CN103160496A - 一种大型实验动物血液总rna提取和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血液总RNA提取和纯化方法，具体地说是利用一种大型实验动物血液为样本，用改良的红细胞裂解液裂解红细胞，通过异硫氰酸胍法提取总RNA并运用改进oligo(dT)-纤维素层析法对总RNA进行纯化，最终获得大型实验动物血液poly(A)⁺RNA。而本发明获得的纯化后的poly(A)⁺RNA可以在研究基因功能及其表达调控、阐明疾病发生机理、寻找药物治疗靶点等诸多方面均具有重要的、不可替代的应用价值。

Description

一种大型实验动物血液总RNA提取和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种血液总RNA提取和纯化方法，具体地说是利用一种大型实验动物血液为样本，改良的红细胞裂解液裂解红细胞，通过异硫氰酸胍法提取总RNA并运用改进的oligo(dT)-纤维素层析法对总RNA进行纯化，最终获得大型实验动物血液poly(A)⁺RNA。此发明属于基础生命科学、动物遗传资源学及分子生物学的交叉学科领域。

背景技术

实验动物是现代生命科学研究的重要组成部分，是生物医学乃至整个生命科学的基础和重要支撑条件。实验动物是以科学实验为目的，经人工饲养、繁殖，对其携带的微生物或寄生虫进行控制，遗传背景明确、来源清楚，而应用于科学研究、教学、生产和鉴定以及其他科学试验的动物。动物实验已被广泛用于科学研究的各个领域，尤其在生物医学研究中更是非常重要的研究手段。随着现代生物学技术迅猛发展，特别是转基因技术、基因敲除技术、克隆技术等其他分子技术在实验动物模型制作中得到广泛应用，从而使实验动物品种、品系及具有人类疾病特征的模型动物种类数量快速增长。重视动物实验问题，既是自然科学发展的必然趋势，也是社会科学发展的必然结果。当前，基因工程技术的飞速发展，实验动物科学也迎来一个革命性时代，这使得在实验动物活体内集整体水平、细胞水平和分子水平于一体的研究成为可能，从而促进生物医学的整体研究。

实验动物是科学研究的基础和重要支撑条件。在医学、化工、农业、轻工、环保、航空、商检、军工等众多领域的科学研究、安全评价、效果验证和新技术方法的探索中，实验动物作为重要的自然科技资源发挥着其他手段不可替代的作用。因此，实验动物资源的合理开发与科学利用与社会经济发展和科技进步有着密切的内在联系。作为一种科技含量较高的生物技术产品，实验动物及其相关研究是一项基础性强的、高新技术发展活跃的研究领域，其发展和应用程度已成为衡量一个国家或地区科学技术水平高低的重要标志之一。

DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。大型实验动物身上的特异基因是及其珍贵的遗传资源。实验动物遗传工程技术的发展、完善，为推动生命科学飞跃发展提供了有力工具。实验动物遗传工程在研究基因功能及其表达调控、阐明疾病发生机理、寻找药物治疗靶点等诸多方面均具有重要的、不可替代的应用价值.

发明内容

本发明是提供大型实验动物血液总RNA和poly(A)⁺RNA

本发明提供大型实验动物血液总RNA的提取方法，其中利用大型实验动物血液作为样本，通过异硫氰酸胍法提取总RNA

本发明提供大型实验动物血液总RNA纯化方法，其中利用大型实验动物总RNA为样本，通过改进的oligo(dT)-纤维素层析法纯提取poly(A)⁺RNA

具体实施方式

1.总RNA的提取

(1)取新鲜血液加入改进的红细胞裂解液(155mmol/LNH₄CL、0.1mmol/LEDTA和12mmol/LKHCO3)，3000rpm/min离心15min，获得白细胞

(2)加入1ml异硫氰酸胍，转移到1.5ml离心管中，混匀后室温静置5min；

(3)加入0.2ml苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，漩涡振荡器振荡15s混匀，室温静置2～3min；

(4)4℃ 12000r/min离心15min；

(5)取上层水相到另一离心管中，加入400μl异丙醇，混匀后室温静置10min；

(6)4℃ 12000r/min离心10min，去上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀两次；

(7)37℃ 5～10min晾干乙醇；

(8)将RNA溶于50～100μl无Rnase的DEPC处理过的水中。；

(9)紫外分光光度计测定OD260/OD280检测提取总RNA的纯度

2.甲醛变性电泳

(1)电泳槽用0.3％ H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。

(2)铺胶(20ml)：琼脂糖0.24g(1MOPS 2.0ml无RNase水17.4ml 10×MOPS2.0ml 37％甲醛0.6ml EB 1ml将琼脂糖加水融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60℃左右，再加甲醛和EB。(若铺大胶可将上述各试剂的量加大2倍)。

(3)RNA样品处理(以一条泳道为例)

10×MOPS             1.0μl

37％甲醛             3.5μl

甲酰胺               10.0μl

RNA样品              4.5μl(20μg/ml)

与55℃变性15min，冰浴5min

(4)加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液(10×)

(5)加样和电泳

将凝胶预电泳5min，电压降为5v/cm。随后加样品和标准物，以3-4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。

(6)电泳结束后，在紫外灯下，仔细测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离，并同荧光尺一起拍照，以记录标准物的位置。

3.Poligo(dT)-纤维素层析法提取poly(A)+RNA

(1)取oligo(dT)-纤维素0.5～1.0g，用0.1mol/L NaOH重悬。

(2)用oligo(dT)-纤维素(0.5～1.0ml柱体积)灌注DEPC处理过的一次性柱子(或塞以无菌玻璃毛的巴式滴管，300℃烘烤灭菌4h)。用3倍柱体积DEPC处理过的水洗涤柱子。

(3)用无菌的1×装柱缓冲液(用无菌的DEPC处理过的水稀释2×的贮存液)洗涤柱子，直到流出液的pH值＜8.0。用pH试纸测试

(4)用双蒸灭菌的水溶解RNA，65℃，5min处理溶液。将溶液快速冷却到室温，并加入1倍体积的2×装柱缓冲液。

柱上poly(A)+的恢复

(5)将RNA溶液加到柱上，并立即用无菌的管子收集流出液。当所有的RNA溶液进入柱子时，用1倍体积的1×装柱缓冲液洗柱，继续收集流出液。

(6)当所有的液体流出柱子后，65℃加热收集液5min，重新加到柱子中。再次收集流出液。

(7)用5～10倍柱体积的1×装柱缓冲液洗涤柱子，用无菌塑料管(如微量离心管)收集1ml洗涤液。

(8)按1∶20比例稀释各部分收集液，用石英杯或处理过的异丁烯杯测量260nm出的吸收值，以1×装柱缓冲液作为空白对照。

(9)将包含大多数OD260物质的部分用2.5倍体积的乙醇沉淀。从柱中洗脱poly(A)+RNA

(10)用2～3倍柱体积的无菌、无RNA酶的洗脱缓冲液从oligo(dT)-纤维素柱上洗脱poly(A)+RNA。收集相当多于1/2～1/3柱体积的流出液。

(11)用石英杯或处理过的异丁烯杯测量各部分收集液在260mn处的吸光值。混合包含洗脱RNA的部分。RNA的进一步纯化(可选)经过一轮oligo(dT)-纤维素柱的层析得到的物质通常会包含大约相同数量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸RNA，可以按下面的步骤进一步纯化。

(12)为进一步纯化poly(A)+RNA，65℃加热准备的RNA 3min，然后迅速冷却到室温。用5mol/L NaCl调整洗脱RNA中的NaCl浓度至0.5mol/L，在同一个oligo(dT)-纤维素柱上进行第二轮层析(重复步骤3和5～11)。

(13)对于第二轮oligo(dT)-纤维素柱层洗脱下来的poly(A)+RNA，加入3mol/L的乙酸钠(pH5.2)至终浓度0.3mol/L。混合均匀。加入2.5倍体积冰冷的乙醇，混合，将该溶液置于冰上至少30min。

(14)在10000g(相当于Sorvall SS-34转子9000r/min)，4℃下离心15min。小心弃掉上清，用70％乙醇洗涤沉淀(通常是不可见的)。稍做离心，吸出上清，将敞口的管子倒置几分钟，使大部分剩余酒精蒸发。不要使沉淀干燥。

(15)重新将潮湿的RNA沉淀用小体积的无菌、DEPC处理过的水溶解。用石英杯或处理过的异丁烯杯测量每一部分柱子收集液在260nm处的吸光值。将含有RNA的部分混合。

(16)保存制备好的poly(A)+RNA。

Claims (2)

1.一种大型实验动物血液总RNA的提取方法，用改良的红细胞裂解液裂解红细胞获得白细胞，将裂解液成分中NaHCO3换成KHCO3，更加充分的裂解红细胞。

2.一种大型实验动物血液总RNA的纯化方法，运用改进的oligo(dT)-纤维素层析法过柱纯化总RNA，2x装柱缓冲液中用Licl代替Nacl可以避免月桂基肌氨基酸钠在室温低于18℃时阻止柱液的流出这一问题。