CN115155680A - 一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用 - Google Patents

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CN115155680A CN202210725346.2A CN202210725346A CN115155680A CN 115155680 A CN115155680 A CN 115155680A CN 202210725346 A CN202210725346 A CN 202210725346A CN 115155680 A CN115155680 A CN 115155680A
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Abstract

本发明公开了一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用。涉及微流控芯片技术领域。包括大螺旋管道层，高/宽＝50μm/900μm；大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。本发明通过在螺旋微通道中引入有序微柱，可以不同程度地增强微流控通道内的二次流动，为粒子聚焦和癌细胞浓缩带来诸多实际收益；更利于细胞聚焦；增强的二次流在完成细胞聚焦的同时还能实现流速和颗粒尺寸不敏感，满足微流细胞仪的开发；可以在宽范围流速内对多尺寸粒子实现高效率的聚焦，不易堵塞，运行时间长。通过收集培养的癌细胞，本发明不会对细胞活性造成影响。

Description

一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，更具体的说是涉及一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用。
背景技术
微流控是一种在微尺度上操控流体的技术，在医学诊断和临床研究中显示出具大的前景。惯性微流控作为其重要分支，可以利用微管道结构中的固有的流体动力被动、连续、高效地聚焦并分离粒子和细胞。与利用外加力场的主动聚焦分离方法，如声场力、光场力、电场力和磁场力等相比，惯性微流控具有制备简单，操作便捷和通量高等独特优势。由于惯性聚焦的状态和位置高度依赖于受灌注流速和粒子尺寸影响的流体动力，因此通过调节灌注流速和粒子尺寸，惯性聚焦已经广泛应用于临床诊断、生化分析、化学合成和环境监测等领域。但是灌注流速精确调节的需求和粒子聚焦状态及位置随粒子尺寸改变的问题极大地限制了惯性微流控在流式细胞仪和在线样品处理设备便携化和集成化方面的应用。
粒子在微通道中能否形成惯性聚焦流动与微通道的尺寸和曲率半径、粒子的尺寸和流速等因素都有关系，在通道的宽度大于高度的矩形截面通道中，一定尺寸的粒子实现惯性聚焦流动通常需要满足条件a/h＞0.07(a是粒子的直径，h是微通道的最小尺寸)。因此，在设计制备微流控芯片时,要根据分离粒子的尺寸来确定微通道的尺寸。如果能够设计出更低高宽比的带有有序微柱的螺旋微通道，那么就可以使更小粒径的细胞实现更高效的聚焦流动。虽然已经有一些不同设计的惯性微流控芯片分别在一定程度上降低了惯性微流控对灌注流速或粒子尺寸的敏感性，但是它们往往存在设计复杂，需要非平面微结构设计或者是多层设计，或者是需要利用鞘流辅助粒子惯性聚焦，增加了芯片制备和操作难度。此外，由于微管道尺寸较小，在实现对不同尺寸粒子惯性聚焦的同时难以维持样品处理的高通量。更重要的是，这些惯性微流控芯片设计都仅能在一定工作流速区间内实现特定尺寸粒子的惯性聚焦或者在特定工作流速下实现一定尺寸区间内粒子的惯性聚焦。
因此，开发一种无需鞘流、易于制备、高通量的惯性微流控芯片，同时降低其对灌注流速和粒子尺寸的敏感性，并将其应用于细胞样品连续处理仍是当前研究者亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用。克服了现有技术使用的大多数设备仅适用于狭窄的应用范围、分离新样品通常需要复杂的设计、制造、验证和优化、惯性微流控的高通量通常需要牺牲纯度或回收率、无法平衡通量、纯度和回收率等一系列技术障碍。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种超低高宽比的惯性微流控芯片，包括大螺旋管道层；大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。
优选的：大螺旋管道层，高/宽比值为20～50：600～900。
进一步的，高/宽具体为20～50μm/900～1000μm。
有益效果在于：高度越低越容易实现小尺寸粒子的不敏感流速聚焦。
优选的：螺旋形管道的初始曲率半径为3～5mm；两条微柱之间的夹角θ为π/7；微柱由圆柱形、立方体形或不规则形状任一组成。
进一步的，初始曲率半径为3mm。
有益效果在于：曲率半径越大，导致粒子在管道的运动距离越长，越有利于粒子聚焦。
优选的：微柱由长方体、半球体组合而成；长方体长350～650μm，宽200μm，半球体直径200μm。
进一步的，长方体长350μm，宽200μm，半球体直径200μm。
有益效果在于：长方体越长，管道最窄区域W1越小，更有利于粒子的聚焦。
优选的：螺旋形管道周数为5～8周。
进一步的，螺旋形管道周数为5周。
有益效果在于：周数越长，粒子在管道的运动距离越长，越有利于粒子聚焦。
优选的：相邻周管道的间距为300～600μm。
进一步的，管道间距为300μm；
有益效果在于：间距越大，芯片越不容易在高流速和长时间的操作中产生破裂。
优选的：还包括1个入口和三个平行出口，出口的宽度为300μm，相邻出口间距50μm。
本发明还提供了上述任一的超低高宽比的惯性微流控芯片在连续粒子聚焦和癌细胞浓缩中的应用。
优选的：流速为1～3ml/min。
进一步的，流速为2ml/min.
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用，取得的技术效果：
建立了用于连续粒子聚焦和癌细胞浓缩的超低高宽比惯性微流控芯片。通过在螺旋微通道中引入有序微柱，可以不同程度地增强微流控通道内的二次流动，为粒子聚焦和癌细胞浓缩带来诸多实际收益。独特的超低AR惯性系统不需要与高精度和笨重的场发生器相关联，只需要流行的低成本微型泵或手动驱动器以特定的宽范围流速推动样品；
利用等序列分布的微柱和螺旋通道相结合，使用AutoCAD软件绘制了无需鞘流辅助的超低AR比(1：18)的螺旋惯性微流控芯片。使用计算流体力学模拟探索了微通道中涡旋流的变化，证明了微柱阵列能完成二次流强化作用；超低超低高宽比设计更利于细胞聚焦；
使用二次流加速的螺旋惯性微流控芯片，成功聚焦了三种尺寸的颗粒和三种类型的癌细胞。增强的二次流在完成细胞聚焦的同时还能实现流速和颗粒尺寸不敏感，满足微流细胞仪的开发；可以在宽范围流速内对多尺寸粒子实现高效率的聚焦，不易堵塞，运行时间长。通过收集培养的癌细胞，本发明不会对细胞活性造成影响；
探索了微柱在螺旋通道中的二次流加速效应，设计了用于颗粒操控和细胞操控的微流控设备。开发的设备具有超低AR比的特点，使芯片设备更容易制造，且能用于模拟癌细胞聚焦，这对于进一步的诊断和研究提供了样品制备的平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的惯性微流控芯片结构示意图，其中W1：窄区域；W2：微柱长度；W3：相邻周间距；W4：出口部分总宽度；L：微柱长方体部分长度；D：微柱半球体直径；R：初始曲率半径；θ：两条微柱之间的夹角；A：第四圈微结构区域；B：第五圈出口处区域。
图2附图为本发明提供的惯性微流控芯片结构局部放大示意图，其中，w1：出口1宽度；w2：出口2宽度；w3：出口3宽度。
图3附图为本发明提供的聚焦大细胞和小细胞的示意图，其中，1～9：横截面。
图4附图为本发明提供的DS-通道不同截面微柱引起的二次流加速图；其中，图4A：5个通道横截面二次流加速模拟演示，Section 2、Section 4、Section6、Section 8、Section 9是对应于图3中位置的通道横截面的流速分布；对照组(control)代表了NS-通道的通道横截面流速分布；为了方便识别通道位置，x轴指向螺旋通道内的主流，y轴指向外通道壁，z轴指向通道顶部；DS通道中宽窄区域的宽度分别为900和450μm，NS通道宽度为900μm，通道高度始终为50μm；操作通量为2mL/min；比例尺，50μm；图4B：DS-通道和NS-通道横截面中流体速度分布的定量证明。
图5附图为本发明提供的最小间距区间和最大间距区间的两个障碍物之间不同横截面的流体速度分布图，其中，图5A：两个障碍物之间被等分为7个横截面；图5B：DS-通道中最小间距的两个障碍物之间7个横截面的流体速度分布；图5C：DS-通道最外两个障碍物之间7个横截面的流体速度分布；比例尺，50μm。
图6附图为本发明提供的两个障碍物最小间距和最大间距的区间的7个横截面流体速度分布的定量分析图，其中，图6A：两个障碍物最小间距区间数字(1至7)对应于图5A中从上游到下游的直排通道中的7个横截面；图6B：两个障碍物最大间距区间数字(1至7)对应于图5A中从上游到下游的直排通道中的7个横截面；选择NS-通道作为对照。
图7附图为本发明提供的DS-通道中的流量调节来表征颗粒(直径为15.5μm)的运动图；其中，图7A：在不同的流速条件下，对应于设计图1区域A和图1区域B中粒子轨迹详细等值线图和对应状态；7B：在不同流速从1到10对应雷诺数下的归一化强度和通道位置示意；图7C：在五种雷诺数2.84，5.69，8.54，11.38，14.23和17.08下和不同加载时间下10min，20min，30min，40min，50min和60min下粒子15.5μm直径的聚焦效率；比例尺：图4-5A为200μm。
图8附图为本发明提供的不同大小聚苯乙烯粒子和癌细胞的操作条件进行实验图，其中，DS通道的所有三个出口：出口1，出口2和出口3均为300μm宽；图8A：在3mL min-1的特定流速下，使用设计优化的设备出口区域中三种不同大小粒子轨迹的荧光图片；图8B：使用设计优化的设备以3ml min-1(Re＝433.3)的流速评估颗粒聚焦；图8C：不同尺寸直径：15.5、9.9和7.3μm的荧光标记颗粒在不同雷诺数下的出口区域的聚焦效率；图8D：AO染色和CellTracker染色的癌细胞在出口处的轨迹；图8E：在3mL min-1的流速下，使用设计优化的设备出口区域中癌细胞聚焦轨迹的荧光图片；图8F：在三种De数条件下，三种癌细胞的聚焦效率；图8G：从装置的出口1收集染色的MCF-7细胞，HeLa细胞和K562细胞，然后培养36h以评估其生存能力和生长；比例尺：图8A，D和E中为200μm，图8B和G中为40μm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种超低高宽比的惯性微流控芯片及其应用。
实施例中，未提及的原料、设备、实验步骤均为市售或常规实验步骤，例如：
PDMS购自日本Silicones公司、青链霉素购自北京索莱宝生物公司、磷酸缓冲液(PBS)购自北京索莱宝生物公司；FBS胎牛血清购自美国GIBCO实验室、DMEM培养基购自美国GIBCO实验室、AO吖啶橙购自北京索莱宝生物公司、PI碘化丙啶购自北京索莱宝生物公司、胰蛋白酶购自美国Sigma公司、荧光微球购自上海辉质生物科技有限公司、CellTrackerGreen CFMDA荧光活体染料购自美国Invitrogen公司；
CKX41型倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司、SZX16型显微镜购自日本Olympus公司、移液枪购自德国Eppendorf公司、AUY220型分析天平购自日本岛津公司、BL-220H型电子天平购自日本岛津公司、AR-100型匀浆机购自日本岛津公司、WS-400B-6NPP型匀浆机购自日本岛津公司、TC20自动细胞计数器购自美国Bio-rad公司、CO2细胞恒温培养箱购自美国Thermo公司、超净工作台购自美国Thermo公司DZF-6022真空干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司、PHG-8032A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥器购自上海精宏实验设备有限公司；LSP04-1A型注射泵购自保定兰格恒流泵有限公司、KDC-40型离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司、冷冻干燥仪购自南京贝帝实验仪器有限公司；
细胞材料人源性乳腺癌细胞MCF-7、人源性宫颈癌细胞HeLa、人源性慢性粒白血病细胞K562购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心等；
对设备、材料来源不做限定，满足实验要求即可；
微流控芯片采用AutoCAD软件绘制和设计。具有超低高宽比的大螺旋通道(高/宽＝50μm/900μm)，在通道内侧增加了等序列分布的微柱，每圈具有13个微柱阵列，每个微柱具有高450μm和宽100μm。设计完成后由深圳美精微光电有限公司制备光掩膜。
惯性微流控芯片的制备：
将通过AutoCAD软件设计所得到的微流控芯片结构打印到透明的掩膜上，再通过光刻机等制备含有微通道结构的PDMS芯片模板，之后进行芯片实物的制备。
(1)流动层的制备
①使用锡箔纸包饰放置模具的器皿，与底部贴平。
②按比例配置A胶和B胶(A胶：PDMS；B胶：固化剂；A胶：B胶＝10：1)。
③取一小杯与其配平，之后按顺序打开混胶机开关，将小杯放入混胶机中，混胶2min。
④从混胶机中将装有混匀的PDMS胶的纸杯取出，将纸杯中的PDMS胶快速地倒入放置模具的器皿中。
⑤盖好器皿，放入真空箱内抽真空45min。
⑥从真空箱内取出器皿，轻压模具，使其尽量贴紧器皿底部，处理后盖上盖子，在80℃干燥箱中烘干(30min)。
⑦将烘好的PDMS胶从80℃干燥箱内取出，撕去锡箔纸，沿着模具边缘用刀片轻轻划开，将PDMS胶与模具分离。
⑧使用切胶机将PDMS胶切开；使用打孔器对每个微结构进行打孔处理。
⑨使用胶带处理PDMS胶表面的杂质，备用。
(2)载玻片的制备
①配胶(A胶：B胶＝15：1)。
②使用混胶机进行离心混胶处理。
③打开真空泵开关，调整转速以及时间(低转速：500转，30s；高转速：1500转，40s)，将载玻片居中放置在吸盘上，打开吸附开关。
④确保载玻片吸附在吸盘上后，在载玻片的中央滴胶(1～2滴)。
⑤待甩胶结束后，按解吸按钮，取下载玻片。
⑥将甩好胶的载玻片放入80℃干燥箱内进行热烘处理(30min)。
(3)粘合
①待PDMS胶和载玻片均制备好之后，将芯片正面朝下，粘附在载玻片上，用刀片轻压，排除残留的气泡。
②粘合完成后，将其放入80℃烘箱内，热烘处理3天。
在此不再一一赘述。
实施例1
一种超低高宽比的惯性微流控芯片(参见图1、2)。
包括大螺旋管道层；大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。
为进一步优化技术方案：大螺旋管道层，高/宽＝50μm/900μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道的初始曲率半径为3mm；两条微柱之间的夹角为π/7；微柱由长方体、半球体组合而成；长方体长350μm，宽200μm，半球体直径200μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道周数为5周。
为进一步优化技术方案：相邻周管道的间距为300μm。
为进一步优化技术方案：还包括1个入口和三个平行出口，出口的宽度为300μm，相邻出口间距50μm。
实施例2
一种超低高宽比的惯性微流控芯片。
包括大螺旋管道层；大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。
为进一步优化技术方案：大螺旋管道层，高/宽＝20μm/900μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道的初始曲率半径为5mm；两条微柱之间的夹角为π/7；微柱由长方体、半球体组合而成；长方体长450μm，宽200μm，半球体直径200μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道周数为6周。
为进一步优化技术方案：相邻周管道的间距为400μm。
为进一步优化技术方案：还包括1个入口和三个平行出口，出口的宽度为300μm，相邻出口间距50μm。
实施例3
一种超低高宽比的惯性微流控芯片。
包括大螺旋管道层；大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。
为进一步优化技术方案：大螺旋管道层，高/宽＝30μm/900μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道的初始曲率半径为5mm；两条微柱之间的夹角为π/7；微柱由长方体、半球体组合而成；长方体长650μm，宽200μm，半球体直径200μm。
为进一步优化技术方案：螺旋形管道周数为8周。
为进一步优化技术方案：相邻周管道的间距为300μm。
为进一步优化技术方案：还包括1个入口和三个平行出口，出口的宽度为300μm，相邻出口间距50μm。
实施例4
实施例1提供的超低高宽比的惯性微流控芯片的应用效果：
细胞培养
人源性慢性粒白血病细胞(K562)和人源性宫颈癌细胞(HeLa)培养采用DMEM完全培养基，人源性乳腺癌细胞(MCF-7)培养采用RPMI-1640完全培养基，均在37℃、5％CO2条件下培养。为获得对数生长期的细胞，每三天以1：2的比例传代一次；当细胞汇合度达80％后，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化HeLa和MCF-7细胞，用新鲜的完全培养基终止胰蛋白酶的作用；1000rpm离心6min收集细胞；将离心收集的细胞重悬于新鲜的培养基中备用。而K562细胞不需要胰蛋白酶溶液消化，直接轻拍细胞瓶的侧壁，使细胞脱落，然后将细胞悬液转入10mL离心管中，1000r/min离心6min收集细胞；将离心收集的细胞重悬于新鲜的培养基中备用即可。
细胞染色
将培养皿内的培养基除去，然后取500μL 37℃预热的CellTracker工作液(使用浓度为10μM，以无血清培养基稀释)。在细胞生长条件下孵育45min。然后，取出培养板弃掉染液，添加500μL 37℃预热的新鲜DMEM溶液并在培养箱中再孵育30min。
孵育结束之后即可消化离心细胞制备适宜浓度的细胞悬液。
微球悬浮液的制备
将直径为7.3μm、9.9μm和15.5μm的荧光微球稀释到去离子水中，形成浓度为5×106/mL的悬浮液。为避免堵塞问题，向微球悬浮液中添加了0.1％v/v的吐温-20作为稳定剂。
流体动力学模拟
为评估装置中流体速度的变动情况，利用ESI-CFD软件(V2010.0,ESI CFD,Inc.,Huntsville,AL)，对微流控芯片结构进行流体动力学模拟。模拟环境是在稳定的不可压缩的流动条件下进行的。在进口处，不同的流速被设置，而在出口处，一个固定的压力边界条件被设置。无滑动边界条件被应用在管壁中。FLOW和TURBULENCE两种模块被应用来探索微管道中的流体现象。基于有限元分析法，结构中流体运动的相关数值求解满足于以下几个方程。
Navier-Stokes动量守恒方程(1)：
Figure BDA0003710809710000101
质量守恒方程(2)：
Figure BDA0003710809710000102
局部湍流雷诺数计算公式(3)：
Figure BDA0003710809710000103
其中，ρ代表流体密度，
Figure BDA0003710809710000104
代表速度向量，P为压强，
Figure BDA0003710809710000105
为应力张量，k为湍流动能，ε为消散速率，t代表时间，
Figure BDA0003710809710000106
代表标准空间梯度运算符，ν代表湍流粘度。由于实验所有流体均是粘度较低的水溶液，所以模拟所用流体设置为27℃的水溶液。其中溶质的扩散系数为5×10-6cm2/s。
显微镜和图像分析
荧光和相位比较图像是通过配备有电荷耦合器件照相机(Olympus,DP72)和汞灯(Olympus,URFLT50)的倒置显微镜(Olympus,CKX41)获得的。图片和数据通过
Figure BDA0003710809710000107
Plus 6.0，origin 9，和SPSS 12.0软件来处理和分析。
图中的结果和误差线通过平均值±标准偏差来表示。实验数据通过单因素方差进行显著性分析。
实验设置
在每个粒子/细胞聚焦流速实验期间，将样品装入1或10mL一次性注射器中。然后将样品流和鞘流的一次性注射器安装到可编程注射器泵(Longer pump，LSP04-1 A)上，以产生连续的微流。内径为0.42毫米、长度为25厘米的Tygon管用于连接微流体装置孔口和注射器。使用前先将微通道在紫外光下照射30分钟，然后依次用75％乙醇和PBS工作缓冲液冲洗。
结果表明：
本发明提供的具有超低纵横比的惯性微流控芯片(高/宽＝50μm/900μm)，其中x轴指向螺旋通道内的主流，高代表通道沿z轴的高度，宽代表通道沿y轴的宽度)，以解除通道尺寸在提高加工性能和产量方面的限制，选择较宽的通道尺寸来扩展，而不是选择较高的通道尺寸，因为超低纵横比微通道更容易制造。如图3显示了设计的尺寸受限的螺旋通道中较大细胞和较小细胞聚焦的示意图。螺旋系统中的惯性癌细胞聚焦来自惯性升力(FL)、萨夫曼升力(FLΩ)和迪恩阻力(FDD)。FL由以FLS为代表的剪切诱导升力和以FLW为代表的壁诱导升力组成。FLΩ是源于细胞旋转的流体动力。在超低纵横比通道中，FLΩ非常弱，几乎没有影响。FL和FDD两种优势竞争促进癌细胞沿着平衡线随迪恩涡运动，直至接近通道内壁。癌细胞沿着环数的增加在内壁附近积聚，浓缩的癌细胞从外壁面出口进行收集。
此外，二次流的横向力FDD能够协助和修改癌细胞的惯性聚焦过程，根据公式：FDD＝3πμUDaP，迪恩流De＝Re(Dh/2R)0.5的横向速度由UD＝1.8×10-4De1.63表示。aP是细胞直径，μ表示流体显示的动态粘度，Dh代表通道的水力直径，Re代表雷诺数，R代表曲率半径。显然，通道几何形状对二次流有明显的影响。通过在螺旋微通道中引入有序微柱来调节二次流和FDD是加速癌细胞聚焦的有效方法。所以，放置有序微柱(两条柱之间的夹角θ为π/15)在螺旋通道中，可作为一种从属调节器。
二次流的数值模拟
选择了图3中DS-通道(有微结构的螺旋形通道)中的5个横截面(Section2，Section4，Section 6，Section 8和Section 9)，模拟了二次流分布和大小。Control表示没有设置微柱(NS-通道)的正常螺旋通道中通道横截面的二次流。在相同的操作流速下微柱诱导的二次流在Section 2、Section4、Section 6和Section 8横截面基本相同，但由于截面中间二次流的明显增强，在内壁附近均出现两处上下对称的二次涡流(参见图4A)。与DS-通道的宽区域(Section9)和NS-通道的Control区域相比，窄区域(Section 1～Section 8)表现出更高的流体速度，这证明了微结构对加速二次流的明显作用(参见图4B)。这是因为曲率半径由宽变窄越明显，二次流的加速度越大。这种二次流加速方式有助于促进颗粒/癌细胞的横向迁移。因为Uy(即横向速度UD)直接影响迪恩阻力FDD的大小，几乎是流速和Dean数的双倍影响。随着环数的增加，强化二次流的差异出现在DS-通道的狭窄区域，证明了螺旋系统中的尺寸限制可以调节涡流的强度。这种现象可以在一定程度上排除了流速变化时流体的不稳定性。
根据模拟结果，在该微流控芯片中，粒子会被捕获于二次流增强所产生的涡流中。在垂直方向上，微通道的低高度(50μm)可以有效地提供惯性力，促进粒子迁移到靠近顶壁和底壁的上下对称的平衡位置处。在水平方向，由于微通道的宽度(900μm)，颗粒的迁移主要取决于横向二次流(即Uy)。垂直聚焦的粒子将沿着迪恩涡流不断迁移，直到达到水平方向的平衡位置处或被涡流捕获。由于有序微柱的存在，二次流，尤其是水平方向上的Uy在管道狭窄处显著增强。截面中间显著增强的二次流扰动了原有的规则分布的迪恩涡流，在内壁附近形成两个对称的二次涡流。
为了计算出由DS-通道中的横截面流动所表现出的动力学，分别提取了DS-通道中最小间距的两个微柱和最大间距的两个微柱，分别比较了与沿y轴的两个微柱之间的不同位置处的流动相关的7个提取的图像，如图5A所示。最小间距的两个微柱的流体动力学图像如图5B所示，最大间距的两个微柱的流体动力学图像如图5C所示，通过比较可以得到在穿过狭窄区域时，流体动力基本相同，而在穿过宽阔通道时，最大间距的两个微柱的流体动力又强于最小间距的两个微条之间的流体动力，所以，随着通道长度的延长和圈数的增多，在狭窄区域的流体动力基本不变而且强于两个宽阔区域，有明显的加速作用。随着通道的延长和圈数的增加，两个微柱之间的流体动力也明显增强。流体首先以适当的顺序在这些区域内以独特的方式分散(即，Uy＜0，其指向内部通道壁)，然后聚焦(Uy＞0，其指向外部通道壁)。在穿过狭窄区域后，流体显示出Uy减小，如图6A和图6B所示。
粒子聚焦特性
为了获得稳健的微流控粒子聚焦，进一步研究不同流动环境下粒子在芯片出口区域的聚焦状态。使用15.5μm荧光聚苯乙烯粒子代替癌细胞验证DS-通道的聚焦性能，对成千上万条成像轨迹的统计表明，随着流动条件的不同，聚焦过程中存在不同的粒子状态(参见图7A)。由于粒子在两个区域的De数不同，分别研究区域A和区域B(参见图1)的粒子聚焦效果。在区域A中，DS-通道总是能实现粒子的单线聚焦，但随着De数的增加，颗粒聚焦的宽度越宽，粒子聚焦越分散。在De处于6.24～31.18范围内时，粒子处于单线聚焦状态，当De≥34.29时，粒子出现多层聚焦。对于在高De数条件下的不稳定聚焦现象，这可能由于高De数条件下，粒子在DS-通道中的微条诱导下加速了所受到的迪恩阻力降低，粒子被推离内壁。
在区域B中，粒子在雷诺数为5.69～19.92范围内时，能实现靠近内部区域较窄的单流聚焦从出口流出，当De＝22.77时，粒子聚焦流变宽，聚焦平衡位置相对远离内壁，当De≥28.46时，粒子聚焦出现多层聚焦，并且聚焦线靠近通道中心，不能得到粒子浓缩的预期效果。根据结果，得到在一定流速范围内(1～4毫升/分钟，De＝5.69～22.77)的单流聚焦和一定流动条件范围内(5～7毫升/分钟，De＝28.46～39.84)的靠近通道中心的多流聚焦。虽然当De增大的流动环境条件下，不能用于有效的粒子浓缩，但也能实现稳定的多流聚焦的粒子定位。这种现象的一种解释是由两种惯性效应引起的粒子散焦，包括惯性粒子迁移和几何诱导的二次流。
结果表明，粒子在距离内壁45μm处完成惯性聚焦。虽然垂直聚焦状态目前尚不清楚，但唯一可能的聚焦位置应该是二次流速度最小的涡流涡心处。由于微柱均匀有序地分布在螺旋微通道中，Uy会在两个狭窄区域之间减小并反复改变方向，形成“缓冲区”。在该缓冲区内，粒子在水平方向上的迁移主要受到迪恩曳力控制，并且在反复振荡的二次流作用下逐渐稳定于聚焦位置。最后，不同尺寸的颗粒将被聚焦在相似的位置(即管道狭窄区域距离内壁45μm处)，并在出口区域内向前流动(由于微管道的不对称扩张导致粒子运动至距离内壁75μm处)。
为了便于更直观的了解出口区域粒子聚焦效果，图7B表明了图7A中第五圈(出口处区域W4)的雷诺数下15.5μm粒子聚焦带在通道的横向位置和归一化强度。对设备聚焦性能的稳定性进行评估，计算出粒子在大范围高流速下(0.5～3.5mL/min)下可为15.5μm微球产生稳定(0～60分钟)和前所未有的粒子浓缩效果(图7C)，聚焦效率＞99％。
与现有的微尺度聚焦技术相比，以前的粒子聚焦仅发生在特定的流速下，本发明实现的分离对流动条件，特别是高流速(毫升/分钟)不太敏感。这一特性显示了粒子浓缩的优势，它定义了一系列可选择的分离流动条件，而不是设定一个固定的流速来获得最佳的分离效果。此外，以高效方式长时间操作的细胞聚焦的稳定性是癌细胞等生物颗粒浓缩的优良惯性平台的重要因素。现有微流控研究没有考虑设备的操作持续时间，以建立更稳定和可靠的连续颗粒浓缩系统。
本发明提供的粒子聚焦不敏感且稳固的方法非常适合探索不同的粒子应用，如粒子聚焦排序和流式细胞术。
不同大小的颗粒和细胞聚焦特性
利用Dean在尺寸限制螺旋通道中的加速聚焦来执行几个与粒子相关的示例应用。
由于癌细胞的尺寸并不像聚苯乙烯微球一样是固定不变的，所以需要测试癌细胞尺寸区间的聚苯乙烯微球的聚焦性能。选择三种尺寸(7.3，9.9和15.5μm)的微球来代替癌细胞测试优化设备聚焦性能，如图8A所示，三种尺寸微球在最优流速下2mL/min在出口区域均能实现靠近内壁区域的单线聚焦。如图8B所示，为了说明优化设备对粒子聚焦的效果，分别选择进口和浓缩出口的含微球样品在显微镜下的荧光图像作为对照。另外，为了得到流速对粒子聚焦效果的影响，使用设备在5种雷诺数下对3种尺寸微球进行聚焦实验，图8C所示，为3种尺寸微球在5种雷诺数下的聚焦效率。根据图8C所示结果，可以得到，在宽范围流速内(1～3ml/min)，三种尺寸的颗粒都在近壁区域聚焦良好(＞90％)，而且粒子的尺寸越大，聚焦效果越好，这主要是由于尺寸大的粒子在微通道中所受到的涡流和迪恩流越大，向通道壁迁移更快。但根据荧光微球聚焦结果可以看出，对于癌细胞尺寸范围的粒子已经能够达到理想的聚焦效果。
为了进一步验证对癌细胞聚焦的性能，选择了三种癌细胞系(K562，HeLa和MCF-7细胞)进行聚焦实验。根据前期研究，这些细胞的大小被证明分布在14.6到18.8μm的范围内。如图8D所示，吖啶橙(AO)和CellTracker分别用于标记MCF-7细胞。叠加的聚焦图像显示，活的和死的MCF-7细胞都能以2mL/min的流速在内壁附近实现单流聚焦。将通道末端分成3个300μm宽的平行出口，研究发现，如图8E所示，MCF-7细胞在亮场和荧光场中以单流模式聚焦在出口1处。荧光场中以单流模式聚焦在出口1处。此外，三种癌细胞在不同应用流速(1.5至2.5mL/min)下的聚焦效率如图8F所示。结果表明，三种癌细胞均能实现理想的聚焦(95％以上)，且在三种操作条件下聚焦效果基本相同。MCF-7细胞的聚焦效果最好，HeLa细胞的聚焦效果最差。这主要是由于三种细胞的大小不同。由于通道中的细胞将经历高剪切应力，这可能会降低其生存能力，因此从出口收集的细胞被重新引入皮氏培养皿中并培养36小时。如图8G所示，三种类型的细胞都保持高活力，这表明通道不会损害细胞活力。实验证明，该通道在不同流速下成功地实现了不同大小的细胞在相似位置的高通量聚焦。因此，本发明也为液体样品回收的应用提供了一个很有前景的工具，对细胞增殖、分化、代谢等功能的研究具有重要意义。液体和颗粒样品可以在设备的不同出口进行采集。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，包括大螺旋管道层；所述大螺旋管道层包括螺旋形管道和微柱；所述微柱均匀分布在螺旋形管道中凸出螺旋形管道内壁。
2.根据权利要求1所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，所述大螺旋管道层，高/宽比值为20～50：600～900。
3.根据权利要求2所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，所述螺旋形管道的初始曲率半径为3～5mm；两条微柱之间的夹角θ为π/7；所述微柱由圆柱形、立方体形或不规则形状任一组成。
4.根据权利要求3所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，所述微柱由长方体、半球体组合而成；所述长方体长350～650μm，宽200μm，所述半球体直径200μm。
5.根据权利要求4所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，所述螺旋形管道周数为5～8周。
6.根据权利要求5所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，相邻周管道的间距为300～600μm。
7.根据权利要求6所述的一种超低高宽比的惯性微流控芯片，其特征在于，还包括1个入口和三个平行出口，所述出口的宽度为300μm，相邻出口间距50μm。
8.权利要求1～7任一所述的超低高宽比的惯性微流控芯片在连续粒子聚焦和癌细胞浓缩中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，流速为1～3ml/min。
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