CN110468048B - 基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备和方法。本发明的微型化设备包括用于从液体样品分离得到目标细胞的第一结构区、用于转染目标细胞得到工程化细胞的第二结构区和用于纯化工程化细胞的第三结构区；其中，第一结构区和第二结构区之间以及第二结构区和第三微控区之间分别通过通道连通，从而使第一结构区、第二结构区和第三结构区经由通道形成封闭系统；其中，第二结构区包括由微通道和/或管腔结构组成的微流控区。本发明的微型化设备为全封闭式系统，并且转染效率高，时间大大缩短，能够达到大型复杂仪器相当的收率。

Description

基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备和 方法
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体地涉及基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备和方法。
背景技术
免疫细胞治疗是将自体或者异体供者的免疫细胞输入患者进行治疗的治疗技术，是目前持续研究的热点，具有诱人的前景。免疫细胞治疗的关键是制备得到所需的工程化的免疫细胞或者未工程化的免疫细胞。目前用于免疫治疗的工程化免疫细胞的制备已有非常成熟的生产操作规程，但是这些操作多在开放系统中进行，造成工艺复杂、耗时长、人工工作量大，并带来容易污染、异质性差等困扰，使得工程化免疫细胞的临床应用审批和实施在安全性和质量一致性等方面遇到了极大的挑战。例如，工程化免疫细胞CAR-T细胞的制备，其细胞来源大多数都是取自患者自身或者合适的健康供者外周血的细胞。因此，在得到外周血后首先需要从中分离出所需的细胞。然后，在转染条件下处理所需的细胞。最后，再从中纯化转染后的细胞。另外，这些操作需在传统的条件下进行，通常需要依赖于例如较大的培养和转染容器、离心机、生物安全柜和结构庞大的GMP生产车间等大型的仪器、设备和厂房才能完成，导致转染率低下、CAR阳性细胞比率低、细胞群分复杂(如有CAR-B细胞形成)、综合成本高等不利因素，且需要耗时两周左右，不方便临床需求。
在从患者自身取外周血时，由于患者通常已进行了多种治疗(例如，放射治疗或化学治疗)，此时外周血中的目标细胞，例如T细胞等的数量大大降低。因此，有效地分离、筛选和利用样品中免疫细胞的目标组分，提高工程化细胞的产率与精度，是提高产品质量、增加临床效果的重要的因素。
如上所述，迫切需要新的系统用来生产高品质的可用于免疫治疗的经遗传修饰的工程化免疫细胞产物，如CAR-T、CAR-NK、CAR-Macrophage、TCR-T等。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明基于微流控系统控制，设计用于制备工程化免疫细胞的方案。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其包括用于从液体样品分离得到目标细胞的第一结构区、用于转染所述目标细胞得到工程化细胞的第二结构区和用于纯化所述工程化细胞的第三结构区；其中，所述第一结构区和所述第二结构区之间以及所述第二结构区和所述第三微控区之间分别通过通道连通，从而使所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区经由通道形成封闭系统；其中，所述第二结构区包括由微通道和/或管腔结构组成的微流控区。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述第一结构区包括液体样品入口、分选区、目标细胞出口和用于排出废液的第一结构区排出口；其中，所述分选区包括微流控分选区和/或磁控分选区。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述微流控分选区由微通道组成，所述磁控分选区包括磁珠分选管腔、磁性试剂入口和设置于磁珠分选管腔外周的磁场产生装置。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述第二结构区进一步包括转染区，且所述微流控区包括目标细胞入口、待转染分子入口、混合区和细胞出口，其中所述目标细胞入口经由通道与所述第一结构区封闭连通，所述细胞出口经由通道与所述转染区封闭连通；
优选地，所述混合区包括撞击流产生区和微涡流产生区，所述目标细胞入口和所述待转染分子入口设置为能够使具有移动速度的目标细胞和待转染分子在所述撞击流产生区产生撞击，所述微涡流产生区具有弯形微通道结构；
进一步优选地，所述微涡流产生区包括沿流体流动方向依次设置的扩张段和收缩段，在所述扩张段微通道的横截面积逐渐变大，在所述收缩段微通道的横截面积逐渐变小。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述混合区还包括连接撞击流产生区和微涡流产生区的挤压区，所述挤压区的孔径小于撞击流产生区的孔径且大于目标细胞的直径，并且由撞击流产生区、挤压区和微涡流产生区组成混合结构单元；
优选地，所述混合区包括封闭式串联连通的多个混合结构单元。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述转染区的容积在0.3-2.0ml之间。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述第三结构区包括与第二结构区连通的入口、纯化区、工程化细胞出口和用于排出废液的第二结构区排出口，其中，所述纯化区为微流控纯化区。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区分别设置于同一基板，或者所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区分别设置于不同的基板。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区沿液体流动的方向依次设置，且在第一结构区的上游设置上游驱动装置，和/或在所述第三结构区的下游设置第二驱动装置，所述第一驱动装置和所述第二驱动装置设置为能够协同作用使流体以所需的速度通过所述第一结构区、第二结构区和第三结构区。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备进一步包括第三驱动装置，其设置为能够使待转染分子以所需的速度经待转染分子入口进入至所述混合区。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备进一步包括位于第三结构区下游的培养袋。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备进一步包括至少一个控制阀，从而控制流体或细胞的移动方式。
在某些实施方案中，根据本发明的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备进一步包括选自输入装置、检测器、存储器、处理器和显示器组成的组中的至少一种部件。
本发明的第二方面，提供一种基于微流控系统控制的工程化免疫细胞的封闭式生产方法，其包括使用第一方面所述的微型化设备的步骤。
本发明的第三方面，提供一种工程化免疫细胞，其由本发明的微型化设备制备得到，或由本发明的封闭式生产方法制备得到。
本发明将工程化免疫细胞的制备客体微型化、全封闭化、自动/半自动化，即减少了制作成本，又增加了安全性。
附图说明
图1为第一种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备1的示意图。
图2为第二种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备2的示意图。
图3为第三种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备3的局部示意图。
图4为第四种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备4的局部示意图。
图5为一种示例性磁控分选区的示意图。
图6为另一种示例性磁控分选区的示意图，其中图6A为立体图，图6B为侧视图。
图7为示例性混合区的内部结构图。
图8为另一种示例性混合区的内部结构图。
附图标记说明：
1、2、3、4-微型化设备、100-第一结构区、200-第二结构区、300-第三结构区、400-培养袋、600-废液回收装置、511-第一软管、512-第二软管、513-第三软管、520-入口软管、530-磁珠通道、540-洗脱液通道、550-转染剂通道、711-第一泵、712-第二泵、713-第三泵、714-第四泵、715-第五泵、716-第六泵、110-微流控分选区、120-磁控分选区、210-混合区、220-转染区、310-微流控纯化区、31-第一基板、32-第二基板、33-第三基板、122-磁珠、121-磁珠分选管腔、123-目标细胞、124-磁体、211-撞击流产生区、213-微涡流产生区、211-1第一撞击流产生区、211-2第二撞击流产生区、212-1和212-2第一挤压区、213-1和213-2第一微涡流产生区、214-1和214-2第二挤压区、215-1和215-2第二微涡流产生区。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中，术语“微型化设备”是指由多个不同构件/部件组成的产品，与现有的产品相比，本发明的微型化设备体积更小，更助于转染效率提高。
本发明中，术语“封闭式”是指微型化设备的不同区域/部位或者不同部件之间由通道/通路连通，由此构成与外界相对独立的环境。封闭式使样品到工程化细胞的全部过程在设备的内部进行，从而无需对细胞转染过程的各步骤分开独立地在外部进行。
本发明中，术语“通道”是指用于流通液体，例如细胞悬液、含待转染分子的液体等的中空通道或管路，有时也称作“通路”。本发明的通道可以是构成微流控的结构，此时通道一般为微通道。微通道可通过例如微蚀刻技术来实现。本发明的通道也可以是连通设备的不同区域或不同部位的软管，其长度不特别限定，可根据需要而自由设定。通道的截面形状不特别限定，可以是例如圆形、椭圆形、跑道形、方形或这些形状的变形等。通常情况下，通道的截面为圆形或其变形。在某些实施方案中，通道的截面为跑道形或扁平形。在截面为圆形或其变形的情况下，本发明的截面的直径在1-6000μm之间，例如微通道的直径一般在10-200μm，优选10-100μm，软管的直径一般为1-15mm，优选1-5mm。本领域技术人员可根据需要对通道的孔径大小进行自由选择，并且本发明的设备的不同部位可以采用不同的孔径大小。
本发明中，术语“管腔结构”是指孔径大于通道孔径的中空管腔结构，本文有时称作“微腔”，管腔结构通常主要用于使细胞进行静养，从而促进目标细胞转染的区域。根据需要管腔结构也可用于其他用途。本发明的管腔结构的体积(或容积)一般为0.1-10ml，优选为0.2-5.0ml，更优选0.3-2.0ml。在本发明的微型化设备的不同区域可根据需要选择相同或不同体积的管腔结构。
本发明中，术语“上游”和“下游”是两个相对的概念。“上游”是指在沿流体流动方向上更靠近流体开始或入口的位置。相反地，“下游”是指在沿流体流动方向上更靠近流体结束或出口的位置。
本发明中，术语“液体样品”是指含有目标细胞的任何样品，包括从受试者采集或分离得到的体液或组织液。例如，全血、腹水及其分离物，如外周血单个核细胞(PBMC)等。本发明的液体样品还包括将上述体液或组织液经处理而得到的处理后的液体样品。这里的处理一般是指使目标细胞的浓度或纯度相对提高的操作。此时，液体样品可以是例如，PBMC悬液。液体样品的实例包括全血、成分血、加了红细胞裂解液的外周血等。
本发明中，术语“待转染分子”是指核酸或含有核酸的分子，其中核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)也可以是核糖核酸(RNA)，优选为DNA。核酸通常包含产生或编码所需活性蛋白的基因。在某些实施方案中，待转染分子为编码融合蛋白的核酸分子。在某些实施方案中，待转染分子为含有核酸分子的病毒颗粒。优选慢病毒颗粒或慢病毒载体。待转染分子优选以液体形式存在。
[基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备]
本发明的第一方面，提供一种基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其包括用于从液体样品分离得到目标细胞的第一结构区、用于转染目标细胞得到工程化细胞的第二结构区和用于纯化工程化细胞的第三结构区。其中，第一结构区和第二结构区之间以及第二结构区和第三结构区之间分别能够通过通道连通，从而使第一结构区、第二结构区和第三结构区经由通道形成封闭系统。优选地，第一结构区、第二结构区和第二结构区沿流体移动方向依次设置。下面详细说明各步骤。
第一结构区
本发明中，第一结构区用于从液体样品分离得到目标细胞。第一结构区包括液体样品入口、分选区、目标细胞出口和用于排出废液的第一结构区排出口。其中，分选区包括微流控分选区和/或磁控分选区。
本发明中，液体样品入口与分选区连通，从而能够将液体样品引至分选区，经分选区的分选从液体样品例如含红细胞和血小板的样品中得到目标细胞，经目标细胞出口将所需的细胞引至下游区域，从而进行后续程序。第一结构区排出口优选与分选区下游连通，用于将分选后剩余的液体作为废液排出。
在某些实施方案中，本发明的分选区为微流控分选区。此时，本发明的液体样品优选为处理的样品，例如PBMC悬液等。微流控分选区为微型化的结构如芯片结构，其一般由设置在基板上的微通道构成。微流控分选区可以是任何类型，并且可以使用已知芯片结构。优选地，本发明的微流控分选区为基于惯性微流原理的微流控芯片。该芯片无需施加任何外力如电磁力，就可以在微通道内实现细胞的聚焦流动。基于惯性微流原理的微流控芯片中微通道可以是直线形通道、不对称弯管通道或螺旋形弯管通道，对此不特别限定。
在某些实施方案中，本发明的分选区为磁控分选区。此时，本发明的液体样品可以是未处理的样品，也可以是处理后的样品。优选地，磁控分选区包括磁珠分选管腔、磁性试剂入口和设置于其外周的磁场产生装置。磁场产生装置包括集成电磁体、集成软磁铁和磁体。集成电磁体是通过微加工的方法，在芯片内集成微小的线圈，施加电流后产生磁场，通过调节电流的大小可以灵活调控磁场强度，同时通过控制电流的开关可以方便的控制磁场的有无，集成度高。集成软磁体是基于微加工技术，在芯片微通道中集成易磁化的微小的软磁体(如镍、镍铁合金等)，在外加磁场的磁化下，局部磁场梯度显著增加，从而明显提高了磁性材料受到的磁场力，能够在较高的流速下控制磁性材料，实现对目标物质的快速、高通量分离和捕获。磁体是在微流控芯片的外部直接放置常规永磁铁或电磁铁，通常使用的钕铁硼固定磁铁的磁极表面的磁通密度高达500mT，即使把外置磁体放置在距离通道几个毫米的范围内也能利用其磁场强度控制磁性粒子。由于加工工艺简单，成功率高，成本低且微流通道的设计不受限制。因此，本发明优选使用磁体作为磁场产生装置。一般来说，磁体放置在芯片的外部，集成软磁体或电磁体能够合并在芯片中，也可根据不同需要，采用不同的磁场调控方式。
磁性试剂一般为偶联有磁性物质(例如，磁珠)的捕获分子。捕获分子的实例包括但不限于与目标细胞表面的特有分子结合的抗体。本发明的磁控分选区可以进行阳性筛选或者阴性筛选，捕获目标细胞。本发明的磁珠分选管腔的结构不特别设定，优选磁珠分选管腔的横截面为扁平结构，即椭圆形结构或跑道结构，此设计可大大提高磁控分选的效果。
在某些实施方案中，本发明的分选区为包括微流控分选区和磁控分选区的双分选区。此时，本发明的液体样品优选为从受试者直接采集的液体样品，例如全血等。在此类实施方案中，通过第一分选区首先进行目标细胞的初步富集，然后通过第二分选区进行目标细胞的进一步分选。本发明中第一分选区可以是微流控分选区，此时第二分选区则为磁控分选区。另外，本发明的第一分选区还可以是磁控分选区，此时第二分选区则为微流控分选区。通过双分选区设置，可使两者联合协同作用，提高分选效果。
本发明中，优选地，分选区还包括至少一个控制阀。控制阀可设置于分选区入口或其上游，从而控制样品或经处理样品以及试剂(例如包被了特定抗体的磁珠的试剂等)进入分选区；控制阀还可设置于目标细胞出口或用于排出废液的排出口，用于控制目标细胞选择性进入后续步骤，同时排出不需要的废物。
第二结构区
本发明的第二结构区用于转染目标细胞而得到工程化细胞。本发明的第二结构区包括由微通道和/或管腔结构组成的微流控区。优选地，微流控区包括目标细胞入口、待转染分子入口、混合区和细胞出口。优选地，第二结构区还包括转染区和可选的废液出口。其中，目标细胞入口经由通道与第一结构区封闭连通。细胞出口经由通道与转染区封闭连通。
与宏观尺度的通道相比，微通道的比表面积显著增大，这使得微流控具有一系列的特殊效应，如层流效应、毛细效应和分析体积减小导致的热传导效应和显著的扩散效应。通常而言，在不受外力影响的情况下，颗粒物质在微流通道中跟随液体进行层流运动，这种运动是一种非常有规律的运动，非常不利于不同物质的混合。而细胞转染需要增强细胞与转染分子之间的充分混合，为此本发明优选在转染区的上游设计混合区用于提高二者的混合效率。本发明的混合区优选包括撞击流产生区和微涡流产生区，以使直径不同的颗粒(例如，目标细胞和待转染分子)充分混合和增加接触机率。优选地，目标细胞入口和待转染分子入口以能够使具有移动速度的目标细胞和待转染分子产生撞击的方式设置于撞击流产生区。为了实现上述目的，目标细胞入口和待转染分子入口可以基本上相对的方式设置，也可以使目标细胞入口和待转染分子入口两者以一定夹角例如大于90度至小于180度的夹角设置，以产生涡流。混合区优选由管腔结构组成。
本发明中，撞击流是指由分别带有细胞和待转染分子(本文有时统称为“颗粒”或“固相”)的两股流体同轴对流而产生，两股射流在接近时发生适度撞击并带动加速后的颗粒在撞击面附近发生碰撞。撞击流这种特殊流动结构使得两种流体在同轴碰撞后，在撞击面附近形成高度湍动、颗粒浓度升高的碰撞区域，从而在极短时间内产生较高的剪切速率和湍流强度，进而增加两种不同直径的颗粒进行充分混合和接触，进而提高转染分子(如病毒载体或者质粒载体)的细胞转染机率。
本发明中，颗粒与液体的密度相差较大，当携带细胞的流体渗透进入反向的含待转染分子的流体内时，两种颗粒之间以相加的速度撞击，密度更大体积更小的待转染分子因撞击而更多机会直接密切接触细胞，并因细胞的摩擦阻力使待转染分子的速度逐渐减小，直至减为零。随后在反向水流的作用下，细胞的轴向速度逐渐减小直至产生径向速度，从而跟随径向水流离开撞击区。本发明中，撞击流产生区的设计可根据例如软球模型来进行。
本发明中，微涡流产生区优选具有弯形微通道结构。优选地，微涡流产生区包括沿流体流动方向依次设置的扩张段和收缩段，两者构成弯曲段，在扩张段的微通道的横截面积逐渐变大，在收缩段的微通道的横截面积逐渐变小。扩张段与收缩段形成具有一定弯曲度的弯形结构。
本发明中，微涡流产生区的设计可根据例如迪恩涡流理论进行。具体地，呈抛物线流动的流体，在通道中间速度大。在经过通道转弯处时,通道中间流体受到的离心力大，从而流向通道外侧边缘。靠近通道壁的流体流速小，所受离心力也小，从而受到中间流体的挤压。为了保持流体中各处质量守恒，在垂直于流体流动的方向上，形成分别位于通道横截面的上部和下部的一对反向旋转且对称的涡流，即迪恩涡流。迪恩涡流对流体中的颗粒产生曳力作用,即迪恩曳力FD。在弯形通道中,流动的颗粒会同时受到惯性升力FL和迪恩曳力FD的作用,这两种力的相对大小决定颗粒在弯形通道中流动的流动情况。惯性升力FL的计算如下所示：
Figure BDA0002203094580000111
式中,Rc和Rp分别为通道雷诺数和颗粒雷诺数
Figure BDA0002203094580000121
ρ为流体的密度；μ为流体的黏度；Um为通道中的大流速；a为颗粒的直径；Dh为通道的水力直径(Dh＝2wh/(w+h),w和h分别为通道的宽度和高度)；fc(Rc,xc)为升力系数，其大小与通道雷诺数Rc和颗粒在通道横截面上的位置xc有关。迪恩曳力FD的尺度为：
Figure BDA0002203094580000122
式中r为弯管的曲率半径。若定义γF为惯性升力FL和迪恩曳力FD的比值，γF的尺度为：
Figure BDA0002203094580000123
式中,δ为曲率比(δ＝Dh/2r)。当γF≥1时,惯性升力占据优势,会将颗粒推向平衡位置；当γF＜1时，迪恩曳力大于惯性升力，将使颗粒流动变得混乱无序，从而增加细胞与待转染分子接触的可能。同时由于待转染分子的密度较大，在涡流中有利于其进入细胞内。
本发明中，混合区优选还包括连接撞击流产生区和微涡流产生区的挤压区。此时，由撞击流产生区、挤压区和微涡流产生区可组成混合结构单元。挤压区优选由微通道或管腔组成。组成挤压区的孔径小于混合区的孔径，同时大于目标细胞的直径。优选地，组成挤压区的微通道的孔径为目标细胞直径的1.2至10倍，优选1.3至5倍，更优选1.5至3倍。挤压区用于使目标细胞受到机械挤压，从而促进待转染分子更进一步地与目标细胞接触而进入目标细胞。由于挤压区下游与微涡流产生区连通，所以挤压区的横截面与扩张段上游起始端相同，并通道横截面沿流动方向开始逐渐变大，后在收缩段横截面又逐渐变小。
在某些实施方案中，本发明的混合区包括一个混合结构单元。在另外的实施方案中，本发明的混合区包括封闭式并联或者串联连通的多个混合结构单元。例如，2-10个，优选2-6个混合结构单元。
本发明中，转染区位于混合区的下游，且转染区一般具有相对较大的容积。该容积一般需要能够容纳从混合区流入的含有目标细胞和待转染分子的液体。优选地，该容积大于含有目标细胞和待转染分子的液体，从而使转染区保持一定的气体空间，用于为细胞生长提供所需的氧，并使细胞产生的废气如CO2排出液体，以避免可能对细胞产生不利影响。转染区一般用于使含有目标细胞和待转染分子的液体能够静止所需的时间。虽然对于转染区的容积不特别限定，但容积一般在0.3-4.0ml之间，优选0.3-2.5ml，更优选0.3-1.0ml，以维持所需密度的细胞悬液。
本发明中，第二结构区可进一步包括至少一个控制阀，从而有利地控制流体的流动方向和不需要的液体的排出。例如，控制阀可设置于目标细胞入口或其上游，用于控制目标细胞进入第二结构区的时机或进入量。控制阀还可设置于工程化细胞出口和/或废物排出口，从而控制工程化细胞的移动和/或废物的排出有序进行。另外，可选地，在待转染分子入口或其上游设置控制阀。
第三结构区
本发明中，第三结构区包括与第二结构区连通的入口、纯化区、工程化细胞出口和用于排出废液的第三结构区排出口。其中，纯化区优选为微流控纯化区。
本发明的微流控纯化区为微型化的结构如芯片结构，一般由设置在基板上的微通道构成。微流控纯化区可以是任何类型。优选地，本发明的微流控纯化区为基于惯性微流原理的微流控芯片。该芯片无需施加任何外力如电磁力,就可以在微通道内实现细胞的聚焦流动。基于惯性微流原理的微流控芯片中微通道可以是直线形通道、不对称弯管通道或螺旋形弯管通道，对此不特别限定。
本发明中，第一结构区、第二结构区和第三结构区可以分别设置于同一基板，三者之间可通过通道(例如微通道)而封闭连通。可选地，第一结构区、第二结构区和第三结构区分别设置于不同的基板模块。不同基板模块之间可以通过通道(例如软管)连通。
驱动装置
本发明中，微型化设备可进一步包括驱动装置。驱动装置可采用本领域已知的任何装置或设备。例如，驱动泵。驱动装置的设置位置可在第一结构区的上游、第三结构区的下游和待转染分子入口的上游等。本发明的微型化设备可包括一个驱动装置，也可包括多个驱动装置。优选地，在第一结构区的上游和第三结构区的下游同时设置驱动装置，且将第一驱动装置和第二驱动装置设置为能够协同作用使流体以所需的速度通过第一结构区、第二结构区和第三结构区。
自动控制装置
本发明的微型化设备可选地进一步包括输入装置、检测器、存储器、处理器和显示器中的至少一种。
本发明的输入装置用于人工输入生产系统所需的参数或控制参数。本发明的检测器用于检测(优选实时检测)生产系统的各种参数，包括但不限于不同结构区的液体流速、温度以及液体中成分的含量或细胞参数(如细胞数、细胞活率、转染的阳性细胞数和转染率)等数据。本发明的存储器用于存储至少由检测器得到的数据或信息。本发明的处理器与存储器通信连接，其优选为CPU。处理器被配置为能够从存储器调取数据，并对数据进行处理，从而输出能够协调微型化设备整体运行的执行命令。执行命令包括调节不同区域液体流速的命令、调节驱动装置运行的命令、控制微型化设备温度的命令或调节液体参数例如pH值的命令等。本发明的显示器用于显示微型化设备的运行参数、运行进度等信息，包括检测器检测的数据、处理器输出的执行命令等。
[基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的方法]
本发明的第二方面，提供基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的方法。本发明的生产方法为基于第一方面所述的微型化的方法，其包括使用本发明第一方面所述的微型化设备的步骤。
[工程化免疫细胞]
本发明的第三方面，提供由本发明的方法或设备生产得到的工程化免疫细胞。本发明中，工程化免疫细胞的实例不限定，其包括但不限于CAR-T细胞、CAR-NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和CAR-巨噬细胞等，或能够产生此类细胞的未分化细胞或免疫记忆细胞。
实施例
图1为第一种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备1的示意图。如图1所示，微型化设备1包括第一结构区100、第二结构区200、第三结构区300、培养袋400和废液回收装置600。第一结构区100和第二结构区200之间通过第一软管511封闭连接，第二结构区200和第三结构区300之间通过第二软管512封闭连接，第三结构区300和培养袋400之间通过第三软管513封闭连接。需要说明的是，图1中的虚线框仅为虚拟的区域，实际上第一结构区100、第二结构区200和第三结构区300内的各结构均设置于由实线框表示的同一基板上。
本实施例中，第一结构区100用于从液体样品分离得到目标细胞，其包括液体样品入口、分选区、目标细胞出口和用于排出废液的第一结构区排出口。其中，液体样品入口与入口软管520连通，样品例如血样在第一泵711驱动下经入口软管520和液体样品入口首先进入分选区。本实施例中，分选区包括微流控分选区110和磁控分选区120。微流控分选区110是根据已知惯性微流原理设计的微流控芯片。通过该微流控分选血样中的大部分血细胞经通道收集至废液回收装置600，同时得到的含有T细胞的初分液体经通道进入磁控分选区120。在磁控分选区的上游设置磁珠通道530，通过磁珠通道530可将与磁珠偶联的T细胞特异性抗体引至初分液体并使其中的目标细胞与之混合。如图1所示，磁珠通道530设置于微流控分选区110和磁控分选区120之间，这种设计有利于避免磁珠对于微流控分选产生影响。本领域技术人员容易理解该设置仅仅是示例性的。实际上，磁珠通道530还可以设置于微流控分选区110的上游，从而有利于T细胞特异性抗体与目标细胞的结合。这种情况更有利于目标细胞在磁控分选区120的分选。本领域技术人员可根据液体样品的情况而自由选择磁珠通道530的位置。经磁控分选区120分选后得到的目标细胞经第一软管511进入第二结构区200，同时废液经通道流出至废液回收装置600。
本实施例中，第二结构区200用于转染目标细胞得到工程化细胞，其包括混合区210和位于混合区210下游的转染区220。本实施例中，混合区210为微流控结构，其由微通道和/或管腔结构组成。设计混合区210用于破坏微控结构中的层流运动现象，增加目标细胞和待转染分子的接触机率。转染区220具有相对较大的容积，约为0.5-3.0ml，用于使混合后的细胞与待转染分子静置充分转染所需的时间，例如60-240分钟，优选80-150分钟等。细胞在转染区220静置后经泵由第二软管512进入第三结构区300。
本实施例中，第三结构区300用于纯化工程化细胞，主要是用于使目标细胞与小分子物质，例如待转染分子分离，其包括微流控纯化区310、与第二结构区连通的入口、工程化细胞出口和用于排出废液的第二结构区排出口。其中，微流控纯化区310由设置于基板上的微通道构成。本实施例中微流控纯化区310为基于微流原理的微流控芯片。该芯片无需施加任何外力如电磁力，就可以在微通道内实现细胞的聚焦流动。通过微流控纯化区310纯化后的目标细胞通过第三软管513输出至培养袋400，用于进一步扩增培养。同时，纯化时产生的废液经由第二结构区排出口和通道排出至废液回收装置600。
在本实施例中，微型化设备1还包括用于驱动液体按所需的方向和流速流动的多个泵。例如，第一泵711用于使液体样品，例如血液输送进入第一结构区100的微流控分选区110。第二泵712用于使偶联有抗体的磁珠泵入至磁控分选区120。第三泵713用于使待转染分子以所需的速度进入混合区210。第四泵714用于使目标细胞从第三结构区300进入培养袋400。第五泵715用于促进废液流出至废液回收装置600。
本实施例中，还包括多个控制阀(图1中以
Figure BDA0002203094580000171
符号示出)，通过控制阀的开启，可以控制细胞或废液的流向，特别是避免液体逆流。
图2为第二种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备2的示意图。如图2所示，在本实施例中，第一结构区100内的结构设置于第一基板31上，第二结构区200内的结构设置于第二基板32上，第三结构区300内的结构设置于第三基板33上。第一基板31、第二基板32和第三基板33分别为独立的模块，三者之间可以具有相对较远的距离，通过软管可将三者封闭连通。另外，废液回收装置600为回收袋，其一端与废液流出的通道连通，另一端与外界连通，以便将废液引出本发明的装置之外。其余结构与图1所示实施例相同。
图3为第三种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备3的局部示意图。如图3所示，本实施例的设备3与图1所示的实施例相比进一步包括洗脱液通道540和第六泵716，通过两者可以使洗脱液进入磁控分选区120，从而将吸附的目标细胞与磁珠分离后进入后续第二结构区200。
图4为第四种示例性基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备4的局部示意图。如图4所示，本实施例的设备4与图3所示的实施例相比在第一结构区100内仅含有磁控分选区120，不包括微流控分选区110。液体样品入口与入口软管520连通，样品例如血样在第一泵711驱动下经入口软管520和液体样品入口进入磁控分选区120。在磁控分选区的上游设置磁珠通道530，通过磁珠通道530可将与磁珠偶联的T细胞特异性抗体引至初分液体并使其中的目标细胞与之混合。洗脱液通道540和第六泵716，通过两者可以使洗脱液进入磁控分选区120，从而将吸附的目标细胞与磁珠分离后进入后续第二结构区200。
图5为一种示例性磁控分选区120的示意图。如图5所示，磁珠分选管腔121为方形空腔，磁体124的两极分别设置于磁珠分选管腔121的两侧，混合有磁珠122的样品经过磁珠分选管腔121区域的两侧。在流经磁珠分选管腔121区域之前磁珠122通过与其偶联的抗体特异性结合至目标细胞123。通过磁体124与磁珠122之间的磁力吸附将目标细胞分选。在目标细胞被吸附后可通过例如移除磁体124，或移动磁珠分选管腔121至磁体124的磁场之外，从而使目标细胞123与磁珠分选管腔121区域的壁分离进入后续程序。另外，还可通过例如磁珠通道530和第二泵712来向磁控分选区120引入洗脱液，以使目标细胞与磁珠122分离。
图6为另一种示例性磁控分选区120的示意图。如图6A和图6B所示，磁珠分选管腔121为圆形空腔，其截面大于两端通道的截面，从而有利于磁珠在分选管腔121吸附，同时还不会因为磁珠的吸附而阻断液体流动。磁体124的两极分别设置于磁珠分选管腔121的两侧，并且使产生的磁场覆盖磁珠分选管腔，混合有磁珠122的样品经过磁珠分选管腔121区域的两侧。在流经磁珠分选管腔121区域之前磁珠122通过与其偶联的抗体特异性结合至目标细胞123。通过磁体124与磁珠122之间的磁力吸附将目标细胞分选。在目标细胞被吸附后可通过移除磁体124或移动磁珠分选管腔121至磁体124的磁场之外，从而使目标细胞123与磁珠分选管腔121区域的壁分离进入后续程序。另外，还可通过例如磁珠通道530和第二泵712来向磁控分选区120引入洗脱液，以使目标细胞与磁珠122分离。
图7为一种示例性混合区210的内部结构图。如图7所示，沿流体流动方向，混合区210依次包括撞击流产生区211和微涡流产生区213。其中，目标细胞经第一软管511由A口以一定的速度进入撞击流产生区211，同时待转染分子随溶液由550经B口以一定的速度进入该撞击流产生区211。A和B口以相对的方式设置于撞击流产生区211的两侧，两股微流在撞击流产生区211碰撞产生碰撞流。之后液体经过位于撞击流产生区一侧的出口进入微涡流产生区213。第一微涡流产生区213具有弯形微通道结构。沿流体流动方向，该弯形微通道结构依次包含扩张段和收缩段，两者构成弯曲段，在扩张段的微通道的横截面积逐渐变大，在收缩段的微通道的横截面积逐渐变小。扩张段与收缩段形成具有一定弯曲度的弯形结构。之后细胞和转染剂随液体经出口流出进入转染区220静置。
图8为另一种示例性混合区210的内部结构图。如图8所示，沿流体流动方向，混合区210依次包括第一撞击流产生区211-1、第一挤压区212-1和212-2、第一微涡流产生区213-1和213-2、第二挤压区214-1和214-2、第二微涡流产生区215-1和215-2和第二撞击流产生区211-2。其中，目标细胞经第一软管511由A口以一定的速度进入第一撞击流产生区211-1，同时待转染分子随溶液由550经B口以一定的速度进入混合区210的第一撞击流产生区211-1。A和B口以相对的方式设置于第一撞击流产生区211-1的两侧，两股微流在第一撞击流产生区211-1碰撞产生碰撞流。之后液体经过位于第一撞击流产生区相对两侧的两个第一挤压区212-1和212-2分别以两股流体的形式进入两个不同的第一微涡流产生区213-1和213-2。第一微涡流产生区213-1和213-2分别具有弯形微通道结构。沿流体流动方向，弯形微通道结构依次包含扩张段和收缩段，两者构成弯曲段，在扩张段的微通道的横截面积逐渐变大，在收缩段的微通道的横截面积逐渐变小。扩张段与收缩段形成具有一定弯曲度的弯形结构。之后细胞和转染剂随液体分别经过第二挤压区214-1和214-2，随后进入与第一微涡流产生区213-1和213-2具有相同结构的第二微涡流产生区215-1和215-2。接下来，细胞和转染剂随着流体进入第二撞击流产生区211-2进一步使细胞与转染剂混合。最后，细胞随着流体经C口流出汇合后进入转染区220静置。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (14)

1.一种基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，包括用于从液体样品分离得到目标细胞的第一结构区、用于转染所述目标细胞得到工程化细胞的第二结构区和用于纯化所述工程化细胞的第三结构区；
其中，所述第一结构区和所述第二结构区之间以及所述第二结构区和所述第三微控区之间分别通过通道连通，从而使所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区经由通道形成封闭系统；
其中，所述第二结构区为由微通道和/或管腔结构组成的微流控区，且包括目标细胞入口、待转染分子入口、混合区和转染区，其中所述目标细胞入口经由通道与所述第一结构区封闭连通，所述细胞出口经由通道与所述转染区封闭连通；所述混合区包括撞击流产生区和微涡流产生区，所述微涡流产生区包括沿流体流动方向依次设置的扩张段和收缩段，在所述扩张段微通道的横截面积逐渐变大，在所述收缩段微通道的横截面积逐渐变小，所述转染区的容积在0.3-2.0ml之间。
2.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述第一结构区包括液体样品入口、分选区、目标细胞出口和用于排出废液的第一结构区排出口；其中，所述分选区包括微流控分选区和/或磁控分选区；
3.根据权利要求2所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述微流控分选区由微通道组成，所述磁控分选区包括磁珠分选管腔、磁性试剂入口和设置于磁珠分选管腔外周的磁场产生装置。
4.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述目标细胞入口和所述待转染分子入口设置为能够使具有移动速度的目标细胞和待转染分子在所述撞击流产生区产生碰撞，所述微涡流产生区具有弯形微通道结构。
5.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述混合区还包括连接撞击流产生区和微涡流产生区的挤压区，所述挤压区的孔径小于撞击流产生区的孔径且大于目标细胞的直径，并且由撞击流产生区、挤压区和微涡流产生区组成混合结构单元。
6.根据权利要求5所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述混合区包括封闭式串联连通的多个混合结构单元。
7.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述第三结构区包括与第二结构区连通的入口、纯化区、工程化细胞出口和用于排出废液的第二结构区排出口，其中，所述纯化区为微流控纯化区。
8.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区分别设置于同一基板，或者所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区分别设置于不同的基板。
9.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，所述第一结构区、所述第二结构区和所述第三结构区沿液体流动的方向依次设置，且在第一结构区的上游设置上游驱动装置，和/或在所述第三结构区的下游设置第二驱动装置，所述第一驱动装置和所述第二驱动装置设置为能够协同作用使流体以所需的速度通过所述第一结构区、第二结构区和第三结构区。
10.根据权利要求9所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，进一步包括第三驱动装置，其设置为能够使待转染分子以所需的速度经待转染分子入口进入至所述混合区。
11.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，进一步包括位于第三结构区下游的培养袋。
12.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，进一步包括至少一个控制阀，从而控制流体或细胞的移动方式。
13.根据权利要求1所述的基于微流控系统控制生产工程化免疫细胞的微型化设备，其特征在于，进一步包括选自输入装置、检测器、存储器、处理器和显示器组成的组中的至少一种部件。
14.一种基于微流控系统控制的工程化免疫细胞的封闭式生产方法，其特征在于，包括使用根据权利要求1-13任一项所述的微型化设备的步骤。
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