CN113588896A - 一种微流道装置和高通量可编程多浓度药物的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种微流道装置和高通量可编程多浓度药物的建立方法。本发明公开了一种微流控装置，该装置可实现含不同种类、不同剂量药物组合的微液滴的高通量制备。该装置可以产生多浓度并且有着较好重复性的稳定液滴，通过改变药物初始浓度和流量，可以获得一系列的药物种类及浓度组合。该装置具有微量、高效、高通量和自动化的优点，能较好地克服多孔板筛选系统的不足。该装置可广泛应用于基因分析、药物筛选、细胞培养等领域。

Description

一种微流道装置和高通量可编程多浓度药物的建立方法
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种微流道装置和高通量可编程多浓度药物的建立方法。
背景技术
药物筛选作为新药研发中的关键步骤，是指将具有生物活性或进一步研究价值的化合物(先导化合物)从众多的天然产物或人工合成的化合物中筛选出来，它的主要方式是采用适宜的药物作用靶点对大量化合物进行筛选。但随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学、组合化学等学科的发展，药物分子库在不断扩大，药物作用靶点也越来越多，这使得药物发现的范围逐渐扩大，药物筛选的工作量急剧增加。近些年，为加速药物筛选进程，人们提出了高通量筛选技术(high-throughput screening，HTS)，它以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，通过自动化操作系统、灵敏快速的检测系统和数据分析系统能够实现数千个反应同时测试和分析，大大提高了药物筛选的实验规模和效率。
目前，发展成熟的高通量药物筛选系统主要基于多孔板，存在细胞培养条件单一、耗时长、试剂消耗量大等问题，且较难实现复杂的多浓度药物组合筛选。近年来，微流控液滴技术迅速发展，并被广泛应用于药物组合筛选。微流控液滴技术是指在微尺度通道内，通常是在微加工的通道结构中，利用流动剪切力与表面张力之间的相互作用将连续流体分割分离成离散的纳升级及以下体积的液滴，并对其进行操控的一种微纳技术。它的优点包括：高灵敏度、高通量、自动化与低成本。此外，该方法还可以建立一种方便控制的流体和颗粒的微环境。目前，以微流控芯片为基础的处理少量液体(如微升/纳升级的液滴)的技术，已经日趋成熟，在微通道中制备液滴变得越来越重要。在微流控细胞筛选系统中，通常会涉及细胞的接种、培养液的更换或添加、药物的加入与清洗、细胞染色试剂的添加等操作，这些操作均需通过对微流体的操控得以实现。
因此，提供一种高效可靠的细胞高通量药物筛选方法是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种微流道装置和高通量可编程多浓度药物的建立方法，该微流道装置可以形成高通量多浓度药物液滴，为生成高通量的多浓度的药物液滴提供了解决方案，还可实现快速而准确的多药物多浓度组合。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种微流道装置，所述微流道装置包括：相互连通的水相通道、油相通道和两相通道；
所述水相通道设置在所述油相通道的上游，所述油相通道的出口与所述水相通道的出口与所述两相通道的入口连通；
所述水相通道包括第一水相通道，所述第一水相通道用于通入药物；
所述水相通道和所述油相通道均为液体注射装置。
优选地，所述油相通道的数量为偶数，所述油相通道对称设置。
优选地，所述第一水相通道的数量至少为两个，不同所述第一水相通道通入的药物不同。
优选地，所述水相通道还包括用于通入水的第二水相通道，所述第二水相通道设置在所述油相通道的上游，且所述第二水相通道的出口与所述两相通道的入口连通。
本发明还提供了一种高通量可编程多浓度药物的建立方法，采用上述微流道装置，包括以下步骤：
分别向第一水相通道和油相通道中通入第一水相和油相，通过液体注射装置分别控制第一水相和油相的流量，从而获得不同浓度药物液滴；
所述第一水相为药物。
优选地，所述第一水相的数量至少为两个，不同所述第一水相通道通入不同的药物。
优选地，所述水相的总流量为60～100μL/min；
优选地，所述油相的总流量为100～200μL/min。
优选地，通入所述第一水相和油相时，还需向第二水相通道中通入第二水相，所述第二水相为水。
本发明还提供了一种微流道芯片，包括液滴收集芯片和权利要求1至5任意一项所述的微流道装置；
所述微流道装置的出口与所述液滴收集芯片连通。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种微流道装置，该装置可实现含不同种类、不同剂量药物组合的微液滴的高通量制备。该装置可以产生多浓度并且有着较好重复性的稳定液滴，通过改变药物初始浓度和流量，可以获得一系列的药物种类及浓度组合。该装置具有微量、高效、高通量和自动化的优点，能较好地克服多孔板筛选系统的不足。该装置可广泛应用于基因分析、药物筛选、细胞培养等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的微流道芯片的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的液滴收集芯片以及高通量微液滴的实物图；
图3为本发明实施例2提供的单一药物三梯度浓度荧光与液滴位置关系图；
图4为本发明实施例3提供的单一药物五梯度浓度荧光与液滴位置关系图；
图5为本发明实施例4提供的双药物组合三梯度浓度荧光与液滴位置关系；
图6为本发明实施例5双药物组合五梯度浓度荧光与液滴位置关系图；
图示说明如下：
1、水相通道；2、油相通道；3、液滴收集芯片。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种微流道装置，微流道装置包括：相互连通的水相通道、油相通道和两相通道；
水相通道设置在油相通道的上游，油相通道的出口与水相通道的出口与两相通道的入口连通。
本发明中，油相通道的出口与水相通道的出口通过硅胶管与两相通道的入口连通。两相通道优选为硅胶管接头。
水相通道包括第一水相通道，第一水相通道用于通入药物，油相通道用于通入油相；
水相通道和油相通道均为液体注射装置。液体注射装置用于提供油相或水相，并提供驱动力将其注入两相通道中，而且液体注射装置可以控制水相或油相的灌注速率。本发明中，液体注射装置优选由注射泵和注射器组成。
本发明中，上游的第一水相通道的药物与下游的油相通道的油相汇集在两相通道中，通过不同流体间的流动剪切力与表面张力的作用，在两相通道几何结构限制的流场交界面处，油相将连续流体药物分割成油包水的离散液滴。本发明可以通过液体注射装置改变第一水相的流量来获得不同浓度的药物。
本发明中，油相通道的数量至少为1个。本发明对油相通道的设置没有特别限定，只需油相通道设置在水相通道的下游即可。优选地，当油相通道为偶数个时，油相通道对称设置在两相通道的侧面。本发明实施例中，油相通道为2个，且2个油相通道对称设置。
本发明中，第一水相通道至少为1个。当第一水相通道的数量为至少两个时，不同第一水相通道通入的药物不同。
本发明对第一水相通道的设置没有特别限定，只设置在油相通道的上游即可。优选地，第一水相通道为偶数个时，第一水相通道可对称设置在两相通道的侧面；第一水相通道为奇数个时，偶数个的第一水相通道对称设置，剩余一个第一水相通道设置在两相通道出口的对侧。本发明实施例中，第一水相通道的数量为2个，2个第一水相通道对称设置。
本发明的水相通道还包括用于通入水的第二水相通道，第二水相通道设置在油相通道的上游，且第二水相通道的出口与两相通道的入口连通。优选地，第二水相通道设置在两相通道出口的对侧，第二水相通道的出口与两相通道的入口连通。
本发明中，第二水相通道通入的水优选为去离子水。第二水相通道的水用于稀释第一水相通道中的药物。
本发明还提供了一种高通量可编程多浓度药物的建立方法，采用上述微流道装置，包括以下步骤：
分别向第一水相通道和油相通道中通入第一水相和油相，通过注射泵分别控制第一水相和油相的流量，从而获得不同浓度药物液滴；
第一水相为药物。
本发明高通量可编程多浓度药物的建立方法的原理如下：
设定液体注射装置中注射泵的流量后，上游的药物溶液与下游的油相在两相通道中相汇，通过不同流体间的流动剪切力与表面张力，在两相通道几何结构限制的流场交界面处，油相将连续流动的药物分割成油包水的离散液滴。通过改变药物溶液的流量来获得不同浓度的药物的分散液滴。
本发明提供的高通量可编程多浓度药物的建立方法操作简单、药物消耗较少、精确、可控、重现性好、便于生成定量的药物时间和空间梯度，同时可制备高通量的药物液滴。
本发明中，当第一水相通道为两个以上时，通过设定不同药物溶液的初始浓度，并改变不同药物溶液的流量，从而获得不同浓度的药物组合物。
本发明中，离散液滴中单一药物的浓度计算方法为：单一药物溶液浓度*该药物的流量/水相总流量。
本发明中，水相的总流量为60～100μL/min，优选为80μL/min；油相的总流量为100～200μL/min，优选为150μL/min。本发明的水相和油相在上述优选流量下可以获得均一稳定的液滴。
本发明中，在药物进行细胞实验时，第一水相可以设置梯度浓度，便于实验样品的处理与研究。
本发明中，油相优选为液体石蜡、硅油或氟油，优选为液体石蜡。
本发明中，通入第一水相和油相时，优选还需向第二水相通道中通入第二水相，第二水相为水。水可以进一步稀释药物溶液。因此，本发明还可以通过调整第二水相的流量来获得不同浓度的药物分散液滴。
本发明还提供了一种微流道芯片，包括液滴收集芯片和上述微流道装置；
微流道装置的出口与液滴收集芯片连通。
本发明中，微流道装置与液滴收集芯片通过毛细硅胶管连接，微流道装置生成液滴后经毛细硅胶管引入液滴收集芯片的入口，随后液滴依次进入，排列在液滴收集芯片中。
本发明可实现含不同种类、不同剂量药物组合的微液滴的高通量制备。在微液滴收集芯片中产生了多浓度梯度并且有着较好重复性的稳定液滴，通过改变药物初始浓度和流量，可以获得一系列的药物种类及浓度组合。微流控方法具有微量、高效、高通量和自动化的优点，能较好地克服多孔板筛选系统的不足，比如：细胞培养条件单一、费时耗力、试剂消耗量大等问题，为构建细胞高通量药物筛选系统提供了一种高效、可靠的技术手段。
以下就本发明的方案做进一步说明。
实施例1
本实施例为液滴收集芯片的制备，具体制备步骤如下：
步骤1)利用AutoCAD设计微流控芯片的几何通道模板，利用激光刻蚀技术将结构刻蚀在铝模板上。
步骤2)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物和交联剂以10：1的比例混合，搅拌均匀后，向模具上倒50mL混合物，抽真空30min除去气泡，再置于80℃热板上加热固化。
步骤3)向透明玻璃板上倒10mL PDMS预聚物和交联剂以10：1的比例混合形成的混合物，静置后形成PDMS薄层，再放入60℃恒温箱里固化。
步骤4)向固化好的玻璃板上滴一小滴PDMS预聚物和交联剂以10：1的比例混合形成的混合物，用滚轮将其均匀地涂在玻璃板上，再将固化好的PDMS从模板上剥离，与玻璃板贴紧，放置10min后，在热板120℃上放置1h固化，完成液滴收集芯片的制作。
实施例2
本实施例为单一药物三浓度梯度液滴的制备
步骤1)将2mg罗丹明溶于2mL去离子水中，制成1mg/mL罗丹明母液；
步骤2)取100μL上述母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100，制成10μg/mL罗丹明稀释液待用；
步骤3)向五个注射器中分别加入待推液体，其中两个注射器充填液体石蜡，用作油相，一个注射器充填10μg/mL罗丹明稀释液，微流控装置从上至下依次为罗丹明稀释液(模拟单一药物)，剩余两个注射器充填去离子水，作为水相，将毛细硅胶管与注射器连接；
步骤4)将注射器固定在注射泵上，调节灌注速度，油相总灌注速度为150μL/min，水相总灌注速度为80μL/min，在这种条件下，液滴均匀且在芯片上稳定，不容易粘连。在该流量条件下，液滴生成区每分钟至少生成65个稳定且大小均匀的液滴，液滴填满液滴收集芯片的时间约为4.5min。其中三梯度时入口1(去离子水)流量保持为20μL/min，入口2(罗丹明溶液)流量依次为10μL/min、30μL/min、50μL/min，相应的入口3(去离子水)的流量依次为50μL/min、30μL/min、10μL/min，液滴中罗丹明浓度计算方法：注射器中罗丹明溶液浓度*该注射器流量/水相总流量。从而得到三种浓度梯度的罗丹明液滴。
实施例3
本实施例为单一药物五浓度梯度液滴的制备
步骤1)将2mg罗丹明溶于2mL去离子水中，制成1mg/mL罗丹明母液；
步骤2)取100μL母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100，制成10μg/mL罗丹明稀释液待用；
步骤3)向五个注射器中分别加入待推液体，其中两个注射器充填液体石蜡，用作油相，一个注射器充填10μg/mL罗丹明稀释液(模拟单一药物)，剩余两个注射器充填去离子水，作为水相，将毛细硅胶管与注射器连接；
步骤4)将注射器固定在注射泵上，调节灌注速度，油相总灌注速度为150μL/min，水相总灌注速度为80μL/min。五梯度时入口1(去离子水)流量保持为20μL/min，入口2(罗丹明溶液)流量依次为10μL/min、20μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min,相应的入口3(去离子水)流量依次为50μL/min、40μL/min、30μL/min、20μL/min、10μL/min，液滴中罗丹明浓度计算方法：注射器中罗丹明溶液浓度*该注射器流量/水相总流量，从而得到五种浓度梯度的罗丹明液滴，将液滴收集到微液滴收集芯片中。
实施例4
本实施例为双药物组合三浓度梯度液滴的制备
步骤1)称取2mg Hoechst 33342溶于1mL去离子水中，制成2mg/mL Hoechst33342母液；称取2mg罗丹明6G溶于1mL去离子水中，制成2mg/mL罗丹明母液；
步骤2)取100μL Hoechst33342母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100,制成20μg/mL Hoechst33342稀释液待用；取100μL罗丹明母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100,制成20μg/mL罗丹明稀释液待用；
步骤3)向五个注射器中分别加入待推液体，其中两个注射器充填液体石蜡，用作油相，一个注射器充填20μg/mL罗丹明稀释液(模拟第一种药物)，一个注射器充填20μg/mLHoechst33342稀释液(模拟第二种药物)，一个注射器充填去离子水，作为水相，将毛细硅胶管与注射器连接；
步骤4)将注射器固定在注射泵上，调节灌注速度，油相总灌注速度为150μL/min，水相总灌注速度为80μL/min。在该流量条件下，液滴生成区每分钟至少生成65个稳定且大小均匀的液滴，液滴填满收集芯片的时间约为4.5min。其中三梯度时入口1(去离子水)流量保持为20μL/min，入口2(罗丹明溶液)流量依次为10μL/min、30μL/min、50μL/min，相应的入口3(Hoechst33342溶液)的流量依次为50μL/min、30μL/min、10μL/min。液滴中罗丹明浓度计算方法：注射器中罗丹明溶液浓度*该注射器流量/水相总流量，液滴中Hoechst33342浓度计算方法：注射器中Hoechst33342溶液浓度*该注射器流量/水相总流量，从而得到三种浓度梯度的双药物液滴。
实施例5
本实施例为双药物组合五浓度梯度液滴的制备
步骤1)称取2mg Hoechst 33342溶于1mL去离子水中，制成2mg/mL Hoechst33342母液；称取2mg罗丹明6G溶于1mL去离子水中，制成2mg/mL罗丹明母液；
步骤2)取100μL Hoechst 33342母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100,制成20μg/mL Hoechst33342稀释液待用；取100μL罗丹明母液与9.9mL去离子水混合，使母液稀释为原来的1/100,制成20μg/mL罗丹明稀释液用；
步骤3)向五个注射器中分别加入待推液体，其中两个注射器充填液体石蜡，用作油相，一个注射器充填罗丹明溶液(模拟第一种药物)，一个注射器充填Hoechst33342溶液(模拟第二种药物)，一个注射器充填去离子水，作为水相，将毛细硅胶管与注射器连接；
步骤4)将注射器固定在注射泵上，调节灌注速度，油相总灌注速度为150μL/min，水相总灌注速度为80μL/min。在该流量条件下，液滴生成区每分钟至少生成65个稳定且大小均匀的液滴，液滴填满收集芯片的时间约为4.5min。其中五梯度时入口1(去离子水)流量保持为20μL/min,入口2(罗丹明溶液)流量依次为10μL/min、20μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min，相应的入口3(Hoechst33342溶液)的流量依次为50μL/min、40μL/min、30μL/min、20μL/min、10μL/min，液滴中罗丹明浓度计算方法：注射器中罗丹明溶液浓度*该注射器流量/水相总流量，液滴中Hoechst33342浓度计算方法：注射器中Hoechst33342溶液浓度*该注射器流量/水相总流量，从而得到五种浓度梯度的双药物液滴。
实施例6
高通量荧光信号采集与数据处理：
步骤1)实施例2～5的微液滴进入液滴收集芯片后，将芯片置于倒置荧光显微镜载物台；
步骤2)将各硬件连接并利用控制软件实现显微镜载物台、物镜、光源及高速摄像机的协同运作，采集荧光信号图；
步骤3)用ImageJ进行荧光分析，得到浓度与荧光强度关系图。
如图3所示，实施例2中，随着罗丹明浓度的升高，荧光强度增强。
如图4所示，实施例3中，随着罗丹明浓度的升高，荧光强度增强。
如图5所示，实施例4中，随着罗丹明浓度的升高，荧光强度增强，随着Hoechst33342浓度的升高，荧光强度增强。
如图6所示，实施例5中，随着罗丹明浓度的升高，荧光强度增强，随着Hoechst33342浓度的升高，荧光强度增强。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种微流道装置，其特征在于，所述微流道装置包括：相互连通的水相通道、油相通道和两相通道；
所述水相通道设置在所述油相通道的上游，所述油相通道的出口与所述水相通道的出口与所述两相通道的入口连通；
所述水相通道包括第一水相通道，所述第一水相通道用于通入药物；
所述水相通道和所述油相通道均为液体注射装置。
2.根据权利要求1所述的微流道装置，其特征在于，所述油相通道的数量为偶数，所述油相通道对称设置。
3.根据权利要求1所述的微流道装置，其特征在于，所述第一水相通道的数量至少为两个，不同所述第一水相通道通入的药物不同。
4.根据权利要求1所述的微流道装置，其特征在于，所述水相通道还包括用于通入水的第二水相通道，所述第二水相通道设置在所述油相通道的上游，且所述第二水相通道的出口与所述两相通道的入口连通。
5.一种高通量可编程多浓度药物的建立方法，其特征在于，采用权利要求1～4任意一项所述的微流道装置，包括以下步骤：
分别向第一水相通道和油相通道中通入第一水相和油相，通过液体注射装置分别控制第一水相和油相的流量，从而获得不同浓度药物液滴；
所述第一水相为药物。
6.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，所述第一水相的数量至少为两个，不同所述第一水相通道通入不同的药物。
7.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，所述水相的总流量为60～100μL/min。
8.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，所述油相的总流量为100～200μL/min。
9.根据权利要求8所述的建立方法，其特征在于，通入所述第一水相和油相时，还需向第二水相通道中通入第二水相，所述第二水相为水。
10.一种微流道芯片，其特征在于，包括液滴收集芯片和权利要求1至4任意一项所述的微流道装置；
所述微流道装置的出口与所述液滴收集芯片连通。
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