CN101709261A - 一种微流控微珠阵列芯片及其在病毒分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控微珠阵列芯片及其在病毒分析中的应用，属于微全分析系统的生物学应用领域。一种微流控微珠阵列芯片，由微珠固定微结构阵列、微珠传送通道、试剂传送通道及微结构阵列覆盖通道四部分构成。在进行高灵敏病毒分析时，血清样品中的病毒分子经过PCR及体外转录过程制备出掺入生物素的目标RNA序列，并流入芯片的检测区与功能微珠阵列反应，功能修饰的微球可以特异性的识别及捕获目标靶序列，然后引入量子点标记试剂，微颗粒表面会因特异性捕获而结合上量子点，再用荧光成像方法进行检测及定量。本发明设计的微流控微珠阵列芯片工艺简单、检测灵敏度高并且检测快速，为高灵敏病毒分析提供了一种有力的研究及检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及微全分析系统的生物学应用领域，尤其涉及微流控微珠阵列芯片的设计及其在高灵敏病毒分析中的应用。
背景技术
在漫长的人类历史长河中病毒一直是人类健康的主要杀手之一，因此病原体监控及诊断以及对人体的危害也是倍受关注的全球性健康问题。在社会经济飞速发展的今天，新病毒正在走出大自然，″发现″人类。仅仅从1994年以来，已有30多种病毒现身，像埃博拉出血热、F和G型肝炎、安第斯病毒、法基病毒、比利多病毒、白水旱谷病毒等已令医学界一筹莫展。在我国，进入21世纪之后的几年内，病原体污染事件频频爆发，SARS病毒、禽流感病毒等过去鲜为人知的病原体引起了前所未有的大面积危害和社会恐慌。因此面对新的形势及健康问题，发展具有独立知识产权的高通量、高灵敏及微量检测病原体鉴定及分析技术平台将极大的推动社会在重大疫情预防及健康维护领域的进步。
现在常规用于病毒分析的方法主要包括荧光定量PCR、免疫学方法及微阵列芯片。这些技术的优势及局限性主要包括：(1)实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，目前已得到广泛应用，但是在高通量检测上仍然存着特异性不足等一些关键的技术难题；(2)免疫学方法自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。但是该技术由于抗体稳定性的问题很难制备出具有高通量特性的检测芯片，同时抗体由于同源性导致的非特异性识别也是一个不容忽视的问题；(3)DNA微阵列技术(microarray)也存在着一定的局限性，比如：微阵列芯片需要昂贵的精密的自动化点样设备和荧光扫描系统；其原位的探针合成技术比较复杂，而且开放式的点样和杂交过程容易污染样品进而影响实验结果的准确性；杂交时间长且普遍灵敏度不理想，不能实现微量样品的高通量检测。虽然这些技术都有着独特的不可替代的优势及特点，而且在相关领域也得到了较好的应用，但其不容忽视的技术缺陷也同样制约了更加广泛及深入的应用。
微流控芯片是上世纪90年代发展起来的新兴技术，但其最主要的缺点是不适合进行大规模样品或高通量样品的分析。虽然有研究小组曾采用了平行组合多条微流控通道的方式来进行多样品分析，但增加通道必然会受芯片尺寸以及微加工技术的制约，而且对于每一条通道也需要单独进样，从而增加了实验的操作难度和复杂性。这些缺点在一定程度上已经限制了微芯片技术的进一步发展和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种微流控微珠阵列芯片及其在病毒分析中的应用，以适应现今社会在病毒的快速、高灵敏及高通量检测及监控领域的需求。所述的微流控微珠阵列芯片由第一PDMS片基1和第二PDMS片基2在显微镜下对准后贴合而成，第一PDMS片基1包含有微珠传送通道3和微珠固定微结构阵列4，第二PDMS片基2包含试剂传送通道5和微结构阵列覆盖通道6。
本发明提供的微流控微珠阵列芯片，第一PDMS片基1所述的微珠固定微结构阵列4由10～30个单独的小室构成，其中单个小室的尺寸为100～200微米宽、100～200微米长、30～50微米深；第二PDMS片基2所述的微结构阵列覆盖通道6的尺寸为300～600微米宽、1000～3000微米长、10～20微米深。
本发明提供的微流控微珠阵列芯片及其制备方法，第一PDMS片基1和第二PDMS片基2在显微镜下对齐贴合，其中微珠固定微结构阵列4和微结构阵列覆盖通道6对准后形成整个微流控检测区，同时也构建出多个可用于微球固定的多高微结构。功能化微球可以分别通过第一PDMS片基1中包含的微珠传送通道流入并固定于检测区中形成阵列。本发明涉及的制备工艺能够以单层次简单结构构建出多层次复杂功能的微流控芯片，较大的简化了模板的制备工艺，使得复杂结构的芯片制备更加简单，快速。
本发明提供的微流控微珠阵列芯片，通过以下技术方案实现在高灵敏病毒分析中的应用：首先根据检测病毒的基因组信息设计不同的特异性检测探针，并通过生物素-亲合素结合方法固定于微球表面，然后利用芯片中的微珠传送通道分别流入检测区并固定于微结构中形成功能化微珠阵列；其次是抽提病毒基因组DNA，通过PCR及体外转录方法制备掺入了生物素的目标片段RNA，通入通道与微球表面的特异性检测探针杂交；最后是特异性洗脱后流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微球表面捕获的目标片段RNA中掺入的生物素识别并结合，通过荧光倒置显微镜观察及拍摄微珠表面荧光，并用软件对颗粒的表面荧光强度进行估算，根据荧光强度的差别获取该检测位点的病毒信息。
本发明提供的微流控微珠阵列芯片高灵敏病毒检测方法中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球或者生物大分子聚合物微球，尺寸为10～30微米。
本发明提供的微流控微珠阵列芯片高灵敏病毒检测方法中，所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS及复合型量子点，其发射范围为400nm～700nm。
附图说明
图1为微流控微珠阵列芯片结构示意图；
图2为芯片内和芯片外以及普通荧光素标记和量子点标记检测病毒的比较结果示意图；
图3为基于量子点标记识别的微流控微珠阵列芯片检测血清中HBV病毒的灵敏度结果示意图。
具体实施方式：
实施例1，基于量子点标记的微流控微珠阵列芯片高灵敏病毒识别的性能分析：
1.乙肝病毒基因型特异探针的设计及合成：检索Genbank数据库，对各型HBV病毒基因组进行序列比对，从序列差异较大的S基因中筛选出各型特异探针，合成各型探针并于5端或者3端进行化学基团的修饰，表1为设计的乙肝病毒B、C、D及E基因型特异性分型探针及相应的修饰基团。
2.微珠的生物功能化修饰：采用15微米聚苯乙烯微球作为探针固定的固相界面，具体步骤如下：(1)取100微升浓度为1％的亲和素修饰微珠于离心管中，用100微升亲和洗脱液(20mM Tris pH 7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％Triton X-100)洗涤两次，离心条件为3500rpm，5min，去上清；(2)加入47微升的亲和洗脱液及3微升10μM的生物素修饰探针，常温孵育15min；(3)通过离心洗涤方法去除未结合的探针并将功能化的微珠悬浮于100微升亲和洗脱液。
3.微流控微珠阵列芯片的制备：首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW9.0)绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按10∶1比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上(厚约1mm)。置于65度烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基从阳模板上剥离下来，待打孔及用等离子清洗后，将相应的芯片基片进行不可逆贴合。使用0.1％的BSA处理通道1h，然后采用流控方法将四种特异性分型探针修饰的微珠分别固定于不同的小室中形成阵列，每个小室中可以放置不同的功能化微球。设计的微流控芯片中，第一PDMS片基中包含的微珠固定微结构阵列由10个单独的小室构成，单个小室的尺寸为150微米宽、200微米长、30微米深；第二PDMS片基包含的微结构阵列覆盖通道的尺寸为500微米宽、2毫米长、10微米深。
4.芯片用于病毒分型的性能分析：(1)采用常规荧光染料标记的芯片内病毒分型特征：将含有浓度为1pM～80nM Vcom-DNA-B1的杂交缓冲液(所述杂交缓冲液的成分为：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％Triton X-100)在压力驱动下通过构建的包含微珠阵列的检测区，杂交15min后，用55℃TE buffer(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图2所示的曲线2。(2)采用量子点标记的芯片内病毒分型特征：将含有浓度为1pM～80nM Vcom-DNA-B2的杂交缓冲液(所述杂交缓冲液的成分为：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％Triton X-100)在压力驱动下通过构建的包含微珠阵列的检测区，杂交15min后，用55℃TE buffer(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)洗涤5min。将稀释的亲合素修饰量子点溶液通入检测区与微球反应15min，最后用TE溶液洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图2所示的曲线1。(3)芯片外病毒分型特征：在0.2ml的Eppendorf管中构建10μl反应体系，其中包含1pM～80nM Vcom-DNA-B1以及1μl的0.1％的分型探针修饰微球，使用的杂交缓冲液成分为：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1M NaCl，1mMEDTA，0.0005％ Triton X-100，常温下杂交15min，并用10μl 55℃的TE buffer(10mMTris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)洗涤5min。将反应后的微球置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图2所示的曲线3。结果显示：在信噪比大于3的情况下，采用常规荧光染料标记的芯片内病毒分型方法可以识别0.03nM的目标序列；采用量子点标记的芯片内病毒分型方法可以识别0.004nM的目标序列；而采用常规荧光染料标记的芯片外病毒分型方法仅能够识别0.1nM的目标序列。由此可见微流体的物质传递增强性能导致了芯片内的病毒分型灵敏度高于芯片外的病毒分型灵敏度，同时量子点优良的荧光性质及量子产率导致了量子点标记的病毒分型灵敏度高于常规染料标记的病毒分型灵敏度。这充分证明了该方法用于高灵敏病毒分析的适用性。
实施例2，基于量子点标记识别的微流控微珠阵列芯片检测血清中HBV病毒的灵敏度：
1.乙肝病毒基因型特异探针的设计及合成：检索Genbank数据库，对各型HBV病毒基因组进行序列比对，从序列差异较大的S基因中筛选出各型特异探针，合成各型探针并于5端或者3端进行化学基团的修饰，表1为设计的乙肝病毒B、C、D及E基因型特异性分型探针及相应的修饰基团。
2.微珠的生物功能化修饰：采用15微米聚苯乙烯微球作为探针固定的固相界面，具体步骤如下：(1)取100微升浓度为1％的亲和素修饰微珠于离心管中，用100微升亲和洗脱液(20mM Tris pH 7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％Triton X-100)洗涤两次，离心条件为3500rpm，5min，去上清；(2)加入47微升的亲和洗脱液及3微升10μM的生物素修饰探针，常温孵育15min；(3)通过离心洗涤方法去除未结合的探针并将功能化的微珠悬浮于100微升亲和洗脱液。
3.微流控微珠阵列芯片的制备：首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW9.0)绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按10∶1比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上(厚约1mm)。置于65度烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基从阳模板上剥离下来，待打孔及用等离子清洗后，将相应的芯片基片进行不可逆贴合。使用0.1％的BSA处理通道1h，然后采用流控方法将四种特异性分型探针修饰的微珠分别固定于不同的小室中形成阵列，每个小室中可以放置不同的功能化微球。设计的微流控芯片中，第一PDMS片基中包含的微珠固定微结构阵列由10个单独的小室构成，单个小室的尺寸为150微米宽、200微米长、30微米深；第二PDMS片基包含的微结构阵列覆盖通道的尺寸为500微米宽、2毫米长、10微米深。
4.用于芯片分析的临床样品处理及目标序列扩增：使用HBV荧光定量试剂盒确定血清样品中HBV的浓度，并将血清样品按比例稀释成1000copies/ml、2000copies/ml、5000copies/ml、10000copies/ml及40000copies/ml。(1)HBV基因组DNA的提取：50微升血清样品与50微升0.4M NaOH混合后于80℃处理10min，然后13500rpm离心5min，上清转入另一离心管中并加入25微升0.4M的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液充分混合，样品于-20℃保存直至使用；(2)目标序列的PCR扩增：构建50μL PCR反应体系，试剂包括：2.0mM MgCl2，200μM dNTPs混合物，400nM前导引物和反向引物，0.25U热启动Extaq酶和2μL抽提的乙肝病毒DNA，其中前导引物序列：5’GAT CAC TAATACGAC TCA CTA TAG GGC CTC ATC TTC TTG TTG GTT CTT 3’；反向引物序列：5’CTG AGC CAA GAG AAA CGG ACT GAG 3’。反应条件为：94℃ 5min一个循环；94℃50s，55℃ 50s，72℃ 1min 30个循环；72℃ 10min 1个循环。(3)体外转录：构建20μL体外转录体系，试剂包括：2μL PCR扩增产物，500μM各种NTP，12.5μM(2.5％)Biotin-11-UTP，1U/μL T7 RNA polymerase和1×转录缓冲液，于37℃反应2h.。
6.基于量子点标记的微流控微珠阵列芯片检测血清样品中乙肝病毒：将由不同浓度乙肝病毒血清样品制备的RNA靶序列按1∶1稀释构建芯片杂交缓冲液(所述杂交缓冲液的成分为：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％ Triton X-100)，杂交溶液先在95℃处理1min，然后在压力驱动下流入微流控微珠阵列芯片，杂交15min后，用55℃ TE buffer(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)洗涤5min。将稀释的亲合素修饰量子点溶液通入检测区与微球反应15min，量子点材料为CdSe，发射为565nm，最后用TE溶液洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图3所示的曲线。结果显示：该量子点标记的微流控芯片病毒分析方法可以识别HBV浓度为1000copies/ml的血清样品。
Claims (7)
1.一种微流控微珠阵列芯片，由第一PDMS片基(1)和第二PDMS片基(2)在显微镜下对准后贴合而成，其特征在于第一PDMS片基(1)包含有微珠传送通道(3)和微珠固定微结构阵列(4)，第二PDMS片基(2)包含试剂传送通道(5)和微结构阵列覆盖通道(6)，其中微珠固定微结构阵列(4)和微结构阵列覆盖通道(6)对准后构建整个微流控检测区。
2.按权利要求1所述的一种微流控微珠阵列芯片，其特征在于第一PDMS片基(1)所述的微珠固定微结构阵列(4)由10～30个单独的小室构成，其中单个小室的尺寸为100～200微米宽、100～200微米长、30～50微米深；第二PDMS片基(2)所述的微结构阵列覆盖通道(6)的尺寸为300～600微米宽、1000～3000微米长、10～20微米深。
3.按权利要求1所述的一种微流控微珠阵列芯片，其特征在于微珠固定微结构阵列(4)中固定的表面修饰功能生物分子的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球或者生物大分子聚合物微球。
4.按权利要求1所述的一种微流控微珠阵列芯片，其特征在于微珠尺寸为10～30微米。
5.按权利要求1所述的一种微流控微珠阵列芯片，其特征在于用于微球固定的多高结构由第一PDMS片基(1)和第二PDMS片基(2)在显微镜下对齐贴合后共同构建。
6.一种基于权利要求1所述的微流控微珠阵列芯片在病毒分析中的应用，其特征在于：通过生物素-亲合素结合方法将设计的病毒特异性探针固定于微球表面，并利用芯片中的微珠传送通道分别流入检测区并固定于微结构中形成功能化微珠阵列；其次是抽提病毒基因组DNA，通过PCR及体外转录方法制备掺入了生物素的目标片段RNA，通入通道与微球表面的特异性检测探针杂交；最后是特异性洗脱后流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微球表面捕获的目标片段RNA中掺入的生物素识别并结合，通过荧光倒置显微镜观察及拍摄微珠表面荧光，并用软件对颗粒的表面荧光强度进行估算，根据荧光强度的差别获取该检测位点的病毒信息。
7.按权利要求6所述的病毒分析应用，其特征在于：用于病毒分析的量子点为CdSe、CdTe、CdS或者复合型量子点，其发射范围为400nm～700nm。
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