、四面体、圆环、二次曲面、圆顶、圆柱体、球体、双曲面、抛 物面、四维体、正一百二十胞体(hecatonicosachoron)、正六百胞体(hexacosichoron)、正十六胞体、正二十四胞体、正五胞体(pentachoron) 、四维立方体、球顶锥体或穹顶。在一些方面，孔的尺寸可以由h1＝孔的深 度,h2＝缢痕的深度,r1＝孔的半径,和r2＝缢痕的半径限定。
在一些方面，装置的物理材料可以由光学透明材料构成，包括但不限于 玻璃、聚合物(例如，PDMS,聚酯(mylar),Dymax,聚氨酯)。在其他情况下， 装置的物理材料可以由多层构成。在一些方面，多层可包括前述材料的各层 。
本文所述的装置可以采用本文所述方法构建。例如，图20显示了可用 于构建一些装置的方法的示意图。在一些方面，该方法可包括一层层构建装 置。对于第一层，固体基层(例如，硅晶片)可以用光刻胶旋涂。涂覆的基层 可以置于刻上UV透过和不透区域中描绘的所需设计的光刻掩模硬接触。掩 模和基层可以暴露于UV光。采用UV光使得光刻胶中的光化学物质交联。 制造的装置的第一层可以通过对所得交联图案显色，溶去光刻胶的非交联部分来完成。在一些方面，第二层可采用模具构建。模具可通过涂覆、暴露和 显色另一层光刻胶来制备。在一些方面，模具可用于在可固化(例如PDMS)或 可压花材料中形成通道、腔室和孔结构。例如，模具可置于碟中。在一些方 面，PDMS可倾倒到模具上并固化。PDMS可以脱模，冲压入口和出口。在 一些方面，图案化的PDMS可密封至平面玻璃或一片PDMS以关闭通道和腔 室或孔。
本文所述的装置可以采用本文所述方法建立。例如，可采用微制造方法 来制备平行流动阻力阱(图21)。装置可以在除了光刻胶之外的材料中制造(例 如SU-8)，包括但不限于：聚合物材料，光刻胶，聚二甲基硅氧烷(PDMS)， 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚甲基聚氨酯(PUMA)等。在一些方面，微制造 方法可包括：(1)将牺牲层旋涂到硅(Si)晶片上，(2)顶部沉积光刻胶(SU-8)，(3) 使光掩膜与微阵列图案对齐并使晶片暴露于UV，(4)处理和去除未交联的光 刻胶，如果需要，旋涂和处理第二层光刻胶，以及最后(5)使SU-8层脱离Si 晶片并组装到(仅路径1)多孔聚碳酸酯滤器和/或(路径1-2)安装有用于插入管 道的单一出口的PDMS上。
在一些方面，单一细胞可以由流体力捕集。流体力可以操控细胞。在一 些方面，流体力可以通过装置表面上的分子的相互作用来提升。在一些方 面，分子可显示特异性结合(例如，适体、抗体、伯胺、琥珀酰氨基酯 (succinymidyl ester))或非特异性结合(例如，聚电解质)。在其他情况下，流体 力可通过光学力提升。光学力可包括但不限于：吸引力(例如，单光束梯度 光学陷阱，旋涡陷阱)，排斥力(如散射)，界面张力(如马兰戈尼(Marangoni)力)，静电作用力(斥力、引力)或磁力(例如，通过施加的具 有固有磁性易感的内部物质的磁场的相互作用产生的磁力)。
本发明提供了可进行隔离或捕集、操纵和样品检测的装置、方法和系统 。在一些方面，样品可以由微流体装置捕集的分析物构成(例如通过流体力、 重力、光学力或分子相互作用或形成共价键保留在固定位置)。
在一些方面，分析物可捕集在、固定在、保留在、或者以其他方式附连 于微穴，例如微流体装置上的孔或室。在其他方面，分析物位于微穴内。在 一些方面，分析物可捕集在、固定在、保留在、或者以其他方式附连于微插 片，例如微流体装置中基材涂覆的插片。在其他方面，分析物通过流体流动 和/或重力产生的力被捕集在、固定在、保留在、或者以其他方式附连于微穴 或微插片。在一些方面，分析物通过粘附力、分子相互作用和/或共价键被捕 集在、固定在、保留在、或者以其他方式附连于微穴或微插片。在一些方 面，分析物通过非共价键被捕集在、固定在、保留在、或者以其他方式附连 于微穴或微插片，所述非共价键包括但不限于范德华相互作用、静电相互作 用、疏水相互作用和/或非特异性吸附。
在一些方面，分析物是单个细胞。分析物可与标签接触。在一些方面， 标签可识别分析物上的靶标。标签可结合靶标。在一些方面，靶标可以是分 析物上的分子组分。在一些方面，该分子组分可以在分析物外面。在一些方 面，该分子组分可以在分析物内部。标签可采用各种检测方法进行检测。
本发明提供了容纳或物理捕集单一分析物的方法。在一些方面，分析物 可以是细胞。细胞可以转运到液相，此时液体沿着流路并且可以运行至物理 限定位置。在一些方面，细胞可保留在限定位置。基于流动的力可施加到细 胞上以将细胞捕集到限定位置。在另一种情况下，由于流体流路从入口连续 至出口，细胞相继被捕获。在另一种情况下，多重流体流路及其相应的多重 单个细胞可以以平行方式捕集或隔离。在一些方面，以平行方式捕集是因为 入口和出口之间细胞同时经历许多流路。
在优选的情况下，该方法可提供流体样品中的每个分析物(例如细胞)沿 着流路并进入腔室。分析物可进入腔室并阻断流路，终止通过流路的流动。 在这种情况下，另一个分析物不能进入腔室。流体样品中剩余的细胞可进入 剩余的空腔室，一直到一些或者所有腔室包含分析物。
在一些方面，本发明揭示了采用顺序流动阻力阱捕集功能收集、离散化 和读取生物来源样品的方法。例如，图22A显示了样品如何顺序填充限定位 置。当样品的关键尺寸(直径)(1)小于主通道的高度和宽度，和(2)大于缢痕的 高度或宽度时，可发生该过程。在一些方面，对流动差异阻力可将样品引导 到限定区域，而缢痕可以闭塞并且流动终止。后续的样品可沿着流路通过主 通道到下一个捕集位置，一直到填充所有的阱。例如，图22B显示了不混溶 的液相如何被引导通过样品入口。不混溶的液体可以顺序离散化捕集的样品 。在一些方面，不混溶的液体不能流入样品区域。不混溶液体的流体流动的 缺乏可能是因为闭塞的限制。在一些方面，流体流动的缺乏可能是因为不混 溶相与通道材料的差异接触角产生的界面屏障以及捕集区域的尺寸。在一些 方面，关于每个样品的暂时信息可以在每个位置物理编码。可检测离散化样 品的各种化学性质(图22C)。
在一些方面，本发明揭示了采用平行流动阻力阱功能收集、离散化和读 取生物来源样品的方法。例如，图22A和22D显示了样品如何填充平行流动 阻力阱。在一些方面，样品颗粒可跟随从装置的顶部到孔内的流动。多重样 品可以在平行流动阻力阱中同时被捕集。在一些方面，采用平行流动阻力阱 比采用顺序流动阻力阱的样品收集速度更快。例如，图22D显示了不混溶相 如何在捕集孔平面的上方和下方被替换。在一些方面，捕集孔平面的上方和 下方的不混溶相可以产生离散化的样品。在一些方面，关于每个样品的暂时 信息可以在每个位置物理编码。可检测离散化样品的各种化学性质(图22C) 。
在一些方面，捕集的分析物可以从单一分析物阵列释放并分析。例如， 图24显示了捕集用于分析和释放的生物分析物的阵列的可能的顺序。在一些 方面，该顺序可包括(1)由管道施加流动以使流体流过阱，(2)一旦捕集分析物 即停止局部区域的流动，和(3)用缓冲液冲洗多余的流体和颗粒。
在一些方面，单一分析物阵列中捕集的分析物可以经历进一步的分析。 在一些方面，单一分析物阵列可以与顺序免疫染色和光漂白的方法联用。
在一些方面，单一分析物阵列可以与本领域技术人员已知的用于核酸分 析的方法联用。在一些方面，核酸分析可包括聚合酶链反应(PCR)。在采用单 一分析物阵列进行PCR的情况下(图17)，所有腔室可填充在流体中的单一分 析物。每个腔室可以密封(例如用油)，每个单一分析物可平行进行PCR。
单一分析物阵列单独的孔或腔室中包含的分析物可采用各种技术进行检 测。例如，可采用显微镜对孔或腔室中的分析物成像。在一些方面，显微镜 可包括亮场显微镜。在一些方面，显微镜可包括荧光显微镜。在任意显微镜 的情况下，样品可置于平台上。在一些方面，平台可手动操控。在其他情况 下，平台可以是由计算机程序控制的自动平移台。在任意显微镜的情况下， 图像可以由CCD相机获取。
应用
本发明提供了可以在各种应用中使用的方法。在一些方面，该方法提供 了对象用于流体样品(例如生物流体如血样)中罕见颗粒的存在相关的病症的 诊断或预后。
本文所述的方法和设备可包括以下步骤：(a)在适用于使标签转化为包含 所述标签和分析物的复合物的条件下使来自对象的生物流体与标签接触；(b) 检测生物流体的等分试样中步骤(a)中形成的复合物的存在与否；(c)基于步骤 (a)中形成的复合物的存在与否对等分试样赋值；和(d)基于分离的等分试样的 分析提供对象的诊断或预后。在一些方面，步骤(b)可包括用照射源询问等分 试样和检测结合至分析物的标签发射的信号。
在许多方面，提供了鉴定流体内的分析物上存在的多种标记物的方法， 所述方法包括：(a)检测来自采用照射源的第一标签的信号，其中所述第一标 签附连至结合所述分析物上的第一标记物的第一结构；(b)基于所述第一标签 的存在分配所述分析物；(c)降低所述第一标签的信号的强度；(d)使所述分 析物与结合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构附连至第二标 签；以及(e)检测第二标签。
在一些方面，步骤(b)的分配是基于第一标签和第三标签的存在。在其他 方面，步骤(b)的分配采用微流体装置进行。在其他方面，步骤(b)分配以及步 骤(b)或步骤(e)中至少一个的检测在相同的微流体装置中进行。
在许多方面，提供了检测分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：使所述分析物与第一标签接触，其中所述分析物包括第一标记物且所 述第一标签对所述第一标记物具有亲和性；检测所述第一标签发射的第一信 号，其中所述第一信号的存在指示所述第一标记物的存在；基于所述第一信 号的存在分配包含所述分析物的流体；降低所述第一信号的强度；使所述分 析物与第二标签接触，其中所述分析物包括第二标记物且所述第二标签对所 述第二标记物具有亲和性；以及检测所述第二标签发射的第二信号，其中所述第二信号的存在指示所述第二标记物的存在。
在一些方面，第一标签的信号降低超过50％。在某些方面，降低信号强 度通过对分析物施加照射来完成。在其他方面，采用白光来降低信号强度。 在其他方面，采用激光来降低信号强度。在其他方面，采用发光二极管来降 低信号强度。在某些方面，降低信号强度通过对第一标签施加化学物质来完 成。在某些方面，化学物质是还原剂。在其他方面，还原剂是二硫苏糖醇。
在一些方面，分配流体是基于第一信号和第三信号的存在。在其他方 面，检测第一信号，检测第二信号，分配流体，或者它们的组合采用微流体 装置进行。
在一些方面，分析物是细胞。在某些方面，细胞是癌细胞。在其他方 面，癌细胞是罕见细胞。在一些方面，分析物是循环的肿瘤细胞。在某些方 面，细胞是细菌细胞、免疫细胞、胎儿细胞、治疗后保留的指示疾病的细胞 、或干细胞。在其他方面，细胞是罕见细胞，占流体中的总细胞群不到1％ 。在某些方面，分析物是分离的细胞(dissociated cell)。
在一些方面，流体选自下组：全血，分离的血，血清，血浆，汗水，泪 水，耳流体，痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流体， 粪便，经子宫颈的灌洗，脑脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房水，皮 脂，内淋巴(endolympth)，腹膜液，胸膜液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道 、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在某些方面，流体是全血。在其他方面，流体是分离的(fractionated)全血。
在一些方面，第一标签是荧光团。在其他方面，第一标签是抗体。在其 他方面，第一标签是由核酸构成的探针。在某些方面，方法还包括使来自第 一标签和第二标签的信号成像。在一些方面，分析物存在于流体中，流体是 更多体积的流体的等分试样。在其他方面，检测第一标签发射的第一信号在 多个分析物上同时进行。
在某些方面，分配半自动或自动进行。在某些方面，分配通过集合决策 等分分级来进行。在一些方面，不采用流式细胞仪来分配分析物。
在其他方面，分析物包括多个标记物。在一些方面，所述多个标记物中 的每一个是生物标记物。在某些方面，分析物包括表达概况，所述表达概况 由所述多个标记物限定。
在其他方面，方法还包括使分析物接触缓冲液。在其他的一些方面，缓 冲液包含固定剂。在某些方面，缓冲液包含透化剂。在其他方面，缓冲液是 洗涤缓冲液。
在各个方面，提供了从包含第一细胞类型和第二细胞类型的样品中分离 细胞的方法，所述方法包括：(a)通过管道组将样品引入微流体芯片，其中所 述微流体芯片包括(i)流体连接至所述管道组的至少一个通道；(ii)被构造成检 测所述至少一个通道内的细胞的信号的检测器；和(iii)流体连接至所述至少一 个通道的至少一个腔室；(b)使样品的一部分流过检测器；(c)采用检测器检 测所述样品部分内第一细胞类型的存在与否；(d)如果在所述样品部分内检测 到第一细胞类型，则将所述样品的等分试样引导到腔室内，其中所述等分试 样包含第一细胞类型；和(e)重复步骤(b),(c)和(d)，从而在腔室中分离多个等 分试样，使得腔室包含大于80％样品内的第一细胞类型的总量以及小于5％样 品内的第二细胞类型的总量。
在各个方面，提供了用于从样品分离细胞的方法，所述方法包括：(a)将 样品引入微流体芯片，其中所述样品包含第一细胞类型和第二细胞类型，所 述微流体芯片包括：通道；被构造成检测通道内发射的信号的检测器；与所 述通道流体连通的腔室；(b)使样品的一部分流过所述通道，其中所述样品部 分包含多个第一细胞类型、多个第二细胞类型或其组合；(c)采用检测器检测 所述样品部分内第一细胞类型的存在与否；(d)如果所述样品部分内存在第一 细胞类型则将所述部分引导到腔室内；和(e)重复(b),(c)和(d)足够的次数，使 得所述腔室包含超过80％所述样品内存在的第一细胞类型的总数和不到5％所 述样品内存在的第二细胞类型的总数。
在一些方面，第一细胞类型和第二细胞类型中的至少一种是癌细胞。在 某些方面，癌细胞是罕见细胞。在其他方面，第一细胞类型和第二细胞类型 中的至少一种是循环的肿瘤细胞。在其他方面，第一细胞类型和第二细胞类 型中的至少一种是细菌细胞、免疫细胞、胎儿细胞、治疗后保留的指示疾病 的细胞、或干细胞。在一些方面，第一细胞类型和第二细胞类型中的至少一 种是罕见细胞，占样品中的总细胞群不到1％。
在一些方面，样品选自下组：全血，分离的血，血清，血浆，汗水，泪 水，耳流体，痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流体， 粪便，经子宫颈的灌洗，脑脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房水，皮 脂，内淋巴(endolympth)，腹膜液，胸膜液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道 、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在某些方面，样品是全血。在其他方面，样品是分离的(fractionated)全血。
在一些方面，腔室位于微流体芯片之外。在某些方面，腔室是小瓶、微 量离心管或孔板中的孔。在其他方面，腔室通过管道与通道流体连通。在其 他方面，腔室通过毛细管与通道流体连通。
在各个方面，提供了鉴定分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：(a)通过使分析物流过包含多个微穴或微插片的基板分配多个分析物， 其中，大多数微穴或微插片能够容纳不超过一个分析物，所述微穴或微插片 位于微流体装置上；(b)在所述微穴或微插片中，每个分析物与能够结合第一 标记物的第一结构接触，其中所述第一结构连接至第一标签；(c)检测来自第 一标签的信号；(d)降低所述第一标签的信号的水平；(e)使所述分析物与结合 第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构连接至第二标签；以及(f)检 测第二标签。
在一些方面，步骤(b)的接触通过使包含第一结构的流体流过与微穴或微 插片流体连通的通道来实现。在某些方面，在步骤(b)的接触步骤之后，该方 法还包括：使分析物与洗涤缓冲液接触。
在各个方面，提供了检测分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：通过使流体流过包含微穴或微插片的基板将分析物分离到微穴或微插 片中，其中所述流体包含分析物；使所述分析物与第一标签接触，其中所述 分析物包括第一标记物且所述第一标签对所述第一标记物具有亲和性；检测 所述第一标签发射的第一信号，其中所述第一信号的存在表明所述第一标记 物的存在；降低所述第一信号的强度；使所述分析物与第二标签接触，其中 所述分析物包括第二标记物且所述第二标签对所述第二标记物具有亲和性；以及检测所述第二标签发射的第二信号，其中所述第二信号的存在指示所述 第二标记物的存在。
在一些方面，该方法在多个微穴或微插片中分离的多个分析物上进行。 在某些方面，第一标签的信号降低超过50％。在其他方面，至少一个分析物 是细胞。
在一些方面，分析物通过流体流动、重力或粘附力产生的力保留在微穴 内的固定位置。在某些方面，分析物通过分子相互作用连接至微穴或微插片 。在他方面，分析物通过非共价键连接至微穴。在其他方面，非共价键是范 德华相互作用、静电键合、疏水键合或非特异性吸附。
在各个方面，提供了用于在微流体芯片内分离流体样品的等分试样的方 法，其中，所述等分试样包含罕见颗粒，所述方法包括以下步骤：(a)检测等 分试样中罕见颗粒的存在与否；(b)基于罕见颗粒的存在与否对所述等分试样 赋值；和(c)基于赋值通过打开电驱动阀引导等分试样的流动，其中所述电驱 动阀位于所述微流体芯片之外的装置上。在一些方面，所述微流体芯片包括 样品输入通道、至少两个输出通道和至少一个定向流动通道，其中所述电驱 动阀控制所述定向流动通道内流体的流动。
疾病的诊断
在一些方面，采用本发明方法分离的分析物(例如细胞)可以进一步经受 亚群分析(例如根据基因型或表型)以开发靶向治疗。例如，分离的细胞(例如 肿瘤细胞)可以与结合特定生物标记物(例如药物靶标)的标签(例如荧光抗体)孵 育以确定药物靶标的存在或程度。一旦证实药物靶标的表达，选择药物用于 特异性开发以靶向特定药物靶标的表达的疗法。在一个例子中，分离的肿瘤 细胞可与特异性结合Her2受体的荧光抗体孵育，以确定乳腺肿瘤脱落CTC 是Her2-阳性。如果分离的肿瘤细胞显示高Her2表达，贺赛汀(Herceptin)(曲 妥单抗)可用作疗法，因为该药物设计成靶向和阻断HER2蛋白过度表达的功 能。其他已知的药物靶标，包括BCR-ABL或PDGFR(由药物格列卫(Gleevec) 靶向),ERBB2(由贺赛汀(Herceptin)靶向),EFGR(由易瑞沙(Iressa),特罗凯 (Tarceva)靶向),RAR-α(由ATRA靶向),雌激素醇受体(由他莫昔芬靶向),芳香 酶(由来曲唑(Letrazole)靶向),雄激素受体(由氟他胺(Flutamide),比卡鲁胺 (Biclutamide)靶向),CD20(由利妥昔单抗靶向),VEGF-受体(由阿瓦斯汀 (Avastin)靶向)，也可类似地从分离的肿瘤细胞筛选，然后指定合适的化疗方 案。
在一些方面，分析物可以是罕见颗粒(例如癌细胞或循环的肿瘤细胞 (CTC))。在其他情况下，罕见颗粒可以是寄生细胞或生物体，例如贾第虫属 (Giardia)或隐孢子虫属(Cryptosporidium)的物种，感染原质团(Plasmodium)物 种的红细胞，感染HIV的淋巴细胞或白细胞，母血中的胎儿细胞，干细胞， 朊病毒感染细胞，CD4+T-细胞等。
在一些方面，方法可包括检测来自对象的血样中循环的肿瘤细胞。该方 法可包括eDAR。在某些方面，对象可以是诊断患有癌症的患者。在一些方 面，癌症可以是I期,II期,III期或IV期。在一些方面，可在过去诊断为癌症 的患者的血样中检测到循环的肿瘤细胞(CTC)。在这种情况下，患者可进一 步诊断为转移癌。
在一些方面，该方法可用于在过去诊断为实体瘤的对象中诊断转移癌， 所述方法包括以下步骤：(a)检测来自对象的血样的等分试样中CTC的存在 与否；(b)基于CTC的存在与否对等分试样赋值；和(c)基于赋值引导等分试 样的流动或收集。
在一些方面，血样中没有CTC可与不患有转移癌的对象相关联。血样 中至少一个CTC的存在可与患有转移癌的对象相关联。在一些方面，血液中 至少一定数量的CTC的存在可与患有转移癌的对象相关联。该方法还包括以 下步骤：(d)如果血样中没有检测到CTC则诊断对象不患有转移癌，或者如果 血样中检测到至少一个CTC则诊断对象患有转移癌。
本发明还提供了监测诊断患有癌症的对象的方法。该方法包括采用本文 提供的eDAR方法检测来自对象的血样的等分试样中CTC的存在与否。在一 些方面，可以有规律的间隔,例如一年至少一次,一年至少两次,一年至少3,4, 5,6,7,8,9,10或更多次，或者一年至少约3,4,5,6,7,8,9,10或更多次监测转 移癌的癌症进程。在一些方面，一个月一次，或者一个月至少2,3,4,5,6,7, 8,9,10或更多次监测对象。在一些方面，一个月约一次，或者一个月至少约 2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多次监测对象。血样中没有CTC可与不患有转移癌的对象相关联。血样中至少一个CTC的存在可与患有转移癌的对象相关联 。血液中至少一定数量的CTC的存在可与患有转移癌的对象相关联。
在血样中检测到CTC的情况下，该方法还包括以下步骤：使一个或多个 鉴定为包含CTC的等分试样经进一步的分析以鉴定一个或多个CTC细胞的一 种或多种表征。例如，含有CTC的等分试样或等分试样的池可以与对于一种 或多种癌特异性表面抗原特异性的一种或多种检测试剂接触。可以分析的癌 特异性表面抗原的非限制性例子包括但不限于：BCR-ABL或PDGFR(由格列 卫靶向),ERBB2(由贺赛汀靶向),EFGR(由易瑞沙,特罗凯靶向),RAR-α(由 ATRA靶向),雌激素醇受体(由他莫昔芬靶向),芳香酶(由来曲唑靶向,雄激素受体(由氟他胺,比卡鲁胺靶向),CD20(由利妥昔单抗靶向),VEGF-受体(由阿瓦斯 汀靶向)等。在一些方面，表面抗原可以采用本文所述的顺序免疫染色和光漂 白方法分析。
本文所述的方法和装置可用于诊断癌症之外的疾病。在一些方面，可诊 断疟疾，该方法包括检测感染原质团的红细胞。在其他情况下，提供了诊断 HIV感染的方法，该方法包括采用本文所述的eDAR方法和/或设备检测感染 HIV病毒的淋巴细胞或白细胞。在另一种情况下，提供了诊断与朊病毒相关 疾病的方法，该方法包括检测来自人或其他动物的生物流体中的朊病毒。
在一些方面，分析物是罕见细胞，罕见细胞是细菌细胞。在一些方面， 细菌细胞存在于全血样品中。在其他方面，采用装置、方法、系统或设备来 检测血样中罕见细菌细胞的存在。在一些方面，采用装置、方法、系统或设 备来检测全血样品中罕见细菌细胞的存在，以提供与表征或管理细菌感染或 败血病相关的诊断、预后或其他治疗参数。
疾病预后
本发明提供了用于与流体中分析物的存在相关的疾病或病症的预后的方 法。在一些方面，分析物可以是生物颗粒。在一些方面，流体可以是生物流 体。在一些方面，方法包括以下步骤：(a)检测来自对象的样品的等分试样中 分析物的存在与否；(b)基于分析物的存在与否对等分试样赋值；(c)基于赋值 引导等分试样的流动或收集；和(d)如果样品中没有检测到分析物则提供良好 预后，或者如果样品检测到分析物则提供差预后。
在一些方面，基于等分试样中分析物的数量和身份对等分试样赋值。在 一些方面，基于样品中分析物的数量提供好或差的预后。例如，如果样品中 分析物的数量小于预定参考值则提供好预后，并且如果样品中分析物的数量 等于或大于参考值则提供差预后。在一些方面，预定参考值可以与响应特定 疗法的可能性相关，或者与总的或无疾病生存持续时间(例如至少6个月，或 至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多年)的可能性相关。
在一些方面，本文提供的方法可用于提供与罕见颗粒相关的任意疾病的 预后。在一些方面，提供了用于提供疟疾的预后的方法，该方法包括包括采 用eDAR方法和/或本文所述的设备确定来自个体的血样中感染原质团的红细 胞的数量。在一些方面，如果血样中检测到的感染红细胞的总数小于预定参 考值则表明好预后，或者如果血样中检测到的感染红细胞的总数等于或大于 参考值则表示差预后。在一些方面，提供了用于提供HIV感染的预后的方 法，该方法可包括采用eDAR方法和/或本文所述的设备确定来自个体的血样中感染HIV病毒的淋巴细胞或白细胞的数量，如果血样中检测到的感染细胞 的总数小于预定参考值则提供好预后，或者如果血样中检测到的感染细胞的 总数等于或大于参考值则提供差预后。在一些方面，提供了用于提供朊病毒 相关疾病的预后的方法，该方法可包括采用eDAR方法和/或本文所述的设备 确定来自对象的生物流体样品中朊病毒的数量，如果样品中检测到的朊病毒 总数小于预定参考值则提供好预后，或者如果样品中检测到的朊病毒总数等 于或大于参考值则提供差预后。
在一些方面，本发明提供了用于提供诊断患有实体瘤的对象的预后的方 法。在一些方面，该方法包括以下步骤：(a)检测来自对象的血样的等分试样 中CTC的存在与否；(b)基于CTC的存在与否对等分试样赋值；(c)基于赋值 引导等分试样的流动或收集；和(d)如果没有检测到CTC则提供好预后，或 者如果检测到CTC则提供差预后。
在一些方面，提供了用于提供诊断患有转移癌的对象的预后的方法。在 一些方面，该方法包括以下步骤：(a)检测来自对象的血样的等分试样中CTC 的存在与否；(b)基于等分试样中检测到的CTC数量对等分试样赋值；(c)基 于赋值引导等分试样的流动或收集；和(d)如果血样中检测到的CTC总数小于 预定参考值则提供好预后，或者如果样品中检测到的CTC总数等于或大于参 考值则提供差预后。
在一些方面，预定参考值可以与响应特定疗法的可能性相关，或者与总 的或无疾病生存持续时间(例如至少6个月，或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 15,20或更多年)的可能性相关。
疾病对治疗的响应
本发明提供了监测疾病进程或对疗法响应的方法。在一些方面，该方法 可包括检测流体样品中的分析物。在一些方面，方法包括以下步骤：(a)第 一次检测取自对象的第一生物样品的多个等分试样中分析物的存在与否；(b) 基于罕见颗粒的存在、不存在、数量或身份对等分试样赋值；(c)确定来自第 一样品的所有等分试样的总值；(d)第二次检测取自对象的第二生物样品的多 个等分试样中分析物的存在与否；(e)基于分析物的存在、不存在、数量或身 份对等分试样赋值；(f)确定来自第二样品的所有等分试样的总值；和(g)比较 赋予第一样品的总值与赋予第二样品的总值，与赋予第一样品相比，赋予第 二样品的值升高与疾病进程和/或疗法响应差相关，和/或与赋予第一样品相 比，赋予第二样品的值降低与疾病退行和/或疗法响应好相关。在一些方面， 等分试样可基于赋值进一步引导到特定的通道或腔室(通道化)用于收集，进 一步富集，或进一步分析。
在一些方面，在诊断疾病或开始治疗方案之后，可以有规律地采用监测 疾病进程或疗法响应的方法。例如，一年至少一次,一年至少两次,一年至少3, 4,5,6,7,8,9,10或更多次，或者一年至少约3,4,5,6,7,8,9,10或更多次从对 象收集样品。在一些方面，一个月一次，或者一个月至少2,3,4,5,6,7,8,9, 10或更多次监测对象。在一些方面，一个月约一次，或者一个月至少约2,3, 4,5,6,7,8,9,10或更多次监测对象。
在一些方面，如果发现疾病进程或者疗法响应差，方法还包括分配疗 法，提高剂量方案，改变治疗方案等步骤。在一些方面，与罕见颗粒相关的 疾病或病症可以是癌症、疟疾、HIV/AIDS、朊病毒相关疾病等。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体 值。表述这样的范围时，另一种实施方式包括自某一具体值始和/或至另一具 体值止。类似地，用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解该具体值构 成另一个实施方式。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值有 关和与另一个端点值无关时，都是有意义的。本文所用术语“约”是指在特 定用法的语境内指定数值加或减15％的范围。例如，约10可包括从8.5到 11.5的范围。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然 了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情 况下可以作出多种改变、变化和取代。应理解，本文所述的本发明实施方式 的各种替代形式可用于实施本发明。下列权利要求书确定了本发明范围，这 些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
本文所述的特例是通过实施例的方法并且仅用于显示本发明的优选实施 方式的示例性描述的目的并且在提供那些是最有用的并易于理解本发明的多 个实施方式的原理描述和概念实施方式。在这方面，没有尝试去以比本发明 的基本理解所需更详细地显示本发明的结构细节，附图和/或实施例的描述使 得在实践中如何实施本发明的几种形式是本领域技术人员是显而易见的。下 面的定义和解释表示或旨在表示控制任意未来构成，除非在以下实施例中清 楚且毫无疑义地改良或者当含义应用产生构成无意义或基本无意义。在术语 构成将产生无意义或基本无意义的情况下，定义应取自韦伯辞典 (Webster’sDictionary),第三版，或者本领域技术人员已知的辞典，例如《牛津 生物化学和分子生物学的辞典》(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，AnthonySmith编,牛津大学出版社(Oxford University Press), 牛津,2004).
如本文所述，除非另有说明，术语“一”和“一个”表示“一个”， “至少一个”，或“一个或多个”。除非另有说明，本文所用单数术语包括 复数且复数术语包括单数。
除非说明书和权利要求书中明确说明，术语“包括”、“包含”等应被 认为是包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，其含义是“包括 但不限于”。
除非另有说明，本发明所述方法和过程可以任何顺序进行。例如，描述 步骤(a)、(b)和(c)的方法可首先进行步骤(a)，随后步骤(b)，随后步骤(c)。 或者，可以不同的顺序进行该方法，例如，首先进行步骤(b)，随后步骤(c)， 随后步骤(a)。此外，那些步骤可以同时或分开进行，除非另有明确说明。
使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，“本文”、“以 上”和“以下”和类似重要词语在本申请中使用时应该整体指代本申请并且 不是指代本申请的任意特定部分。
实施例
包括以下实施例以进一步描述本发明的一些方面，这些实施例不应用于 限制本发明的范围。
实施例1
用于大容量捕集循环的肿瘤细胞的基于微流体组件的集合决策等分分级
该实施例描述和证实了根据本发明一个方面用于分离包含细胞的颗粒的 新的eDAR平台。
决定eDAR平台的特征和性能的两个关键因素是高效的主动分选方案和 后续的有效纯化(例如纯化腔室)方案。本发明的eDAR-平台优化了这两个组 件。在一个例子中，eDAR平台可包括通过标准光刻方法制造的集成的过滤 区域。微流体芯片可以由位于硅母版上的两层组成，采用一步复型模制制造 成聚二甲基硅氧烷(PDMS)。微流体芯片可以粘结到玻璃基板进行精整。整 个系统可包括主动分选方案。微流体芯片和流体动力学转换方案的分析性能 可以优化到特定的回收效率(例如95％)，特定的假阳性率(例如，0)和特定的 处理量(例如，4.8mL全血/小时)。
微流体芯片
该实施例中使用的微流体芯片具有集成在相同设计中的两个功能区域， eDAR分选区域和基于缝结构的过滤单元。将血液引入分选连接处的分选单 元中的主通道具有50μm的高度和150μm的宽度；所有其他4个通道的高度 为50μm，宽度为200μm。缝过滤器的高度为5μm，宽度为5μm。测试的 缝的最大数量为20,000。
硅母板采用两种光刻工艺制造(图5,20和21)。采用AutoCAD(加利福尼 亚州拉霍亚Autodesk公司(Autodesk,San Rafael,CA))设计特征并且可以写在 铬掩模上(加利福尼亚州SF的TRICR公司(TRICR Corporation,SF,CA))。选 择正性胶光刻和深度反应性离子刻蚀(DRIE)来形成第一层，微过滤器特征。 采用AZ 1512作为正性光刻胶，由华盛顿大学的微制造工厂 (Micromanufacturing Facility(MMF))提供。优化DRIE工艺以实现4.5-5μm的深度。eDAR特征的第二层可以采用SU-8-3050作为负性光刻胶(马萨诸塞州 牛顿市微化学公司(MicroChem))制造，该特征的高度可以控制成50μm。母 版采用十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷(密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔 德里奇公司(Sigma-Aldrich))硅烷化之后，将未固化的PDMS倾倒到硅晶片上 并在70℃烘烤2小时。具有所需微特征的PDMS片可以从硅母版剥离，然 后采用等离子氧化的标准工艺粘结一片盖玻片。
生物和临床样品
采用三种乳腺癌细胞系SKBr-3,MCF-7和MDA-MB-231细胞(弗吉尼亚 州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC))来表征和优化eDAR系统。 SKBr-3细胞在McCoy’s 5中培养，MCF-7在伊氏极限必需培养基(EMEM)中 培养，MDA-MB-231在达氏修正伊氏培养基(DMEM)中培养(弗吉尼亚州玛纳 萨斯的ATCC)。所有细胞培养基还包含2mM L-谷氨酰胺,10％胎牛血清 (FBS)(弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC)以及50μg/mL青霉素/链霉素(弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC)。培养在湿润环境中，含5％CO2，37℃进行。MDA- MB-231-GFP细胞系由Tuffs大学的PGS(Prof.Gail Sonenshein)提供，并在含 10％FBS和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基(加利福尼亚卡尔斯巴德的生 命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中培养。来自健康供体的对照血 液购自血浆国际实验室(Plasma International Lab)(华盛顿州埃维特(Everett, WA))；弃去第一管的血样以避免任何可能的来自皮肤细胞的污染。基于Fred Hutchinson癌症研究中心的机构审查委员会批准的方案，从转移胰腺癌患者 获取全血样品。在西雅图癌症护理联合会(SCCA)采用含有EDTA作为抗凝剂 的真空药瓶(Vacutainer，纽约州富兰克林湖的BD)收集患者样品，储存在4 ℃，4小时内分析。
样品制备和eDAR分析
除非另有说明，采用Isoton(美国加利福尼亚州晒诺的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))作为缓冲液，用于所有实验。对于典型的eDAR实 验，采用1ml偶联藻红蛋白(PE)(批号515776,加利福尼亚州核桃市的亚诺法 公司(Abnova,Walnut,CA))的抗EpCAM标记的全血样品，黑暗中室温下保持 30分钟。所有标记参数已优化。标记的样品稀释至14mL，然后离心以去除 游离抗体。最终体积调节至与初始体积相同。然后，制备的样品采用注射泵 注入微流体芯片。通过PCI数据获取卡(PCI 6602,德克萨斯州奥斯汀的国家设备公司(National Instruments,Austin,TX))，从纤维偶联的雪崩光电二极管 (APD)(马萨诸塞州沃森姆的专业技术公司(Excelitas Technologies,Waltham,MA) 收集痕量。采用主目录写入LabVIEW(德克萨斯州奥斯汀的国家设备公司)脚 本以及内部构建的场-可编程-门控-阵列(FPGA)装置自动收集eDAR的分选过 程。收集分选的等分试样的流体动力学转换通过购自李氏公司(Lee Company (康涅狄格州威斯特布鲁克(Westbrook,CT))的电磁阀(INKA1226212H)控制。
在将所有阳性等分试样收集到过滤区域上之后，采用Isoton在不到1分 钟内快速洗涤过滤区域。如果使用任意细胞质标记物进行第二标记，将4％ 的多聚甲醛(PFA)加载到过滤区域以固定细胞。采用
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465(美国宾夕 法尼亚州阿伦敦的空气产品公司(Airproduct,Allentown,PA))来透化固定的细 胞。一般采用抗-EpCAM-PE和抗-细胞角蛋白-APC(批号MAB5131,加利福 尼亚州核桃市的亚诺法公司(Abnova,Walnut,CA))和抗-CD45-荧光素异硫氰 酸酯(FITC)(批号B116314,加利福尼亚州圣地亚哥的生物传奇公司(BioLegend San Diego,CA))作为用于第二标记的抗体。赫斯特(加利福尼亚卡尔斯巴德的生命技术公司)也用作核染剂以验证标记的靶标实际上是有核细胞。
eDAR的方法如下：将血样注入微流体芯片并分成等分试样。然后施加 线-共聚焦检测方案，将等分试样分级为“阳性”或“阴性”，通过标记方案 确定。例如，在许多应用中，血样用抗-EpCAM-PE标记，因此仅具有偶联至 该抗体的特定染料的荧光信号的等分试样被分级为阳性事件。施加自动反馈 方案以产生血流方向的转换，允许阳性等分试样快速收集。由于CTC的浓度 非常低，超过99.999％的等分试样因为没有所需的荧光信号而被丢弃。给出 阳性荧光信号的那些等分试样转移至微流体芯片上的另一区域，进一步纯化 然后计数。对捕集的细胞进行一系列下游分析，例如第二免疫染色步骤，更 复杂的染色/漂白过程，或者在单一分析物水平的操控和培养。
重新设计的流体动力学分选方案。
过去，eDAR具有机械阀来控制主动分选步骤，与其他报道的转换机制 (例如电渗流或溶胶-凝胶转化)相比，快速(约2毫秒的响应时间)且稳健。虽 然有前景，这种机械阀方案的一些设计因素潜在地约束eDAR的潜在应用。 为了在微流体芯片上形成机械阀，需要3个单独的结构层—螺线管，其 PDMS线圈(thread)和150μm PDMS薄膜上的微通道。这就使得微流体芯片 的制备变得复杂且耗时。另一个缺点是捕获的血液等分试样与机械阀之间直接接触，潜在地增加了CTC损失或损伤的风险。在本实施例中，用芯片外模 型代替螺线管，这些模型正常关闭但是在施加5V DC电压时在2-3毫秒内打 开。因为这种直列式螺线管不是微流体芯片的一部分，微流体装置的制备显 著简化。螺线管可以容易地连接至任何微通道以测试流体动力学分选方案。 设计和测试了8种不同的方案(图6)以驱动流体转换。因为这种类型的螺线管 的结构以及PDMS的弹性，流体性能变化(表1)，每个方案对于最佳性能进行 表征。
在表征和优化之后，选择平台的结构和相应的流体动力学分选方案用于 eDAR(图7)。采用注射泵将标记的血样注入微射流芯片的顶部通道(图7a)。 使用缓冲液流经的两侧通道来控制主动分选步骤。两个端口位于右侧通道， 它们均连接至加压缓冲液源。正常关闭的螺线管连接至分选连接处附近的端 口以控制流体动力学转换。分选连接处之后存在两个通道。左侧的一个用于 收集阳性等分试样并将它们传递至过滤和收集区域用于进一步纯化(例如纯化 腔室)；右侧的一个是流经所有阴性等分试样的废液收集通道。
当那些等分试样分级为“阴性”(图7b)时，不会螺线管施加电压，因而 其关闭。No.1和3缓冲液源之间设定初始压降，因而血液仅流入收集废液的 通道，如图7b的亮场图像所示。当第一检测窗检测到阳性事件时，对螺线管 立即施加5V DC电压以打开来自No.2缓冲液储库的缓冲液流。这就降低了 右侧缓冲液通道的流动阻力并在那里产生较高的流速。血液流动可以从右侧 推送到左侧以收集阳性等分试样(图7c)。在等分试样收集和第二检测窗验证 之后，螺线管关闭以转换血液流回废液收集通道(图7d)。来回转换所需的时间确定为每次2-3毫秒(图8)。对于eDAR而言该过程足够稳定，即使在测试 了超过105个开关循环之后。直列式螺线管放置在缓冲液管线上，因此血液 不会与螺线管接触，消除了血液凝聚和交叉污染的可能性。而且，在这种方 案中，eDAR过程期间CTC收集通道中存在恒定的缓冲液流。这就改善了后 续纯化(例如纯化腔室)步骤的效率并可防止细胞聚集体的形成。
在本实施例的一些方面，阳性等分试样被收集到过滤区域，不到1分钟 内使用Isoton洗涤过滤区域。胞质标记物可用于二级标记并可包括将4％多聚 甲醛加载到过滤区域以固定细胞。采用
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465(美国宾夕法尼亚州阿 伦敦的空气产品公司(Airproduct,Allentown,PA))来透化固定的细胞。抗- EpCAM-PE和抗-细胞角蛋白-APC(加利福尼亚州核桃市的亚诺法公司)和抗- CD45-荧光素异硫氰酸酯(FITC)(加利福尼亚州圣地亚哥的生物传奇公司)可用 于二级标记。赫斯特(加利福尼亚卡尔斯巴德的生命技术公司)可用作核染剂 以验证有核细胞。
纯化(例如纯化腔室)机制的设计
该实施例的另一方面可包括基于由PDMS构成的微缝结构的芯片上过滤 的新方案，可以不要求额外的层(图10a)。图10a显示了这些微缝的一个例子 的基本结构，可用于捕获CTC而不保留任何血红细胞(RBC)。缝的尺寸可优 化成高5μm，宽5μm(图10b)以避免任何小CTC的损失。采用这种比大多数 基于过滤的CTC方法中使用尺寸小的尺寸的过滤器，没能捕获许多WBC。 因为微过滤器由PDMS构成并且粘结一片盖玻片，与不是完全透明并可产生 散射和象差的聚碳酸酯过滤器相比，图像质量显著改善(图10c和10D)。而 且，因为仅沿着缝阵列捕获细胞，细胞可以容易地参照和追踪；在许多其他 方法中，细胞随机分布在表面上。这种沿缝捕获使得成像过程更快，计数结 果更准确。缝也可更快且更有效地对捕集的CTC进行二级标记。图10e显示 了在微缝上捕集的抗-EpCAM-PE标记的两种癌细胞。细胞固定，透化，并用 抗-细胞角蛋白-Alexa488,抗-Her2-Alexa647和赫斯特标记。荧光图像清晰显 示这些标记物在这两种细胞上的表达，亮场图像也证实其形态。用抗-CD45-Alexa700作为阴性对照标记物标记两种细胞，没有来自颜色通道的信号对应 于该标签。
eDAR的表征和分析性能
实时监测主动分选步骤的效率。图9显示少部分来自胰腺癌患者样品的 APD数据。“决策APD痕迹”来自分级等分试样和控制分选的第一检测窗。 在978和1298毫秒的两个峰代表了触发等分试样的分选的两种用抗-EpCAM- PE标记的CTC。“验证APD痕迹”的两个峰显示两种癌细胞流过位于收集 通道的第二检测窗，证实实际分选了两种阳性等分试样。值得注意的是，第 二检测器的背景改变(图9a)也证实仅小部分的血液由eDAR收集，有助于 CTC的高富集率(一直到通常临床样品的百万倍)。
因为标记的CTC必须从第一检测窗流动到第二检测窗，观察到决策 APD峰与其验证信号之间的时间差。该时间差限定为分选的CTC的通行时 间，其可由于微通道中层流的性质导致CTC具有不同的线性流速而改变。图 9b显示了40和80μL/分钟的流速下通行时间的分布柱形图。通常，血液较 高的体积流速将导致分选的CTC较短的通行时间(图9c)。当流速为90μL/分 钟时，平均通行时间缩短至4毫秒，非常接近分选方案的转换时间(2-3毫秒)，提示用于该eDAR设计的具体实施方式的通量限。在其他实施方式 中，本发明eDAR设计可产生不到2毫秒的通行时间。
如果分选的CTC的通行时间比流体动力学转换时间短，该平台上细胞可 能不被可靠地分选。因此，分选效率限定为收集的事件数量相对于触发分选 的总的事件数量。图9d显示了在30-100μL/分钟的流速下分选效率的值。当 流速为30μL/分钟时，分选效率几乎为100％，因为在该流速下的平均通行时 间约为10毫秒(图9c)。该通行时间对于主动分选步骤足够长以收集CTC。在 80μL/分钟的流速下分选效率降低至90％，当流速为90μL/分钟时降低至 49％。图9d也显示了在不同流速下eDAR的回收效率，与分选效率相比具有 类似的趋势。然而，回收效率限定为掺入(spiked-in)细胞的数量相对于微流体 芯片上采用多色荧光成像计数的回收细胞的数量。该性能是许多因素的组 合，包括抗体标记效率，线-共聚焦检测效率和分选效率。这解释了在相同流 速下回收和分选效率之间的差异。结果，对于当前的eDAR，通量上限为80 μL/分钟(对于1mL血液而言是12.5分钟)，回收率为88％。虽然对于全血分 析而言该通量高于大多数CTC技术，其可以通过设计更宽的血液入口通道或者使第一检测束更远离进一步提高。
3至975MCF-7细胞掺入1mL健康血液中，分析50μL/分钟流速下的回 收效率。为了确保下限处细胞数量的准确性，当浓度低于100细胞/mL时， 采用毛细管计数方法精确掺入培养的细胞中。平均回收率为95％，R2值 0.998(图9e)，稍高于第一代eDAR(93％)。因为CTC的浓度通常非常低，计 数结果可能受到泊松分布的影响。在这种情况下，具有可接受的通量和回收 率的分析较大体积的全血样品的能力是非常重要的。相同数量的MCF-7细胞 掺入1,5和10mL健康血液中，然后在50μL/分钟的流速下分析这三种样品 。它们的回收率无显著性变化(图9f)，显示该方法能够以高效率和通量运行 大量的全血。
虽然大多数CTC研究中使用EpCAM来选择肿瘤细胞，越来越多的研究 报告，具有低EpCAM表达的CTC具有更多间充质特征并且更具攻击性。最 新的eDAR平台足够灵活，使用任意标记方案来选择罕见细胞，利用除 EpCAM之外的生物标记物捕获肿瘤细胞。这些方案设计成选择不同的培养 的乳腺癌细胞系(图9g)。使用EpCAM选择MCF-7细胞，使用Her-2选择SKBr-3细胞，且使用EGFR选择MDA-MB-231细胞。所有这三种方案分离 和捕集靶细胞，回收率超过88％。eDAR的另一独特且重要的特征是与标记 物的位置无关。例如，在其他技术中，例如表面捕获方法或免疫磁性方法 中，仅可捕获细胞表面上的抗原。当前的方法能够选择具有细胞内标记物(例 如GFP)的细胞(图9d)。掺入人全血的MDA-MB-231-GFP细胞的回收率为 91％(图9g)。由于荧光蛋白广泛应用于动物模型以研究转移的进程和机制， eDAR成为在这些模型中选择CTC的理想工具，无需任何免疫染色步骤。
来自胰腺癌患者的样品的高通量分析
采用来自15位健康供体的血样来评价该方法的假阳性率；在它们的任一 个中未发现CTC。从胰腺癌患者收集26个血样。其中16个样品用第一代 eDAR分析，其他10个样品用更新的eDAR平台分析。图25显示以下三个数 据组的分布：用本发明方法分析的对照血样，用第一代eDAR分析的胰腺癌 样品，和用本发明方法分析的胰腺癌样品。这些临床样品的原始数据如下表 3所示。
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表3：显示了对照和胰腺癌样品的原始数据。
采用该方法，在80％(10个中的8个)的样品检测到CTC，从2到872个 细胞/毫升。在患者血样中也观察到过去研究报道的CTC簇。有趣的是，该 研究中观察到的许多簇具有低的EpCAM表达。图26显示了具有高细胞角蛋 白表达但具有低EpCAM表达的CTC簇。
实施例2
通过顺序免疫染色和光漂白对捕获的罕见细胞中的多种生物标记物成像
在该实施例中，描述了用于顺序免疫染色和光漂白过程的优选的方案。 在一个优选的例子中，直列式染色和洗涤系统偶联eDAR以尽可能减小死体 积；降低使用的抗体的量；避免引入气泡；和自动化该过程。
该实施例描述了一种优化、简单且半自动的方法以进行捕集的CTC上的 蛋白标记物的表达分析。直列式免疫染色和光漂白系统允许在选择的CTC上 标记和荧光成像。该方法可包括：用一组偶联不同荧光团的抗体标记CTC， 然后光漂白，用针对不同组生物标记物的不同荧光抗体重新标记。该过程可 重复多次以研究几组蛋白生物标记物。在示例性的情况下，两种感兴趣的蛋 白标记物可以与阳性对照标记物(例如核染剂)和阴性对照标记物(例如CD45) 组合形成一组。每轮中可以研究一组，然后光漂白，然后第二轮(例如四轮免疫染色和光漂白)，研究感兴趣的蛋白标记物的表达。
微流体组件和线-共聚焦光学元件
采用上文所述的方法制造聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体芯片。简言 之，采用加利福尼亚州拉霍亚Autodesk公司(AutoDesk,San Rafael,CA)的 AutoCAD设计特征，然后通过线路板成像(Fineline Imaging)(科罗拉多斯普林 斯(Colorado Springs,CO))写在透明掩模上。采用SU-8-3050(马萨诸塞州牛顿 市的微化学公司(Micro-Chem Corp.,Newton,MA))在硅晶片上制造微特征作为 负性光刻胶；特征高度控制在50μm。一旦特征显色，将未固化的PDMS倾 倒到硅母版上，在75℃孵育2小时，揭去，然后采用等离子氧化方法粘结到玻璃盖玻片。
采用一系列分色镜、柱面透镜和分束器，线-共聚焦检测方案采用两个激 光源(488和633nm)以形成两个检测窗。两种激光束同时重叠的第一检测窗 用于检测标记的CTC的荧光信号，然后自动控制分选。第二检测窗用于证实 分选的等分试样和监测分选效率。
生物材料和eDAR过程
除非另有说明，采用Isoton(美国加利福尼亚州晒诺的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))作为缓冲液，用于所有实验。采用三种乳腺癌细胞系 SKBr-3,MCF-7和MDA-MB-231(弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏 中心(ATCC))来表征系统。在供应商推荐的条件下培养细胞，每周获取一次 。MCF-7在伊氏极限必需培养基(EMEM)中培养，SKBr-3细胞在McCoy’s 5 中培养，MDA-MB-231在达氏修正伊氏培养基(DMEM)中培养(弗吉尼亚州玛 纳萨斯的ATCC)。所有培养基还包含2mM L-谷氨酰胺,10％胎牛血清(FBS) (弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC)以及50μg/mL青霉素/链霉素。来自健康供 体的人全血从国际血浆实验室(Plasma Lab International)(华盛顿州埃维特 (Everett,WA)购得，获得后即在4℃储存。每个20mL样品分配到含有 EDTA作为抗凝剂的四个5mL真空管(Vacutainer tubes)中。每次取样的第一 管弃去以避免潜在的来自皮肤细胞的污染。
抗体在14,000rpm离心5分钟，以在任何标记过程之前去除可能的聚集 体。每个血样在黑暗中用偶联藻红蛋白(PE)的抗-上皮细胞粘附分子(EpCAM) 标记(台湾台北市的亚诺法公司(Abnova,Taipei City,Taiwan))，室温下孵育30 分钟。标记的血样进行洗涤和离心(2,300rpm持续10分钟)以去除游离的抗体 。样品采用注射泵立即注入微流体芯片。通常，流速设定为50μL/分钟用于 运行eDAR，虽然基于过去的优化方法，流速也可以更高。通过PCI数据获 取卡(PCI 6602,德克萨斯州奥斯汀的国家设备公司(NationalInstruments,Austin, TX))收集APD信号痕迹，由内部开发的MATLAB(马萨诸塞州内蒂克的麦斯 沃克公司(MathWorks,Natick,MA))脚本进行分析。对主目录构建电子盒进行 编程，基于检测的APD信号给出自动反馈控制，并对连接至微流体芯片的电 磁阀(S-10-38-H-40,加利福尼亚州范萘的磁性感应器系统(Magnetic sensor systems,Van Nuys,CA))施加电压。关于eDAR的更多细节如上文所述。
顺序的免疫染色和光漂白过程
洗涤通过eDAR分离的细胞之后，通过关闭直立式阀关闭主通道、侧通 道和废液通道。采用蠕动泵(美国宾夕法尼亚州匹兹堡的费舍尔科学公司 (Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)，以15微升/分钟的流速，将400微升细胞固 定缓冲液的等分试样(加利福尼亚州圣地亚哥的生物传奇公司(BioLegend, San Diego,CA))引入微流体芯片。以相同的流速用缓冲液洗涤5分钟之后， 通过流过250uL 2.5％Surfynol 465表面活性剂(美国宾夕法尼亚州阿伦敦的空 气产品公司(Air product,Allentown,PA)持续15分钟来透化细胞。该步骤之 后，对细胞进行四轮免疫染色和光漂白。对于每一轮的染色，制备具有偶联 至四种不同的荧光染料的四种生物标记物的220uL染色溶液。关于每一轮中 使用的抗体和核染剂的细节总结在表2中。离心步骤(14,000rpm持续5分钟) 以去除聚集体之后，收集200uL上清液作为染色缓冲液。将上清液以20微 升/分钟的流速注入微流体芯片。当抗体溶液填充全部过滤区域时，流动停止 。孵育在黑暗中进行20分钟，确保所有捕集的细胞与抗体有效接触。该步 骤之后，细胞洗涤10分钟以去除任何游离的抗体和尽可能减小荧光背景。采 用氙弧灯(加利福尼亚州诺瓦托的萨特仪器公司(Sutter instrument,Novato,CA)) 作为光源进行光漂白。每个漂白步骤进行15分钟。采用20X目镜进行落射 荧光成像和光漂白。在光漂白步骤之前和之后从四种不同的发射通道收集荧 光图像：黄色(555-605nm，PE),蓝色(435-485nm，赫斯特(Hoechst),绿色 (510-540nm，FITC或Alexa 488)和红色(665-695nm，Alexa 647或APC)。
光漂白过程的安全考虑
为了确保在运行光漂白测试时的安全性，最高功率锁定为10mW。当样 品暴露于光源时应考虑某些保护方法，例如戴上护目镜或者用黑色盒子覆盖 光漂白区域。
eDAR分离的CTC
用偶联至荧光团的抗体预先标记全血样品，然后引入微流体芯片。在许 多应用中，采用EpCAM作为阳性选择的生物标记物。然而，该方法在使用 不同的或更复杂的选择逻辑中是灵活的。
在eDAR中，可通过激光检测束、体积流率以及分选速度的组合首先限 定虚拟的等分试样。基于这些因素，标记的血样虚拟分成每1毫升五十万等 分试样，每个等分试样2nL。线-共聚焦检测方法以单一分析物灵敏度检测荧 光发射。结果，这些虚拟的等分试样基于主标记方案以“阳性”或“阴性” 进行分级。由于CTC的浓度非常低，超过99.999％的等分试样被丢弃(图 10A)，产生超过1-百万-倍富集率。
基于等分试样分级的结果，施加自动反馈机制以触发血流的流体动力学 转换，使得“阳性”等分试样可以被收集并转移至用于进一步纯化和分析的 区域(例如纯化腔室)。两种设计元素控制这种流体动力学转换-螺线管和两侧 缓冲液管线中的压降。在左侧螺线管以关闭位置放置在CTC收集通道中(图 4A)，因而“阴性”等分试样仅流入右侧的废液通道。缓冲液流入时两侧通 道之间还存在压降，当螺线管打开时将血流从废液通道转换至收集侧。这种 简单的方案足够快，2-3毫秒以收集CTC和最少量的血细胞。第二线-共聚焦 检测窗也放置在收集侧以实时监测流体动力学转换的效率。图4B显示了从肺 癌患者获取的样品的少部分数据。在该图中，绿色信号显示控制等分试样分 选的第一检测区域的APD痕迹；红色信号是来自验证等分试样实际上被分选 的第二检测区域的APD计数。
这些分选的等分试样被转移至CTC可以被捕集而大多数血细胞被丢弃的 区域(图4A)。虽然存在许多可能的方式来进一步纯化捕获的细胞，将一小片 聚碳酸酯过滤器(5x 5μm孔径)结合到微流体芯片上。捕集的细胞成像并在微 流体芯片上用更多生物标记物进一步标记以确定其身份。例如，图26a和图 26b显示了微流体芯片上捕集的癌细胞，对EpCAM、细胞角蛋白和核染剂阳 性，但对CD45阴性。该细胞也可以在亮场显微镜中观察到，提供形态信息 。
顺序的免疫染色和光漂白
开发直列式染色和洗涤系统并偶联eDAR以尽可能减小死体积；降低使 用的抗体的量；避免引入气泡；和自动化该过程。如图13A所示，微流体芯 片上的两个端口保持开放以进行灌注标记和洗涤步骤，而所有其他三个端口 完全关闭。蠕动泵传递洗涤缓冲液和标记试剂至微流体芯片，通过六通阀偶 联至加压缓冲液源。该阀上的其他三个端口完全阻塞以避免任何可能的渗漏 或污染。当运行eDAR实验时，六通阀转换到加压缓冲液侧以提供流体动力 学转换的稳定控制。转换到蠕动泵侧以将准确量的反应试剂注入微流体芯片 而不引入任何气泡。采用该方案，在不到5分钟内几个纳克的抗体被引入捕 集的细胞；一般的孵育步骤耗时不到20分钟(图13B)。
如果需要进行细胞内标记物测试，在测试之前捕获的细胞在微流体芯片 上被固定和透化。按顺序进行多轮染色、洗涤、成像和漂白实验。在每一轮 中，监测四种颜色的荧光，即黄色(PE),红色(Alexa 647或APC),绿色(FITC) 和蓝色(核染剂)。
对于该部分研究，设计基于四轮顺序的免疫染色和光漂白过程对捕获的 CTC上的蛋白标记物的表达进行的分析。采用落射荧光显微镜监测通过四个 单独通道的每一轮中的四种不同的标记物。每一组标记物具有核染剂(赫斯特) 作为阳性对照标记物，偶联FITC的CD45作为阴性对照标记物以及两种偶联 PE或Alexa 647的蛋白标记物。基于以下两个原因系统被设计成不会漂白赫 斯特染剂：染剂用作阳性对照标记物；以及需要UV暴露来漂白染剂，这可能 导致显著的细胞损伤。CD45在许多类型的白细胞(WBC)上表达，被认为是在CTC分离中的最大干扰。因此，它们常常用作阴性对照标记物。
许多蛋白标记物可以在CTC上检测，但作为一种概念证明，选择8种抗 原并将它们分成四组(表2)。第一组具有EpCAM和细胞角蛋白，是最广泛使 用的用于鉴别CTC的标记物。eDAR捕获CTC之后立即进行免疫染色测试组 以进一步验证和列举具有上皮生物标记物的CTC。表2显示了微流体芯片上 捕集了6种肿瘤细胞，它们为赫斯特染色阳性但CD45阴性。其中两种具有 EpCAM和细胞角蛋白强表达，提示细胞具有上皮特征。
第二组设计成研究对于临床和生物研究重要的其他上皮标记物。选择 Her2和MUC1作为该组的两种蛋白标记物，因为这两种蛋白标记物在癌症发 病机制和耐药性方面起着重要作用。它们也是抗肿瘤药物和免疫治疗的潜在 靶标。图14中第二轮标记显示，微流体芯片上捕集的部分细胞具有MUCI表 达但它们在其Her2表达上均非常低。
已经显示癌干细胞在肿瘤进展中发挥重要作用并且已经在CTC群中被观 察到。第三组标记物具有两种癌干细胞抗原CD44和CD24。它们作为乳腺 癌以及可能的其他类型的癌症的干细胞标记物被广泛研究。表2中的数据显 示，4种细胞具有CD44+/CD24-强表达，另两种是CD44-/CD24+。基于原发 性癌症的类型，其他干细胞标记物，例如CD133和CD105，也可用于该组。
表2中的最后一组标记物被设计成研究EGFR和CD166的表达，以显示 肿瘤细胞的间充质特征。EGFR已显示与EMT进程相关，CD166则用于限定 骨髓中的间充质干细胞。其他相关的标记物，例如波形蛋白和钙粘蛋白也可 用于该组。
光漂白的表征
决定光漂白步骤的效率存在两个关键因素—暴露功率和时间，对它们进 行表征和优化以在提高效率和通量的同时确保细胞不会受到潜在加热的破坏 。首先研究不同暴露功率下的光漂白曲线(图15A)。用抗-EpCAM-PE标记 MCF-7细胞并置于No.2盖玻片上。标记的单细胞用三种不同的功率设置进 行漂白。漂白曲线显示，当暴露功率大于2mW时，暴露时间控制在10分钟 内以实现超过95％的漂白效率。
基于此，四种荧光团PE,FITC,Alexa 488和Alexa 647的任意漂白曲线可 直接应用于该方案。图15B显示PE,FITC和Alexa 488的荧光发射可以在不 到5分钟内被漂白至小于10％；Alexa 647的光漂白时间较长，部分地因为610-660nm(红色激发)的光源的功率低于黄色和绿色激发范围内的功率。结 果，漂白时间设定为15分钟以实现具有可接受的通量的高漂白效率。这可以 通过提高光源功率来实现，虽然这可能潜在地提高了加热和细胞损伤的风险 。
实施例3
用于顺序免疫染色和成像的单一分析物捕集
该实施例描述了与顺序免疫染色和成像方法偶联的单一分析物捕集设备 。
相关尺寸涉及有效的顺序流动阻力阱设计，以及具有任意捕集密度和尺 寸的装置的示意图(图17)，图18中显示具有放大区域的进口。图18A的示意 图显示了装置的相对尺寸，例如主通道的宽度，缢痕的宽度，主通道缢痕入 口到主通道缢痕出口的长度，横跨缢痕的长度，以及主通道、缢痕、缢痕腔 室的高度。图18C显示了示例性的微流体装置设计，其利用顺序流动阻力阱 。该设计包括导入样品的进口(左侧)和去除多余液相的出口(右侧)。装置设 计的中央描绘了结合的高密度的流动阻力阱。图18B显示了图18C的放大区 域，显示构成装置功能部件的流动阻力阱。
图19描绘了平行流动阻力阱。图19的最上侧描绘了来自装置的孔的三 维截面侧视图，显示孔和缢痕中的形状变化。孔设计可以是不同或者类似的 形状组合，例如圆柱体、圆锥体、方形、六角形、穹顶形等。孔的尺寸可以 由以下限定：h1＝孔的深度,h2＝缢痕的深度,r1＝孔的半径,和r2＝缢痕的半 径。根据该方面，装置能够从溶液捕集单一颗粒/细胞如珠、细胞等。多个孔 可以平行排列以形成装置。
图20示意性地描绘了用于构建一些本文所述装置的方法。在该方法 中，用光刻胶旋涂固体基层(例如，硅晶片)。将涂覆的基层置于与刻上UV 透过和不透区域中描绘的所需设计的光刻掩模硬接触。掩模和基层暴露于 UV-光，启动光刻胶中的光化学交联反应。制造的装置的第一层通过对所得 交联图案显色，溶去光刻胶的非交联部分来完成。制造的第二层通过涂覆、 暴露、显色第二层的光刻胶来继续。结果得到模具，该模具被用于在可固化(例如PDMS)或可压花材料中形成通道、腔室和孔结构。例如，模具可置于 碟中。第二，将PDMS倾倒到模具上并固化。第三，PDMS从模具释放(剥 离)，在该点冲压进口和出口(未显示)。最后，图案化的PDMS密封至平面玻 璃或PDMS片以封闭通道和腔室/孔。
图21显示了用于产生平行流动阻力阱的微制造方法的一个例子。该装 置采用除了上文所述光刻胶(例如SU-8)之外的材料进行制造。可获得的材料 包括但不限于：聚合物材料，光刻胶，聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚甲基丙烯 酸甲酯(PMMA)，聚甲基聚氨酯(PUMA)等。(1)牺牲层可以是旋涂在硅(Si)晶 片上。(2)光刻胶(SU-8)可以沉积在顶部。(3)具有微阵列图案的光掩模排列 对齐，晶片暴露于UV。(4)处理和去除未交联的光刻胶，在硅晶片上留下所 需的图案。在一个方面，采用2-层设计。在该情况下，旋涂和加工处理第二 层的光刻胶。(5)SU-8层从硅晶片释放并组装到(仅路径1)多孔聚碳酸酯过滤 器和/或(路径1-2)安装有单个出口用于插入管道的PDMS上。
图22描绘了通过顺序流动阻力阱和平行流动阻力阱的功能收集、离散化 、和读取生物衍生样品的一系列步骤。A图显示样品如何顺序填充限定的位 置。当样品的关键尺寸(直径)小于主通道的高度和宽度，并且大于缢痕的高 度或宽度时发生该过程。不同的流动阻力控制样品进入限定区域，而缢痕闭 塞且流动停止。后续的样品沿着流路通过主通道，流至下一捕集位置，一直 到所有阱均被填充。B图显示了不混溶液相如何被通过样品进口引入并顺序 离散化捕集的样品。由于闭塞的缢痕，以及不混溶相与通道材料之间的差异接触角所产生的界面屏障和捕集区域的尺寸，导致缺乏流体流动，所以不混 溶液体将不会流入样品区域。C图显示了如何检测离散化的样品的各种化学 性质。作为填充的顺序性质的结果，关于每个样品的暂时信息也被物理编码 在每个位置。D图显示了填充平行流动耐受阱的样品的第一步。样品颗粒从 装置顶部流动进入限定的捕集孔。由于设计的平行性质，多个样品可以被同 时捕集，与本文提及的某些其他捕集方案相比能够更快收集样品。E图显示 了不混溶相如何在捕集孔的平面上方和下方被替换，从而产生离散化的样品 。F图显示了如何同时检测样品的各种化学性质。
图23显示了基于亮场显微镜和荧光显微镜的微孔和侧腔室的阵列的检测 和读取方案。将样品置于计算机程序控制的自动转移平台上。通过高速CCD相机获取图像。
图24显示了用于捕集生物颗粒/细胞的阵列用于分析和释放的顺序。(1) 从管道施加流动以利于流体流过阱。流体中的自立式颗粒/细胞沿着流动图案 进入开放孔。(2)一旦捕集，该区域的流动停止。(3)用溶液冲洗掉多余的流 体和颗粒/细胞。装置能够对颗粒/细胞进行后续的分析，例如荧光成像、漂 白和分析的重复循环。一旦完成分析，(4)管道内的流动逆转以释放颗粒。
实施例4
双重捕获eDAR
该实施例描述了根据本发明一个方面的eDAR的“双重捕获”版本。双 重捕获eDAR可以在相同的微流体装置上从相同的人血样中同时分离两种不 同的CTC亚群。这两种亚群可以高回收率和纯度被分别捕集到微流体芯片上 的两个不同的区域上。
图11显示了微流体装置的一般结构。血样预先标记有两种与不同荧光 标签偶联的抗体。例如，血样可以标记上皮标记物(例如偶联PE的抗- EpCAM)，以及间充质标记物(例如偶联具有不同于PE的发射波长的另一种荧 光团(例如FITC)的抗-EGFR或抗-波形蛋白。标记的血样注入微流体芯片，具 有EpCAM表达的CTC采用线-共聚焦方案检测，在黄色通道内具有峰，然后 启动主动分选事件以将等分试样收集到收集通道#1中。类似地，如果等分试 样分级为间充质标记物，则分选到收集通道#2。然后，两种亚群被分别捕集 和富集到微流体芯片上。过滤区域被构建在第二代eDAR中使用的相同的微 缝设计上。
流体转换方案总结如下。当等分试样分级为对于任何应用的标记物而言 阴性时，图11中的两个螺线管均关闭。如果两侧通道上的压力达到平衡，血 液流动至底部中央通道，用于收集废液。当等分试样分级为仅对上皮标记物 阳性时，螺线管#2立即打开，血流被推送到左侧的收集通道(图12B)。收集 等分试样之后，螺线管#2再次关闭，血流转换回到中间。当等分试样分级为 仅对上皮标记物阳性时，螺线管#1立即打开，血流被推送到右侧(图12C)。 两种类型的eDAR分选事件的响应时间约为2-3毫秒。
图11显示了“双捕获”eDAR的一般结构。标记的血液在顶部被引入主 通道。缓冲液在两侧通道内流动，采用两个螺线管控制血流的流体动力学转 换。两种CTC的亚群被分级和捕集到相同微流体芯片上的两个不同的过滤区 域。
图12显示了血流的三种状态的亮场图像。A)血液流动到废液收集通道 中，因为等分试样被分级为对于两种标记物而言均为阴性。B)血液转换至收 集通道#1，第一种CTC的亚群被转移到这里。C)血液转换至收集通道#2， 第二种CTC的亚群被转移到这里。
其他方面
本文描述了用于分析颗粒，尤其是流体样品的等分试样中的颗粒的方法 和设备，其中，颗粒是分析物，分析物是细胞，目的是(1)鉴定流体内分析物 上存在的多个标记物，具体过程包括使用针对分析物上的至少每一种标记物 的标签并检测每一种标签发射的信号，之后去除每一种标签发射的信号，以 及重复检测和降低信号的过程；(2)从包含第一和第二细胞亚型的混合物的样 品中分离细胞，具体过程包括将样品引入微流体芯片，该微流体芯片包括流 体连接至管道组和至少一个腔室的至少一个通道；(3)分配流体样品中表达特 定生物标记物概况的细胞，具体过程包括采用包括连接至具有至少一个通道 的微流体芯片的管道组；(4)鉴定分析物上存在的多个标记物，具体过程包括 采用基板分配多个分析物，所述基板包括多个微穴或微插片以在每个微穴或 微插片中容纳不超过一个分析物；(5)检测流体样品中的颗粒，具体过程包括 使用微流体芯片和电驱动阀，所述微流体芯片具有至少一个样品输入通道、 至少一个定向流动通道、和至少两个输出通道，所述电驱动阀位于不是微流 体芯片的一部分的装置上；(6)分离微流体芯片内的流体样品的等分试样，具 体过程包括基于罕见颗粒的存在与否向等分试样赋值，通过打开位于微流体 芯片外部的装置上的电驱动阀基于赋值引导等分试样的流动；和(7)采用具有 至少两个输出通道的装置检测流体中的罕见颗粒，特别是两个输出通道中至 少一个与微孔阵列流体连接，并使用装置分选一个或多个罕见颗粒。
在一些方面，本发明提供了鉴定流体内的分析物上存在的多种标记物的 方法，所述方法包括：(a)检测来自采用照射源的第一标签的信号，其中所述 第一标签附连至结合所述分析物上的第一标记物的第一结构；(b)基于所述第 一标签的存在分配所述分析物；降低所述第一标签的信号的水平；(c)使所述 分析物与结合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构附连至第二标 签；以及(d)检测第二标签。在这些方面的一些实施方式中，第一标签的信号 降低超过50％。在一些方面，步骤(a)的分配是基于第一标签和第三标签的存 在。在一些方面，步骤(a)分配采用微流体装置进行。在一些方面，步骤(a)的 分配和步骤(b)中的检测在相同的微流体装置内进行。在一些方面，分析物是 细胞。在一些方面，细胞是癌细胞。在一些方面，癌细胞是罕见细胞。在一 些方面，分析物是循环的肿瘤细胞。在一些方面，细胞是免疫细胞、胎儿细 胞、治疗后保留的指示疾病的细胞、或干细胞。在一些方面，所述流体选自 下组：全血，分离的血，血清，血浆，汗水，泪水，耳流体，痰，淋巴，骨 髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流体，粪便，经子宫颈的灌洗，脑 脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房水，皮脂，内淋巴，腹膜液，胸膜 液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在一些 方面，流体是全血。在一些方面，流体是分离的全血。在一些方面，第一标 签是抗体。在一些方面，第一标签是荧光团。在一些方面，第一标签是由核酸构成的探针。在一些方面，步骤(c)中降低信号通过对分析物施加照射来完 成。在一些方面中，照射是白光。在一些方面，步骤(c)中降低信号通过对第 一标签施加化学物质来完成。在一些方面，化学物质是还原剂。在一些方 面，还原剂是二硫苏糖醇。在一些方面，照射采用激光施加。在一些方面 中，照射采用发光二极管(LED)施加。
在一些方面，方法还可包括使来自第一标签和第二标签的信号成像。在 一些方面，分析物存在于流体中，流体是更大体积的流体的等分试样。在一 些方面，分配半自动或自动进行。在一些方面，分配通过集合决策等分分级 来进行。在一些方面中，每个标记物是生物标记物。在一些方面，多个生物 标记物通过表达分布来表征。
在一些方面，方法还包括使分析物接触缓冲液。在一些方面，缓冲液包 含固定剂。在一些方面，缓冲液包含透化剂。在一些方面，缓冲液是洗涤缓 冲液。在一些方面，不采用流式细胞仪来分配分析物。在一些方面，在步骤 a中检测时，分析物不是连接至组织内的其他细胞的细胞。
本文描述了用于从细胞样品分离细胞的方法和组合物，在一些方面，从 包含第一细胞亚型和第二细胞亚型的细胞样品分离细胞的方法可包括(a)将样 品通过管道组引入微流体芯片，所述微流体芯片包括(i)流体连接至所述管道 组的至少一个通道；(ii)被构造成在至少一个通道内检测细胞信号的检测器； 和(iii)流体连接至所述至少一个通道的至少一个腔室；(b)使一部分的细胞样品 通过检测器；(c)采用检测器检测该部分细胞样品内第一细胞亚型的存在与 否；(d)如果在该部分的细胞样品内检测到第一细胞亚型，则将细胞样品的等 分试样引导到腔室内，其中所述等分试样包含第一细胞亚型；和(e)重复步骤 (b)-(d)，从而在腔室中分离多个等分试样，使得腔室包含超过80％样品内的 第一细胞亚型的总数和不到5％样品内第二细胞亚型的总数。
在一些方面，本文提供了用于分配源自流体的样品中表达特定生物标记 物概况的细胞的设备，其中：所述设备包括连接至微流体芯片的管道组，所 述微流体芯片具有至少一个通道和腔室；和所述设备能够分离腔室中的细 胞，其中，分离后，所述腔室包含超过80％表达特定生物标记物概况的样品 中的总细胞群，以及分离后，所述腔室包含不到5％表达不同生物标记物概况 的样品中的总细胞群。在一些方面，表达特定生物标记物概况的细胞的分离 过程不到20分钟。在一些方面，流体样品中特定生物标记物概况存在于不到5％的细胞。在一些方面，流体是血。在一些方面，流体是分离的全血。在 一些方面，流体是全血的核化细胞馏分。
在一些方面，本文提供了鉴定分析物上存在的多种标记物的方法，所述 方法包括：(a)通过使分析物流过包含多个微穴或微插片的基板分配多个分析 物，其中，大多数微穴或微插片能够容纳不超过一个分析物，所述微穴或微 插片位于微流体装置上；(b)在所述微穴或微插片中，每个分析物与能够结合 第一标记物的第一结构接触，其中所述第一结构连接至第一标签；(c)检测来 自第一标签的信号；降低所述第一标签的信号的水平；(d)使所述分析物与结 合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构连接至第二标签；以及(e) 检测第二标签。在一些方面，第一标签的信号降低超过50％。在一些方面， 步骤(b)的接触通过使包含第一结构的流体流过与微穴或微贴片流体连通的通 道来实现。在一些方法，在步骤(b)的接触步骤之后，该方法还包括：使分析 物与洗涤缓冲液接触。在一些方面，分析物是细胞。在一些方面，分析物通 过流体流动、重力或粘附力产生的力保留在微穴内的固定位置。在一些方 面，每个分析物通过分子相互作用连接至微穴或微插片。在一些方面，每个 分析物通过非共价键连接至微穴。在一些方面，非共价键是范德华相互作用 、静电键合、疏水键合或非特异性吸附。
在一些方面，本文提供了用于检测流体样品中的颗粒的装置，该装置包 括：微流体芯片，包括至少一个样品输入通道、至少一个定向流动通道和至 少两个输出通道，其中所述至少一个定向流动通道与所述样品输入通道相 交；电驱动阀，位于不是微流体芯片的一部分的装置上，其中所述电驱动阀 通过控制与至少一个定向流动通道或者至少两个输入通道中的至少一个相交 的输入通道来控制流体的流动；至少一个检测器，能够检测流体样品的等分 试样中的一种或多种分析物；和数字处理器，能够基于等分试样中分析物的存在、不存在、身份、组成或数量对所述等分试样赋值，其中所述数字处理 器与所述检测器和电驱动阀连通。在一些方面，电驱动阀是电磁阀。在一些 方面，电驱动阀控制至少一个定向流动通道中流体的流动。在一些方面，电 驱动阀通常关闭，在接收到来自计算机的信号之后电驱动阀打开。在一些方 面，电驱动阀通常开放，在接收到来自计算机的信号之后电驱动阀关闭。在 一些方面，至少一个定向流动通道包括至少两个端口，所述电驱动阀控制通 过端口之一的流体的流动。在一些方面，装置包括第二检测器。在一些方 面，输出通道中至少一个与过滤器流体连通。在一些方面，电驱动阀直接控 制至少一个定向流动通道中流体的流动。在一些方面，电驱动阀直接控制送 料到至少一个定向流动通道的通道中的流体的流动。在一些方面，电驱动阀 直接控制仅一个定向流动通道中流体的流动。在一些方面，电驱动阀直接控 制至少两个输出通道中的一个的流体的流动。在一些方面，电驱动阀直接控 制送料到至少两个输出通道中的一个的通道中流体的流动。在一些方面，至 少一个定向流动通道在一个或多个连接处与至少两个输出通道相交。在一些 方面，装置包括检测器。在一些方面，该装置包括验证激光。在一些方面， 检测器位于不是输出通道的至少一个通道上。在一些方面，验证激光位于不 是输入通道的至少一个通道上。在一些方面，电驱动阀是压电阀。
在一些方面，本文提供了用于在微流体芯片内分离流体样品的等分试样 的方法，其中，所述等分试样包含罕见颗粒，所述方法包括以下步骤：检测 等分试样中罕见颗粒的存在与否；基于罕见颗粒的存在与否对所述等分试样 赋值；和基于赋值通过打开电驱动阀引导等分试样的流动，其中所述电驱动 阀位于所述微流体芯片之外的装置上。在一些方面，所述微流体芯片包括样 品输入通道、至少两个输出通道和至少一个定向流动通道，其中所述电驱动 阀控制所述定向流动通道内流体的流动。
在一些方面，本文提供了用于检测流体样品中的罕见颗粒的装置，该装 置包括：至少第一样品输入通道；至少两个输出通道，其中所述两个输出通 道中至少一个与微孔阵列流体连通；至少一个检测器，能够检测流体样品等 分试样中的一种或多种罕见颗粒；和用于通过将包含一种或多种罕见颗粒的 等分试样的流动引导通过第一输出通道来分选所述一种或多种罕见颗粒的机 制。在一些方面，如果等分试样不含罕见颗粒，机制将等分试样的流动引导 到第二输出通道。在一些方面，孔阵列位于第一样品输入通道和至少两个输出通道之间。在一些方面，孔阵列位于和第一样品输入通道和输出通道的相 同平面。在一些方面，孔阵列被配置成罕见颗粒无法通过孔但至少一种其他 颗粒能够通过孔。在一些方面，孔阵列包括超过1000个孔。在一些方面， 用于分选罕见颗粒的机制包括电极，磁性元件、声波元件或电驱动元件。在 一些方面，检测器选自：照相机，电子倍增器，电荷耦合器件(CCD)图像感应 器；光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极管(APD)，单光子雪崩二极管(SPAD)，光电倍增管(SiPM)，和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像感应器。
在许多方面，提供了鉴定流体内的分析物上存在的多种标记物的方法， 所述方法包括：(a)检测来自采用照射源的第一标签的信号，其中所述第一标 签附连至结合所述分析物上的第一标记物的第一结构；(b)基于所述第一标签 的存在分配所述分析物；(c)降低所述第一标签的信号的水平；(d)使所述分 析物与结合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构附连至第二标 签；以及(e)检测第二标签。
在一些方面，第一标签的信号降低超过50％。在其他方面，步骤(a)的分 配是基于第一标签和第三标签的存在。在其他方面，步骤(a)的分配采用微流 体装置进行。在其他方面，步骤(a)的分配和步骤(b)中的检测在相同的微流体 装置上进行。在一些方面，分析物是细胞。在其他方面，细胞是癌细胞。在 其他方面，癌细胞是罕见细胞。在其他方面，分析物是循环的肿瘤细胞。在 一些方面，细胞是免疫细胞、胎儿细胞、治疗后保留的指示疾病的细胞、或 干细胞。在其他方面，所述流体选自下组：全血，分馏血，血清，血浆，汗 水，泪水，耳流体，痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道 流体，粪便，经子宫颈的灌洗，脑脊液，脑液，腹水，母乳，玻璃体液，房 水，皮脂，内淋巴，腹膜液，胸膜液，耵聍，心外膜流体，以及呼吸道、肠 道和泌尿生殖道的分泌物。在一些方面，流体是全血。在其他方面，流体是 分离的全血。在其他方面，第一标签是抗体。在一些方面，第一标签是荧光 团。在一些方面，第一标签是由核酸构成的探针。在其他方面，步骤(c)中降 低信号通过对分析物施加照射来完成。在其他方面中，照射是白光。在其他 方面，步骤(c)中降低信号通过对第一标签施加化学物质来完成。在一些方 面，化学物质是还原剂。在其他方面，还原剂是二硫苏糖醇。在一些方面， 照射采用激光施加。在其他方面中，照射采用发光二极管(LED)施加。在 其他方面，方法还包括使来自第一标签和第二标签的信号成像。在其他方 面，分析物存在于流体中，流体是更大体积的流体的等分试样。在一些方 面，分配半自动或自动进行。在其他方面，分配通过集合决策等分分级来进 行。在一些方面中，每个标记物是生物标记物。在其他方面，多个生物标记 物通过表达概况来表征。在其他方面，方法还包括使分析物接触缓冲液。在 一些方面，缓冲液包含固定剂。在其他方面，缓冲液包含透化剂。在其他方 面，缓冲液是洗涤缓冲液。在其他方面，不采用流式细胞仪来分配分析物。 在一些方面，在步骤a中检测时，分析物不是连接至组织内的其他细胞的细 胞。
在各个方面，提供了从包含第一细胞亚型和第二细胞亚型的细胞样品中 分离细胞的方法，所述方法包括：(a)通过通道组将样品引入微流体芯片，其 中所述微流体芯片包括(i)流体连接至所述管道组的至少一个通道；(ii)被配置 成检测所述至少一个通道内的细胞的信号的检测器；和(iii)流体连接至所述至 少一个通道的至少一个腔室；(b)使细胞样品的一部分流过检测器；(c)采用 检测器检测所述细胞样品部分内第一细胞亚型的存在与否；(d)如果在所述细 胞样品部分内检测到第一细胞亚型，则将所述细胞样品的等分试样引导到腔 室内，其中所述等分试样包含第一细胞亚型；和(e)重复步骤(b),(c)和(d)，从而在腔室中分离多个等分试样，使得腔室包含大于80％样品内的第一细胞亚 型的总量以及小于5％样品内的第二细胞亚型的总量。
在各种方面，提供用于分配源自流体的样品中表达特定生物标记物概况 的细胞的设备，其中：(a)所述设备包括连接至微流体芯片的管道组，所述微 流体芯片具有至少一个通道和腔室；和(b)所述设备能够分离腔室中的细胞， 其中，分离后，所述腔室包含超过80％样品中表达特定生物标记物概况的总 细胞群，以及分离后，所述腔室包含不到5％样品中表达不同生物标记物概况 的总细胞群。在一些方面，表达特定生物标记物概况的细胞的分离过程不到 20分钟。在其他方面，流体样品中特定生物标记物概况存在于不到5％的细 胞。在其他方面，流体是血。在其他方面，流体是分离的全血。在一些方 面，流体是全血的核化细胞馏分。
在各个方面，提供了鉴定分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法 包括：(a)通过使分析物流过包含多个微穴或微插片的基板分配多个分析物， 其中，大多数微穴或微插片能够容纳不超过一个分析物，所述微穴或微插片 位于微流体装置上；(b)在所述微穴或微插片中，每个分析物与能够结合第一 标记物的第一结构接触，其中所述第一结构连接至第一标签；(c)检测来自第 一标签的信号；(d)降低所述第一标签的信号的水平；(e)使所述分析物与结合 第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构连接至第二标签；以及(f)检 测第二标签。
在一些方面，第一标签的信号降低超过50％。在其他方面，步骤(b)的接 触通过使包含第一结构的流体流过与微穴或微贴片流体连通的通道来实现。 在其他方面，在步骤(b)的接触步骤之后，该方法还包括：使分析物与洗涤缓 冲液接触。在其他方面，分析物是细胞。在一些方面，分析物通过流体流动 、重力或粘附力产生的力保留在微穴内的固定位置。在其他方面，每个分析 物通过分子相互作用连接至微穴或微插片。在其他方面，每个分析物通过非 共价键连接至微穴。在其他方面，非共价键是范德华相互作用、静电键合、 疏水键合或非特异性吸附。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的颗粒的装置，该装置包括：(a) 微流体芯片，包括至少一个样品输入通道、至少一个定向流动通道和至少两 个输出通道，其中所述至少一个定向流动通道与所述样品输入通道相交；(b) 电驱动阀，位于不是微流体芯片的一部分的装置上，其中所述电驱动阀通过 控制与至少一个定向流动通道或者至少两个输入通道中的至少一个相交的输 入通道来控制流体的流动；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品的等分试 样中的一种或多种分析物；和(d)数字处理器，能够基于等分试样中分析物的 存在、不存在、身份、组成或数量对所述等分试样赋值，其中所述数字处理 器与所述检测器和电驱动阀连通。在一些方面，电驱动阀是电磁阀。在其他 方面，电驱动阀控制至少一个定向流动通道中流体的流动。
在其他方面，电驱动阀通常关闭，在接收到来自计算机的信号之后电驱 动阀打开。在其他方面，电驱动阀通常开放，在接收到来自计算机的信号之 后电驱动阀关闭。在一些方面，至少一个定向流动通道包括至少两个端口， 所述电驱动阀控制通过端口之一的流体的流动。在其他方面，装置包括第二 检测器。在其他方面，输出通道中至少一个与过滤器流体连通。
在各个方面，提供了用于在微流体芯片内分离流体样品的等分试样的方 法，其中，所述等分试样包含罕见细胞，所述方法包括以下步骤：(a)检测等 分试样中罕见颗粒的存在与否；(b)基于罕见颗粒的存在与否对所述等分试样 赋值；和(c)基于赋值通过打开电驱动阀引导等分试样的流动，其中所述电驱 动阀位于所述微流体芯片之外的装置上。
在一些方面，所述微流体芯片包括样品输入通道、至少两个输出通道和 至少一个定向流动通道，其中所述电驱动阀控制所述定向流动通道内流体的 流动。
在各种方面，提供用于检测流体样品中的罕见颗粒的装置，该装置包 括：(a)至少第一样品输入通道；(b)至少两个输出通道，其中所述两个输出通 道中至少一个与微孔阵列流体连通；(c)至少一个检测器，能够检测流体样品 等分试样中的一种或多种罕见颗粒；和(d)用于通过将包含一种或多种罕见颗 粒的等分试样的流动引导通过第一输出通道来分选所述一种或多种罕见颗粒 的机制。
在一些方面，如果等分试样不含罕见颗粒，机制将等分试样的流动引导 到第二输出通道。在一些方面，孔阵列位于第一样品输入通道和至少两个输 出通道之间。在一些方面，孔阵列位于和第一样品输入通道和输出通道的相 同平面。在一些方面，孔阵列被配置成罕见颗粒无法通过孔但至少一种其他 颗粒能够通过孔。在一些方面，孔阵列包括超过1000个孔。在一些方面， 用于分选罕见颗粒的机制包括电极，磁性元件、声波元件或电驱动元件。在 一些方面，检测器选自：照相机，电子倍增器，电荷耦合器件(CCD)图像感应 器；光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极管(APD)，单光子雪崩二极管(SPAD)， 光电倍增管(SiPM)，和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像感应器。在一些方 面，电驱动阀直接控制至少一个定向流动通道中流体的流动。在一些方面， 电驱动阀直接控制送料到至少一个定向流动通道的通道中的流体的流动。在 一些方面，电驱动阀直接控制仅一个定向流动通道中流体的流动。在一些方 面，电驱动阀直接控制至少两个输出通道中的一个的流体的流动。在一些方面，电驱动阀直接控制送料到至少两个输出通道中的一个的通道中流体的流 动。在一些方面，至少一个定向流动通道在一个或多个连接处与至少两个输 出通道相交。在一些方面，装置包括检测器。在一些方面，该装置包括验证 激光。在一些方面，检测器位于不是输出通道的至少一个通道上。在一些方 面，验证激光位于不是输入通道的至少一个通道上。在一些方面，电驱动阀 是压电阀。

Claims (11)

1.一种鉴定分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法包括：
a.通过使分析物流过包含多个微穴或微插片的基板分配多个分析物，其中，大多数微穴或微插片能够容纳不超过一个分析物，所述微穴或微插片位于微流体装置中；
b.在所述微穴或微插片中，每个分析物与能够结合第一标记物的第一结构接触，其中所述第一结构连接至第一标签；
c.检测来自所述第一标签的信号；
d.降低所述第一标签的信号的水平；
e.使所述分析物与结合第二标记物的第二结构接触，其中所述第二结构连接至第二标签；以及
f.检测所述第二标签。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b的接触通过使包含所述第一结构的流体流过与所述微穴或微插片流体连通的通道来实现。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的接触步骤之后，所述方法还包括：使所述分析物与洗涤缓冲液接触。
4.一种检测分析物上存在的多种标记物的方法，所述方法包括：
通过使流体流过包含微穴或微插片的基板将分析物分离到微穴或微插片中，其中所述流体包含所述分析物；
使所述分析物与第一标签接触，其中所述分析物包括第一标记物且所述所述第一标签对所述第一标记物具有亲和性；
检测所述第一标签发射的第一信号，其中所述第一信号的存在表明所述第一标记物的存在；
降低所述第一信号的强度；
使所述分析物与第二标签接触，其中所述分析物包括第二标记物且所述第二标签对所述第二标记物具有亲和性；以及
检测所述第二标签发射的第二信号，其中所述第二信号的存在指示所述第二标记物的存在。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法在多个微穴或微插片中分离的多个分析物上进行。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一标签的信号降低超过50％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种分析物是细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物通过流体流动、重力或者粘附力产生的力保留在微穴内的固定位置。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物通过分子相互作用连接至微穴或微插片。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析物通过非共价键连接至微穴。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述非共价键是范德华相互作用、静电键合、疏水键合或非特异性吸附。
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