CN103224997A - 蔗糖酶-dna复合物及其制备方法、相关试剂盒及配合血糖仪检测hbv不同分型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蔗糖酶-DNA复合物，其分子一端为含有氨基的蔗糖酶，另一端为可杂交于HBV不同基因型上的辅助探针，蔗糖酶和辅助探针通过连接臂进行连接，连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。本发明的试剂盒包括微流控芯片和报告探针溶液，芯片内设有主通道和多个侧通道，不同侧通道内固定有针对HBV不同分型的捕获探针；报告探针溶液为前述复合物配制而成。本发明还公开了前述复合物和试剂盒的制备方法，该试剂盒可配合血糖仪检测HBV不同分型，检测时先杂交目标基因，然后杂交报告探针，最后通入底物并配合血糖仪的检测信号进行判断即可。本发明具有低成本、易操作、不需外援设备、使用携带方便、检测结果准确等优点。

Description

蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法、相关试剂盒及配合血糖仪检测HBV不同分型的方法

技术领域

本发明涉及一种酶与DNA结合的复合物及其制备和在病毒检测中的应用，尤其涉及一种蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法，及该复合物制成的试剂盒和在乙型肝炎病毒不同基因分型检测中的具体应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的感染性疾病，全世界有3.5亿乙型肝炎病毒携带者，乙肝不仅损害人体健康，而且给家庭、社会造成沉重的经济负担。乙型肝炎病毒(HBV)是目前已知的最小DNA病毒，部分双链的环形基因组，全长3.2Kb。HBV有8种基因分型，不同的基因分型之间存在致病性和抗药性的差异。由于中国地区95％以上的乙型肝炎病毒携带者均可归为B、C、D三种HBV病毒株，因此B、C、D三种HBV病毒株的基因分型成为我们主要的研究对象。目前，国内外传统的临床诊断方法无法有效地检测乙型肝炎病毒的基因分型，在临床上会表现为漏诊、盲目用药和延误治疗。因此，发展快速、准确、简单易行的HBV基因分型检测技术，在乙肝诊断、治疗以及研究HBV基因组变异等方面有着非常重要的现实意义。

开发一种便携式传感器，以用于快速、低成本且能够在住所或事发地实时定量地检测目标物(例如离子、小分子、DNA、蛋白质等)，这是人们长期以来的研发目标。近年来，便携式检测仪器的研究取得了重大进展，血糖仪等便携式检测仪器已经商业化，基本满足了大众对于某些疾病的家用诊断和预防等方面的需求，也改善了数以万计疾病患者的生活状况。然而，现有的便携式检测仪器往往只可检测单目标物。近几年，一些研究者发展了将便携式血糖仪与功能化的DNA传感器结合起来以用于检测分析血糖以外其他目标物的检测新方法，例如Lu等(Yu Xiang，Yi Lu.Using personal glucose meters and functional DNA sensors toquantify a variety of analytical targets.Nature Chemistry，2011，3(9)∶697-703.)、Yuan等(Jiao Su，Jin Xu.Ying Chen.et al.Personal glucose sensor for point-of-care early cancer diagnosis.Chem.Commun.2012，48，6909-6911)利用血糖仪分别实现了单个小分子、蛋白以及DNA的检测，然而目前暂未出现利用便携式血糖仪检测乙型肝炎病毒基因分型的检测技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法，还相应提供一种该复合物制成的低成本、易操作、不需外援设备、使用携带方便、检测结果准确的试剂盒，以及用该试剂盒配合血糖仪(体外)检测乙型肝炎病毒不同分型的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物，所述蔗糖酶-DNA复合物为链式分子结构，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子一端为蔗糖酶，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于乙型肝炎病毒不同基因型上的辅助探针，所述蔗糖酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基；所述蔗糖酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团；所述辅助探针的核苷酸序列为：5’-SH-(T)₁₀ATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTG-3’。

上述的技术方案中，所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环1号位上一般通过羰基与所述蔗糖酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。

上述本发明的技术方案还提出了一种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物，其复合物合成时利用的基本原理为(可参见图1)：以4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)做为生成连接臂的原料，进而将巯基化的辅助探针与蔗糖酶连接起来，本领域技术人员一般很预见到这二者的结合方式及结合后的具体应用效果，而本发明中由于是针对特定领域的具体应用，因此创造性地将该蔗糖酶与该特定核苷酸序列的辅助探针进行了有效结合。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的蔗糖酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：

(a)将0.1mM～2mM的所述辅助探针(优选巯基修饰的辅助探针)的溶液、0.75M～2M的磷酸盐缓冲液(即缓冲液B)和15mM～60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室温下充分孵育，再使用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)得辅助探针溶液；

(b)将10mg/mL～20mg/mL的蔗糖酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐振荡混合，混合时保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，室温下振荡反应完全，然后用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)，得到sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液；

(c)将上述步骤(a)得到的辅助探针溶液和步骤(b)制得的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液混合，混合时其中的辅助探针与蔗糖酶的摩尔比控制在(5～20)∶1，室温下反应完全，再用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)，即得到蔗糖酶-DNA复合物。

上述的制备方法，所述步骤(a)中，充分孵育的时间优选控制在1h～2h。

上述的制备方法，所述步骤(b)中，控制蔗糖酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比优选为1∶(100～1000)；振荡反应完全的时间优选为1h～5h。

上述的制备方法，所述步骤(c)中，室温下反应完全的时间优选为36h～54h。

上述的制备方法，所述步骤(a)中使用的超滤离心管优选为3K超滤离心管；所述步骤(b)、(c)中使用的超滤离心管均优选为30K超滤离心管。所述超滤离心管反复离心时用到的缓冲液A优选为0.1M～0.3MNaCl和0.1M～0.5M磷酸盐配制成的pH值为7.0～7.5的缓冲液。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片和报告探针溶液，所述微流控芯片主要由底片和盖片上下叠加而成，所述底片和盖片之间设有液流通道，该液流通道包括主通道和多个与主通道分别交汇的侧通道，各侧通道相互独立分隔开，不同侧通道的内表面中分别固定有针对乙型肝炎病毒不同分型的捕获探针；所述报告探针溶液为上述本发明蔗糖酶-DNA复合物配制成的溶液。

上述本发明的试剂盒中，所述乙型肝炎病毒不同分型优选包括HBV-B、HBV-C、HBV-D中的至少两种。作为本发明优选的HBV基因分型，我们以占中国地区95％以上的三种HBV基因型HBV-B、HBV-C、HBV-D为研究对象，选择GenBank中已发表的18株HBV病毒株，应用Vector NTI suite7软件和Tree View软件分别对全基因序列及S、C、X区序列进行同源性比较和分子进化关系分析，最终设计了以下三种优选的对HBV-B、HBV-C、HBV-D三种基因型特异的捕获探针。

针对所述HBV-B基因型的捕获探针的核苷酸序列优选为：

5’-GTAACAGCGGCATAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’。

针对所述HBV-C基因型的捕获探针的核苷酸序列优选为：

5’GTAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’。

针对所述HBV-D基因型的捕获探针的核苷酸序列优选为：

5’-GTAACAGCGGTAAAAAGGGACTCAAGATGCTG(T)₁₀-biotin-3’。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备蔗糖酶-DNA复合物：先按照上述本发明的制备方法制备得到蔗糖酶-DNA复合物，将该蔗糖酶-DNA复合物与缓冲液混合后配制得到上述的报告探针溶液；所述缓冲液优选为0.1M～0.3MNaCl和0.1M～0.5M磷酸盐配制成的pH值为7.0～7.5的缓冲液(即上文提到的缓冲液A)；

(2)制作微流控芯片：根据预先设计的微流控芯片尺寸，通过裁剪、组装、粘结得到带有所述底片、盖片和液流通道的微流控芯片；

(3)微流控芯片的修饰：在所述微流控芯片中加入biotin-BSA溶液，温育(温育时间优选为1h～4h)后用缓冲液冲洗；接着加入亲和素溶液(亲和素溶液的浓度优选控制在0.5μM～20μM)，温育(温育时间优选为1h～2h)后用缓冲液冲洗；然后往向所述液流通道的各个侧通道中加入生物素标记的针对乙型肝炎病毒不同分型的不同捕获探针溶液(浓度均优选控制在1μM～2μM)，温育(温育时间优选为1h～2h)后用缓冲液冲洗，完成微流控芯片的修饰；将该微流控芯片与步骤(1)中的报告探针溶液组合包装后即得到试剂盒。

上述试剂盒的制备方法中，所述微流控芯片主要是通过亲和素-生物素交联方法构建得到。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述的试剂盒配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的方法，包括以下步骤：

(1)杂交目标基因：向所述微流控芯片的主通道中通入待测的目标DNA溶液，目标DNA溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，待目标DNA溶液与侧通道内表面固定的捕获探针充分杂交反应后(杂交反应的时间优选为1h～2h)，引入去离子甲酰胺洗脱液(洗脱液中去离子甲酰胺的体积分数可以为40％～70％)对各个侧通道进行洗脱(所述甲酰胺洗脱液的洗脱时间优选至少为15min)；

(2)杂交报告探针：继续向所述微流控芯片的主通道中通入报告探针溶液，报告探针溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，待报告探针溶液与侧通道内表面杂交上的目标DNA充分杂交反应后(杂交反应的时间优选为0.5h～4h)，引入缓冲液对各个侧通道进行洗涤；

(3)通入底物：继续向所述微流控芯片的主通道中通入蔗糖溶液，蔗糖溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，充分催化反应后用血糖仪靠近微流控芯片的每个侧通道出口对反应产物进行检测；如果某个侧通道中的溶液用血糖仪检测出的结果显示为Lo或背景值，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中未被检出；如果某个侧通道中的溶液用血糖仪检测出的结果显示有较高信号数值(例如信号数值在3～27.8之间)，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中被检出。

上述的检测方法，所述步骤(1)中，所述目标DNA溶液优选是由pH值为7.0～7.5的柠檬酸三钠缓冲液稀释配制而成；所述柠檬酸三钠缓冲液优选是由0.5M～0.9M的NaCl溶液和0.06M～0.09M柠檬酸三钠溶液配制成(即缓冲液C)。

上述的检测方法，所述步骤(3)中，蔗糖溶液的浓度优选为100mM～1M，所述催化反应的时间优选为20min～75min。

上述的检测方法，所述各个步骤的操作过程均控制在室温下进行(优选为25℃～50℃)。

本发明的上述各技术方案主要基于以下思路：首先提出了一种新的蔗糖酶-DNA复合物，使该蔗糖酶-DNA复合物同时具有蔗糖酶的催化能力与辅助探针的特性，再利用该复合物和微流控芯片技术完成了乙型肝炎病毒目标DNA的传感器构建，最后在检测过程中利用该复合物的寡核苷酸与乙型肝炎病毒目标DNA以及捕获探针形成三明治杂交结构，从而实现了乙型肝炎病毒目标DNA与蔗糖酶的联系，同时实现了传感器与血糖仪的关联，这为利用血糖仪检测乙型肝炎病毒目标DNA开辟了有效可行的途径。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了一种新颖的信号获取方式，其不需要大型、复杂、昂贵的检测仪器和设备，利用简单、低成本的血糖仪即可实现对乙型肝炎病毒目标DNA的有效检测，具有便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高等优点，可以真正实现在事故地点或其他场合进行简便、实时地检测。由于本发明中利用的酶催化底物具有专一性、高效率等特点，其可明显地增强检测信号，从而实现对乙型肝炎病毒目标DNA高灵敏、高选择性地检测。此外，由于本发明利用血糖仪这样一种已经广泛商业化的产品实现了对乙型肝炎病毒不同分型的有效检测，其在今后的DNA检测领域将具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中蔗糖酶-DNA复合物合成工艺的原理示意图。

图2为本发明实施例中微流控芯片的结构示意图；其中，侧通道B、C、D分别对应HBV-B、HBV-C、HBV-D三种基因型的捕获探针所在位置，R为检测对照。

图3为本发明实施例中血糖仪对不同HBV分型的某一种HBV基因型的检测结果。

图4为本发明实施例中对检测应用过程洗脱条件的考察优化结果。

图5为本发明实施例中对检测应用过程催化底物反应时间的考察优化结果。

图6为本发明实施例中对检测应用过程催化底物浓度的考察优化结果。

图7为本发明实施例中对检测应用过程操作温度的考察优化结果。

图8为本发明实施例中含不同浓度HBV-C的待测目标DNA溶液在用试剂盒检测时的检测结果。

图9为本发明实施例中合成的蔗糖酶-DNA复合物的电泳图。

图10为本发明实施例中血糖仪对HBV-B和HBV-C混合基因型的检测结果。

图11为本发明实施例中检测方法的检测原理示意图。

图例说明：

1、主通道；2、侧通道。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

本实施例中涉及的目标物、探针的核苷酸序列如下表1所示(所有设计好的DNA序列均可购自上海生工生物工程技术有限公司)：

表1：本实施例中涉及的目标物、探针的核苷酸序列

一种本发明的可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物(参见图1)，该蔗糖酶-DNA复合物为链式分子结构，该蔗糖酶-DNA复合物的分子一端为蔗糖酶，分子另一端为可杂交于乙型肝炎病毒不同基因型上的辅助探针，蔗糖酶上含有氨基，辅助探针上修饰有巯基；蔗糖酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团；辅助探针的核苷酸序列为：

5’-SH-(T)₁₀ATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTG-3’。

上述本实施例的蔗糖酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：

(a)将30μL1mM含上述巯基修饰辅助探针的溶液、2μL1M的磷酸盐缓冲液B(pH＝5.5)和2μL30mM的磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)混合，室温下充分孵育1h，再使用超滤离心管(Amicon-3K，BufferA)反复离心3次，得辅助探针溶液；BufferA是由0.1M NaCl和0.1M磷酸盐配制成的pH值为7.5的缓冲液；

(b)将400μL20mg/mL的蔗糖酶溶液与1mg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐振荡混合搅拌5min，混合时保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，室温下在摇床上振荡反应1h，离心去除不容的sulfo-SMCC，然后澄清的溶液用超滤离心管(Amicon-30K，Buffer A)反复离心3次，得到sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液；

(c)将上述步骤(a)得到的辅助探针溶液和步骤(b)制得的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液混合，混合时其中的辅助探针与蔗糖酶的摩尔比控制在10∶1，室温下反应48h，再用超滤离心管(Amicon-30K，BufferA)反复离心3次以上，即得到蔗糖酶-DNA复合物，分散在400μL Buffer A中，4℃保存、备用。

上述制备方法的工艺合成原理如图1所示，最后合成的蔗糖酶-DNA复合物的电泳图如图9所示，使用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证已合成蔗糖酶-DNA复合物。在电泳泳道内依次四个样品：a.DNA ladder marker；b.DNA；c.DNA和蔗糖酶；d.DNA-蔗糖酶复合物。所有样品均置于6×SSC(pH7.3)中。每个样品分别取8μL样品和2μL loadingbuffer混匀加入到各泳道中，先用40V电压电泳1h，再用80V电泳约3-4h；然后用SYBRGold溶液浸泡染色30min，用凝胶成像系统成像、拍照。结合图1、图9及已有的理论基础可以证实本发明中生成了蔗糖酶-DNA复合物。

一种本发明的用于配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的试剂盒，该试剂盒包括微流控芯片和报告探针溶液，如图2所示，该微流控芯片主要由底片和盖片上下叠加而成，底片和盖片之间设有液流通道，该液流通道包括主通道1和多个与主通道1分别交汇的侧通道2，各侧通道2相互独立分隔开，不同侧通道2的内表面中分别固定有针对乙型肝炎病毒不同分型的捕获探针；报告探针溶液为上述本实施例蔗糖酶-DNA复合物配制成的溶液。

本实施例的试剂盒检测的乙型肝炎病毒不同分型包括HBV-B、HBV-C和HBV-D三种。

针对HBV-B基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’-GTAACAGCGGCATAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’。

针对HBV-C基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’GTAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’。

针对所述HBV-D基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’-GTAACAGCGGTAAAAAGGGACTCAAGATGCTG(T)₁₀-biotin-3’。

本实施例中上述试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)制备蔗糖酶-DNA复合物：先按照上述方法制备得到蔗糖酶-DNA复合物，将该蔗糖酶-DNA复合物与缓冲液混合后配制得到上述的报告探针溶液；缓冲液采用上述的BufferA：

(2)制作微流控芯片：根据预先设计的微流控芯片尺寸，通过裁剪、组装、粘结得到带有底片、盖片和液流通道的如图2所示的微流控芯片；具体操作步骤包括：裁剪两个尺寸为5cm×3cm的聚苯乙烯片材，作为微流控芯片的底片和盖片；裁剪三个尺寸为2cm×0.8cm、两个尺寸为2cm×0.5cm以及一个尺寸为5cm×0.5cm的聚苯乙烯片材作为芯片的间隔，间隔出芯片中四个尺寸为2cm×2mm×0.5mm的侧通道2(参见图2中的侧通道B、C、D和R)和尺寸为5cm×5mm×0.5mm的主通道1；所有间隔的正反两面均粘贴有3M467无基材防水双面，用这种双面胶将微流控芯片的底片、间隔和盖片粘贴在一起就形成了如图2所示的一次性微流控芯片；

(3)微流控芯片的功能化修饰：在上述微流控芯片中加入1mg/mL biotin-BSA溶液，温育(温育时间可为1h～4h)后用缓冲液冲洗；接着加入1mg/mL(17μM)亲和素溶液，温育(温育时间可为1h～2h)后用缓冲液冲洗；然后往向上述液流通道的各个侧通道2中加入生物素标记的针对乙型肝炎病毒不同分型的不同捕获探针溶液(捕获探针浓度为1.0μM)，温育(温育时间为1h～2h)后用缓冲液冲洗，完成微流控芯片的修饰；将该微流控芯片与步骤(1)中的报告探针溶液组合包装后即得到试剂盒。

一种用上述制备方法得到的试剂盒配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的方法(检测原理参见图11)，包括以下步骤：

(1)杂交目标基因：向上述试剂盒的微流控芯片的主通道1中通入待测的某一种或多种HBV基因分型目标DNA溶液(目标DNA溶液是由pH值为7.0～7.5的柠檬酸三钠缓冲液稀释配制而成，柠檬酸三钠缓冲液是由0.5M～0.9M的NaCl溶液和0.06M～0.09M柠檬酸三钠溶液配制成)，目标DNA溶液流经主通道1后开始进入不同的侧通道2中，待目标DNA溶液与侧通道2内表面固定的捕获探针充分杂交反应后(杂交反应的时间控制在1h～2h)，引入去离子甲酰胺洗脱液(洗脱液中去离子甲酰胺的浓度可以为40％～70％)对各个侧通道2进行洗脱至少15min；由于不同HBV基因分型之间只有三到四个碱基的差别，三个侧通道2表面的捕获探针都会与目标DNA发生杂交，引入去离子甲酰胺洗脱液(洗脱液中去离子甲酰胺的浓度控制为40％～70％)洗脱之后，将没有完全互补的HBV基因分型洗脱下来，而完全互补的目标链则不被洗脱；

(2)杂交报告探针：继续向微流控芯片的主通道中通入上述试剂盒中的报告探针溶液，报告探针溶液流经主通道1后开始进入不同的侧通道2中，待报告探针溶液与侧通道2内表面杂交上的目标DNA充分杂交反应后(杂交反应的时间控制在0.5h～4h)，引入缓冲液(100mM PBS缓冲液，pH＝7.4)对各个侧通道2进行洗涤；

(3)通入底物：继续向微流控芯片的主通道1中通入蔗糖溶液(蔗糖溶液的浓度为50mM～1M)，蔗糖溶液流经主通道1后开始进入不同的侧通道2中，充分催化反应(催化反应的时间为10min～70min)后用血糖仪靠近微流控芯片的每个侧通道2出口对反应产物进行检测；如果某个侧通道2中的溶液用血糖仪检测出的结果显示为Lo或背景值，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中未被检出，目标DNA溶液中不含或少含对应的乙型肝炎病毒基因型(即被捕获在芯片表面的蔗糖酶的量极少，甚至没有，产生较小或者几乎不产生信号)；如果某个侧通道中的溶液用血糖仪检测出的结果显示数值在3～27.8之间，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中被检出，目标DNA溶液中含对应的乙型肝炎病毒基因型。

根据血糖仪上信号数值的大小，首先可以定性地判断待测目标DNA溶液中是否含相应的目标DNA。如图3所示，当在三个不同的微流控芯片中分别加入含HBV-B、HBV-C、HBV-D的目标DNA溶液时，微流控芯片中只有修饰了对应靶DNA捕获探针的侧通道有较高的信号值，芯片中其他侧通道的目标链被洗脱后不能结合报告探针，从而得到较低的信号值，此时随机链的对比通道也有一定的信号值，可能是芯片的非特异性吸附导致，但信号值较小。由图3可以看出，本发明方法对于HBV不同分型的区分是完全可行的。

根据血糖仪上信号数值的大小，还可以定量地分析待测目标DNA溶液中含相应的目标DNA的浓度数值大小。例如，当向本发明试剂盒的微流控芯片中加入不同浓度的某一种分型目标DNA(本实施例以HBV-C为例)时，随着目标物浓度的增加，血糖仪的信号数值增大(图8)，这说明随着目标物浓度的增加，捕获在芯片表面的蔗糖酶增多，其催化能力越强，如果根据常规的方法拟合得到信号数值与目标物浓度数值的线性回归方程后，即可根据血糖仪的信号数值大小，间接分析待测目标DNA溶液中目标物DNA的浓度含量。

检测应用效果考察1：在HBV-C基因分型的检测中对去杂交洗脱条件的考察。

由于本发明设计的用于HBV-B、HBV-C、HBV-D三种基因分型探针相互之间存在三到四个碱基的差异，要实现理想的分型结果，有必要对目标DNA与捕获探针之间的杂交洗脱等实验条件进行考察和优化。本实施例在洗脱过程中通过控制洗脱液中去离子甲酰胺的浓度对实验条件进行了改进和优化，在上述的检测乙型肝炎病毒不同分型的方法中，分别用洗脱液A(1×SSC，40％去离子甲酰胺，0.1％SDS)、洗脱液B(1×SSC，50％去离子甲酰胺，0.1％SDS)、洗脱液C(1×SSC，60％去离子甲酰胺，0.1％SDS)、洗脱液D(1×SSC，70％去离子甲酰胺，0.1％SDS)进行洗脱15min，其余操作步骤不变，检测结果如图4所示。从图4可以看出，当去离子甲酰胺的浓度为50％时，目标DNA的信号值与其他分型DNA之间的信号值的差异最大，所以我们优选采用去离子甲酰胺占50％的质量浓度作为洗脱液。

检测应用效果考察2：在HBV-C基因分型的检测中对催化底物反应时间的考察。

在上述的检测乙型肝炎病毒不同分型的方法中，将底物蔗糖的催化反应的时间分别设定为10min、20min、30min、40min、50min、60min、75min，其余操作步骤不变。考察检测结果如图5所示。由图5可见，随着催化反应时间增加，产生的葡萄糖增多，血糖仪测出来的信号数值越大；当催化时间为50min时，基本达到平台期，因此，本发明中最优选采用50min作为蔗糖酶的催化反应时间。

检测应用效果考察3：在HBV-C基因分型的检测中对催化底物浓度的考察。

在上述的检测乙型肝炎病毒不同分型的方法中，将底物蔗糖的浓度分别设定为0.05M、0.1M、0.5M、0.8M、1M，其余操作步骤不变，另外根据上文对催化底物反应时间的优化，加入蔗糖溶液后催化反应时间设定为50min，考察检测结果如图6所示。由图6可见，当蔗糖溶液的浓度为0.5M时，基本达到平台期，此时可以将靶DNA与其他分型进行十分显著的区分，因此本发明优选采用0.5M作为催化底物的最佳浓度。

检测应用效果考察4：在HBV-C基因分型的检测中对操作温度的考察。

在上述的检测乙型肝炎病毒不同分型的方法中，将构建好的微流控芯片的实验操作温度分别设定为4℃、25℃、37℃、50℃，其余操作步骤不变，另外根据上文的优化考察结果，将催化底物的浓度定为0.5M，催化反应时间定为50min，考察结果如图7所示。由图7可见，当实验反应温度较高时(37℃或50℃)，虽然靶DNA的信号值也比较高，但是同时也引起其他分型以及空白对照的信号有较大的升高，不易明显地区分三种分型；而当反应温度较低时(4℃)，所有的信号值都很低，可能在此温度下会大大降低DNA杂交的效率，且.蔗糖酶对底物蔗糖的催化效率在此时也较低。相比之下，在25℃的条件下，完全能满足区分靶DNA的要求，可以顺利实现血糖仪对此信号值的检测，因此，本发明实验操作的最佳温度为25℃。

检测应用效果考察5：不同浓度HBV-C的待测目标DNA溶液的考察。

在上述的检测乙型肝炎病毒不同分型的方法中，根据上文实施例中对检测条件的优化，将检测实验操作的温度定为25℃，催化底物的浓度定为0.5M，催化反应的时间定为50min，分别对浓度为10pM～100nM的HBV-C基因进行检测，检测结果如图8所示。由图8可知，采用本发明的试剂盒和血糖仪检测乙型肝炎病毒基因分型的方法，可灵敏检测10pM～100nM范围内的HBV不同分型DNA。

检测应用效果考察6：HBV-B和HBV-C的混合目标DNA溶液的考察。

根据上文实施例中对检测条件的优化，将检测实验操作的温度定为25℃，催化底物的浓度定为0.5M，催化反应的时间定为50min，对浓度为1nM的HBV-B和HBV-C混合基因型进行检测，检测结果如图10所示。由图10可知，当在微流控芯片中分别加入含1nM HBV-B和1nM HBV-C混合目标DNA溶液时，微流控芯片中只有修饰了HBV-B和HBV-C捕获探针的侧通道有较明显的信号，而修饰了HBV-D捕获探针侧通道与空白通道则信号相对较低，这可能是少量杂交及非特异性吸附所致。由图10可以看出，本发明方法对于HBV混合型的检测是完全可行的。

Claims (10)

1.一种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物，所述蔗糖酶-DNA复合物为链式分子结构，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子一端为蔗糖酶，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于乙型肝炎病毒不同基因型上的辅助探针，所述蔗糖酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基；所述蔗糖酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团；所述辅助探针的核苷酸序列为：

5’-SH-(T)₁₀ATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTG-3’。

2.一种用于配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片和报告探针溶液，所述微流控芯片主要由底片和盖片上下叠加而成，所述底片和盖片之间设有液流通道，其特征在于：该液流通道包括主通道和多个与主通道分别交汇的侧通道，各侧通道相互独立分隔开，不同侧通道的内表面中分别固定有针对乙型肝炎病毒不同分型的捕获探针；所述报告探针溶液为权利要求1所述蔗糖酶-DNA复合物配制成的溶液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述乙型肝炎病毒不同分型包括HBV-B、HBV-C、HBV-D中的至少两种；

针对所述HBV-B基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’-GTAACAGCGGCATAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’；

针对所述HBV-C基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’GTAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATGTTG(T)₁₀-biotin-3’

针对所述HBV-D基因型的捕获探针的核苷酸序列为：

5’-GTAACAGCGGTAAAAAGGGACTCAAGATGCTG(T)₁₀-biotin-3’。

4.一种如权利要求1所述的蔗糖酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：

(a)将0.1mM～2mM的所述辅助探针的溶液、0.75M～2M的磷酸盐缓冲液和15mM～60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室温下充分孵育，再使用超滤离心管反复离心得辅助探针溶液；

(b)将10mg/mL～20mg/mL的蔗糖酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐振荡混合，混合时保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，室温下振荡反应完全，然后用超滤离心管反复离心，得到sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液；

(c)将上述步骤(a)得到的辅助探针溶液和步骤(b)制得的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液混合，混合时其中的辅助探针与蔗糖酶的摩尔比控制在(5～20)∶1，室温下反应完全，再用超滤离心管反复离心，即得到蔗糖酶-DNA复合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(a)中，充分孵育的时间控制在1h～2h，所述超滤离心管为3K超滤离心管；

所述步骤(b)中，控制蔗糖酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的摩尔比为1∶(100～1000)，振荡反应完全的时间为1h～5h，所述超滤离心管为30K超滤离心管；

所述步骤(c)中，室温下反应完全的时间为36h～54h，所述超滤离心管为30K超滤离心管。

6.一种如权利要求2或3所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备蔗糖酶-DNA复合物：先按照权利要求4或5所述的制备方法制备得到蔗糖酶-DNA复合物，将该蔗糖酶-DNA复合物分散于缓冲液后配制得到所述报告探针溶液；

(2)制作微流控芯片：根据预先设计的微流控芯片尺寸，通过裁剪、组装、粘结得到带有所述底片、盖片和液流通道的微流控芯片；

(3)微流控芯片的修饰：在所述微流控芯片中加入biotin-BSA溶液，温育后用缓冲液冲洗；接着加入亲和素溶液，温育后用缓冲液冲洗；然后往向所述液流通道的各个侧通道中加入生物素标记的针对乙型肝炎病毒不同分型的不同捕获探针溶液，温育后用缓冲液冲洗，完成微流控芯片的修饰；将该微流控芯片与步骤(1)中的报告探针溶液组合包装后即得到试剂盒。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，所述缓冲液为0.1M～0.3MNaCl和0.1M～0.5M磷酸盐配制成的pH值为7.0～7.5的缓冲液；

所述步骤(3)中，第一次的温育时间控制在1h～4h，第二次和第三次的温育时间均控制在1h～2h；所述亲和素溶液的浓度控制在0.5μM～20μM，不同捕获探针溶液的浓度均控制在1μM～2μM。

8.一种用权利要求2或3所述的或者权利要求6或7所述制备方法得到的试剂盒配合血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的方法，包括以下步骤：

(1)杂交目标基因：向所述微流控芯片的主通道中通入待测的目标DNA溶液，目标DNA溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，待目标DNA溶液与侧通道内表面固定的捕获探针充分杂交反应后，引入去离子甲酰胺洗脱液对各个侧通道进行洗脱；

(2)杂交报告探针：继续向所述微流控芯片的主通道中通入报告探针溶液，报告探针溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，待报告探针溶液与侧通道内表面杂交上的目标DNA充分杂交反应后，引入缓冲液对各个侧通道进行洗涤；

(3)通入底物：继续向所述微流控芯片的主通道中通入蔗糖溶液，蔗糖溶液流经主通道后开始进入不同的侧通道中，充分催化反应后用血糖仪靠近微流控芯片的每个侧通道出口对反应产物进行检测；如果某个侧通道中的溶液用血糖仪检测出的结果显示为L0或背景值，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中未被检出；如果某个侧通道中的溶液用血糖仪检测出的结果显示有较高信号数值，则表明此侧通道中捕获探针对应的乙型肝炎病毒基因型在待测的目标DNA溶液中被检出。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，所述目标DNA溶液是由pH值为7.0～7.5的柠檬酸三钠缓冲液稀释配制而成；所述去离子甲酰胺洗脱液中去离子甲酰胺的体积分数为40％～70％；

所述步骤(3)中，蔗糖溶液的浓度为100mM～1M。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述方法的操作过程均控制在25℃～50℃温度下进行；

所述步骤(1)中，杂交反应的时间为1h～2h，所述甲酰胺洗脱液的洗脱时间至少为15min；

所述步骤(2)中，杂交反应的时间为0.5h～4h；

所述步骤(3)中，所述催化反应的时间为20min～75min。

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