CN105707010A - 基于微阀的双检测微流控芯片及糖尿病模型构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于微阀的双检测微流控芯片及糖尿病模型构建方法。该芯片由三层PDMS组成，上层为液路层，下层为气路控制层，上下两层中间为PDMS膜，膜在气压作用下发生形变以实现线虫固定。基于微阀的双检测微流控芯片的糖尿病模型构建方法,将单个线虫加入虫及药品入口处，将单个虫引入线虫固定及培养室；荧光成像时利用气压使PDMS膜形变，将虫体压在进样通道侧壁上使其固定并成像；每天进行三次物质交换，为添加新鲜食物并施加葡萄糖或者药物刺激，排出线虫代谢废物。本发明采用通道设计，操作简单，且易于实现物质交换，有利于线虫的长期培养；线虫固定方法采用膜形变的方式，对虫体安全无害，可对单个线虫进行长期培养及运动、成像双检测。

Description

基于微阀的双检测微流控芯片及糖尿病模型构建方法
技术领域
本发明主要涉及微流控芯片和糖尿病研究，基于微阀的双检测微流控芯片及糖尿病模型构建方法。
背景技术
现有技术中，微流控芯片(microfluidicchip)又称芯片实验室(labonachip)，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。发展至今，微流控芯片技术已经开始在生命科学的不同领域得到应用，并已成为系统生物学研究中的重要技术平台之一。同时，秀丽隐杆线虫以其生命周期和寿命短、全身透明、全基因组测序等特征，成为生物学研究领域中常用的一种重要模式生物。最近，微流控芯片因其与秀丽隐杆线虫尺寸匹配、环境可控、通量高、易于实现自动化、集成化等特征而成为线虫相关研究的重要平台。
糖尿病作为一种危及人类健康的疾病，越来越受到广泛关注，而秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，并且由于胰岛素信号通路基因的保守性，成为了糖尿病研究的热点，但是现有的技术难以实现对单线虫进行相关的糖尿病研究。人们期待一种单个线虫长期培养及观察的简易平台用于研究糖尿病等疾病并对相关的药物进行高通量的筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、通量高的微流控芯片平台并用于构建秀丽隐杆线虫的糖尿病模型，具体说是一种基于微阀的运动成双像检测的用于构建秀丽隐杆线虫的糖尿病模型的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片平台。
本发明基于微阀的双检测微流控芯片，所述芯片由三层组成，上层为用于线虫培养及固定的液路层，中间层为可形变PDMS膜，下层为气路控制层；
所述液路层由20～50个线虫分析功能单元组成，所有功能单元共用一个中心废液池；每个分析功能单元由虫及药品入口、进样通道、线虫固定及培养室、废液通道组成；虫及药品入口通过进样通道与线虫固定及培养室连接，然后通过废液通道连接到与其它分析功能单元共用的中心废液池；
气路控制层的气路通道中设有阀，控制气路通道，气路通道在线虫固定及培养室下方，由气体正压驱动，用于进行线虫固定；
所述液路层为基于SU8模板所得的PDMS模块，气路层是在制作成功的气路SU8模板上甩一层高于模板20μm的PDMS膜，所述液路层的PDMS模板有结构一侧封接到气路层PDMS膜无结构一侧，然后将其有气路阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃或平整的PDMS块上；
该芯片可作为施加高浓度葡萄糖条件诱使线虫产生糖尿病相关特性，并对该条件下的线虫生命状态进行研究。
所述线虫固定及培养室的尺寸为2mm×1mm×80μm。
所述进样通道为楔形通道，最宽处的宽度为250μm，最窄处的宽度为35μm，长度为1.2mm。
所述废液通道与培养室连接处由一系列小通道组成，第一排的通道宽度为25μm，共有三个；第二排的通道宽度为30μm，共有两个；两排分别交错居中分布。
所述阀由气体正压驱动。
所述阀宽度为2.1mm。
所述芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及PDMS模块之间的可逆封接和PDMS与玻璃基底之间的不可逆封接技术构建。
一种基于微阀的双检测微流控芯片的糖尿病模型构建方法，采用上述基于微阀的双检测微流控芯片，按照以下步骤进行：
将单个线虫加入虫及药品入口处，利用负压驱动的方式，将单个虫引入线虫固定及培养室，培养室的尺寸可使其自由游动；
荧光成像时利用气压使PDMS膜形变，将虫体压在进样通道侧壁上使其固定并成像；
每天进行三次物质交换，为添加新鲜食物并施加葡萄糖或者药物刺激，排出线虫代谢废物，方式为负压抽取。
通过对培养室中的线虫进行高浓度葡萄糖刺激，使线虫体内糖浓度达到与人类糖尿病患者相似的糖浓度，并研究在该条件下线虫的寿命和氧化应激变化。
通过对培养室中的线虫进行加药刺激，可以对治疗糖尿病的药物进行高通量筛选。
本发明基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，其阀的操控方法如下：成像时利用正压将阀控制下的PDMS膜压下，使虫体被压在通道侧壁上，实现虫的固定并进行荧光成像，成像后释放线虫，使其恢复自由运动状态。
本发明采用通道设计，操作简单，且易于实现物质交换，有利于线虫的长期培养；线虫固定方法采用膜形变的方式，对虫体安全无害，可对单个线虫进行长期培养及运动、成像双检测。
本发明有以下优点：
(1)采用通道灌流的方式进行食物添加及废液排出，操作简单，效率高，有利于线虫的长期培养。
(2)培养室同样作为线虫固定成像通道，且虫的固定方式对虫体无损伤，方法简单，通量高。
(3)单个培养室中培养单个线虫的设计使得每只虫的寿命、运动行为及荧光特征得到实时及长期追踪，可满足生物研究的需要。
(4)单阀控制，简化芯片结构，并使操作更简单。
附图说明：
图1芯片结构示意图；(a)为液路层结构，(b)为气路层结构，
图2每个分析功能单元放大图，
其中：1为虫及药品入口，2为进样通道，3为线虫固定及培养室，4为线虫分选处，5为废液通道，6为废液池，7为气路控制阀，8为气路通道，9为防塌陷小柱；
图3不同糖浓度对野生型线虫N2寿命的影响图；(a)图为糖对线虫存活率的影响，(b)图为糖对线虫平均寿命的影响；
图4不同糖浓度对突变型虫株CL2166氧化应激表达的影响图。
具体实施方式
实施例1
实验室自行设计并制作的微流控芯片：制备基于微阀的双检测微流控芯片的材料为PDMS聚合物，液路和气路之间的封接采用可逆封接，而气路与玻璃片之间的封接采用等离子体不可逆封接。
该芯片由三层组成，上层为液路层，中间层PDMS膜，下层气路控制层。
其中液路层由30个线虫分析功能单元组成，所有功能单元共用一个中心废液池6；每个分析功能单元由虫及药品入口1、进样通道2、线虫固定及培养室3(尺寸为2mm×1mm×80μm)、废液通道4组成(图2)；虫及药品入口1通过进样通道2与线虫固定及培养室3连接，然后通过废液通道4通向与其它分析功能单元共用的中心废液池6；
气路控制层的气路通道8中设有阀7(宽度为2mm)，控制气路通道8，气路通道8在线虫固定及培养室3下方，由气体正压驱动，用于进行线虫固定。
所述液路层为基于SU8模板所得的PDMS模块，气路层是在制作成功的气路SU8模板上甩一层高于模板20μm的PDMS膜，所述液路层的PDMS模板有结构一侧封接到气路层PDMS膜无结构一侧，然后将其有气路阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃或平整的PDMS块上；
该芯片可作为施加高浓度葡萄糖条件诱使线虫产生糖尿病相关特性，并对该条件下的线虫生命状态进行研究。
所述线虫固定及培养室3的尺寸为2mm×1mm×80μm。
所述进样通道2为楔形通道，最宽处的宽度为250μm，最窄处的宽度为35μm，长度为1.2mm。
所述废液通道5与培养室3连接处由一系列小通道组成，第一排的通道宽度为25μm，共有三个；第二排的通道宽度为30μm，共有两个；两排分别交错居中分布。
所述阀7由气体正压驱动。
所述阀7宽度为2.1mm。
所述芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及PDMS模块之间的可逆封接和PDMS与玻璃基底之间的不可逆封接技术构建。
使用前事先灌好线虫培养液KMedium。秀丽隐杆线虫野生型虫株N2及突变型虫株CL2166琼脂板上培养至大虫后，进行bleach操作将大量卵取出，并使其孵化，长至L4期。将L4期线虫进样到入口，芯片共30个单元，利用负压将虫子进样到培养室中。各个单元相互独立，进样互不干扰，可达到单个培养室都只有单条虫。
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，将线虫野生型N2拟合至幼虫L4期后引入芯片中进行长期培养，施加不同浓度的葡萄糖，对线虫的寿命进行记录，如图3所示，在高糖条件的培养下线虫的寿命缩短5天左右。
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，研究不同糖浓度对线虫氧化应激的表达强度影响：
采用带有氧化应激绿色荧光蛋白(GFP)表达的线虫突变型虫株CL2166进行相关实验，当外界因素致氧化应激产生时，GFP表达增强。在本实验新型中，外界因素为不同浓度的葡萄糖溶液，观察在不同糖浓度下线虫的氧化应激表达情况，如图4所示，在高糖条件下，线虫的GFP荧光强度明显增强，说明高糖会增强氧化应激。
本发明采用了单阀控制，使线虫的操纵更加简单；对进样通道的宽度和长度进行了调整，使线虫在固定成像时不会从入口处进入到培养室外；对阀的宽度进行了调整，避免了由于PDMS形变引起的无法固定线虫的情况；对废液通道与培养室的连接处进行了改进，足以使刚孵化的幼虫从废液通道被抽离培养室，保证了培养室的单线虫培养，无需外界加药；并针对该单线虫的培养平台进行了糖尿病模型的构建；设计简单并且具有实用价值。

Claims (11)

1.一种基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：所述芯片由三层组成，上层为用于线虫培养及固定的液路层，中间层为可形变PDMS膜，下层为气路控制层，
所述液路层由20～50个线虫分析功能单元组成，所有功能单元共用一个中心废液池；每个分析功能单元由虫及药品入口、进样通道、线虫固定及培养室、废液通道组成；虫及药品入口通过进样通道与线虫固定及培养室连接，然后通过废液通道连接到与其它分析功能单元共用的中心废液池；
所述气路控制层的气路通道中设有阀，控制气路通道，气路通道在线虫固定及培养室下方，由气体正压驱动，用于进行线虫固定；
所述液路层为基于SU8模板所得的PDMS模块，气路层是在制作成功的气路SU8模板上甩一层高于模板20μm的PDMS膜，所述液路层的PDMS模板有结构一侧封接到气路层PDMS膜无结构一侧，有气路阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃或平整的PDMS块上；
该芯片可作为施加高浓度葡萄糖条件诱使线虫产生糖尿病相关特性，并对该条件下的线虫生命状态进行研究。
2.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：所述线虫固定及培养室的尺寸为2mm×1mm×80μm。
3.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：进样通道为楔形通道，最宽处的宽度为250μm，最窄处的宽度为35μm，长度为1.2mm。
4.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：废液通道与培养室连接处由一系列小通道组成，第一排的通道宽度为25μm，共有三个；第二排的通道宽度为30μm，共有两个；两排分别交错居中分布。
5.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：所述阀由气体压驱动。
6.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：所述阀宽度为2.1mm。
7.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：在气路层增加了防塌陷小柱结构，防止在封接时导致气路层无法连通。
8.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于：所述芯片的材料均为PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及PDMS模块之间的可逆封接和PDMS与玻璃基底之间的不可逆封接技术构建。
9.按照权利要求1所述的基于微阀的双检测微流控芯片的糖尿病模型构建方法，采用上述基于微阀的双检测微流控芯片，其特征在于按照以下步骤进行：
将单个线虫加入虫及药品入口处，利用负压驱动的方式，将单个虫引入线虫固定及培养室，培养室的尺寸可使其自由游动；
荧光成像时利用气压使PDMS膜形变，将虫体压在进样通道侧壁上使其固定并成像；
每天进行三次物质交换，为添加新鲜食物并施加葡萄糖或者药物刺激，排出线虫代谢废物，方式为负压抽取。
10.按照权利要求9所述的基于微阀的双检测微流控芯片的糖尿病模型构建方法，其特征在于：通过对培养室中的线虫进行高浓度葡萄糖刺激，使线虫体内糖浓度达到与人类糖尿病患者相似的糖浓度，并研究在该条件下线虫的寿命和氧化应激变化；
所述孔板培养中使用糖浓度为100mM-200mM。
11.按照权利要求9所述的基于微阀的双检测微流控芯片的糖尿病模型构建方法，其特征在于：通过对培养室中的线虫进行加药刺激，可以对治疗糖尿病的药物进行高通量筛选。
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