CN103205418B - 一种在dna重亚硫酸盐转化过程中纯化dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，属于核酸转化和纯化技术领域。本发明方法在DNA重亚硫酸盐转化体系中加入一种能够防止DNA片段化而降解的DNA保护剂，使得DNA在重亚硫酸盐处理过程中不至于片段化而降解。进而有效的提高了处理后DNA的质量，使得核酸的回收率达到了70%左右，并且增加了转化后的PCR及其他分析技术的灵敏度。本发明方法使得整个DNA重亚硫酸盐处理过程更加简单，快捷，同时提高了处理后DNA的质量。

Description

一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，有利于在重亚硫酸盐转化过程中加快反应速度，保护DNA的完整性，属于核酸转化和纯化技术领域。

背景技术

虽然检测DNA甲基化的方法有很多种，但是在众多方法中，研究人员首先都会使用到一项技术，那就是DNA的重亚硫酸盐转化。DNA的重亚硫酸盐转化会将DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化了的胞嘧啶则保持不变。因此，通过随后的测序、甲基化特异性PCR或芯片等分析手段来比较处理前和处理后的DNA序列，就能确定DNA待检序列中哪些碱基是甲基化了的。

尽管这种转化在理论上很简单，但是重亚硫酸盐转化真正要做起来却并非那么容易。因为重亚硫酸盐转化的条件非常苛刻，比如在反应体系中需要提供高浓度的重亚硫酸盐来完成未甲基化胞嘧啶的转化，而且还需要保证双链DNA分子长时间处于解链状态以便于进行有效的转化。因此，DNA重亚硫酸盐转化的体系通常是一种高盐，高温和低pH值的条件。但是在这种条件下，反应体系中会产生大量的活性氧基团，这种活性氧会使DNA发生片段化并发生降解，因此将导致转化后的PCR及后续分析技术灵敏度降低，同时也会导致DNA的回收率下降，有时甚至达不到50%。

基于上述重亚硫酸盐转化的特点，传统的转化方法为保证DNA的完整性通常将转化条件优化的相对缓和，但在这种缓和的处理条件下，研究人员将会牺牲大量的处理时间，因此将会导致整个处理流程非常繁琐和耗时，一般都会消耗18个小时左右。但是即便是这样，对于珍贵的微量样品（比如1ng），由于DNA的降解仍不可避免，所以传统方法的处理效果也不尽如人意。

发明内容

本发明的目的是提出一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，通过采用一种新的DNA保护剂来防止DNA在重亚硫酸盐转化过程中发生片段化和降解，同时也使整个重亚硫酸盐转化更加高效、快速。

本发明所涉及的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，包括以下步骤：

（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐：0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（15～25摄氏度），得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：6～8克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升，将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到纯化的DNA溶液。

上述方法中所述的硅膜吸附柱为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附柱可从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

本发明提出的在DNA重亚硫酸盐转化过程中防止DNA降解的方法，其优点是：

1、本发明方法使用了一种新的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，因此使得DNA在重亚硫酸盐处理过程中不至于片段化而降解。进而有效的提高了处理后DNA的质量，使得核酸的回收率达到了70%左右，并且增加了转化后的PCR及其他分析技术的灵敏度。

2、通过使用本发明的方法，可以使得重亚硫酸盐处理过程向着更节省时间的方向进行，因此可以大大的缩短重亚硫酸盐处理时间，可将传统的18个小时的处理时间缩短到目前的2小时。

附图说明

图1是本发明方法的实施例的结果图，通过本发明方法处理4个1000纳克人类基因DNA组样品的后续甲基化特异性PCR电泳检测图。

其中，泳道M：脱氧核糖核酸分子量标准（TIANGEN，100bp DNA Ladder）。泳道1～4：以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化后的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。泳道5～8：以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化前的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。

具体实施方式

本发明提出的在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，包括以下步骤：

（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐：0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（15～25摄氏度），得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：6～8克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：11～13克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升，将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到纯化的DNA溶液。

本发明方法中所述的硅膜吸附柱，为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附柱可从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

以下介绍本发明方法的实施例。

实施例：

通过本发明方法分别处理4份10微升（DNA的量为1000纳克）的人类基因组样品，并通过后续的甲基化特异性PCR检测样品的处理效果。具体的操作步骤如下：

（1）在200微升的离心管中加入10微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1.5克，重亚硫酸盐：0.4克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.5，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2.5克，加去离子水，溶解后定容至1000毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温（25摄氏度），得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：12克，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：7克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至6.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）：12克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至9.5，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：750毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：12克，无水乙醇：750毫升，将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到纯化的DNA溶液。

上述方法中所述的硅膜吸附柱为商业化耗材，并且与其收集管配套使用。此吸附柱可从天根生化科技（北京）有限公司购买，其货号为RK125-B。

为验证纯化后DNA的质量，需要通过甲基化特异性PCR反应来检测，具体流程如下：

（1）在200微升离心管中依次加2微升重亚硫酸盐处理后的DNA，1微升上游引物（10微摩尔/升），1微升下游引物（10微摩尔/升），1.6微升dNTP（2.5毫摩尔/升），2微升反应缓冲液和0.4微升的DNA聚合酶（2.5单位/微升），并用去离子水补足体积至20微升。

（2）将步骤（1）配制好的反应体系进行PCR反应。反应过程中，预变性程序为：95摄氏度5分钟；循环步骤为：94摄氏度20秒，60摄氏度30秒，72摄氏度20秒，循环次数为35个；随后的延伸程序为72摄氏度5分钟；最后将反应体系冷却至室温（25摄氏度）。

（3）步骤（2）的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

图1是本发明方法的实施例的结果图，通过本发明方法处理4个1000纳克人类基因DNA组样品的后续甲基化特异性PCR电泳检测图。

其中，泳道M：脱氧核糖核酸分子量标准（TIANGEN，100bp DNA Ladder）。泳道1～4：以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化后的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。泳道5～8：以使用本发明方法处理的4个人类基因组样品为模板，以按照转化前的p16基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异性PCR结果。

Claims (1)

1.一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；

其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐：0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；

其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000毫升；

（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温，得到第一溶液；

（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；

其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷：11～13克，乙二胺四乙酸二钠：6～8克，将两种组分称量后与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷：11～13克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱放入收集管中；

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；

其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升，将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；

（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步骤一次；

（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；

（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到纯化的DNA溶液。