CN105080627A - 一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法 - Google Patents

Abstract

一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，由PDMS流体通道层与玻璃层构成，所述PDMS流体通道层与玻璃层通过氧等离子键合构成不可逆结构的流体通道单元；该流体通道单元包括浓度梯度生成结构区、阵列式细胞培养区及缓冲结构区。本发明将药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、药物对细胞刺激、结果生成与检测集成在一张芯片上，并通过缓冲结构区的启闭来实现浓度梯度生成结构区和阵列式细胞培养区的独立工作与整体运行，灵活实现各功能的切换。本发明还提供所述集成化微流控芯片的应用方法，该方法简化了细胞接种、受激、洗涤和染色等操作过程，一次运行即可获得多个实验相关参数，为药物筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

Description

一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法。

背景技术

药物筛选是新药研究的最初过程和关键步骤，目的是发现新药，然而很长时间以来，成本过高、周期过长、过程复杂、通量不足、成功率低下等缺点一直制约着现代药物的筛选和开发。现阶段以96孔板为基础的高通量筛选由于其快速、高效等特点，适合药物初步筛选，被国际大多数药物研究机构广泛采用，并得到快速的发展，已成为药物筛选的主要技术手段之一。然而这种基于常规孔板的药物筛选方式存在一些局限，如试剂消耗大、操作繁琐、检测和分析灵敏度低等，这在很大程度上限制了其普及与应用。因此，药物筛选技术的微型化、自动化和低成本化是未来发展的必然趋势。

在20世纪90年代，瑞士的Manz和Widmer等首次提出了微流控芯片技术（Microfluidics），该技术通过在大小仅为几平方厘米的芯片上集成各种具有功能单元的微通道，构成网络和阵列，并通过操纵流体在通道中的行为以实现各种常规化学和生物实验室中需要的甚至难以完成的功能。由于具有快速检测分析、试剂消耗量少、灵活可控、信息量大、高通量等诸多优点，如今这种技术已经广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域，成为21世纪最为热门的前沿技术之一。新药研发是微流控芯片最重要的应用领域之一，微流控芯片的基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成，利用微系统内流体独有的尺度效应，成十倍、百倍地提高样品处理和反应效率，大幅降低样品和试剂消耗，利用芯片快速和多通道的特点可显著提高分析和筛选通量。由于诸多优点，该技术可以克服传统药物筛选的限制，显著缩短整个药物筛选周期，微流控芯片技术的出现，给药物筛选领域带来了新的生机。

微流控芯片在细胞水平药物筛选方面有许多独特的优势，例如微流控芯片操作所需的细胞量很少，适合来源稀缺但又十分重要的细胞研究；芯片的多维网络结构形成相对独立、封闭的环境与体内环境类似，可以精确控制温度、成分等因素，从而高度模拟体内细胞外基质；且由于微通道中的高表面积体积比，使得更多的界面可以用来进行物质和能量交换，传送效率提高，细胞代谢加快，且可以将药物的合成分离富集、细胞培养、药物刺激、药效实时检测等多步工序集成在单片的微系统中。

目前，将微流控芯片技术用于细胞研究和药物筛选等方面已有不少报道，如Ye等人在文献（NannanYe,JianhuaQin,WeiweiShi,XinLiu,BingchenLin,Cell-basedhighcontentscreeningusinganintegratedmicfluidicdevice,LabChip,2007,7(12),1696-1704）中构建了一种集成化细胞水平的药物筛选微流控芯片，该芯片集浓度梯度稀释和加样、细胞培养、细胞刺激和细胞标记等单元操作于一体，实现了肝癌细胞多种参数测量的高内涵筛选；Wu等在文献（WuJ,WheeldonI,GuoY,etal.Asandwichedmicroarrayplatformforbenchtopcell-basedhighthroughputscreening[J].Biomaterials,2011,32(3):841-848.）中设计了一种具有“三明治”夹层结构的、细胞水平的阵列式高通量筛选芯片，通过荧光检测药物与乳腺癌细胞（MCF-7）的相互作用，筛选出潜在的抗肿瘤药物，实验采用9-羟基喜树碱进行实验，证明其有效可行，该方法为药物活性成分的筛选提供了一种快速、低成本的途径。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法，该芯片含有浓度梯度生成结构区和阵列式细胞培养区，一次运行即可获得多个实验相关参数，为药物筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，由上层的PDMS流体通道层与下层的适合细胞贴壁生长的玻璃层构成；所述PDMS流体通道层与玻璃层通过氧等离子键合构成不可逆结构的流体通道单元。

所述流体通道单元包括：位于芯片上游的浓度梯度生成结构区与位于芯片下游的阵列式细胞培养区；所述浓度梯度生成结构区与阵列式细胞培养区之间设有缓冲结构区，所述浓度梯度生成结构区、阵列式细胞培养区、与缓冲结构区通过微通道相互连通。

所述阵列式细胞培养区由若干列细胞培养单元相互并联组成，所述细胞培养单元由若干个细胞培养腔通过微通道相互串联组成一列，每两列细胞培养单元的出口由微通道逐级互相连接，最终连接成一个出口通道，该出口通道末端作为细胞注入口。

所述浓度梯度生成结构区最上端设有若干个进样孔，所述浓度梯度生成结构区由多级相互连通的分支通道组组成，所述分支通道组由若干个分支通道相互连通组成，所述分支通道组的分支通道数量从进样孔向缓冲结构区逐层依次增加，至数量与细胞培养单元的列数相同；所述进样孔的数目大于1个小于细胞培养单元的列数。

所述缓冲结构区由若干列缓冲单元组成，所述缓冲单元的列数与细胞培养单元的列数相同。

所述浓度梯度生成结构区最下层分支通道的每一个出口，都通过所述缓冲结构区的一列缓冲单元与阵列式细胞培养区的一列细胞培养单元入口相连接。

所述阵列式细胞培养区由四列或四列以上的细胞培养单元相互并联组成，所述细胞培养单元由三个或三个以上的细胞培养腔相互串联组成一列，所述每列细胞培养单元中包含的细胞培养腔的数量相同。

所述进样孔为两个，分别为药物入口和培养基入口。

所述相邻的分支通道组连通形成的横向直型通道宽度为为200-400μm，弯曲的分支通道宽度为100-300μm。

所述细胞培养腔截面为圆形或椭圆形，尺寸为（0.8-1.2）×（0.8-1.2）mm。

所述微通道宽度为200-500μm。

所述缓冲单元的弯曲流道宽度为100-300μm。

所述芯片的浓度梯度生成结构区、阵列式细胞培养区、缓冲结构区通道高度相同，为80-200μm。

本发明还提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片的应用方法，具体步骤如下。

步骤1、使用微流体驱动装置，将细胞悬液通过阵列式细胞培养区的细胞注入口注入芯片，待细胞均匀注满各细胞培养腔后，移走微流体驱动装置，使芯片中溶液处于静置状态，并将芯片置于细胞培养箱中放置培养。

步骤2、培养3-3.5h后细胞贴壁，用微流体驱动装置经由细胞注入口，以0.1-0.4μL·min^-1的速度实时通入培养液，并将芯片置于细胞培养箱中进行实时培养。

步骤3、培养12-72h后停止实时培养，用软胶带贴住缓冲结构区的各出液口，在浓度梯度生成结构区的进样孔处，分别作为药物入口和培养基入口，分别加入所需浓度的待测药物溶液和空白培养液，并使用微流体驱动装置同步施加驱动力，使得药物实施注入的速度为0.1-1μL·min^-1，使溶液始终保持从上游的浓度梯度生成结构区流向下游的阵列式细胞培养区，芯片置于细胞培养箱中。

步骤4、12-72小时后停止注入所述待测药物溶液和空白培养液，揭下缓冲结构区的各出液口的软胶带，从细胞注入口处加入洗涤溶液，使用微流体驱动装置施加驱动力，以0.2μL·min^-1对细胞进行洗涤。

步骤5、在所述细胞注入口处加入染色溶液，施加使用微流体驱动装置施加驱动力，以0.2μL·min^-1对细胞进行染色。

步骤6、将芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡坏死检测。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明提供的用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法，将药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、药物对细胞刺激、结果生成与检测集成在一张芯片上，并通过缓冲结构区的启闭来实现两个结构单元（即浓度梯度生成结构区和阵列式细胞培养区）的独立工作与整体运行，灵活实现各功能的切换，避免不同结构间的互相干扰。采用本发明集成化微流控芯片研究临床药物诱导肿瘤细胞凋亡坏死作用，与传统的孔板技术相比，省去了配制不同浓度药物溶液的繁冗操作，大大简化了细胞接种、受激、洗涤和染色等操作过程，显著降低细胞数量和试剂耗量，并可一次运行获得多个实验相关参数，为药物筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

附图说明

图1为本发明用于药物筛选的集成化微流控芯片的总体结构示意图。

图2为本发明用于药物筛选的集成化微流控芯片的结构分解示意图。

图3为明场下肝肿瘤HepG2细胞的生长状态图。

图4为LIVE/DEAD染色后荧光显微镜下的培养24h肝肿瘤HepG2细胞形态图。

图5为LIVE/DEAD染色后荧光显微镜下的培养48h肝肿瘤HepG2细胞形态图。

图6为LIVE/DEAD染色后荧光显微镜下的培养72h肝肿瘤HepG2细胞形态图。

图7为不同浓度槲皮素作用下Hoechst33342染色后荧光显微镜下的肝肿瘤HepG2细胞凋亡形态图。

图8为不同浓度槲皮素作用下PI染色后荧光显微镜下的肝肿瘤HepG2细胞凋亡形态图。

图9为各浓度槲皮素对肝肿瘤HepG2细胞的凋亡坏死影响折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。

请参阅图1、图2，本实施例提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，由上层的PDMS流体通道层1与下层的适合细胞贴壁生长的玻璃层2构成；所述PDMS流体通道层1与玻璃层2通过氧等离子键合构成不可逆结构的流体通道单元。

所述流体通道单元包括：位于芯片上游的浓度梯度生成结构区3与位于芯片下游的阵列式细胞培养区4；所述浓度梯度生成结构区3与阵列式细胞培养区4之间设有缓冲结构区5，所述缓冲结构区5由八列缓冲单元6组成。所述浓度梯度生成结构区3、阵列式细胞培养区4、与缓冲结构区5通过微通道9相互连通。

所述阵列式细胞培养区4由八列细胞培养单元7并联组成，所述并联的八列细胞培养单元7通过微通道9相互连通，所述每列细胞培养单元7均由五个细胞培养腔8通过微通道9相互串联组成一列，每两列细胞培养单元7的出口由微通道9逐级互相连接，最终连接成一个出口通道10，该出口通道10末端作为细胞注入口11。

所述浓度梯度生成结构区3最上端设有两个进样孔12，分别作为药物入口13与培养基入口14。所述浓度梯度生成结构区3为“圣诞树”形，由多级相互连通的分支通道组15组成，所述分支通道组15由若干个分支通道16相互连通组成，所述分支通道组15的分支通道16数量从进样孔12向缓冲结构区5逐层依次增加至八列；所述分支通道组15每增加一层，分支通道16的数量增加一个。

所述相邻的分支通道组15连通形成的横向直型通道宽度为300μm；所述分支通道16为迂回的弧形，分支通道16的宽度为200μm。

所述浓度梯度生成结构区3最下层分支通道的每一个出口，都通过所述缓冲结构区5的一列缓冲单元6与阵列式细胞培养区4的一列细胞培养单元7入口相连通。

所述缓冲单元6设有两个出液口17及一段“S”形弯曲流道18，用于废液排出及阻挡细胞悬液流入浓度梯度生成结构区3，避免相互干扰；同时，通过缓冲结构区5中各出液口17的启闭，可控制浓度梯度生成结构区3与阵列式细胞培养区4的独立运行与整体衔接，实现各功能的灵活切换。

所述阵列式细胞培养区4的细胞培养腔8截面为椭圆形，尺寸为1×1.2mm。

所述微通道9宽度为300μm，所述缓冲单元6的弯曲流道18宽度为200μm。

所述芯片的浓度梯度生成结构区3、阵列式细胞培养区4、缓冲结构区5通道高度相同，为90μm。

本实施例还提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片的应用方法，包括如下步骤。

步骤1、使用精密注射泵将细胞悬液通过阵列式细胞培养区4的细胞注入口11注入芯片，使用精密注射泵施加驱动力，使得细胞注入速度为0.2μL·min^-1。待细胞均匀注满各细胞培养腔8后，移走精密注射泵，使芯片中溶液处于静置状态，并将芯片置于细胞培养箱中放置培养。

步骤2、培养3h后细胞贴壁，用精密注射泵经由细胞注入口11，以0.2μL·min^-1的速度实时通入培养液，并将芯片置于细胞培养箱中进行实时培养。

步骤3、培养48h后停止实时培养，用软胶带贴住缓冲结构区5的各出液口17，在浓度梯度生成结构区3的药物入口13和培养基入口14处，分别加入1mg/mL槲皮素待测药液及含10%灭活小牛血清的DMEM培养液，使用精密注射泵同步施加驱动力，使得溶液注入速度为0.2μL·min^-1，并始终保持从上游的浓度梯度生成结构区3流向下游的阵列式细胞培养区4，芯片置于细胞培养箱中。

步骤4、48h后停止注入所述待测药物溶液和空白培养液，揭下缓冲结构区5的各出液口17的软胶带，从细胞注入口11处加入磷酸盐缓冲液，使用精密注射泵施加驱动力，以0.2μL·min^-1对细胞进行洗涤。

步骤5、在所述细胞注入口11处加入LIVE/DEAD染液，使用精密注射泵施加驱动力，以0.2μL·min^-1对细胞进行染色。

步骤6、将芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡坏死检测。

为进一步验证本发明的有益效果，本发明提供以下试验案例。

1、芯片细胞培养。

（1）芯片预处理：将芯片先用无菌水润洗，之后通入75%乙醇清洗3遍，每遍5min，然后用无菌水冲洗数遍，烘干，紫外照射20min灭菌，之后通入0.1mg·mL^-1的多聚L-赖氨酸（PLL），于37℃下孵育1h，以对芯片的细胞培养腔8进行包被处理，提高细胞的贴壁率，最后用无菌水将剩余PLL冲掉，烘干备用。

（2）芯片细胞培养：将对数生长期的人肝癌HepG2细胞用含10%灭活小牛血清的DMEM培养液配制成密度为5×10⁵个/cm²的悬液，利用精密注射泵将细胞通过细胞注入口11注入芯片中，之后将芯片放入细胞培养箱中静置，约3-3.5h细胞贴壁后，使用精密注射泵以0.2μL·min^-1的流速从细胞注入口11实时通入培养液，进行灌流培养，明场下观察细胞的生长状态，如图3所示，其中，左图为显微镜下放大40倍细胞照片，右图为显微镜下放大100倍细胞照片。通过图3可以观察到细胞粘附在基底并能完全伸展开，生长状态良好，形态并未发生明显变化。

（3）芯片细胞活力检测：细胞在本实施例微流控芯片中分别培养24h、48h、72h后，停止实时通入培养液，用精密注射泵从细胞注入口11处通入磷酸盐缓冲液（PBS），对细胞进行清洗后，将配制好的LIVE/DEAD染液混匀后通入芯片，避光染色30min，然后继续用PBS清洗细胞3次，使用倒置荧光显微镜进行拍照，并结合图像分析软件IPP检测细胞的存活率，如图4-6所示，结果显示芯片中培养的细胞活力良好，细胞存活率能达到97%以上。

2、芯片细胞凋亡坏死研究。

将肝癌HepG2细胞密度调整为5×10⁵个/cm²，利用精密注射泵注入经过消毒处理的芯片中，待细胞贴壁且进入对数生长期时，将芯片缓冲结构区5的各出液口17用软胶带封住，之后将配制好的1mg/mL槲皮素待测药液及含10%灭活小牛血清的DMEM培养液分别从浓度梯度生成结构区3的药物入口13和培养基入口14注入芯片，用精密注射泵以0.4μL·min^-1的速度实时灌注刺激，当药物分别作用HepG2细胞24h、48h、72h后，打开芯片缓冲结构区5的各出液口17的软胶带，吸取一定量的PBS缓慢匀速的注入到芯片细胞培养腔8，对细胞清洗3遍后，向芯片中通入凋亡坏死试剂盒中现配的Hoechst33342和PI染液（V/V=1:1）对细胞进行双染，4℃避光孵育12min，然后用PBS清洗剩余的染料，最后使用Olympus荧光显微镜CellSens成像软件对芯片进行拍照，并结合IPP软件计算出待测药物对HepG2细胞的凋亡坏死率。

实验利用浓度梯度生成结构区3可实现药物浓度自动分配的优势，可自动生成0、0.14、0.29、0.43、0.57、0.71、0.86和1mg·mL^-1八种待测药物浓度，分别对细胞进行刺激。由于实验样本量较大，导致采集到的荧光图数量也比较多，故选取了第3、5、7列腔道（即待测药物浓度分别为0.29、0.57、0.86mg·mL^-1）中的各1个细胞培养腔，作为整个双染结果的代表，Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双染结果如图7、图8所示。

由图7可知，随着药物浓度的增加，呈现亮荧光的细胞个数随之增多，即发生凋亡的细胞数增加；由图8可知，随着药物浓度的增加，呈现亮荧光的细胞个数也随之增多，即发生坏死的细胞数也开始增加。通过IPP软件对所得荧光图像做进一步分析，计算出各实验组HepG2细胞的凋亡坏死率，绘并制了槲皮素各浓度给药组对HepG2细胞影响的曲线，如图9所示。由图9可知，各浓度槲皮素的凋亡坏死率与空白对照组相比均有显著性差异，说明槲皮素各浓度给药组对人肝癌细胞HepG2均有一定的促凋亡作用，且随着给药浓度的增加及作用时间的延长，抑制作用增强，呈现出一定的浓度-效应及时间-效应关系。

Claims (10)

1.一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，由上层的PDMS流体通道层（1）与下层的玻璃层（2）构成；所述PDMS流体通道层（1）与玻璃层（2）通过氧等离子键合构成不可逆结构的流体通道单元；

所述流体通道单元包括：位于芯片上游的浓度梯度生成结构区（3）与位于芯片下游的阵列式细胞培养区（4）；所述浓度梯度生成结构区（3）与阵列式细胞培养区（4）之间设有缓冲结构区（5），所述浓度梯度生成结构区（3）、阵列式细胞培养区（4）、与缓冲结构区（5）通过微通道（9）相互连通；

所述阵列式细胞培养区（4）由若干列细胞培养单元（7）并联组成，所述细胞培养单元（7）由若干个细胞培养腔（8）相互串联组成一列，每两列细胞培养单元（7）的出口由微通道（9）逐级互相连接，最终连接成一个出口通道（10），该出口通道（10）末端作为细胞注入口（11）；

所述浓度结构区（3）最上端设有若干个进样孔（12），所述浓度梯度生成结构区（3）由多级分支通道组（15）组成，所述分支通道组（15）的分支通道（16）数量从进样孔（12）向缓冲结构区（5）逐层依次增加，至数量与细胞培养单元（7）的列数相同；

所述缓冲结构区（5）由若干列缓冲单元（6）组成，所述缓冲单元（6）的列数与细胞培养单元（7）的列数相同；

所述浓度梯度生成结构区（3）最下层分支通道（16）的每一个出口，都通过所述缓冲结构区（5）的一列缓冲单元（6）与阵列式细胞培养区（4）的一列细胞培养单元（7）入口相连接。

2.如权利要求1所述的缓冲单元，其特征在于，所述缓冲单元（6）设有两个出液口（17）及一段“S”形弯曲流道（18）。

3.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述阵列式细胞培养区（4）由四列或四列以上偶数列的细胞培养单元（7）相互并联组成，所述细胞培养单元（7）由三个或三个以上的细胞培养腔（8）相互串联组成一列；所述每列细胞培养单元（7）中包含的细胞培养腔（8）的数量大约相同。

4.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述进样孔（12）的数目大于1个，小于细胞培养单元（7）的列数。

5.如权利要求4所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述进样孔（12）为两个，分别作为药物入口（13）与培养基入口（14）。

6.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述相邻的分支通道组（15）连通形成的横向直型通道宽度为为200-400，弯曲的分支通道（16）宽度为100-300。

7.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养腔（8）截面为圆形或椭圆形，尺寸为（0.8-1.2）×（0.8-1.2），所述微通道（9）宽度为200-500。

8.如权利要求2所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述缓冲单元（6）的弯曲流道（18）宽度为100-300。

9.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述芯片的浓度梯度生成结构区（3）、阵列式细胞培养区（4）、缓冲结构区（5）通道高度相同，为80-200μm。

10.如权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片的应用方法，包括如下步骤：

步骤1、使用微流体驱动装置，将细胞悬液通过阵列式细胞培养区（4）的细胞注入口（11）注入芯片，待细胞均匀注满各细胞培养腔（8）后，移走微流体驱动装置，使芯片中溶液处于静置状态，并将芯片置于细胞培养箱中放置培养；

步骤2、培养3-3.5h后细胞贴壁，用微流体驱动装置经由细胞注入口（11），以0.1-0.4μL·min^-1的速度实时通入培养液，并将芯片置于细胞培养箱中进行实时培养；

步骤3、培养12-72h后停止实时培养，用软胶带贴住缓冲结构区（5）的各出液口（17），在浓度梯度生成结构区（3）的不同进样孔（药物入口（13）和培养基入口（14））处，分别加入所需浓度的待测药物溶液和空白培养液，并同步施加驱动力，使溶液始终保持从上游的浓度梯度生成结构区（3）流向下游的阵列式细胞培养区（4），芯片置于细胞培养箱中；

步骤4、12-72小时后停止注入所述待测药物溶液和空白培养液，揭下缓冲结构区（5）的各出液口（17）的软胶带，从细胞注入口（11）处加入洗涤溶液，施加驱动力，对细胞进行洗涤；

步骤5、在所述细胞注入口（11）处加入染色溶液，施加驱动力，对细胞进行染色；

步骤6、将芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡坏死检测。