CN101724691A

CN101724691A - CD11a、CD70基因甲基化水平定量检测方法

Info

Publication number: CN101724691A
Application number: CN200910044721A
Authority: CN
Inventors: 陆前进; 张秀娟; 周东蕊; 陆祖宏
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2029-11-06
Also published as: CN101724691B

Abstract

本发明公开了一种用于SLE早期诊断的DNA芯片以及CD11a和CD70甲基化水平的定量检测方法。该DNA芯片的探针由针对CD70或/和CD11a的CpG位点而设计的寡核苷酸序列组成，每个基因设计一对区分甲基化与非甲基化的探针。在建立CD70和CD11a荧光强度的标准化曲线后，利用该芯片，本发明还可以定量检测待检样本CD70和CD11a基因的甲基化水平。本发明的芯片能广泛用于红斑狼疮的早期诊断，本发明用于定量检测待检样品中红斑狼疮相关基因甲基化水平的方法为帮助进行红斑狼疮临床早期诊断、判断疾病活动性以及疗效和预后评价提供了一种的精确、廉价、快速的工具。

Description

CD11a、CD70基因甲基化水平定量检测方法

技术领域

本发明涉及用于系统性红斑狼疮早期诊断的基因芯片，还涉及基因甲基化定量检测方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，简称SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。作为一种典型的严重危害人类健康的自身免疫性疾病，其病因和发病机制非常复杂，医学界至今尚不十分清楚。目前，SLE的诊断主要依赖临床表现和实验室检查，临床表现包括如面颊部蝶形红斑等，实验室检查主要有狼疮带试验、抗核抗体谱等。但根据临床表现及实验室检查确诊时，患者往往已多器官系统受累。因此，如果能将SLE的诊断上升到基因水平，找到一种能用于临床的快速诊断工具，则能对该疾病的早期诊断和尽早干预起到重要作用。

发明人的研究表明：T细胞DNA低甲基化在SLE发病中起重要作用，这种低甲基化在CD11a(又称ITGAL，GeneID：3683；HGNC6148)和CD70(GeneID：970；HGNC：11937)这两个基因中表现明显。近些年来对SLE发病机制的研究表明SLE患者CD₄ ⁺T细胞中CD11a和CD70两个基因的特定CpG位点处于低甲基化状态，其甲基化改变及模式有望成为极具前途的SLE早期诊断标志。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于SLE早期诊断的DNA芯片。

本发明进一步目的在于提供一种检测待检样品中红斑狼疮相关基因CD11a和CD70甲基化水平的方法。

本发明用于诊断红斑狼疮的DNA芯片由基片和固定于基片上的探针组成，所述探针由针对CD70或/和CD11a的CpG位点而设计的寡核苷酸序列组成，每个基因设计一对区分甲基化与非甲基化的探针，采用氨基对每个探针5’末端进行活性基团的标记，固定DNA的基片用醛基修饰。

所述针对CD70或/和CD11a的CpG位点而设计的探针具体核苷酸序列为：

CD11a-M：5’NH₂-(T)₁₀-TTATCGTATTAGGTCGTTTA；

CD11a-U：5’NH₂-(T)₁₀-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA；

CD70-M：5’NH₂-(T)₁₀-ATACGCGCGCCACGATAC；

CD70-U：5’NH₂-(T)₁₀-AACATACACACACCACAATAC。

上述的DNA芯片的每个探针最好横向重复6次。

本发明检测待检样品中CD11a和CD70甲基化水平的方法包括步骤：(1)分别建立CD70和CD11a荧光强度的标准化曲线：针对CD11a和CD70基因分别建立甲基化的阳性与阴性质控品，阳性与阴性质控品按质量比0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0混合，5组质控品混合物分别与本发明的DNA芯片杂交，得到荧光图谱和荧光强度数据；阳性质控品杂交的荧光强度标记为M，阴性质控品杂交的荧光强度标记为U；以M/(M+U)为纵坐标，甲基化阳性产物在总产物中的百分比为横坐标，分别得到CD70和CD11a基因甲基化的标准曲线方程【A：CD70：y＝0.925x+0.017(R²＝0.9912)】和【B：CD11a：y＝0.933x-0.014(R^2＝0.9832)】；(2)取待检样品血，分选CD₄ ⁺T细胞，提取DNA，对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理，用荧光标记引物分别进行巢式PCR扩增，将PCR产物分别与本发明的DNA芯片进行杂交，分别读取荧光信号强度Y，将其分别带入上述CD70和CD11a的荧光强度标准曲线中，分别计算出X即为待检样本CD70和CD11a基因的甲基化百分比。

所述建立CD70和CD11a甲基化的阳性与阴性质控品的过程为：取正常人外周血，分选CD₄ ⁺T细胞，提取DNA，对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理，针对CD70和CD11a基因分别巢式PCR扩增经亚硫酸氢钠转化处理后的DNA，PCR产物回收纯化后与p-GEM T载体连接，克隆至DH5a感受态细胞，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点转变为TG的作为阴性质控品，而把仍为CG者作为阳性质控品。

所述针对CD11a进行巢式PCR时，第一轮PCR的引物为：上游5′-GAAGAATTCGTAGGTTGGTTTGAGTGTAGTGGTGTTTAAAA-3’；下游5′-CTCTCTAGAACTAAAACCACAAATACATACCACCATACCTAA-3’；

第二轮PCR引物为：上游5’-TTTAAGTAGTTGGGATTATAGGTAT-3’；下游5’Cy3-ATTAATAACTAATTATACTCCATTA-3’；

所述针对CD70巢式PCR第一轮引物为：

上游5’-GGTGAATTCTTTAAGGTTAGGAGTTTAAGTTTAGTT-3’；

下游5’-CAATCTAGAACTACACATTTATTAAAAATTAAATTA-3’；

第二轮引物为：

上游5’Cy3-GTTGAATTCGGTTAATATGGTGAAATTTTATTTTTAT-3’；

下游5’-CACTCTAGATACAACAAACATCCAAAAATTAAAAATA-3’。

本发明的用于诊断红斑狼疮的DNA芯片能广泛用于红斑狼疮的早期诊断，以达到提高诊断效率，降低诊断成本，缩短诊断时间的目的。

本发明用于定量检测待检样品中红斑狼疮相关基因甲基化水平的方法借助于红斑狼疮相关基因集成的甲基化定量检测芯片，为临床提供一种红斑狼疮早期诊断、疾病活动性以及疗效和预后评价的精确、廉价、快速的工具。根据标准曲线计算出该患者甲基化百分比，芯片的高通量与便捷解决了耗时费力的问题，应用方便，成本减低。

具体实施方式

实施例1制备用于检测红斑狼疮的DNA芯片

1.探针的设计

用于诊断红斑狼疮的DNA芯片由基片和固定于基片上的探针组成，基片可以是任何适用于固定寡核苷酸探针的载体。固定于基片上的探针则是针对CD70和CD11a特定CpG位点而设计的，根据DNA碱基序列识别的特异性原则，每个基因设计了一对探针来区分甲基化与非甲基化，探针序列见表1。

本发明的DNA芯片上可以只包含针对CD11a特定CpG位点而设计的用于定量检测该基因的DNA探针，或仅包含针对CD70特定CpG位点而设计的用于定量检测该基因的DNA探针，也可以同时包括两种探针。

表1

2.DNA探针的点样及固定

先将探针用碳酸缓冲液稀释至50umol/L，通过微阵列点样仪分别将表1中的各条探针横向重复6次点印在基片上。为了使寡核苷酸探针有效地固定于基片上，合成探针时，采用氨基直接进行5’末端活性基团的标记，固定DNA的玻片用醛基修饰，探针点印于玻片后置于37℃、80％的饱和湿度过夜进行进一步固定。

3.根据样本的芯片杂交结果与其测序结果的一致性来验证芯片的效度

针对CD70和CD11a每个基因挑选一个SLE病人和一个健康对照样本，一面用本发明的芯片进行定量分析，一面用传统的金标准亚硫酸氢钠测序，每个样本挑选20个克隆进行测序，计算其甲基化水平，两者相比较，具有较好的一致性(参见图4和图5)。

实施例2 CD11a、CD70基因甲基化定量检测方法

(一)建立CD11a、CD70基因甲基化标准曲线

1.制备CD11a、CD70阳性和阴性质控品

(1)取人外周血标本20ml；

(2)免疫磁珠分选CD₄ ⁺T细胞，具体步骤如下：

i.取肝素抗凝静脉血与等量PBS充分混匀。

ii.在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，使淋巴细胞分离液：PBS：待检血(体积比)＝1∶1∶1，用移液器将稀释后的肝素抗凝静脉血沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面。20℃水平2000rpm(加速减速均为0)离心30分钟。

iii.离心后管内分为四层，从上往下顺次为血浆和PBS液、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、红细胞层。单个核细胞层为血浆与淋巴细胞分离液处的一层白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。用毛细血管插到云雾层，小心吸取单个核细胞。置入另一干净离心管中，加入5倍以上体积的PBS，1500rpm(加速为8，减速为9)10分钟，离心洗涤细胞两次。将所得的单个核细胞悬液加入PBS洗涤一次，250g离心10分钟。弃上清；

iv.约每107个细胞加入80μl缓冲液和20μl MACS CD₄磁珠，混匀；

v.4℃避光孵育15分钟，每107个细胞再加入1～2ml缓冲液洗涤细胞；

vi.300g离心10分钟，弃上清，加入500μl缓冲液悬浮细胞；

vii.置LS分离柱于Midi MACS分选器中，3ml缓冲液湿润LS分离柱；

viii.将细胞悬液加入分离柱中，待完全滴尽后，加3ml缓冲液冲洗LS分离柱3次；所得的滤过液为除去CD₄ ⁺T细胞的单个核细胞，收集于15ml干净离心管，用于下一步分离CD₈ ⁺T细胞；

ix.将LS分离柱移出磁场，加入5ml缓冲液将滞留在LS分离柱中的CD₄ ⁺T细胞冲出；

(3)提取DNA；DNA抽提采用TIANamp Genomic DNA kit(血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒)提取，具体操作步骤如下：

i.上述分离出的CD₄ ⁺T细胞，加入200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

ii.加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混匀。

iii.加入220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴箱中放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

iv.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

v.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

vi.向吸附柱CB3中加入500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

vii.向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

viii.向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

ix.将吸附柱CB3放回废液收集管中，12,000rpm离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

x.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12,000rpm离心30秒。

xi.离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟。收集离出液。

(4)对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理；采用Qiagen公司的EpiTect

Bisulfite试剂盒处理CD₄ ⁺T细胞DNA，DNA标本来自第一部分实验提取所得，操作步骤按试剂盒说明书进行，具体如下：

i.往缓冲液BW中加入30ml无水乙醇；

ii.往缓冲液BD中加入30ml无水乙醇；

iii.将310μl无酶水加入310μg carrier RNA中，得到1μg/μl的carrier RNA溶液

iv.按1∶100体积往缓冲液BL中加入1μg/μl的carrier RNA溶液，使缓冲液BL中carrier RNA的浓度为10μg/ml；

v.根据需要处理的样本多少溶解Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加入800μl的无酶水，剧烈震荡5分钟至完全溶解；

vi.在200μl的PCR管中依次表2.5加入各成分，充分震荡混匀，

vii.在PCR仪中按表3条件进行亚硫酸氢钠转换；

表2 亚硫酸氢钠处理反应物组成

表3 亚硫酸氢钠处理反应条件

viii.反应结束后将PCR管简短离心，将所有的反应液体转至干净的1.5mlEP管中；

ix.加入560μl缓冲液BL(含10μg/mlcarrier RNA，见第4步)，震荡混匀，简短离心；

x.将上一步所得的所有液体全部转入带有收集管的EpiTect spin离心柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；

xi.往离心柱中加入500μl洗脱缓冲液BW，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；

xii.往离心柱中加入500μl缓冲液BD，室温孵育15分钟；13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；

xiii.13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中

xiv.往离心柱中加入500μl洗脱缓冲液BW，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；

xv.重复步骤xiv一次；

xvi.将离心管放入一个新的2ml的收集管中，13000rpm离心1分钟；

xvii.将离心管放入一个新的1.5ml的EP管中，加20μl缓冲液EB，12000rpm离心1分钟洗脱DNA，所得的液体即为纯化了的亚硫酸氢钠处理后的DNA。

(5)巢式PCR扩增经亚硫酸氢钠转化处理后的DNA；为了获得杂交信号，所用巢式PCR引物中的一条需用Cy3标记，具体见表4。PCR采用promega公司的GoTaq hot star polymerase系统，CD70及CD11a的巢式第一轮反应体系及反应条件见表5及表6，第二轮反应体系及反应条件见表7及表8。

表4 巢式PCR引物序列

表5 巢式PCR第一轮反应体系

表6 巢式PCR第一轮反应条件

表7 巢式PCR第二轮反应体系

表8 巢式PCR第二轮反应条件

(6)将巢式PCR产物进行回收纯化，操作过程按照回收纯化试剂盒(天根生物有限公司)的要求进行。

(7)将回收纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，具体过程如下：将反应缓冲液5μl，连接酶1μl，T载体1μl，(pGEM-T easy vector试剂盒提供)(Promega，Madison，WI，USA)与纯化后的DNA 3μl加入PCR管中，4℃过夜与载体连接。

(8)转化到DH5a感受态细胞，具体步骤为：

i.连接产物加入100μlDH5a感受态细胞中，冰上30分钟；

ii.42℃水浴90秒；

iii.冰上2分钟；

iv.加入800μl不含氨苄青霉素的LB液体培养基，置于摇床37℃，200rpm，1小时；

v.4000rpm离心10分钟，留沉淀涂于含氨苄青霉素的LB固体培养基上。培养基37℃倒置过夜生长；

vi.培养基上挑取独立，饱满的白色菌落作为重组阳性克隆，加至4ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃，300rpm过夜培养；

vii.抽提质粒后进行测序；

viii.测序结果进行序列比对，挑选CG位点转变为TG的作为阴性质控品，而把仍为CG者作为阳性质控品。

2.分别建立CD11a、CD70甲基化标准曲线

将甲基化阳性与阴性质控品PCR扩增，阳性与阴性扩增产物按质量比0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0混合，5组质控品混合物分别与实施例1的芯片杂交，得到荧光图谱和荧光强度数据(见图1)。其中，阳性质控品杂交的荧光强度标记为M，阴性质控品杂交的荧光强度标记为U。

以M/(M+U)为纵坐标，甲基化阳性产物在总产物中的百分比为横坐标，每组探针分别对应5个散点，进行一元线性回归分析，分别得到呈线性关系的CD70荧光强度线性回归方程【A：CD70：y＝0.925x+0.017(R²＝0.9912)】和标准曲线(见图2)，以及CD11a的荧光强度荧光强度线性回归方程【B：CD11a：y＝0.933x-0.014(R²＝0.9832)】和标准曲线(见图3)。

(二)样本CD11a、CD70基因甲基化定量检测

1.样本中CD11a、CD70的提取和扩增：取待检人外周血标本20ml；免疫磁珠分选CD4⁺T细胞；DNA抽提；对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理；巢式PCR。所有过程的具体操作步骤见(一)中。

2.扩增产物与DNA芯片杂交：将上述巢式PCR产物与实施例1中所述本发明的DNA芯片进行杂交，具体步骤为：取5-10ul的荧光标记产物花青素5与3X杂交液混合，与固定在玻片上的探针进行杂交，盖上盖玻片，放入湿润的杂交盒中孵育两个小时，前一小时42℃，后一小时改为37℃，然后将玻片用2XSSc，0.2XSSc/0.5％SDS各洗一次，每次五分钟，接着双蒸水洗两次，每次五分钟，然后氮气吹干，在LuxScan-10K/A microarray scanner上进行扫描。

3.信号检测与基因甲基化计算：杂交信号可以通过包含绿光通道的激光芯片扫描仪(本方法所用为LuxScan-10K/A microarray scanner)(北京博奥生物有限公司)进行检测。扫描获得杂交信号，用分析软件(Genepix pro 3.0)提取每个信号的荧光强度值，为减少偏移，取重复的六个信号荧光强度的平均值作为Y值，将其带入相应的标准曲线中，根据公式计算出的X值即为该样本的甲基化百分比。

为了进一步对本发明的甲基化定量检测方法进行验证，发明人进一步对20名SLE病人以及20名健康对照进行了芯片分析。芯片检测结果(参见图6和图7)显示，与健康对照相比，SLE病人的CD70和CD11a甲基化水平明显降低(参见图8)。

以上对本发明实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员根据本发明作出各种变通均应属于本发明所附的权利要求所属的范围。

Claims

1.一种用于诊断红斑狼疮的DNA芯片，由基片和固定于基片上的探针组成，其特征在于：所述探针由针对CD70基因或CD11a基因的CpG位点而设计的寡核苷酸序列组成，每个基因包括一对区分甲基化与非甲基化的探针。

2.一种用于诊断红斑狼疮的DNA芯片，由基片和固定于基片上的探针组成，其特征在于：所述探针由针对CD70基因和CD11a基因的CpG位点而设计的寡核苷酸序列组成，每个基因包括一对区分甲基化与非甲基化的探针。

3.如权利要求1或2所述的DNA芯片，其特征在于：所述探针5’末端采用氨基进行活性基团的标记，采用醛基对固定DNA的基片进行修饰。

4.如权利要求3所述的DNA芯片，其特征在于：所述探针核苷酸序列为：

CD11a-M：5’NH₂-(T)₁₀-TTATCGTATTAGGTCGTTTA；

CD11a-U：5’NH₂-(T)₁₀-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA；

CD70-M：5’NH₂-(T)₁₀-ATACGCGCGCCACGATAC；

CD70-U：5’NH₂-(T)₁₀-AACATACACACACCACAATAC。

5.如权利要求4所述的DNA芯片，其特征在于：每个探针重复6次。

6.一种CD11a、CD70甲基化水平定量检测方法，包括步骤：

(1)分别建立CD70和CD11a荧光强度的标准化曲线：针对CD11a和CD70基因分别建立甲基化的阳性与阴性质控品，阳性与阴性质控品按质量比0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0混合，5组质控品混合物分别与本发明的DNA芯片杂交，得到荧光图谱和荧光强度数据；阳性质控品杂交的荧光强度标记为M，阴性质控品杂交的荧光强度标记为U；以M/(M+U)为纵坐标，甲基化阳性产物在总产物中的百分比为横坐标，分别得到CD70和CD11a基因甲基化的标准曲线方程【A：CD70：y＝0.925x+0.017】和【B：CD11a：y＝0.933x-0.014】；

(2)取待检样品血，分选CD₄ ⁺T细胞，提取DNA，对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理，用荧光标记引物分别进行巢式PCR扩增，将PCR产物分别与本发明的DNA芯片进行杂交，分别读取荧光信号强度Y，将其分别带入上述CD70和CD11a的荧光强度标准曲线中，分别计算出X即为待检样本CD70和CD11a基因的甲基化百分比。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述建立CD70和CD11a甲基化的阳性与阴性质控品的过程为：取正常人外周血，分选CD₄ ⁺T细胞，提取DNA，对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理，针对CD70和CD11a基因分别巢式PCR扩增经亚硫酸氢钠转化处理后的DNA，PCR产物回收纯化后与p-GEM T载体连接，克隆至DH5a感受态细胞，对重组阳性克隆进行测序，挑选CG位点转变为TG的作为阴性质控品，而把仍为CG者作为阳性质控品。

8.如权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于：所述针对CD11a进行巢式PCR时，第一轮PCR的引物为：上游

5′-GAAGAATTCGTAGGTTGGTTTGAGTGTAGTGGTGTTTAAAA-3’；下

游5′-CTCTCTAGAACTAAAACCACAAATACATACCACCATACCTAA-3’；

第二轮PCR的引物为：上游5’-TTTAAGTAGTTGGGATTATAGGTAT-3’；

下游5’Cy3-ATTAATAACTAATTATACTCCATTA-3’；

所述针对CD70巢式PCR第一轮引物为：

上游5’-GGTGAATTCTTTAAGGTTAGGAGTTTAAGTTTAGTT-3’；

下游5’-CAATCTAGAACTACACATTTATTAAAAATTAAATTA-3’；

第二轮PCR的引物为：

上游5’Cy3-GTTGAATTCGGTTAATATGGTGAAATTTTATTTTTAT-3’；

下游5’-CACTCTAGATACAACAAACATCCAAAAATTAAAAATA-3’。