CN101935646A - 一种从微量样品中提取dna的试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种从微量样品中提取DNA的试剂盒，还公开了一种从微量样品中提取DNA的方法。该试剂盒包括结合液、调节结合液和去蛋白液，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.55-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇。本发明所述试剂盒及方法提取的DNA含量和纯度较高，提取速度快，不采用有毒试剂，适用于提取各种微量样品的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种从微量样品中提取DNA的试剂盒，还涉及从微量样品中提取DNA的方法。
背景技术
DNA，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要组成成分。DNA是最重要的生物信息分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作，主要功能是贮存决定物种性状的几乎所有蛋白质和RNA分子的全部遗传信息；编码和设计生物有机体在一定的时空中有序地转录基因和表达蛋白完成定向发育的所有程序；初步确定了生物独有的性状和个性以及和环境相互作用时所有的应激反应。由于DNA在生物生长发育中扮演如此重要的角色，使得它成为分子生物学研究人员的重要研究对象，因此基因组DNA的分离纯化就成为分子生物学实验技术中最重要、最基本的技术之一。
不同来源的材料因材料起始量、细胞结构及其成分的不同，所提取的基因组DNA有很大差异。因此，充足的材料起始量对提取足够用于下游实验的基因组DNA非常关键。但是，并非所有情况下起始材料都充足，例如法医材料、考古材料等获取量非常少，另外医学领域中越来越倾向于通过获取微量样本来进行疾病诊断，例如通过口腔拭子、漱口水、唾液等采集口腔脱落细胞，或者采集极少量血液来进行疾病诊断。采集微量样本不仅减少了患者的忧虑和痛苦，而且采集方式快速、柔和。因此，微量样品的基因组DNA的有效提取成为实现上述领域的目标的关键性步骤。
目前常用的基因组DNA分离纯化方法有SDS/苯酚/氯仿抽提法、高盐沉淀法、离子交换法和硅介质选择性吸附法等，这些方法在提取各种材料的基因组DNA时具有一些本身的优点，但这些方法在提取微量样品时面临无法有效提取DNA、操作步骤繁琐等缺点。
针对以上分离纯化技术的问题，现在分离纯化DNA大都采用离心柱法，即通过内嵌玻璃纤维素膜吸附从样品中裂解出的DNA，漂洗杂质后再将DNA洗脱下来。离心柱法虽然能够提取DNA并保证其纯度，但是其提取DNA的量普遍不高，无法满足法医检测、考古分析和医学检测等领域的要求。此外，离心柱法使用到一些有毒试剂，如苯酚、氯仿等，不利于实验人员的身体健康；同时，离心柱法在整个提取DNA的过程中耗时较多，影响了下一步分析检测的速度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从微量样品中提取DNA的试剂盒，采用本试剂盒提取DNA的含量较高。
本发明的另一个目的在于提供一种从微量样品中提取DNA的方法，该方法耗时短，不使用有毒试剂，所提DNA含量和纯度较高。
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒包括：
结合液、调节结合液和去蛋白液，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇。
本发明所述结合液主要用来进一步裂解细胞，并且提供磁珠与基因组DNA结合的环境；调节结合液用于促进磁珠与基因组DNA的结合，使基因组DNA和磁珠形成磁珠-DNA复合物，而蛋白、RNA以及其他代谢产物不能结合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上残余的蛋白质，并且保证基因组DNA不会损失。
优选地，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.410mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
优选地，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒还包括：
预处理缓冲液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脱液，所述预处理缓冲液pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4，所述裂解液包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.05-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl。
本发明所述预处理缓冲液是一种不含核酸酶的磷酸盐缓冲液，主要用来预处理样品；裂解液为DNA的提取提供了最优的缓冲条件，既能强烈抑制DNase的活性，又能高效裂解微量样品释放DNA；磁珠采用Promega公司产品，该磁珠在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集现象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的杂质，如多糖、纤维素、脂类及提取过程中残留的胍盐、SDS等，同时保证基因组DNA不会损失；洗脱液可以有效的将磁珠上结合的基因组DNA洗脱下来。
优选地，所述裂解液包含0.1M的NaCl、pH8.010mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇。
优选地，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
本发明还提供一种从微量样品中提取DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1、将样品进行预处理后充分裂解，所述样品为血液、血迹、唾液、口腔拭子、漱口水或毛发；
步骤2、向裂解后所得溶液加入结合液混匀并静置，所得混合液加入调节结合液再次混匀，然后与磁珠充分作用，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇；
步骤3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混匀，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇；
步骤4、漂洗所述磁珠，然后洗脱所述磁珠上结合的DNA。
优选地，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
优选地，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
其中，步骤2所述加入调节结合液的量为0.5-1倍于混合液体积，优选为0.8倍于混合液体积，所述静置为在55-70℃下静置5-15min，优选地，所述裂解为在70℃下静置10min。
其中，所述预处理采用pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4的预处理缓冲液进行预处理。所述预处理包括对固体样品需要将其处理成适合提取的体积和形状；对液体样品需要加入一定量预处理缓冲液补足至合适体积
其中，其中所述裂解采用包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.0 5-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS的裂解液进行裂解，优选地，采用包含0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS进行裂解。
其中，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。
其中，所述漂洗采用包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇的漂洗液进行漂洗，优选地，采用包含pH7.510mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇进行漂洗。
其中，所述洗脱采用pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl进行洗脱，优选地，采用pH8.0 10mM的Tris-HCl进行洗脱。
本发明所述方法采用磁珠吸附法，通过预处理缓冲液、裂解液、结合液、调节结合液、磁珠、去蛋白液、漂洗液、洗脱液从微量样品中提取DNA。其中，生物磁珠是一种新型的亚微米级或纳米级的功能化载体，包括磁性颗粒和有活性基团的超顺磁性材料。生物磁珠是分散在基液中而形成的磁性液体材料，超顺磁性材料在一定条件下可以在溶液中分散，而在外磁场作用下可以定向运动和富集。因此，生物磁珠兼具有液体的流动性和固体磁性材料的特点，在外磁场的作用下可以定向移动或集中，撤去外磁场后稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变得十分快捷方便，通过简单的洗脱就可以得所提DNA。
本发明根据不同样品耗时不同，微量血液样品可以在30分钟内完成，血迹、唾液、漱口水、口腔拭子等可以在60分钟内完成，毛发等难以裂解的样品一般可在2小时内完成，相比常见的离心柱提取法，提取时间均不同程度缩短。
采用本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒及方法，所提DNA含量高、纯度高，提取速度快，不采用有毒试剂。
附图说明
图1示从干血点中提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：分子量Marker，从上至下依次为23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp；
泳道1：本发明从干血点中提取的DNA条带；
泳道2：离心柱法从干血点中提取的DNA条带；
图2示从唾液中提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：分子量Marker，从上至下依次为23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp；
泳道1：本发明从唾液中提取的DNA条带；
泳道2：离心柱法从唾液中提取的DNA条带；
图3示从毛发中提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：分子量Marker，从上至下依次为23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp；
泳道1：本发明从毛发中提取的DNA条带；
泳道2：离心柱法从毛发中提取的DNA条带；
具体实施方式
本发明公开了一种从微量样品中提取DNA的试剂盒及其方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的试剂盒及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明，所述从微量样品中提取DNA的试剂盒包括：
结合液、调节结合液和去蛋白液，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇。
本发明所述结合液主要用来进一步裂解细胞，并且提供磁珠与基因组DNA结合的环境；调节结合液用于促进磁珠与基因组DNA的结合，使基因组DNA和磁珠形成磁珠-DNA复合物，而蛋白、RNA以及其他代谢产物不能结合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上残余的蛋白质，并且保证基因组DNA不会损失。
优选地，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
优选地，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒还包括：
预处理缓冲液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脱液，所述预处理缓冲液pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4，所述裂解液包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.05-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl。
本发明所述预处理缓冲液是一种不含核酸酶的磷酸盐缓冲液，主要用来预处理样品；裂解液为DNA的提取提供了最优的缓冲条件，既能强烈抑制DNase的活性，又能高效裂解微量样品释放DNA；磁珠采用Promega公司产品，该磁珠在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集现象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的杂质，如多糖、纤维素、脂类及提取过程中残留的胍盐、SDS等，同时保证基因组DNA不会损失；洗脱液可以有效的将磁珠上结合的基因组DNA洗脱下来。
优选地，所述裂解液包含0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS。
优选地，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇。
优选地，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
本发明还提供一种从微量样品中提取DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1、将样品进行预处理后充分裂解，所述样品为血液、血迹、唾液、口腔拭子、漱口水或毛发；
步骤2、向裂解后所得溶液加入结合液混匀并静置，所得混合液加入调节结合液再次混匀，然后与磁珠充分作用，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇；
步骤3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混匀，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇；
步骤4、漂洗所述磁珠，然后洗脱所述磁珠上结合的DNA。
优选地，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
优选地，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.525mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
其中，步骤2所述加入调节结合液的量为0.5-1倍于混合液体积，优选为0.8倍于混合液体积，所述静置为在55-70℃下静置5-15min，优选地，所述裂解为在70℃下静置10min。
其中，所述预处理采用pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4的预处理缓冲液进行预处理。所述预处理包括对固体样品需要将其处理成适合提取的体积和形状；对液体样品需要加入一定量预处理缓冲液补足至合适体积
其中，其中所述裂解采用包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.0 5-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS的裂解液进行裂解，优选地，采用包含0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS进行裂解。
其中，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。
其中，所述漂洗采用包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇的漂洗液进行漂洗，优选地，采用包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇进行漂洗。
其中，所述洗脱采用pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl进行洗脱，优选地，采用pH8.0 10mM的Tris-HCl进行洗脱。
本发明根据不同样品耗时不同，微量血液样品可以在30分钟内完成，血迹、唾液、漱口水、口腔拭子等可以在60分钟内完成，毛发等难以裂解的样品一般可在2小时内完成，相比常见的离心柱提取法，提取时间均不同程度缩短。
取相同质量的干血点采用本发明的方法和离心柱法分别提取DNA，本发明所提取的DNA的含量为0.54μg，OD260/OD280值为1.78；离心柱法所提取的DNA的含量为0.19μg，OD260/OD280值为2.08。
取相同质量的唾液采用本发明的方法和离心柱法分别提取DNA，本发明所提取的DNA的含量为1.35μg，OD260/OD280值为1.98；离心柱法所提取的DNA的含量为1.05μg，OD260/OD280值为2.02。
取相同质量的毛发采用本发明的方法和离心柱法分别提取DNA，本发明所提取的DNA的含量为3.14μg，OD260/OD280值为1.85；离心柱法所提取的DNA的含量为0.81μg，OD260/OD280值为1.95。
以上实验表明，本发明从各种微量样品中所提取的DNA总量均明显高于离心柱法所提取的DNA，并且其OD260/OD280值均接近于标准值1.8，表明DNA纯度较高。
下面结合实施例进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述试剂盒
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒包括：
预处理缓冲液：pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4。具体配制方法：分别称取0.8gNaCl、0.02g KCl、0.024g KH2PO4、0.18g K2HPO4，加适量蒸馏水分别溶解后混合，再用HCl调pH7.2，然后定容到100ml。
裂解液：0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS。具体配制方法：分别量取1M的Tris-HCl(pH为8.0)1ml、0.5M的EDTA(pH为8.0)5ml、5M的NaCl 2ml、10％的SDS 5ml，加入适量蒸馏水后定容到100ml。
结合液：4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。具体配制方法：分别称取53.172g异硫氰酸胍和0.06g Urea，加入适量蒸馏水分别溶解，然后加入1M的Tris-HCl(pH为4.4)1ml、0.5M EDTA(pH为8.0)2ml、Triton-X 10020ml、Tween20 5ml，50℃加热搅拌溶解，然后定容到100ml。
调节结合液：分析纯的异丙醇。
生物磁珠：核心为Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司产品。
磁性分离架：内置磁铁。
去蛋白液：6M的盐酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。具体配制方法：称取57.3g盐酸胍，加蒸馏水充分溶解，然后加入1M的Tris-HCl(pH为7.5)2.5ml、无水乙醇37ml，定容到100ml，充分混匀。
漂洗液：pH7.5 10mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇。具体配制方法：量取pH值为7.5、浓度为1M的Tris-HCl 1ml，再量取5M的NaCl 2ml，加入适量的蒸馏水混匀，再加入25ml的无水乙醇和25ml的异丙醇，定容到100ml，充分混匀。
洗脱液：pH8.0 10mM的Tris-HCl。
实施例2：从干血点中提取DNA
利用实施例1所述试剂盒从干血点中提取DNA。
1、提取试剂
预处理缓冲液：pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4。
裂解液：0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS。
结合液：4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
调节结合液：分析纯的异丙醇。
生物磁珠：核心为Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司产品。
磁性分离架：内置磁铁。
去蛋白液：6M的盐酸胍、pH7.525mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
漂洗液：pH7.510mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇。
洗脱液：pH8.0 10mM的Tris-HCl。
2、提取方法
(1)取带有干血点(直径2mm)的滤纸放入1.5ml离心管，加入200μl组织裂解液和20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，56℃放置30-60min，期间不断涡旋混匀直至血迹被洗脱下来。
(2)避开滤纸将上清移至另一1.5ml离心管中，加入200μl结合液，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min，每隔2min颠倒混匀一次。
(3)冷却后加入10μl磁珠及350μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
(4)室温孵育5min，每隔2min轻微涡旋一次。孵育完毕后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(5)加入300μl去蛋白液，涡旋混匀后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(6)加入500μl漂洗液，涡旋混匀后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，重复此步骤1-2次。最后一次漂洗结束后，用移液器小心吸尽残液，室温晾干5min。
(7)加50μl洗脱液，涡旋混匀后56℃放置5min，期间不断涡旋混匀，将离心管置于磁性分离架上20s，将上清移至另一干净离心管中，即得基因组DNA。
3、所提DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
同样取上述本发明提取方法中所述带有干血点(直径2mm)的滤纸，采用离心柱法提取DNA，采用本发明方法提取的干血点DNA与离心柱法提取的干血点DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为5μl，电压为100V，电泳时间为25min，结果参见图1。结果显示，本发明方法所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于离心柱法提取的干血点DNA，表明本发明方法提取的干血点DNA含量和纯度较高。
4、所提DNA的含量及OD260/OD280值检测
使用分光光度计对采用本发明方法提取的干血点DNA与离心柱法提取的干血点DNA进行含量和OD260/OD280值检测，结果参见表1。
表1 DNA的含量及OD260/OD280值检测
结果显示，本发明所提取的DNA总量明显高于离心柱法提取的DNA总量，此外本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值(1.8)无明显差异，表明本发明方法提取的干血点DNA含量和纯度较高。
实施例3：从唾液中提取DNA
1、本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒包括：
预处理缓冲液：pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4。
裂解液：0.05M的NaCl、pH6.5 5mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和0.25％的SDS。
结合液：3M的异硫氰酸胍、pH3.5 5mM的Tris-HCl、5％的Ttiton-X100、5mM的Urea、5mM的EDTA和5％的Tween20。
调节结合液：分析纯的异丙醇。
生物磁珠：核心为Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司产品。
磁性分离架：内置磁铁。
去蛋白液：2M的盐酸胍、pH6.5 5mM的Tris-HCl和5％的无水乙醇。
漂洗液：pH6.55mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10％的无水乙醇和10％的异丙醇。
洗脱液：pH7.05mM的Tris-HCl。
2、提取方法
采用上述提取试剂从唾液中提取DNA。
(1)取10μl新鲜的唾液放入1.5ml离心管，补加预处理缓冲液至500μl，颠倒混匀后12000rpm离心5min，弃上清。
(2)加入200μl组织裂解液和20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分重悬沉淀，56℃孵育15min，每隔5min涡旋混匀一次。
(3)加入200μl结合液，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min，每隔2min颠倒混匀一次。
(4)冷却后加入20μl磁珠及350μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
(5)室温孵育5min，每隔2min轻微涡旋一次。孵育完毕后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(6)加入300μl去蛋白液，涡旋混匀后室温静置1-2min，将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(7)加入500μl漂洗液，涡旋混匀后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，重复此步骤1-2次。最后一次漂洗结束后，用移液器小心吸尽残液，室温晾干5min。
(8)加100μl洗脱液，涡旋混匀后56℃放置5min，期间不断涡旋混匀，将离心管置于磁性分离架上20s，将上清移至另一干净离心管中，即得基因组DNA。
3、所提DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
同样取上述本发明提取方法中所述新鲜唾液10μl，用离心柱法提取DNA，采用本发明方法提取的唾液DNA与离心柱法提取的唾液DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为5μl，电压为100V，电泳时间为25min，结果参见图2。结果显示，本发明方法所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于离心柱法提取的唾液DNA，表明本发明方法提取的唾液DNA含量和纯度较高。
4、所提DNA的含量及OD260/OD280值检测
使用分光光度计对采用本发明方法提取的唾液DNA与离心柱法提取的唾液DNA进行含量和OD260/OD280值检测，结果参见表2。
表2 DNA的含量及OD260/OD280值检测
结果显示，本发明所提取的DNA总量明显高于离心柱法提取的DNA总量，此外本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值
(1.8)无明显差异，表明本发明方法提取的唾液DNA含量和纯度较高。
实施例4：从毛发中提取DNA
1、本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒
本发明所述从微量样品中提取DNA的试剂盒包括：
预处理缓冲液：pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4。
裂解液：1M的NaCl、pH9.0 50mM的Tris-HCl、50mM的EDTA和2％的SDS。
结合液：8M的异硫氰酸胍、pH5.5 50mM的Tris-HCl、25％的Ttiton-X 100、20mM的Urea、20mM的EDTA和5％的Tween20。
调节结合液：分析纯的异丙醇。
生物磁珠：核心为Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司产品。
磁性分离架：内置磁铁。
去蛋白液：8M的盐酸胍、pH8.0 50mM的Tris-HCl和50％的无水乙醇。
漂洗液：pH8.0 50mM的Tris-HCl、200mM的NaCl、50％的无水乙醇和50％的异丙醇。
洗脱液：pH8.550mM的Tris-HCl。
2、提取方法
采用上述提取试剂从毛发中提取DNA。
(1)将3根带有毛囊的毛发末端1cm剪下放入1.5ml离心管，加入100μl组织裂解液、10μl蛋白酶K(20mg/ml)和20μl1M DTT溶液，充分混匀，56℃孵育，每隔15min混匀一次，直至毛发完全溶解。
(2)加入100μl结合液，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min，每隔2min涡旋混匀一次。
(3)将上清移至另一1.5ml离心管中，冷却后加入10μl磁珠及180μl异丙醇。
(4)室温孵育5min，每隔2min轻微涡旋一次。孵育完毕后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(5)加入300μl去蛋白液，涡旋混匀后室温静置1-2min，将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，并用移液器小心吸尽残液。
(6)加入500μl漂洗液，涡旋混匀后将离心管置于磁性分离架上20s，勿将离心管取下直接倾倒上清，重复此步骤1-2次。最后一次漂洗结束后，用移液器小心吸尽残液，室温晾干5min。
(7)加50μl洗脱液，涡旋混匀后56℃放置5min，期间不断涡旋混匀，将离心管置于磁性分离架上20s，将上清移至另一干净离心管中，即得基因组DNA。
3、所提DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
同样取上述本发明提取方法中所述3根毛发末端1cm样品，用离心柱法提取DNA，采用本发明方法提取的毛发DNA与离心柱法提取的毛发DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为5μl，电压为100V，电泳时间为25min，结果参见图3。结果显示，本发明方法所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度明显亮于离心柱法提取的毛发DNA，表明本发明方法提取的毛发DNA含量和纯度较高。
4、所提DNA的含量及OD260/OD280值检测
使用分光光度计对采用本发明方法提取的毛发DNA与离心柱法提取的毛发DNA进行含量和OD260/OD280值检测，结果参见表3。
表3 DNA的含量及OD260/OD280值检测
结果显示，本发明所提取的DNA总量明显高于离心柱法提取的DNA总量，此外本发明所提取的DNA的OD260/OD280值与标准值(1.8)无明显差异，表明本发明方法提取的毛发DNA含量和纯度较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从微量样品中提取DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
结合液、调节结合液和去蛋白液，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
预处理缓冲液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脱液，所述预处理缓冲液pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4，所述裂解液包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.0 5-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇，所述洗脱液为pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含0.1M的NaCl、pH8.0 10mM的Tris-HCl、25mM的EDTA和0.5％的SDS，所述漂洗液包含pH7.5 10mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25％的无水乙醇和25％的异丙醇，所述洗脱液为pH8.0 10mM的Tris-HCl。
6.一种从微量样品中提取DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将样品进行预处理后充分裂解，所述样品为血液、血迹、唾液、口腔拭子、漱口水或毛发；
步骤2、向裂解后所得溶液加入结合液混匀并静置，所得混合液加入调节结合液再次混匀，然后与磁珠充分作用，所述结合液包含3-8M的异硫氰酸胍、pH3.5-5.5 5-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述调节结合液为异丙醇；
步骤3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混匀，所述去蛋白液包含2-8M的盐酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的无水乙醇；
步骤4、漂洗所述磁珠，然后洗脱所述磁珠上结合的DNA。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述结合液包含4.5M的异硫氰酸胍、pH4.4 10mM的Tris-HCl、20％的Ttiton-X 100、10mM的Urea、10mM的EDTA和5％的Tween20，所述去蛋白液包含6M的盐酸胍、pH7.525mM的Tris-HCl和37％的无水乙醇。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤2所述加入调节结合液的量为0.5-1倍于混合液体积。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤2所述静置为在55-70℃下作用5-15min。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述预处理采用pH值为7.2，包含135mM的NaCl、2.7mM的KCl、1.5mM的KH2PO4、8mM的K2HPO4的预处理缓冲液进行预处理，所述裂解采用包含0.05-1M的NaCl、pH6.5-9.05-50mM的Tris-HCl、10-50mM的EDTA和0.25-2％的SDS的裂解液进行裂解，所述磁珠为一种核心为Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗采用包含pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50％的无水乙醇和10-50％的异丙醇的漂洗液进行漂洗，所述洗脱采用pH7.0-8.5 5-50mM的Tris-HCl进行洗脱。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NATIONAL BIO-FOUNDER CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: TIANJIN YUANPINGHAO BIOTECH CO., LTD. Effective date: 20121024 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 300457 HANGU, TIANJIN TO: 225316 TAIZHOU, JIANGSU PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20121024 Address after: 225316 R16 research and development building, No. 1, drug city road, Taizhou, Jiangsu Patentee after: National Bio-Founder Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 300457, Tianjin Development Zone, No. fourth, 80 Avenue, Tian Da Science and Technology Park, B5 Patentee before: Yuanpinghao (Tianjin) Biological Technology Co., Ltd. |
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 225316, R16 building, No. 1, drug City Avenue, Taizhou, Jiangsu Patentee after: China Biotechnology international Limited by Share Ltd Address before: 225316 R16 research and development building, No. 1, drug city road, Taizhou, Jiangsu Patentee before: National Bio-Founder Biotechnology Co.,Ltd. |