CN110982882B - 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用 - Google Patents

用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110982882B
CN110982882B CN201911328152.3A CN201911328152A CN110982882B CN 110982882 B CN110982882 B CN 110982882B CN 201911328152 A CN201911328152 A CN 201911328152A CN 110982882 B CN110982882 B CN 110982882B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
nucleic acid
acid amplification
outlet
inlet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911328152.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110982882A (zh
Inventor
秦玉岭
吴丽
冀海伟
周晓波
刘金霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nantong University
Original Assignee
Nantong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nantong University filed Critical Nantong University
Priority to CN201911328152.3A priority Critical patent/CN110982882B/zh
Publication of CN110982882A publication Critical patent/CN110982882A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110982882B publication Critical patent/CN110982882B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于单细胞固定‑隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用，包括进样口、细胞阵列室和出样口，所述细胞阵列室包括若干个细胞阵列室单元，所述细胞阵列室单元包括单元进口、单元出口、核酸扩增反应室和导流管道，所述核酸扩增反应室的入口为细胞固定卡口；所述导流管道的两端分别连通细胞固定卡口与单元进口之间的通道，以及核酸扩增反应室出口与单元出口之间的通道。本发明能实现细胞的快速固定。待细胞固定后，通过油水不互溶形成油包水隔离单元，每个单元只含有一个细胞和用于细胞裂解和核酸扩增的试剂，从而实现单细胞的基因等信息的分析。可以解决现有技术中无法做到的集单细胞固定和原位分析于一体的问题。

Description

用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其 应用
技术领域
本发明属于临床医学单细胞分析芯片领域，具体涉及一种用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用。
背景技术
细胞异质性在细胞分化，疾病发生、发展，以及治疗后的缓解和复发都扮演着十分重要的角色。研究单细胞水平的基因(DNA和RNA)表达能提供细胞之间的个体差异，对研究疾病的生理和病理学有重要意义。
宏观的用于定量评估基因表达的方法不适用于处理非常小的体积的研究，并且在应用于单细胞分析时受到其敏感性和准确性的限制。为了应对这些挑战，已开发出了各种微流体平台来使用数字聚合酶链反应(digital polmerase chain reaction，dPCR)测量单个细胞中的基因表达。
高通量平台提供了一种方法来同时平行研究一组细胞中多个基因的表达水平。然而，在处理单细胞方案的技术中变异性方面仍然存在挑战，在这种情况下，细胞裂解、转录、扩增、PCR和其他步骤可能会带来不确定性。
传统的dPCR实验是预先将要实验的细胞裂解，使其释放出目标DNA或RNA等遗传物质，再经过纯化富集，最后转移到微流控高通量分析平台进行核酸扩增反应。然而该技术仅能实现目标基因的检测，不能追溯细胞源头。同时，在样品的处理过程中由于涉及多步操作，极容易引入污染。
实现单细胞的原位裂解，遗传物质扩增可以缩减步骤，减少污染可能性。同时，由于细胞之间已经预先隔离，可以根据遗传信息追溯细胞源头，进行其它相关分析，比如蛋白等物质的分析。
迄今为止，用于单细胞核酸扩增的微流控芯片鲜有报道，主要难点就是难以原位的实现单个细胞固定，并直接隔离进行核酸扩增实验。
发明内容
本发明提供用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用，能实现细胞的快速固定。待细胞固定后，通过油水不互溶形成油包水隔离单元，每个单元只含有一个细胞和用于细胞裂解和核酸扩增的试剂，从而实现单细胞的基因等信息的分析。可以解决现有技术中无法做到的集单细胞固定和原位分析于一体的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片，包括进样口、细胞阵列室和出样口，所述细胞阵列室包括若干个细胞阵列室单元，所述细胞阵列室单元包括单元进口、单元出口、核酸扩增反应室和导流管道，所述核酸扩增反应室的入口为细胞固定卡口；所述导流管道的两端分别连通细胞固定卡口与单元进口之间的通道，以及核酸扩增反应室出口与单元出口之间的通道。
优选的，所述细胞固定卡口的宽度在5-10微米。
优选的，所述导流管道的宽度为20微米。
上述的微流控芯片的应用，包括如下步骤：
步骤1：对微流控芯片内所有液体接触到的表面做亲水处理；
步骤2：将不含有细胞的溶液加入进样口，同时从出样口连接注射泵，打开注射泵使其匀速从出样口抽出溶液；
步骤3：在进样口滴入含有细胞的溶液；
步骤4：在进样口滴入密封油，继续保持注射泵工作，利用油将微阵列单元分隔开；
步骤5：移动微流控芯片到加热设备进行核酸扩增实验。
优选的，步骤2中，从出样口匀速抽出溶液的速度为2-5微升每分钟。
有益效果：(1)相对于传统的单细胞孔板分析手段，本发明的芯片只需要2纳升即可分析一个细胞样本。极大的减少了试剂消耗成本。
(2)从细胞实验开始，所有的操作都是在芯片内进行，降低杂质污染风险。
(3)可平行进行多样本高通量分析，极大的缩短了分析时间成本。每个阵列单元只有一个细胞固定卡口，因此，单元内只有一个细胞。可以完美实现对单个细胞的分析。同时可以到追溯基因等物质的源头，进行后续的蛋白等其它物质的定向分析。
(4)可以根据实际样品中细胞的大小来设计修改阵列尺寸，使其具有广谱适用性。
(5)芯片装置体积小，便于存储和携带。芯片具有可视化特点，可以根据荧光信号直接得出分析结果。
(6)芯片的使用具有普适性，方便和PCR反应设备以及荧光检测设备等配合使用。
(7)本发明的芯片既可以分析少量细胞，也可以进行大量细胞实验。弥补了流式设备必须要大量细胞才能检测的缺陷。同时，对比微乳液法，该芯片结构稳定，不会出现隔离区间的混合，避免单细胞之间信号污染。
附图说明
图1为芯片结构总览图；
图2为芯片阵列结构单元图；
图3为软件模拟阵列单元内细胞粒子的运动行为；
图4为软件模拟导流管道为35微米宽时阵列单元内细胞粒子的运动行为。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
本发明提供的微流控芯片包括：进样口、细胞阵列室和出样口。进样口和出样口主要进行液体样品(包括细胞清洗液和反应试剂)流入和流出。每一个细胞阵列室单元也有一个出口和一个入口。细胞阵列室单元由细胞固定卡口、反应室和导流管道组成。每一个微阵列单元用于细胞的固定和原位的核酸扩增，卡口用于细胞的固定，反应室用于核酸扩增反应，导流管道用于水相和油相的流通，最后油会将含水相的微反应室隔离开。
所述微流控芯片的应用方法包括如下步骤：
步骤1：首先对芯片内所有液体接触到的表面做亲水处理：玻璃和塑料材质的芯片可以考虑用亲水性修饰液体处理；聚二甲基硅氧烷材质的芯片可以用等离子清洗仪处理密封后加入F127溶液低温(4摄氏度)保存。
步骤2：将不含有细胞的溶液加入进样口，同时从出样口连接注射泵，打开注射泵使其匀速(2-5微升每分钟)从出样口抽出溶液。该步骤操作是为了将步骤1中维持芯片内表面亲水性液体排出。保持5分钟。
步骤3：待步骤2的溶液将步骤1中的液体全部冲出，此时芯片内只有步骤2的溶液。在进样口滴入含有细胞的溶液。
步骤4：待细胞捕捉结束后，在进样口滴入密封油，继续保持注射泵工作10分钟，油相会将管道内水相全部排出，从而实现将微阵列单元分隔开；
步骤5：移动芯片到加热设备进行核酸扩增实验。
为了确保该设计芯片使用可行，首先用流体模拟软件对芯片单元内的流体力学行为进行分析。设计不同的管径的导流渠道后，可以方便控制粒子和流体在芯片单元内的行为，对单个粒子进行导流、固定。结果表明，设计的芯片可以非常好的实现单细胞的抓捕和固定。模拟油相进入芯片可以非常完美的把单元阵列进行隔离，避免了反应之间的污染接触。用15微米聚苯乙烯微球模拟细胞进样，可以完美的实现对单个微球粒子的固定。
如图1所示，芯片出样口连接注射泵，提供液体在芯片内流动的动力。中间深色区域为单细胞阵列区，细胞的固定、隔离和核酸扩增在本区域发生。
如图2所示芯片阵列结构单元图，(1)液体样品从右侧进入阵列结构单元，从左侧流出。(2)细胞卡口为特殊设计，比细胞尺寸略窄，宽度在5-10微米，主要来固定10-18微米的人体细胞或细菌等。(3)核酸扩增反应室主要填充细胞裂液和核酸扩增试剂，待细胞在卡口处固定、单元阵列被油分割开后。运行PCR升温程序，细胞破裂，释放出DNA、RNA和蛋白质等物质。细胞裂解成分进入反应室开始扩增。(4)导流管的作用主要是在流体往反应室方向运动阻力较大时，将流体从该管道引流：当细胞在卡口处固定后，多余的细胞、溶液可以直接流经导流管道运动，最终由单元出样口流出，进入下一个单元；细胞在卡口处固定后，从进样口流入的密封油也会直接从导流管道流过，经出样口流出，不会进入反应室。
如图3所示软件模拟阵列单元内细胞粒子的运动行为。导流管道为20微米宽，在该条件下，流体在流经第一个T字口时更容易继续沿着朝向反应室的方向流动。惯性力的作用下，细胞必然会沿着该路径流动，最终被卡口固定。A)-D)为细胞粒子随时间变化的移动轨迹。
如图4所示软件模拟导流管道为35微米宽时阵列单元内细胞粒子的运动行为。在该条件下，流体在T字口分裂后，在导流管道方向的速率高于主管道朝向反应室的区域。表明细胞溶液受朝向导流管的惯性力更大，会沿着导流管道运动，而不会朝向反应室方向移动。A)-D)为细胞粒子随时间变化的移动轨迹。细胞粒子由于受朝向导流管道的惯性力更大，因此在运动到T字口时，运动轨迹发生改变，最终流入导流管。对比图3结果，适当的收窄导流管道可以控制细胞在经过T字口后的运动轨迹，但是，导流管道也不可以过窄。假如其小于细胞尺寸，会导致细胞在该处大量堆积，堵塞管道。再者，导流管道如果太窄，当卡口处固定细胞后会导致管道内压力陡增。当压力过大时，由于细胞并非刚性颗粒，它会被压力推动，最终克服卡口的束缚进入反应室，并被后面的流体推动出出样口，导致细胞固定失败。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片，包括进样口、细胞阵列室和出样口，所述细胞阵列室包括若干个细胞阵列室单元，其特征在于，所述细胞阵列室单元包括单元进口、单元出口、核酸扩增反应室和导流管道，所述核酸扩增反应室的入口为细胞固定卡口；所述导流管道的两端分别连通细胞固定卡口与单元进口之间的通道，以及核酸扩增反应室出口与单元出口之间的通道；
所述细胞固定卡口的宽度在5-10微米；所述导流管道的宽度为20微米。
2.权利要求1所述的微流控芯片的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：对微流控芯片内所有液体接触到的表面做亲水处理；
步骤2：将不含有细胞的溶液加入进样口，同时从出样口连接注射泵，打开注射泵使其匀速从出样口抽出溶液；
步骤3：在进样口滴入含有细胞的溶液；
步骤4：在进样口滴入密封油，继续保持注射泵工作，利用油将微阵列单元分隔开；
步骤5：移动微流控芯片到加热设备进行核酸扩增实验。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2中，从出样口匀速抽出溶液的速度为2-5微升每分钟。
CN201911328152.3A 2019-12-20 2019-12-20 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用 Active CN110982882B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328152.3A CN110982882B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328152.3A CN110982882B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110982882A CN110982882A (zh) 2020-04-10
CN110982882B true CN110982882B (zh) 2023-06-20

Family

ID=70074485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911328152.3A Active CN110982882B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110982882B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102580794A (zh) * 2011-01-13 2012-07-18 博奥生物有限公司 可定位细胞及生物体的微流控芯片及其应用
CN103018224A (zh) * 2012-12-14 2013-04-03 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法
CN104073428A (zh) * 2014-07-09 2014-10-01 北京大学 一种细胞分离微结构系统
CN106568982A (zh) * 2016-10-31 2017-04-19 浙江大学 一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法
WO2019085388A1 (zh) * 2017-11-01 2019-05-09 深圳市瑞格生物科技有限公司 一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用
CN110339876A (zh) * 2019-06-27 2019-10-18 昆明理工大学 一种基于液滴寄存的肿瘤细胞筛查微流控装置及筛查方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9902990B2 (en) * 2011-05-27 2018-02-27 The University Of British Columbia Microfluidic cell trap and assay apparatus for high-throughput analysis
WO2016059302A1 (fr) * 2014-10-17 2016-04-21 Ecole Polytechnique Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102580794A (zh) * 2011-01-13 2012-07-18 博奥生物有限公司 可定位细胞及生物体的微流控芯片及其应用
CN103018224A (zh) * 2012-12-14 2013-04-03 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法
CN104073428A (zh) * 2014-07-09 2014-10-01 北京大学 一种细胞分离微结构系统
CN106568982A (zh) * 2016-10-31 2017-04-19 浙江大学 一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法
WO2019085388A1 (zh) * 2017-11-01 2019-05-09 深圳市瑞格生物科技有限公司 一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用
CN110339876A (zh) * 2019-06-27 2019-10-18 昆明理工大学 一种基于液滴寄存的肿瘤细胞筛查微流控装置及筛查方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110982882A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230109667A2 (en) PCR-Activated Sorting (PAS)
US10427160B2 (en) Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
US10239057B2 (en) Microfluidic devices and methods for cell analysis and molecular diagnostics
US9849456B2 (en) Microfluidic device
US10717086B2 (en) Integrated system for isolation and emulsification of particles and cells
CN100503838C (zh) 用于分析核酸的微流系统
US9243288B2 (en) Cartridge with lysis chamber and droplet generator
EP2440941B1 (en) Sheath flow devices and methods
WO2018031691A1 (en) Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
US20140248621A1 (en) Microfluidic devices and methods for cell sorting, cell culture and cells based diagnostics and therapeutics
US20140208832A1 (en) Methods and Apparatus for Flow-Controlled Wetting
EP3253910A1 (en) Multiple-emulsion nucleic acid amplification
US20140179909A1 (en) Microfluidic device for nucleic acid extraction and fractionation
CN103732731A (zh) 用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备
US11701656B2 (en) Multi-droplet capture
US10722879B2 (en) Magnetic separation
EP3525933B1 (en) Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
US20220297128A1 (en) Single cell whole genome amplification via micropillar arrays under flow conditions
US11478795B2 (en) Microfluidic device and method for analyzing nucleic acids
CN108315389A (zh) 一种微体积细胞核酸扩增方法
JP6931540B2 (ja) 検体処理チップを用いた送液方法、検体処理チップの送液装置
WO2021103970A1 (zh) 一种微流控芯片的使用方法及其装置
TW201248148A (en) Microfluidic bio-chip and automatic reaction detection system thereof
CN110982882B (zh) 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用
CN112574853B (zh) 用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant