CN112538428B - 基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法，采用螺旋形分散相进液通道利用惯性聚焦原理可将细胞单分散，使其前后均匀排布于通道内，利于形成高包裹率的单细胞液滴；另外，使分散相进液通道与连续相进液通道交汇呈“十”字交叉，形成十字形液滴生成通道便于调节两相液体的流量比，进而控制液滴生成的长度与间距，液滴大小更均一稳定；再者本发明的微流控芯片设置为上下层，上层实现高通量单细胞的捕获，下层实现单细胞的培养及其分泌物的富集，从而达到单细胞在液滴中长期培养，并能进行单细胞原位培养、细胞共培养、药物筛选、分泌物实时、高灵敏检测等研究，且操作简单灵活、高通量、无污染、耗时短、成本低廉、应用范围广。

Description

基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法

技术领域

本发明属于细胞培养及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于液滴微流控技术的集单细胞捕获、培养、分泌物实时检测与一体的微流控芯片及其检测方法。

背景技术

细胞是生物体结构和功能的基本单位，而在任何细胞群体中，都会存在不同程度的细胞异质性，而细胞异质性在肿瘤恶化、肿瘤耐药性、免疫反应、细胞分化等方面具有重要影响。近几年随着生物学和医学的不断发展，针对单个细胞的研究显得愈发重要。通过研究单细胞可以看出细胞异质性对基体功能和状态的影响，研究不同单细胞的病理特征，对分析细胞代谢、细胞紊乱等细胞活动有非常重要的意义。近年来，单细胞分析在生命科学、肿瘤等疾病的精准诊断、生物医药等方面已得到广泛的应用。因此，单细胞分离及捕获技术对于单细胞分析具有重要作用。由于单细胞体积小、所测组分含量低、种类繁多，使得单细胞的精准分离和分析难度很大，如何高效率、低成本、方便灵活地分离和捕获单细胞，是目前亟需解决的技术问题。细胞分泌物包括外泌体、细胞因子、糖蛋白、miRNA等，这些物质所含的信息对于研究单细胞，特别是肿瘤细胞的生理功能尤为重要。

微流控芯片是一种能在微米级尺度空间对流体进行操控的技术，早期研究主要集中在连续相流体的化学电泳分析，故又被称为微全分析系统、芯片实验室。近年来，液滴微流控芯片开始大放光彩，其利用互不相容的两相液体，一种作为连续相，另一种作为分散相，通过两相界面处的表面张力和剪切力共同作用形成液滴。它具有液滴体积小(皮升至纳升)、体系封闭、无交叉污染、大小均一、生成速度快、通量高等优势，在药物筛选、细胞研究以及DNA和蛋白质等生物大分子的分析检测等方面有着广泛的应用。

由于液滴可作为独立的单细胞微反应容器，能够有效控制扩散，提高检测灵敏度，已被应用于多种单细胞分析中，而微流控芯片作为生成液滴的主要工具，其在单细胞分析中的应用也得到了越来越多的关注。目前，液滴微流控芯片通过形成包裹有细胞的液滴实现了多种单细胞捕获，进而实现对固定细胞的分析检测。如专利申请公开号为CN108949496A的现有技术公开了一种基于液滴微流控芯片的单细胞分离方法，设计了一款可以实现单细胞包裹的液滴微流控芯片，但是它只实现了单细胞的捕获和分选，不能对单细胞进行分析检测。专利申请公开号为CN109991423A的现有技术公开了一种高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法，设计了一种捕获并孵育单细胞、检测其分泌蛋白的微流控芯片，但此芯片在设计上限制了液滴的高通量生成(最多5万个)；且不能进行实时检测，需要将捕获检测物的芯片分离下来进行后续检测。

因此设计一种集单细胞捕获、培养、分泌物实时检测于一体的微流控芯片及其检测方法实属必要。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法，用于解决现有技术中的微流控芯片存在单细胞捕获率低、单细胞分泌物检测灵敏度低以及无法直接实时检测细胞分泌物等的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片，所述微流控芯片包括：位于上层的液滴生成及单细胞捕获单元及位于下层的单细胞培养单元；

所述液滴生成及单细胞捕获单元包括：连续相入口、第一分散相入口、第二分散相入口、分散相进液通道、连续相进液通道、十字形液滴生成通道、出液通道及出液口；

所述分散相进液通道包括三条：弧形分散相进液通道、螺旋形分散相进液通道及直线型分散相进液单通道，所述第一分散相入口连接所述弧形分散相进液通道，所述第二分散相入口连接所述螺旋形分散相进液通道，所述弧形分散相进液通道与所述螺旋形分散相进液通道在末端交汇且与所述直线型分散相进液单通道相连；

所述连续相进液通道包括两条：第一子连续相进液通道及第二子连续相进液通道，所述连续相入口同时连接所述第一子连续相进液通道及第二子连续相进液通道；

所述连续相进液通道位于所述分散相进液通道的外周，所述第一子连续相进液通道、所述第二子连续相进液通道及所述直线型分散相进液单通道交汇处呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道；

所述出液通道连接所述十字形液滴生成通道和所述出液口；

所述单细胞培养单元包括细胞培养皿。

可选地，所述连续相入口、所述第一分散相入口及所述第二分散相入口均设置有过滤柱。

可选地，所述连续相进液通道的宽度介于50μm～60μm之间；所述弧形分散相进液通道的宽度介于20μm～30μm之间；所述螺旋形分散相进液通道的宽度介于50μm～60μm之间，螺旋圈数介于3～10之间；所述直线型分散相进液单通道的宽度介于50μm～70μm之间；所述分散相进液通道及所述连续相进液通道的高度介于50μm～60μm之间；所述弧形分散相进液通道的流阻与所述螺旋形分散相进液通道的流阻相同。

可选地，所述弧形分散相进液通道的弧度介于200°～240°之间，外径介于1800μm～2300μm之间；所述螺旋形分散相进液通道外圈的曲率半径介于2300μm～3400μm之间，内圈的曲率半径介于1500μm～2000μm之间，宽度介于50μm～60μm之间，螺旋间距介于50μm～100μm之间。

可选地，所述连续相进液通道的宽度为55μm；所述弧形分散相进液通道的宽度为25μm；所述螺旋形分散相进液通道的宽度为55μm，螺旋圈数为3圈；所述直线型分散相进液单通道的宽度为60μm之间；所述分散相进液通道及所述连续相进液通道的高度为55μm；所述弧形分散相进液通道的弧度为237°，外径为2200μm；所述螺旋形分散相进液通道外圈的曲率半径为2300μm，内圈的曲率半径为1800μm，宽度为50μm，螺旋间距为100μm。

可选地，所述细胞培养皿的尺寸介于2英寸～4英寸之间。

可选地，所述出液通道上设置有一个直三棱柱及两个四棱柱；两个所述四棱柱对称分布于所述直三棱柱的两侧；所述直三棱柱设置于所述出液通道的中间位置，且朝向所述十字形液滴生成通道的一侧设置有凸起部；所述出液通道的宽度自所述十字形液滴生成通道一侧起逐渐增宽。

可选地，所述直三棱柱的上下表面为等腰三角形，所述四棱柱的上下表面为平行四边形。

本发明还提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

1)提供如上所述任意一项所述基于液滴微流控技术的微流控芯片；

2)利用压力泵使水相单细胞悬液从所述第二分散相入口进入、水相磁珠悬液从所述第一分散相入口进入、油相液体从所述连续相入口进入，其中，所述水相单细胞悬液中含有基底膜基质胶；

3)所述水相单细胞悬液流经所述螺旋形分散相进液通道及所述水相磁珠悬液流经所述弧形分散相进液通道并在所述直线型分散相进液通道处汇合，所述油相液体流经所述连续相进液通道，最终于所述十字形液滴生成通道处交叉汇合，在外力的推动和油相剪切力的作用下，分散相与连续相同步向前运动，两相界面处的张力不足以维持连续相施加给分散相的剪切力时，分散相断裂形成一个个独立的、被连续相包裹的液滴，单细胞和磁珠被包裹在所述液滴中；

4)所述液滴经过所述出液通道，从所述出液口流入到添加了完全培养基的所述细胞培养皿中；

5)随着所述液滴大量生成，当所述液滴浮于所述完全培养基上并铺展开来，将所述基于液滴微流控技术的微流控芯片置于37℃的二氧化碳培养箱中培养；

6)在培养过程中，所述单细胞分泌物释放至其所在的液滴中，并被该液滴中磁珠上捕获分子捕获、富集，借此实现对所述单细胞分泌物进行实时检测。

可选地，所述压力泵为多通道压力泵，向所述分散相进液通道施加的压力介于0.005MPa～0.01MPa之间，向所述连续相进液通道施加的压力介于0.01MPa～0.02MPa之间；所述水相单细胞悬液的细胞浓度介于1*10⁴个/mL～1*10⁶个/mL之间，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度介于5％～40％之间；所述磁珠为捕获所述单细胞分泌物的磁珠，所述水相磁珠悬液的磁珠浓度1*10⁶个/mL～1*10⁷个/mL之间。

可选地，所述水相单细胞悬液的细胞浓度为1*10⁶个/mL，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度为20％；所述水相磁珠悬液的磁珠浓度1*10⁷个/mL。

可选地，所述液滴的直径介于50μm～300μm之间，所述水相单细胞悬液在所述螺旋形分散相进液通道中的流阻与所述水相磁珠悬液在所述弧形分散相进液通道中的流阻相同，所述油相液体为氟化油。

如上所述，本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法，采用螺旋形分散相进液通道利用惯性聚焦原理可将细胞单分散，使其前后均匀排布于通道内，利于形成高包裹率的单细胞液滴；另外，使分散相进液通道与连续相进液通道交汇呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道便于调节两相液体的流量比，进而控制液滴生成的长度与间距，相较于“T”字型液滴生成通道所生成的液滴大小来说更均一稳定；再者本发明的微流控芯片设置为上下两层，上层实现高通量单细胞的捕获，下层实现单细胞的培养及其分泌物的富集，从而达到单细胞在液滴中长期培养，并能进行单细胞原位培养、细胞共培养、药物筛选、分泌物实时、高灵敏检测等研究，且操作简单灵活、高通量、无污染、耗时短、成本低廉、应用范围广。

附图说明

图1显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片的整体结构示意图。

图2显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片中上层的液滴生成及单细胞捕获单元的平面结构示意图。

图3显示为图2中虚线框B处的放大示意图。

图4显示为图2中虚线框A处的放大示意图。

图5显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片刚捕获的单细胞的液滴图片。

图6显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片捕获的单细胞在液滴中培养24h的液滴图片。

图7显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片捕获的单细胞在液滴中培养48h的液滴图片。

图8显示为本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片捕获的单细胞在液滴中培养8天的液滴图片。

元件标号说明

1 细胞培养皿

2 液滴生成及单细胞捕获单元

10 连续相入口

11 第一分散相入口

12 第二分散相入口

13 分散相进液通道

131 弧形分散相进液通道

132 螺旋形分散相进液通道

133 直线形分散相进液通道

14 连续相进液通道

141 第一子连续相进液通道

142 第二子连续相进液通道

15 十字形液滴生成通道

16 出液通道

17 出液口

18 过滤柱

19 直三棱柱

191 凸起部

20 四棱柱

21 液滴

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅图1至图8。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图示中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

实施例1

如图1至图4所示，本实施例提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片，所述微流控芯片包括：位于上层的液滴生成及单细胞捕获单元2及位于下层的单细胞培养单元；

如图1及图2所示，所述液滴生成及单细胞捕获单元2包括：连续相入口10、第一分散相入口11、第二分散相入口12、分散相进液通道13、连续相进液通道14、十字形液滴生成通道15、出液通道16及出液口17；

如图1所示，所述分散相进液通道13包括三条：弧形分散相进液通道131、螺旋形分散相进液通道132及直线型分散相进液单通道133，所述第一分散相入口11连接所述弧形分散相进液通道131，所述第二分散相入口12连接所述螺旋形分散相进液通道132，所述弧形分散相进液通道131与所述螺旋形分散相进液通道132在末端交汇且与所述直线型分散相进液单通道133相连；

如图2所示，所述连续相进液通道14包括两条：第一子连续相进液通道141及第二子连续相进液通道142，所述连续相入口10同时连接所述第一子连续相进液通道141及第二子连续相进液通道142；

如图2所示，所述连续相进液通道14位于所述分散相进液通道13的外周，所述第一子连续相进液通道141、所述第二子连续相进液通道142及所述直线型分散相进液单通道133交汇处呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道15；

所述出液通道16连接所述十字形液滴生成通道15和所述出液口17；

如图1所示，所述单细胞培养单元包括细胞培养皿1。

本实施例的微流控芯片采用螺旋形分散相进液通道利用惯性聚焦原理可将细胞单分散，使其前后均匀排布于通道内，利于形成高包裹率的单细胞液滴；另外，使分散相进液通道与连续相进液通道交汇呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道便于调节两相液体的流量比，进而控制液滴生成的长度与间距，相较于“T”字型液滴生成通道所生成的液滴大小来说更均一稳定；再者本实施例的微流控芯片设置为上下两层，上层实现高通量单细胞的捕获，下层实现单细胞的培养及其分泌物的富集，从而达到单细胞在液滴中长期培养，并能进行单细胞原位培养、细胞共培养、药物筛选、分泌物实时、高灵敏检测等研究，且操作简单灵活、高通量、无污染、耗时短、成本低廉、应用范围广。

如图2及图3所示，作为示例，所述连续相入口10、所述第一分散相入口11及所述第二分散相入口12均设置有过滤柱18。相邻两过滤柱的间隙大于单细胞直径，以减少相应通道中的气泡并防止细胞团块等堵塞通道。

所述过滤柱18的形状以及排布方式可以根据其相应通道中流入的液体进行选择，在此不作限制，如图3所示，例如可以是圆柱状、三棱柱状。

作为示例，所述弧形分散相进液通道131的流阻与所述螺旋形分散相进液通道132的流阻相同，以使分散相断裂形成一个个独立的、被连续相包裹的液滴中同时包裹有所述单细胞和磁珠。

作为示例，所述连续相进液通道14的宽度介于50μm～60μm之间；所述弧形分散相进液通道131的宽度介于20μm～30μm之间；所述螺旋形分散相进液通道132的宽度介于50μm～60μm之间，螺旋圈数介于3～10之间；所述直线型分散相进液单通道133的宽度介于50μm～70μm之间；所述分散相进液通道13及所述连续相进液通道14的高度介于50μm～60μm之间，以上包括端点值。本实施例中优选选择所述连续相进液通道14的宽度为55μm；所述弧形分散相进液通道131的宽度为25μm；所述螺旋形分散相进液通道132的宽度为55μm，螺旋圈数为3圈；所述直线型分散相进液单通道133的宽度为60μm；所述分散相进液通道13及所述连续相进液通道14的高度为55μm。较佳地，所述弧形分散相进液通道131的弧度介于200°～240°之间，外径介于1800μm～2300μm之间；所述螺旋形分散相进液通道132外圈的曲率半径介于2300μm～3400μm之间，内圈的曲率半径介于1500μm～2000μm之间，宽度介于50μm～60μm之间，螺旋间距介于50μm～100μm之间，以上包括端点值。本实施例中优选选择所述弧形分散相进液通道131的弧度为237°，外径为2200μm；所述螺旋形分散相进液通道132外圈的曲率半径为2300μm，内圈的曲率半径为1800μm，宽度为50μm，螺旋间距为100μm。本实施例中弧形分散相进液通道131的弧度及外径是根据螺旋形分散相进液通道132的圈数进行相应减小或增加，以使该两分散相进液通道中的流阻相同。

如图1所示，作为示例，所述细胞培养皿1的尺寸介于2～4英寸之间，本实施例中选择2英寸。

如图2及图4所示，作为示例，所述出液通道16上设置有一个直三棱柱19及两个四棱柱20；两个所述四棱柱20对称分布于所述直三棱柱19的两侧；所述直三棱柱19设置于所述出液通道16的中间位置，且朝向所述十字形液滴生成通道15的一侧设置有凸起部191；所述出液通道16的宽度自所述十字形液滴生成通道15一侧起逐渐增宽。所述直三棱柱19及所述四棱柱20起到支撑微流控芯片防止其坍塌的作用，同时两者之间的相对位置设置可将从所述十字形液滴生成通道15出来的液滴实现两次分流(如图2及图4中的箭头所示)出液，且配合出液通道16的宽度自所述十字形液滴生成通道15一侧起逐渐增宽的设计，有效提高液滴出液的均匀性。较佳地，所述直三棱柱19的上下表面为等腰三角形，所述四棱柱20的上下表面为平行四边形，进一步提高出液均匀性。

实施例2

本实施例提供一种上述实施例1所述的基于液滴微流控技术的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，使用AutoCAD软件绘制出所述微流控芯片中所述液滴生成及单细胞捕获单元2的通道结构图，根据图形制作掩膜版。

步骤S2，在4英寸单晶硅片上采用光刻和腐蚀方法，经过涂胶、甩胶、前烘、曝光、后烘、显影、硬烘，制备出通道凸起的SU-8模板。具体为：在4英寸单晶硅片上甩一层SU-8胶，使其厚度为50μm～60μm之间，95℃前烘40min，自然冷却至室温；将所述掩膜版置于单晶硅片上方，使用光刻机紫外曝光100s，95℃后烘30min，自然冷却至室温；采用PGMEA显影液显影3min后甩干，170℃硬烘20min，自然冷却至室温，最终制备出通道结构部分凸起的SU-8模板。

步骤S3，将PDMS与固化剂以重量比为10：1混合均匀浇注于所述SU-8模板上，80℃热板加热固化2h后，将所述PDMS层与所述SU-8模板剥离，切割、打孔得到微流控芯片上层的液滴生成及单细胞捕获的PDMS单元。具体为：将PDMS预聚物与固化剂按照重量比10：1混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中抽真空并静置40min，待气泡消除后，将其浇筑于所述SU-8模板上，静置5min使PDMS充分覆盖所述SU-8模板，然后将其置于热板上80℃加热2h；待PDMS固化后，将其从所述SU-8模板上剥离下来，SU-8模板保存备用，PDMS层的多余部分切割丢弃，并对连续相入口和分散相入口进行打孔，得到液滴生成及单细胞捕获的PDMS单元。

步骤S4，将所述PDMS单元与细胞培养皿经氧等离子处理后各自浸泡于5％APTES和1％GLYMO中，氮气吹干，然后将二者贴合并加热10h～12h。具体为：按体积比事先配制5％APTES溶液和1％GLYMO溶液，将所述PDMS单元的结构面和2英寸细胞培养皿各自朝上放入等离子清洗机中氧等离子处理1min，取出后立即将所述PDMS单元浸入5％APTES溶液中，细胞培养皿内倒入1％GLYMO溶液，静置20min；随后倒掉溶液，用氮气将所述PDMS单元和细胞培养皿吹干，将二者贴合，置于热板上65℃温度下11h，即完成了微流控芯片的制备。

实施例3

本实施例提供一种基于液滴微流控技术的微流控芯片的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

步骤S1，提供如实施例1所述基于液滴微流控技术的微流控芯片。所述微流控芯片可采用实施例2所述的制备方法制备，但不限定于此，也可使用其他制备方法制得。

步骤S2，利用压力泵使水相单细胞悬液从所述第二分散相入口12进入、水相磁珠悬液从所述第一分散相入口11进入、油相液体从所述连续相入口10进入，其中，所述水相单细胞悬液中含有基底膜基质胶。

作为示例，所述压力泵为多通道压力泵，可同时实现对所述第二分散相入口12、所述第一分散相入口11及所述连续相入口10施压。较佳地，所述多通道压力泵向所述分散相进液通道13施加的压力介于0.005MPa～0.01MPa之间，向所述连续相进液通道14施加的压力介于0.01MPa～0.02MPa之间；所述水相单细胞悬液的细胞浓度介于1*10⁴个/mL～1*10⁶个/mL之间，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度介于5％～40％之间；所述磁珠为捕获所述单细胞分泌物的磁珠，所述水相磁珠悬液的磁珠浓度1*10⁶个/mL～1*10⁷个/mL之间，所述单细胞分泌物包括外泌体、酶及细胞因子等。通过设置该水相磁珠悬液，使后续形成的液滴中包裹有单细胞的同时还包裹磁珠，在后续步骤的培养过程中，单细胞分泌物释放至其所在的液滴中，并被同一液滴内的磁珠上捕获分子捕获、富集，该方式可有效提高检测灵敏度。本实施例中优选选择所述水相单细胞悬液的细胞浓度为1*10⁶个/mL，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度为20％；所述水相磁珠悬液的磁珠浓度1*10⁷个/mL。

这里需要说明的是所述基底膜基质胶主要成分是由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，可在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，在所述水相单细胞悬液中添加所述基底膜基质胶，一方面可以给后续形成的液滴中包裹的单细胞提供生长因子，另一方面还起到水凝胶的作用，防止后续形成的液滴中的油挥发后液滴破裂导致融合。

步骤S3，所述水相单细胞悬液流经所述螺旋形分散相进液通道132及所述水相磁珠悬液流经所述弧形分散相进液通道131并在所述直线型分散相进液通道133处汇合，所述油相液体流经所述连续相进液通道14，最终于所述十字形液滴生成通道15处交叉汇合，在外力(压力泵)的推动和油相剪切力的作用下，分散相与连续相同步向前运动，两相界面处的张力不足以维持连续相施加给分散相的剪切力时，分散相断裂形成一个个独立的、被连续相包裹的液滴，单细胞和磁珠被包裹在所述液滴中。

作为示例，所述液滴的直径介于50μm～300μm之间。

作为示例，所述水相单细胞悬液在所述螺旋形分散相进液通道132中的流阻与所述水相磁珠悬液在所述弧形分散相进液通道131中的流阻相同。以使单细胞与磁珠同时到达所述十字形液滴生成通道15处，以使液滴可同时包裹单细胞及磁珠，提高液滴的包裹成功率。

作为示例，所述油相液体为氟化油Novec7500，氟化油Novec7500可挥发，液滴形成后其会挥发掉，可使细胞培养所需物质进入液滴，便于对单细胞的培养。

步骤S4，所述液滴经过所述出液通道16，从所述出液口17流入到添加了完全培养基的所述细胞培养皿1中。

步骤S5，随着所述液滴大量生成，当所述液滴浮于所述完全培养基上并铺展开来，将所述基于液滴微流控技术的微流控芯片置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。从而可实现单细胞在微流控芯片的液滴结构中原位培养、细胞共培养或中长期培养。

步骤S6，在培养过程中，所述单细胞分泌物释放至其所在的液滴中，并被该液滴中磁珠上捕获分子捕获、富集，借此实现对所述单细胞分泌物进行实时检测。且由于液滴中的磁珠捕获的是该液滴中的细胞分泌物，可有效提高检测灵敏度；另外，也可实时根据要求对细胞分泌物进行检测。

实施例4

运用实施例3的基于液滴微流控技术的微流控芯片的检测方法实施对肿瘤细胞的捕获、培养及其分泌物的检测，所述检测方法包括如下步骤：

步骤S1，水相肿瘤细胞悬液的制备：用T25培养瓶培养肿瘤细胞，待细胞汇合率达到90％后，吸弃培养基，PBS清洗后，加入1mL胰酶置于二氧化碳培养箱中37℃消化2min～5min，将消化下来的细胞1000rpm离心5min，吸弃上清，加入1mL完全培养基重悬，吸取80μL细胞悬液加入20μL Matrigel基底膜基质胶混合均匀，这里Matrigel为corning公司的一款基底膜基质胶产品，置于冰上备用。

步骤S2，水相磁珠悬液的制备：涡旋震荡重悬磁珠，吸取1mL于EP管中，置于磁铁上2min，吸弃上清，加入1mL 0.1％BSA-PBS溶液，涡旋震荡重悬磁珠，留以备用。

步骤S3，微流控芯片预处理：向微流控芯片内倒入75％酒精浸泡1h，吸弃酒精加入PBS洗涤后，置于超净台内风干，并用紫外消毒半小时。

步骤S4，将微流控芯片置于显微镜上便于观察液滴生成，在第二分散相入口12的枪头中加入水相肿瘤细胞悬液，利用螺旋形通道的惯性聚焦原理使肿瘤细胞单分散，在第一分散相入口11的枪头中加入水相磁珠悬液，保证两个分散相进液通道流阻相同；在连续相入口10的枪头中加入氟化油Novec7500，枪头上端用导管与多通道压力泵相连；打开压力泵的气泵和压力阀，气压推动连续相和分散相的液体流入各自的通道，水相肿瘤细胞悬液和水相磁珠悬液在直线型分散相进液单通道133混合，两相液体在十字形液滴生成通道15处汇合，分散相液体突破界面张力进入连续相中形成一个个包裹了单肿瘤细胞及磁珠的油包水乳化液滴，液滴流经出液通道16并从出液口17流入细胞培养皿1中；细胞培养皿1中预先加入2mL完全培养基，由于浮力作用，出液口17附近大量堆积的液滴集团会上浮到完全培养基液面并铺展开；盖上细胞培养皿盖，置于二氧化碳培养箱内37℃培养，期间可用显微镜进行观察单肿瘤细胞生长状况(如图5至图8所示)，在此期间，磁珠会捕获肿瘤细胞分泌的物质，可在原位进行后续分泌物富集及实时检测。

综上所述，本发明的基于液滴微流控技术的微流控芯片及其检测方法，采用螺旋形分散相进液通道利用惯性聚焦原理可将细胞单分散，使其前后均匀排布于通道内，利于形成高包裹率的单细胞液滴；另外，使分散相进液通道与连续相进液通道交汇呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道便于调节两相液体的流量比，进而控制液滴生成的长度与间距，相较于“T”字型液滴生成通道所生成的液滴大小来说更均一稳定；再者本发明的微流控芯片设置为上下两层，上层实现高通量单细胞的捕获，下层实现单细胞的培养及其分泌物的富集，从而达到单细胞在液滴中长期培养，并能进行单细胞原位培养、细胞共培养、药物筛选、分泌物实时、高灵敏检测等研究，且操作简单灵活、高通量、无污染、耗时短、成本低廉、应用范围广。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.一种基于液滴微流控技术的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：位于上层的液滴生成及单细胞捕获单元及位于下层的单细胞培养单元；

所述液滴生成及单细胞捕获单元包括：连续相入口、第一分散相入口、第二分散相入口、分散相进液通道、连续相进液通道、十字形液滴生成通道、出液通道及出液口，其中，水相单细胞悬液从所述第二分散相入口进入，油相液体从所述连续相入口进入，所述水相单细胞悬液中含有基底膜基质胶，所述油相液体为氟化油；

所述分散相进液通道包括三条：弧形分散相进液通道、螺旋形分散相进液通道及直线型分散相进液单通道，所述第一分散相入口连接所述弧形分散相进液通道，所述第二分散相入口连接所述螺旋形分散相进液通道，所述弧形分散相进液通道与所述螺旋形分散相进液通道在末端交汇且与所述直线型分散相进液单通道相连，所述弧形分散相进液通道的弧度及外径根据所述螺旋形分散相进液通道的圈数进行相应减小或增加以使所述弧形分散相进液通道的流阻与所述螺旋形分散相进液通道的流阻相同；

所述连续相入口、所述第一分散相入口及所述第二分散相入口均设置有过滤柱，相邻两所述过滤柱的间隙大于单细胞直径；

所述连续相进液通道包括两条：第一子连续相进液通道及第二子连续相进液通道，所述连续相入口同时连接所述第一子连续相进液通道及第二子连续相进液通道；

所述连续相进液通道位于所述分散相进液通道的外周，所述第一子连续相进液通道、所述第二子连续相进液通道及所述直线型分散相进液单通道交汇处呈“十”字交叉，形成所述十字形液滴生成通道；

所述出液通道连接所述十字形液滴生成通道和所述出液口；

所述单细胞培养单元包括细胞培养皿。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述连续相进液通道的宽度介于50μm~60μm之间；所述弧形分散相进液通道的宽度介于20μm~30μm之间；所述螺旋形分散相进液通道的宽度介于50μm~60μm之间，螺旋圈数介于3~10之间；所述直线型分散相进液单通道的宽度介于50μm~70μm之间；所述分散相进液通道及所述连续相进液通道的高度介于50μm~60μm之间。

3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述弧形分散相进液通道的弧度介于200°~240°之间，外径介于1800μm~2300μm之间；所述螺旋形分散相进液通道外圈的曲率半径介于2300μm~3400μm之间，内圈的曲率半径介于1500μm~2000μm之间，宽度介于50μm~60μm之间，螺旋间距介于50μm~100μm之间。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：所述连续相进液通道的宽度为55μm；所述弧形分散相进液通道的宽度为25μm；所述螺旋形分散相进液通道的宽度为55μm，螺旋圈数为3圈；所述直线型分散相进液单通道的宽度为60μm；所述分散相进液通道及所述连续相进液通道的高度为55μm；所述弧形分散相进液通道的弧度为237°，外径为2200μm；所述螺旋形分散相进液通道外圈的曲率半径为2300μm，内圈的曲率半径为1800μm，宽度为50μm，螺旋间距为100μm。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述细胞培养皿的尺寸介于2英寸~4英寸之间。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述出液通道上设置有一个直三棱柱及两个四棱柱；两个所述四棱柱对称分布于所述直三棱柱的两侧；所述直三棱柱设置于所述出液通道的中间位置，且朝向所述十字形液滴生成通道的一侧设置有凸起部；所述出液通道的宽度自所述十字形液滴生成通道一侧起逐渐增宽。

7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于：所述直三棱柱的上下表面为等腰三角形，所述四棱柱的上下表面为平行四边形。

8.一种基于液滴微流控技术的微流控芯片的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

1）提供如权利要求1至7中任意一项所述基于液滴微流控技术的微流控芯片；

2）利用压力泵使水相单细胞悬液从所述第二分散相入口进入、水相磁珠悬液从所述第一分散相入口进入、油相液体从所述连续相入口进入，其中，所述水相单细胞悬液中含有基底膜基质胶，所述油相液体为氟化油；

3）所述水相单细胞悬液流经所述螺旋形分散相进液通道及所述水相磁珠悬液流经所述弧形分散相进液通道并在所述直线型分散相进液通道处汇合，所述油相液体流经所述连续相进液通道，最终于所述十字形液滴生成通道处交叉汇合，在外力的推动和油相剪切力的作用下，分散相与连续相同步向前运动，两相界面处的张力不足以维持连续相施加给分散相的剪切力时，分散相断裂形成一个个独立的、被连续相包裹的液滴，单细胞和磁珠被包裹在所述液滴中；

4）所述液滴经过所述出液通道，从所述出液口流入到添加了完全培养基的所述细胞培养皿中；

5）随着所述液滴大量生成，当所述液滴浮于所述完全培养基上并铺展开来，将所述基于液滴微流控技术的微流控芯片置于37℃的二氧化碳培养箱中培养；

6）在培养过程中，所述单细胞分泌物释放至其所在的液滴中，并被该液滴中磁珠上捕获分子捕获、富集，借此实现对所述单细胞分泌物进行实时检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述压力泵为多通道压力泵，向所述分散相进液通道施加的压力介于0.005 MPa~0.01 MPa之间，向所述连续相进液通道施加的压力介于0.01 MPa~0.02 MPa之间；所述水相单细胞悬液的细胞浓度介于1*10⁴个/mL ~1*10⁶个/mL之间，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度介于5%~40%之间；所述磁珠为捕获所述单细胞分泌物的磁珠，所述水相磁珠悬液的磁珠浓度介于1*10⁶个/mL ~1*10⁷个/mL之间。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述水相单细胞悬液的细胞浓度为1*10⁶个/mL，所述水相单细胞悬液的所述基底膜基质胶浓度为20%；所述水相磁珠悬液的磁珠浓度1*10⁷个/mL。

11.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述液滴的直径介于50μm~300μm之间，所述水相单细胞悬液在所述螺旋形分散相进液通道中的流阻与所述水相磁珠悬液在所述弧形分散相进液通道中的流阻相同。

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