CN102759621A - 基于微流控芯片的高通量快速检测疟疾血清的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学研究及临床应用领域，涉及血清免疫学检测方法。本发明以微流控芯片为基础，建立了专门用于高通量快速检测疟疾血清的方法，本发明方法在微流控芯片上同时进行两种疟原虫抗原的免疫学测定，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，能大量降低病人血清样本使用量，试剂和能量消耗大大降低，从降低整个检测成本，同时该方法自动化程度高，能防止标本间的污染，提高检测准确性。
Description
技术领域
本发明属生物医学领域，涉及血清免疫学检测方法，具体涉及一种基于微流控芯片专门用于高通量快速检测疟疾血清的方法。
背景技术
疟疾（malaria）是一种由疟原虫引起的、经按蚊叮咬而传播的重要的寄生虫病。据WHO最新估计，全球有41%的人生活在疟疾流行区，分布于100多个国家，每年有3～5亿临床病例，死亡人数约270 万，平均每15秒钟就有一人因疟疾死亡，其中大多为儿童和孕妇。目前，疟疾与结核、AIDS病一起并列为全球最严重的三大传染病，对于疟疾的防治，世界卫生组织将发展准确、快速诊断疟疾的技术视为防治疟疾优先考虑的对策之一。
目前最广泛应用的疟疾诊断方法是显微镜镜检；该方法是疟疾诊断的金标准，具有特异性好，可鉴别虫种的优点，但该方法操作复杂、费时、费力，容易漏检，且对镜检人员和设备的要求较高。随着免疫学的发展，免疫层析技术、胶体金标记免疫法及Dipstick抗原捕获法等多种用于疟疾的快速诊断方法不断出现；上述技术多基于双抗体夹心法原理，采用固定于硝酸纤维素膜某一区带的特异性抗体对样品中目标抗原的捕获；由于存在毛细管作用力，当硝酸纤维素膜一端浸入样品，样品即沿膜向特异性抗体固定点移动，一旦样品行至抗体固定区域，样品中目标抗原即与之产生免疫结合,结合产物用免疫胶体金或免疫酶显色，从而实现免疫诊断。上述方法一般仅能检测病人血清中单一的抗原如HRP2或LDH，虽然操作简单，但不能区别疟原虫虫种，并具有自动化程度不高、经常伴随着非特异性吸附、以及容易出现交叉污染等诸多缺点。
20世纪90年代发展起来的微流体学科是指操作微小网络通道（5-500微米）中流体的科学技术，是分子生物学技术、微加工技术、机械制造技术、计算机技术等多种现代技术的发展与融合，是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，具有信息通量大、自动化、系统化的特点；其中微流体芯片用于操作，传输微升（10-6L）至毫微微升（10-15L）量级的流体，可将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在一块或几块微流体芯片上，其微通道孔径只有微米级大小，具有浓缩和富集的作用，可加速反应缩短测试时间，从而大大降低了测试成本。和常规的实验技术相比，上述技术极大降低了试剂的消耗量（至少3个数量级）、同时分析产生的废液极少；在微小范围内的能量传递、物质分散更快更均匀，热能传导快，也更易实现各种操控，因此反应快、收率高，污染少、成本低。
目前，微流控芯片已从分离检测发展为包括复杂试样前处理的高功能全分析系统；从分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段。在微流控芯片上进行免疫分析，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，样品、试剂和能量消耗大大降低。所述用于免疫分析的微流控芯片是运用微加工技术建立微米级的免疫反应空间，由于尺寸上的减小，加快了反应动力学过程，使得基于生物大分子扩散控制的免疫反应速度提高几个数量级。微流控芯片多种功能结合与集成化的特点也使微流控芯片上的免疫分析与常规免疫分析相比有很多潜在的优势，因此受到越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的高通量快速检测疟疾血清的方法。
具体而言，本发明的疟疾血清免疫学检测方法，其特征在于，以微流控芯片为基础，专门用于高通量快速检测疟疾血清的方法，包括如下步骤：
（1）将抗疟原虫抗体泵入微流控芯片的分析室；
（2）不同的分析室泵入数个填料体积的不同的疟原虫蛋白溶液，通过特异性结合，使疟原虫蛋白抗原与聚合微球填料结合；
（3）将含有有5%牛白蛋白的磷酸盐缓冲液泵入微流控芯片分析室，对结合了重组疟原虫蛋白抗原的聚合微球进行封闭；
（4）一定量的血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗不同疟原虫蛋白的抗体特异性与聚合微球上的重组疟原虫蛋白结合；
（5）将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室；
（6）由信号采集模块采集数据，并由软件进行分析。
本发明方法的步骤（1）中，所述的抗疟原虫抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体；所述的抗疟原虫抗体可抗天然疟原虫蛋白抗体、重组疟原虫蛋白抗体，优选抗重组疟原虫蛋白抗体；
所述的微流控芯片由样品富集及免疫分析模块和信号采集模块及对芯片的系统控制组成；其中，
所述的样品富集及免疫分析模块由并行的一个或几个单独的纳升体积的免疫色谱柱微分析室所组成，每个分析室连接有多个进样空和出样口，每个分析室通过聚合填料键合固定了抗体蛋白或抗原，能够和样品混合物中的抗原发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的反应物（抗体或抗原）实现，经过多次洗涤之后，免疫标记信号的产生的变化如荧光强度的变化可以被信号采集模块采集分析；
所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，血清中抗阿米巴特异性抗体与阿米巴抗原的特异性结合后，与标记的羊抗人二抗结合导致的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传至到微处理器（计算机）中和数据库相比较，来分析检测血清中特异性抗阿米巴原虫抗原的抗体浓度；
所述的芯片的系统控制模块中，硬件部分主要由控制部分（计算机），操作系统（集成化微流体芯片，数控界面）和数据采集、数据分析部分（计算机）组成，软件部分主要包括LABVIEW程序（控制）和ImagePro程序（数据分析）。
本发明中，所述的微流控芯片采用PDMS高分子聚合材料制备。
本发明中，所述的微流控芯片的分析室为整体柱或聚合填料灌柱，聚合填料为硅胶填料或其它有机聚合物，本发明的一个实施例中优选有机聚合微球。
本发明中，所述的微流控芯片的分析室数量可由实际情况确定，如样品数及其中各成分的性质差别；在本发明的一个实施例中制备了一个双样品的微流控芯片，可根据实际情况将该单通道以不同方式并联、串联。
本发明方法的步骤（2）中，所述的重组疟原虫蛋白不受特别限制，其选自恶性疟原虫的裂殖子表面抗原1（merozoite surface protein
1, MSP1）、红细胞结合抗原175（EBA175）或上述两种分子的的多肽片段。
本发明方法的步骤（2）中，所述的重组疟原虫蛋白抗原为标签融合蛋白，蛋白标签不受限制，选自组氨酸残基组成的融合标签、Flag标签、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签、GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签、HA标签蛋白、C-Myc 标签蛋白、AviTag标签、SNAP-Tag或HaloTag™标签，优选组氨酸残基组成的融合标签。
本发明方法的步骤（5）中，所述的标记的抗人抗体不受物种来源限制，优选羊抗人抗体。
本发明方法的步骤（5）中，所述的抗人抗体的标记是酶标抗体或荧光标记抗体。
本发明方法的步骤（6）中，所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，对免疫分析结果结合导致的光学信号都可进行采集并传至到微处理器（计算机）分析。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：在微流控芯片上同时进行两种疟原虫抗原的免疫学测定，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，能大量降低病人血清样本使用量，试剂和能量消耗大大降低，从降低整个检测成本，同时该方法自动化程度高，能防止标本间的污染，提高检测准确性。
附图说明
图1是本发明的微流控芯片设计图。
图2 是本发明酶联免疫吸附试验（ELISA）检测疟疾患者血清中抗MSP1抗体结果。
图3 是本发明酶联免疫吸附试验（ELISA）检测疟疾患者血清中抗EBA175抗体结果。
图4是本发明以微流控芯片对疟疾患者进行抗EBA175抗体免疫学检测分析室图。
图5是本发明以微流控芯片对疟疾患者进行抗MSP1抗体免疫学检测分析室图。
图6是本发明以微流控芯片对疟疾患者进行抗EBA175抗体免疫学检测结果。
图7是本发明以微流控芯片对疟疾患者进行抗MSP1抗体免疫学检测结果。
具体实施方案
实施例
1
制备微流控芯片
将硅片放入Piranha溶液（98%浓硫酸：30%双氧水=7：3）煮沸清洗15min；用去离子水冲洗5遍后用氮气吹干，并在200℃烘培30min；将Microchem公司的SU-8胶倒在硅片中央，缓慢旋转，使SU-8覆盖住硅片大部分区域；用旋涂机以3000转/min旋涂60s，使胶分布较为均匀，静置10min缓解边缘突起效应；随后进行软烘，软烘的目的是使SU-8光刻胶中的溶剂挥发，工艺控制的关键是使溶剂挥发以可控的速率进行；在65℃、95℃和65℃分别保持3min、6min和3min。之后以0.5℃/min的速率缓慢降至室温；采用接触式曝光机（波长365nm）；曝光后烘培（PEB，post exposure bake）；再热板上以5℃/min的速率由室温逐步升到95℃，期间在65℃和95℃分别保持1min和5min，之后以0.5℃/min的速率缓慢降至室温，显影在通风厨中进行，显影液的主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯；将模具放入显影液中显影7min，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干，在热板上120℃加热5min，180℃加热5min，200℃加热20min，在缓慢降至室温。将PDMS单体与固化剂按照5：1的质量配比混合均匀，除净气泡；倒在经三甲基氯硅烷处理过的SU-8模具上，在调整好的水平热板上80℃保持1h固化，形成上层具有反应微通道层的基片；在硅片上甩涂光刻胶，经紫外曝光、显影，制成硅基光阳模，用三甲基氯硅烷在气相中熏蒸5min，使其表面硅烷化，以防止在注塑过程中PDMS的粘附，并且具有控制通道的PDMS层单体与固化剂的比例为18：1，相对较软；在甩胶机上2000转/min甩涂35s，形成下层具有控制阀门通道的基片；键合及接口制作；将上层基片打孔，下层基片打孔用于控制通道；上下两片仔细对合，80℃过夜固化。整个芯片结构如图1所示。
实施例
2
酶联免疫吸附试验（
ELISA
）检测疟疾患者血清
96孔酶标板分别每孔加入含100ng疟原虫蛋白的裂殖子表面抗原1（MSP1）、红细胞结合抗原175（EBA175）的Coating Buffer 100μl，4℃湿盒中过夜。PBS（含0.05% Tween20）洗板后每孔加入含3%脱脂奶的PBS 400μl，湿盒中室温封闭1h。每孔中分别加入100μl健康人或病人血清（1:400稀释），阴性对照为健康人血清（1:400稀释）湿盒中室温孵育1h。PBS（含0.05% Tween20）洗板后每孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（1:1000稀释）100μl，湿盒中室温孵育1h。PBS（含0.05% Tween20）洗板后加入显色液200μl/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入2M H2SO4
50μl终止显色反应。酶标仪490nm测定吸光度。
如图2、3所示，结果表明12名疟疾患者抗MSP1和EBA175的抗体均为阳性，其中6号病人的血清中抗MSP1抗体反应较弱，Jap、1、6和9号病人的血清中抗EBA175抗体反应较弱。
实施例
3
以微流控芯片对疟疾患者进行血清学检测
经进样通道将聚合材料填料灌注装柱，闭合柱底阀门，控制阀门气压不超过20psi，同时控制装柱速度，待填料装满后进缓冲液平衡色谱柱，将抗疟原虫抗体泵入微流控芯片的分析室后，经过数次PBS洗涤，不同的分析室中分别泵入数个填料体积的重组疟原虫的MSP1和EBA175抗原溶液，通过特异性结合，使溶疟原虫蛋白抗原与聚合微球填料结合。经数次PBS洗涤后，将含有有5%牛白蛋白的PBS泵入微流控芯片分析室，对结合了重组疟原虫抗原的聚合微球进行封闭 。随后将疟疾患者的血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗疟原虫的MSP1和EBA175抗体特异性与聚合微球上的重组溶组织内阿米巴蛋白结合。经数次PBS洗涤后，将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室，抗体的特异性结合导致的光学信号可被信号采集模块的光敏器件阵列采集并传至到微处理器（计算机）中和数据库相比较，来分析样品。整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分（计算机），操作系统（集成化微流体芯片，数控界面）和数据采集，数据分析部分（计算机）。软件系统主要包括LABVIEW程序（控制）和ImagePro程序（数据分析）。
如图4所示，结果显示12名疟疾患者血清中抗疟原虫的EBA175抗原的特异性抗体均可被该微流控芯片检测出，其血清中疟原虫的EBA175抗原的特异性抗体的含量与ELISA结果相一致；12名疟疾患者中有10名病人血清中抗疟原虫的MSP1抗原的特异性抗体的含量与ELISA的结果一致，其中6号和11号病人的MSP1抗原的特异性抗体反应性为阴性（图5）。
结果表明，采用微流控芯片检测疟疾患者血清中抗疟原虫的EBA175抗原的特异性抗体的灵敏性均和ELISA检测结果一致，为100%（见图6）；而用微流控芯片检测疟疾患者血清中抗疟原虫的MSP1抗原的特异性抗体的灵敏性为83%，较ELISA法低（见图7）；但通过同时针对疟原虫的EBA175和MSP1两种的特异性抗体的检测可以大大提高疟疾检测的敏感性；上述结果显示，基于微流控芯片专门用于高通量快速检测疟疾血清的方法有助于疟疾患者的免疫学诊断。
Claims (15)
1.一种基于微流控芯片高通量快速检测疟疾血清的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）将抗疟原虫抗体泵入微流控芯片的分析室；
（2）不同的分析室泵入数个填料体积的不同的疟原虫蛋白溶液，通过特异性结合，使疟原虫蛋白抗原与聚合微球填料结合；
（3）将含有有5%牛白蛋白的磷酸盐缓冲液泵入微流控芯片分析室，对结合了重组疟原虫蛋白抗原的聚合微球进行封闭；
（4）一定量的血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗不同疟原虫蛋白的抗体特异性与聚合微球上的重组疟原虫蛋白结合；
（5）将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室；
（6）由信号采集模块采集数据，并由软件进行分析。
2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1）的抗疟原虫抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.按权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述步骤（1）的抗疟原虫抗体抗天然疟原虫蛋白抗体或重组疟原虫蛋白抗体。
4.按权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述步骤（1）的抗疟原虫抗体抗重组疟原虫蛋白抗体。
5.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1）的微流控芯片由样品富集及免疫分析模块和信号采集模块及对芯片的系统控制组成；其中，
所述的样品富集及免疫分析模块由并行的一个或几个单独的纳升体积的免疫色谱柱微分析室所组成，每个分析室连接有多个进样空和出样口，每个分析室通过聚合填料键合固定了抗体蛋白或抗原；
所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成；
所述的芯片的系统控制模块中，硬件部分主要由控制部分，操作系统和数据采集、数据分析部分组成，软件部分主要包括LABVIEW程序和ImagePro程序。
6.按权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的微流控芯片采用PDMS高分子聚合材料制备。
7.按权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的微流控芯片的分析室为整体柱或聚合填料灌柱。
8.按权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的聚合填料为硅胶填料或其它有机聚合物。
9.按权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的聚合填料为有机聚合微球。
10.按权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的微流控芯片的分析室单独或连接使用。
11.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）的重组疟原虫蛋白选自恶性疟原虫的裂殖子表面抗原1、红细胞结合抗原175，或上述两种分子的的多肽片段。
12.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）的重组疟原虫蛋白抗原为标签融合蛋白，其选自组氨酸残基组成的融合标签、Flag标签、MBP标签、GST标签、HA标签蛋白、C-Myc 标签蛋白、AviTag标签、SNAP-Tag或HaloTag™标签。
13.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）的重组疟原虫蛋白抗原为组氨酸残基组成的融合标签。
14.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（5）的标记的抗人抗体为羊抗人抗体。
15.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述的抗人抗体的标记为酶标抗体或荧光标记抗体。
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