CN103966205A - 从血液中提取核糖核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从血液中提取核糖核酸的方法，其包括向全血样品中加入含有阳离子表面活性剂的快速细胞裂解液，混匀，静置；清洗后离心分离，去除上层溶液，保留沉淀物；在沉淀物中加入高离子浓度的核糖核酸纯化液，混匀，静置；离心分离，取出离心分离后的溶液部分，得到核糖核酸溶液。本发明的从血液中提取核糖核酸的方法可以使血液核糖核酸的提取过程更加高效、快速、简便，无需先进行白细胞的分离，且用本发明的提取方法可以获得较现有技术完整性更好、纯度更高的核糖核酸，更加适用于对核糖核酸及相关技术的实验、研究、分析。
Description
技术领域
本发明涉及生物中核酸纯化技术领域，尤其涉及一种快速从血液中提取核糖核酸的方法。
背景技术
血液是人和动物体内循环系统中的液体组织，它保持着整个身体与外界环境间的联系，也维持着各器官组织间的相互联系，对维持生命起重要作用。由于其比较容易获得，在基础和临床医学研究中具有相当重要的地位。血液可以作为造血系统疾病研究中的分子标志以及用于体外诊断系统的开发，还可以用于血液系统外众多系统疾病的分子监测。
其中，有效提取血液中的核糖核酸(简称RNA)是最重要的过程。由于血液本身的易凝固性以及血液内多种细胞的复杂性，无法像实体组织那样冷冻后再提取RNA，导致很难提取到高质量高纯度的RNA。有研究表明，在采血后的几个小时之内，RNA即迅速且显著降解，因此，RNA的非常不稳定性是提取血液中RNA的最大技术难题之一。
中国专利CN102154264B公开了一种提取血液总核糖核酸的方法，其首先向全血中加入快速红细胞裂解液，对混合物进行离心分离，取出离心分离的沉淀物，在其中加入悬浮液，再依次加入裂解液和蛋白酶K溶液，混匀后加入无水乙醇，再混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，加入去蛋白液和脱氧核糖核酸酶溶液，进行两次去蛋白离心，加入漂洗液进行脱盐离心，最后干燥离心后，加入无核糖核酸酶的水洗脱离心，得到核糖核酸溶液。
可见，上述该专利提取核糖核酸的过程仍然复杂，步骤繁多且需分批加入多种试剂，增加了工艺成本，仍无法从根本上解决现有技术存在的不足。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的问题，而提供一种新的从血液中快速提取核糖核酸的方法，解决现有工艺效率低、成本高等技术问题。
本发明的从血液中提取核糖核酸的方法，其包括以下步骤：
a.向全血样品中加入含有阳离子表面活性剂的快速细胞裂解液，混匀，并将该混合物在室温条件下静置；
b.将步骤a中混合物进行离心分离，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
c.清洗该沉淀物一次或多次；
d.在步骤c中得到的沉淀物中加入核糖核酸纯化液，混匀，并将所得混合物在室温条件下静置；
e.将步骤d中混合物进行离心分离，取出离心分离后的溶液部分，得到核糖核酸溶液。
进一步地，该阳离子表面活性剂在裂解液总量的重量体积百分比为0.2-1％，其选自下式(I)化合物中的一种或多种：
其中，R1选自C10-16的烷基，R2选自Cl﹣、Br﹣、HSO4 ﹣、HSO3 ﹣和COOH﹣。
进一步地，该阳离子表面活性剂选自十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或多种。
进一步地，该快速细胞裂解液还含有去垢剂，该去垢剂在裂解液总量的重量体积百分比为0.1-10％。该去垢剂用于破细胞膜并避免形成蛋白质沉淀。
进一步地，该去垢剂选自Tween-20(吐温20，聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物)和TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)中的一种或多种。
进一步地，该快速细胞裂解液还含有缓冲液，该缓冲液在裂解液总量的重量体积百分比为0.5-3％且其pH值为3.8-4.2。
进一步地，该缓冲液含有柠檬酸盐。
进一步地，该快速细胞裂解液的体积是全血样品的3-5倍。
进一步地，步骤c中清洗该沉淀物包括向该沉淀物中加入不含核酸酶的水，该不含核酸酶的水的体积是全血样品的4-6倍，混匀并离心分离，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物。
进一步地，步骤c包括清洗该沉淀物一次或多次，直至该沉淀物不显明显的红色。
进一步地，该核糖核酸纯化液为高离子浓度，其体积是全血样品的0.5-1.5倍。
进一步地，该核糖核酸纯化液含有缓冲液或/和氯化钠溶液，该缓冲液在纯化液总量的重量体积百分比为0.5-3％且其pH值为5.5-6.8，该氯化钠溶液在纯化液总量的重量体积百分比为5.5-10％。
进一步地，该缓冲液含有柠檬酸盐。
进一步地，该柠檬酸盐为柠檬酸钠。
进一步地，该核糖核酸纯化液含有氯化钠溶液和核糖核酸稳定剂，该氯化钠溶液在纯化液总量的重量体积百分比为5.5-10％，该稳定剂在纯化液总量的重量体积百分比为0.1-3％。
进一步地，该稳定剂为RNasin(核糖核酸酶抑制剂)。
进一步地，步骤b、步骤c和/或步骤e中离心分离的离心力为5000-10000g，离心时间为5-10分钟，步骤a中静置时间为15-30分钟，步骤d中静置时间为5-10分钟。
本发明所述各物质均由市售可得。
本发明的从血液中提取核糖核酸的方法可以使血液核糖核酸的提取过程更加高效、快速、简便，无需先进行白细胞的分离，且用本发明的提取方法可以获得较现有技术完整性更好、纯度更高的核糖核酸，更加适用于对核糖核酸及相关技术的实验、研究、分析。
附图说明
为能更清楚理解本发明的目的、特点和优点，以下将结合附图对本发明的较佳实施例进行详细描述，其中：
图1是利用本发明实施例1得到的核糖核酸溶液在1％的琼脂糖电泳中进行分析的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
(1)向100微升人全血样品中加入400微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.5％的十二烷基三甲基氯化铵，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置20分钟，形成十二烷基三甲基氯化铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入500微升不含核酸酶的水，充分混匀；其中，因为核酸酶会破坏核糖核酸，因此清洗沉淀物的试剂不能含有核酸酶，可以本领域常用的清洗剂，或亦可用纯水清洗，清洗的目的是为了将沉淀物中其他杂质去除，如蛋白质等；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
重复(3)和(4)一次，直至沉淀物不显明显的红色；
(5)在(4)中沉淀物中加入100微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分比为8％的氯化钠溶液，充分混匀，并在室温条件下静置10分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
将得到的核糖核酸溶液在1％的琼脂糖凝胶电泳中进行分析，结果如图1所示。其中，本分析方法为本领域常用手段，为通过溴化乙啶的染色然后在紫外灯下观测到的结果，图1中Genomic DNA表示染色体脱氧核糖核酸；28s rRNA表示28s核糖体核糖核酸；18srRNA表示18s核糖核酸；Small RNA表示小分子核糖核酸。可见，本实施例1的方法可以快速提纯核糖核酸分子，而且核糖核酸分子的完整度相当高。
实施例2
(1)向100微升小鼠全血样品中加入300微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.2％的十四烷基三甲基氯化铵以及5％的Tween-20，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置15分钟，形成十四烷基三甲基氯化铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为5000g，离心时间为10分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入400微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为5000g，离心时间为10分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(5)在(4)中沉淀物中加入50微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为6％的氯化钠溶液以及2％的核糖核酸酶抑制剂RNasin，充分混匀，并在室温条件下静置5分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例3
(1)向100微升人全血样品中加入500微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.7％的十六烷基三甲基溴化铵以及10％的TritonX-100，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置30分钟，形成十六烷基三甲基溴化铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为10000g，离心时间为5分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入600微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为10000g，离心时间为5分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
重复(3)和(4)两次，直至沉淀物不显明显的红色；
(5)在(4)中沉淀物中加入150微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为2％的柠檬酸钠溶液(pH为6)，充分混匀，并在室温条件下静置10分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例4
(1)向200微升小鼠全血样品中加入800微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.9％的十烷基三甲基硫酸铵以及2％的柠檬酸钠溶液(pH为4)，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置25分钟，形成十烷基三甲基硫酸铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为8000g，离心时间为7分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入800微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为8000g，离心时间为7分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
重复(3)和(4)一次，直至沉淀物不显明显的红色；
(5)在(4)中沉淀物中加入140微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为0.5％的柠檬酸钠溶液(pH为5.5)以及5.5％的氯化钠溶液，充分混匀，并在室温条件下静置8分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例5
(1)向200微升小鼠全血样品中加入800微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为1％的十六烷基三甲基亚硫酸铵、0.5％的柠檬酸钠溶液(pH为3.8)以及0.1％的TritonX-100，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置20分钟，形成十六烷基三甲基亚硫酸铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为6000g，离心时间为9分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入900微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为6000g，离心时间为9分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(5)在(4)中沉淀物中加入270微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为3％的柠檬酸钠溶液(pH为6.8)以及10％的氯化钠溶液，充分混匀，并在室温条件下静置6分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例6
(1)向100微升小鼠全血样品中加入350微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.4％的十二烷基三甲基溴化铵，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置25分钟，形成十二烷基三甲基溴化铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入550微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
重复(3)和(4)两次，直至沉淀物不显明显的红色；
(5)在(4)中沉淀物中加入100微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为7％的氯化钠溶液以及0.1％的核糖核酸酶抑制剂RNasin，充分混匀，并在室温条件下静置7分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例7
(1)向100微升小鼠全血样品中加入450微升快速细胞裂解液，该裂解液含有重量体积百分含量为0.6％的十四烷基三甲基醋酸铵、3％的柠檬酸钠溶液(pH为4.2)以及6％的Tween-20，充分混匀该混合物，并将该混合物在室温条件下静置30分钟，形成十四烷基三甲基醋酸铵和核糖核酸的沉淀物；
(2)将(1)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(3)在(2)中沉淀物中加入500微升不含核酸酶的水，充分混匀；
(4)将(3)中沉淀物进行进行离心分离，离心力为7000g，离心时间为8分钟，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
(5)在(4)中沉淀物中加入100微升核糖核酸纯化液，该纯化液含有重量体积百分含量为8.5％的氯化钠溶液以及3％的核糖核酸酶抑制剂RNasin，充分混匀，并在室温条件下静置9分钟，这时沉淀中的核糖核酸就游离到溶液中；
(6)将(5)产物进行离心分离，小心取出溶液部分，不要混入沉淀部，得到核糖核酸溶液。
实施例8
本实施例删去了实施例1中的(3)和(4)的清洗步骤，保留其他步骤，结果是核糖核酸分离的效果不佳，沉淀物中有蛋白质等杂质，导致核糖核酸的产率低，纯度也受较大影响。
Claims (17)
1.一种从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
a.向全血样品中加入含有阳离子表面活性剂的快速细胞裂解液，混匀，并将该混合物在室温条件下静置；
b.将步骤a中混合物进行离心分离，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物；
c.清洗该沉淀物一次或多次；
d.在上述沉淀物中加入核糖核酸纯化液，混匀，并将所得混合物在室温条件下静置；
e.将步骤d中混合物进行离心分离，取出离心分离后的溶液部分，得到核糖核酸溶液。
2.根据权利要求1所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该阳离子表面活性剂在裂解液总量的重量体积百分比为0.2-1％，其选自下式(I)化合物中的一种或多种：
其中，R1选自C10-16的烷基，R2选自Cl﹣、Br﹣、HSO4 ﹣、HSO3 ﹣和COOH﹣。
3.根据权利要求2所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该阳离子表面活性剂选自十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该快速细胞裂解液还含有去垢剂，该去垢剂在裂解液总量的重量体积百分比为0.1-10％。
5.根据权利要求4所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该去垢剂选自Tween-20和TritonX-100中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该快速细胞裂解液还含有缓冲液，该缓冲液在裂解液总量的重量体积百分比为0.5-3％且其pH值为3.8-4.2。
7.根据权利要求6所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该缓冲液含有柠檬酸盐。
8.根据权利要求1至7任一项所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该快速细胞裂解液的体积是全血样品的3-5倍。
9.根据权利要求1至7任一项所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：步骤c中清洗该沉淀物包括向该沉淀物中加入不含核酸酶的水，该不含核酸酶的水的体积是全血样品的4-6倍，混匀并离心分离，去除离心分离后的上层溶液，保留沉淀物。
10.根据权利要求9所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：步骤c包括清洗该沉淀物一次或多次，直至该沉淀物不显明显的红色。
11.根据权利要求1所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该核糖核酸纯化液为高离子浓度，其体积是全血样品的0.5-1.5倍。
12.根据权利要求11所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该核糖核酸纯化液含有缓冲液或/和氯化钠溶液，该缓冲液在纯化液总量的重量体积百分比为0.5-3％且其pH值为5.5-6.8，该氯化钠溶液在纯化液总量的重量体积百分比为5.5-10％。
13.根据权利要求12所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该缓冲液含有柠檬酸盐。
14.根据权利要求13所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该柠檬酸盐为柠檬酸钠。
15.根据权利要求1或11所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该核糖核酸纯化液含有氯化钠溶液和核糖核酸稳定剂，该氯化钠溶液在纯化液总量的重量体积百分比为5.5-10％，该稳定剂在纯化液总量的重量体积百分比为0.1-3％。
16.根据权利要求15所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：该稳定剂为RNasin。
17.根据权利要求9所述的从血液中提取核糖核酸的方法，其特征在于：步骤b、步骤c和/或步骤e中离心分离的离心力为5000-10000g，离心时间为5-10分钟，步骤a中静置时间为15-30分钟，步骤d中静置时间为5-10分钟。
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