CN106754884A - 试剂盒及其应用 - Google Patents

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CN106754884A CN201710016037.7A CN201710016037A CN106754884A CN 106754884 A CN106754884 A CN 106754884A CN 201710016037 A CN201710016037 A CN 201710016037A CN 106754884 A CN106754884 A CN 106754884A
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Abstract

本发明涉及试剂盒及其应用，具体地，所述试剂盒包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20‑50mmol/L Tris；0.01‑0.2％Triton X‑100；1‑10mmol/L EDTA；5‑50mmol/L MgCl2；以及5‑50mmol/L KCl。由此，利用所述试剂盒可以有效地对血液进行前处理，从而获得细胞核沉淀，便于后续处理。

Description

试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提取血液基因组DNA的试剂盒及其应用。
背景技术
血液基因组DNA的提取是进行分子医学检测等的首要步骤，高质量的DNA的获得是保证后续检测成功的关键。对于遗传病相关基因检测以及甲基化位点研究等的研究，需要检测位点较多，基因组DNA的需求量更大，所以很多研究者需要从更大体积的血液，比如1-10ml中提取基因组DNA以满足后续需要。
目前，现有的基因组DNA提取方法仍有待改进。
发明内容
本发明是发明人基于以下发现和事实所获得的：
发明人发现目前常用的基因组DNA提取方法具有明显的不足之处，具体如下：
传统的酚氯仿抽提方法需要接触有机试剂，长期使用有损人体健康。而且利用该方法耗时较长，提取得到的基因组DNA纯度不高，无法满足后续实验需求。
离心柱法在很多实验室得到较多的应用，但是由于离心柱硅胶膜的吸附结合能力较低，结合30μg以上得率的DNA就需要更大体积的吸附膜，因此无法实现高通量的自动化操作。
现有磁珠法和直接裂解法结合提取血液基因组DNA可以应用于小体积血液提取，但是血液体积较大时，利用现有磁珠法和直接裂解法结合提取血液基因组DNA，需要加入大量的蛋白酶K溶液、裂解液以及磁珠，耗时，也就是说，采用现有磁珠法和直接裂解法提取较大体积血液中基因组DNA存在以下问题：成本高，耗时，提取过程中体积大，不适合在自动核酸提取仪上进行使用，无法实现高通量。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
根据本发明的一个方面，本发明提出一种试剂盒，包含：细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：20-50mmol/L Tris；0.01-0.2％(体积百分比)Triton X-100；1-10mmol/L EDTA；5-50mmol/L MgCl2；以及5-50mmol/L KCl。经过细胞核分离液的前期处理，只需要等体积的细胞核裂解液就可以得到很好的效果，其中，此处“等体积”应该理解为加入与细胞核体积相等的细胞核裂解液，由此可以实现在采血管中直接处理1-10ml血样，不需要转移到更大体积的离心管中操作，浓缩后的细胞核沉淀只需要加入500μl-1ml的细胞核裂解液，节省了成本，体积更小，可以满足高通量自动化核酸提取的需求。由此，利用所述试剂盒可以有效地对血液进行前处理，从而获得细胞核沉淀，便于后续处理。
根据本发明的一些实施例，所述细胞核分离液的pH值为7-8。根据本发明的具体实施例，可以采用氢氧化钠溶液调节所述细胞核分离液的pH值至7-8。由此，可以进一步提高细胞核分离液的分离效率。
根据本发明的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：细胞核裂解液，其中，所述细胞核裂解液包含：4-5mol/L盐酸胍；1-2mol/L异硫氢酸胍；30-50mmol/L Tris(pH＝8.0)；30-50mmol/L EDTA；2-5％Triton X-100；以及0.2-0.5％(重量百分比)脱氧胆酸钠。细胞核裂解液中加入脱氧胆酸钠和Triton X-100等两种表明活性剂，增加对脂类等杂质的消化，提高了对细胞核的裂解能力，更加促进DNA的释放。无需加入蛋白酶K，无需加热在室温条件下就能达到很强的裂解作用。由此，利用所述试剂盒可以有效地对血液进行前处理，获得细胞核沉淀，并对细胞核进行有效裂解。
根据本发明的一些实施例，所述细胞核裂解液的pH值为7.5-8.5。根据本发明的具体实施例，可以采用氢氧化钠溶液调节所述细胞核裂解液的pH值至7.5-8.5。由此，可以进一步提高细胞核裂解液的裂解效率。
根据本发明的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：玻璃珠。玻璃珠的使用可以避免细胞核沉淀在离心时形成过于紧密的团块，更易于细胞核的分散，提高后续的裂解效果。
根据本发明的具体实施例，所述玻璃珠直径为0.5-1mm。由此，可以进一步分散细胞核，提高后续的裂解效果。
根据本发明的一些实施例，所述试剂盒进一步包含：去蛋白缓冲液，漂洗液，洗脱液以及磁珠G悬浮液。由此，利用所述试剂盒可以有效地提取血液基因组DNA，尤其是可以有效地提取大体积血液基因组DNA，并且提取获得的基因组DNA纯度高，可以满足后续的各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交，芯片检测、高通量测序等实验。
根据本发明的具体实施例，所述去蛋白缓冲液包含：5-6mol/L盐酸胍；30-50mmol/L Tris(pH＝8.0)；30-50mmol/L EDTA；1％-2％(重量百分比)月桂酰肌氨酸钠；以及30％乙醇。需要说明的是，去蛋白缓冲液在使用前才加入30％(体积百分比)乙醇，由此，可以有效地除去蛋白杂质。
根据本发明的具体实施例，所述漂洗液包含：10-20mmol/L Tris(pH＝8.0)，以及80％乙醇。需要说明的是，漂洗液在使用前才加入80％乙醇。由此，可以更加有效地除去杂质。
根据本发明的具体实施例，所述洗脱液包含：10mmol/L Tris(pH＝8.0)。由此，可以有效洗脱基因组DNA，获得分离纯化后的基因组DNA。
根据本发明的具体实施例，所述磁珠G悬浮液的浓度为150-250mg/mL。由于磁珠G粒径很小，具有更大的比表面积，因此具有更强的吸附DNA的能力，另外，磁珠也更适合在高通量自动化上进行使用。
根据本发明的再一个方面，本发明提出一种利用前述试剂盒制备血液基因组DNA的方法，包括：
(1)将血液样品进行预处理，以便去除血浆；
(2)将细胞核分离液以及玻璃珠加入步骤(1)中获得的经过预处理后的血液样品中，混合，离心，除去上清，以便获得细胞核沉淀；
(3)将细胞核裂解液加入所述细胞核沉淀中，混合，加入异丙醇，以便获得第一混合液；
(4)将磁珠G悬浮液加入所述第一混合液中，混合，除去液体，以便获得第一磁珠G；
(5)将第一磁珠G进行漂洗，以便获得第二磁珠G；
(6)将所述第二磁珠G进行洗脱，收集洗脱液，以便获得血液基因组DNA。
根据本发明的一些实施例，所述步骤(5)包括：
(5-1)将第一磁珠G中加入去蛋白缓冲液，静置于磁力架上，去除液体；
(5-2)将步骤(5-1)处理后的磁珠G中加入漂洗液，静置与磁力加上，去除液体，以便获得所述第二磁珠G。
本发明所述方法具有以下优势：
(1)经过优化细胞核分离液的前期处理，只需要等体积的细胞核裂解液就可以得到很好的效果。可以实现在采血管中直接处理1-10ml血样，不需要转移到更大体积的离心管中操作，浓缩后的细胞核沉淀只需要加入500μl-1ml的细胞核裂解液，节省了成本，体积更小，可以满足高通量自动化核酸提取的需求。
(2)玻璃珠的使用可以避免细胞核沉淀在离心时形成过于紧密的团块，更易于细胞核的分散，提高后续的裂解效果。
(3)细胞核裂解液中加入脱氧胆酸钠和Triton X-100等两种表明活性剂，增加对脂类等杂质的消化，提高了对细胞核的裂解能力，更加促进DNA的释放。无需加入蛋白酶K，无需加热在室温条件下就能达到很强的裂解作用。
(4)使用所述方法提取的基因组DNA纯度高，可以满足后续的各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交，芯片检测、高通量测序等实验。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市售可得，或者可以按照本文或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
实施例
实施例1手工操作提取血液的对比实验
利用本方法提取2ml血液样本，与天根生化科技(北京)有限公司产品DP333大量血液基因组DNA提取试剂盒进行磁珠法和离心柱法提取的对比实验。DP333参照已有说明书进行操作。磁珠法提取步骤如下：
(1)血液前处理：
a.将1-3号5ml血液样品放置室温至完全解冻，在离心机中2500rpm离心10min，丢弃上部分血浆，保留中间层及下层的血细胞部分。
b往含2.5ml血细胞的抽血管里加入等体积2.5ml的细胞核分离液以及25mg玻璃珠，颠倒混匀5次，3600rpm离心10min。
c取出抽血管，轻轻倒出上清，留下细胞核沉淀。
(2)向上述(1)得到的细胞核沉淀中加入1ml细胞核裂解液，振荡混匀，置于室温孵育15min。
(3)将上述步骤(2)中得到的裂解液放入离心机中，3600rpm离心10min，以去除残留的杂质。
(4)将上述(3)中的血液裂解液样本加入800μl异丙醇和30μl磁珠G悬浮液，颠倒混匀10min。
(5)将上述(4)中的得到的混合溶液静置在磁力架上2min，弃去废液，保留磁珠。
(6)在上述(5)得到的磁珠中加入1ml去蛋白液，振荡混匀3min。
(7)将上述(6)中的得到的混合溶液静置在磁力架上2min，弃去废液，保留磁珠。
(8)在上述(7)得到的磁珠中加入1ml漂洗液，振荡混匀3min。
(9)将上述(6)中的得到的混合溶液静置在磁力架上2min，弃去废液，保留磁珠。
(10)重复步骤(8)和(9)一次。
(11)室温晾干10min。
(12)将上述(11)中的得到的磁珠中加入洗脱缓冲液200μl，振荡混匀10min。
(13)将上述(12)中的得到的混合溶液静置在磁力架上2min，将DNA溶液转移到一个干净的离心管，并于适当条件保存。
使用Nano Drop 2000将上述提取的基因组DNA进行测值，结果如下：
从实施例1的提取结果看，本实施例所采用的磁珠法提取方法提取5ml血液所提取得到的基因组DNA的平均得率为71.46μg，而离心柱法DP333提取得到的得率为19μg，磁珠法提取的得率远高于离心柱法的提取得率，也适合于96高通量核酸提取仪器。而离心柱一次提取通量仅为6-10个，不适合高通量提取。
实施例2Thermo KingFisher Flex磁棒法自动化仪器上进行10ml血液的基因组DNA提取
1、试剂和材料：
细胞核分离液包含：
30mmol/L Tris；
0.015％Triton X-100；
5mmol/L EDTA；
30mmol/L MgCl2；以及
30mmol/L KCl，细胞核分离液的pH值为7.5。
细胞核裂解液包含：
4.5mol/L盐酸胍；
1.5mol/L异硫氢酸胍；
40mmol/L Tris(pH＝8.0)；
40mmol/L EDTA；
4％Triton X-100；以及
0.3％脱氧胆酸钠，细胞核裂解液的pH值为8.0。
玻璃珠，玻璃珠购自苏州金星玻璃磨料有限公司，该玻璃珠的直径为1mm。
去蛋白缓冲液包含：
5mol/L盐酸胍；
40mmol/L Tris(pH＝8.0)；
40mmol/L EDTA；
1.5％月桂酰肌氨酸钠；以及
30％乙醇，
漂洗液包含：
15mmol/L Tris(pH＝8.0)，以及
80％乙醇
洗脱液包含：
10mmol/L Tris(pH＝8.0)，
磁珠G购自QIAGEN，悬浮液的浓度为200mg/mL。
2、具体实验步骤如下：
(14)血液前处理：
a.将1-8号血液样品放置室温至完全解冻，在离心机中2500rpm离心10min，丢弃上部分血浆，保留中间层及下层的血细胞部分。
b往含5ml血细胞的抽血管里加入等体积5ml的细胞核分离液以及25mg玻璃珠，颠倒混匀5次，3600rpm离心10min。
c取出抽血管，轻轻倒出上清，留下细胞核沉淀。
(15)向上述(1)得到的细胞核沉淀中加入1ml细胞核裂解液，振荡混匀，置于室温孵育15min。
(16)准备Thermo KingFisher Flex上机用的96孔深孔板及相应的溶液，将异丙醇(400μl)加入第一块板和第二块板、去蛋白缓冲液(1000μl)和磁珠G悬浮液(30μl)加入第三块板、漂洗液(1ml)加入第四块板、洗脱液(500μl)加入第五块板中。分装完溶液后将磁力套放在第四块板上。
(17)将上述步骤(2)中得到的裂解液放入离心机中，3600rpm离心10min，以去除残留的杂质。
(18)将上述(4)中的血液裂解液样本平行转移至步骤(3)中所述的含有异丙醇的第一块板和第二块板中，每块样品板的加样体积为500μl。将所有的96孔深孔板按照程序提示放到提取仪器中去。
(19)运行BindIt 3.3程序，到步骤(3)中所述的第四块板上去抓取磁力套。
(20)使用磁力套在含样品的步骤(5)中所述的第一块样品板中快速拍打混匀5min。
(21)使用磁力套在含样品的步骤(5)中所述的第二块样品板中快速拍打混匀5min。
(22)将磁力棒深入到磁力套中，到步骤(3)中所述的含有磁珠G和去蛋白缓冲液的第三块板中快速拍打混匀1min，然后吸附磁珠3次，每次20秒。
(23)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G转移到步骤(5)中所述的第一块样品板中，释放磁珠G，快速和中速间隔拍打混匀10min，然后吸附磁珠G3次，每次20秒。
(24)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G转移到步骤(5)中所述的第二块样品板中，释放磁珠G，快速和中速间隔拍打混匀10min，然后吸附磁珠3次，每次20秒。
(25)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G转移到步骤(3)中所述的含有去蛋白缓冲液的第二块板中，释放磁珠，快速拍打混匀10min，然后吸附磁珠G3次，每次20秒。
(26)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G转移到含有步骤(3)中所述的漂洗液的第三块板中，释放磁珠，快速拍打混匀10min，然后吸附磁珠3次，每次20秒。
(27)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G在步骤(13)中所述的含有漂洗液的深孔板上方悬空晾干10min。
(28)将磁棒吸附的磁珠G转移到含有步骤(3)中所述的洗脱液的第五块板中，释放磁珠，置于75℃，拍打混匀15min。然后吸附磁珠5次，每次20秒。
(29)将磁力棒和磁力套吸附的磁珠G转移到含有步骤(12)中所述的去蛋白缓冲液的第三块板中，释放磁珠G，快速拍打混匀1min。
(30)程序结束后，小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
使用Nano Drop 2000将上述提取的基因组DNA进行测值，结果如下：
从实施例2的提取结果看，本实施例所采用的磁珠法提取方法提取10ml血液得到的DNA纯度高，OD 260/280的平均比值为1.83，OD 260/230的平均比值为2.19，所提取得到的基因组DNA的平均得率为254.7μg。
实施例2所采用的方法同样适用于在高通量仪器上进行96通道的样品提取，步骤同上。
实施例3博奥生物Labkeeper移液法自动化仪器上进行2ml血液的基因组DNA提取
1、材料和试剂
细胞核分离液包含：
30mmol/L Tris；
0.015％Triton X-100；
5mmol/L EDTA；
30mmol/L MgCl2；以及
30mmol/L KCl，细胞核分离液的pH值为7.5。
细胞核裂解液包含：
4.5mol/L盐酸胍；
1.5mol/L异硫氢酸胍；
40mmol/L Tris(pH＝8.0)；
40mmol/L EDTA；
4％Triton X-100；以及
0.3％脱氧胆酸钠，细胞核裂解液的pH值为8.0。
玻璃珠，该玻璃珠的直径为0.5mm。
去蛋白缓冲液包含：
5mol/L盐酸胍；
40mmol/L Tris(pH＝8.0)；
40mmol/L EDTA；
1.5％月桂酰肌氨酸钠；以及
30％乙醇，
漂洗液包含：
15mmol/L Tris(pH＝8.0)，以及
80％乙醇
洗脱液包含：
10mmol/L Tris(pH＝8.0)，
磁珠G购自QIAGEN，悬浮液的浓度为200mg/mL。
2、具体实验步骤如下：
(1)血液前处理：
a.将1-8号血液样品放置室温至完全解冻。
b往含2ml血液的抽血管里加入等体积2ml的细胞核分离液以及25mg玻璃珠，颠倒混匀5次，3600rpm离心10min。
c取出抽血管，轻轻倒出上清，留下细胞核沉淀。
(2)向上述(1)得到的细胞核沉淀中加入300μl细胞核裂解液，振荡混匀，置于室温孵育15min。
(3)将上述(2)中得到的裂解液转移至96深孔板中，进行上机操作。
(4)向上述(3)中含有裂解液的96深孔板的每孔加入300μl细胞核裂解液。
(5)将上述(4)中的深孔板置于75℃，孵育15min，一直振荡混匀。
(6)向上述(5)中的深孔板每孔加入350μl的异丙醇，吹吸6次，然后振荡混匀5min。
(7)向上述(6)中的深孔板每孔加入30μl磁珠G悬浮液，吹吸6次，然后振荡混匀10min。
(8)将上述(7)中的深孔板放置于磁力架上静置2min，磁珠G完全吸附后，吸去液体。
(9)将上述(8)中的深孔板从磁力架上取下，加入100μl去蛋白缓冲液，振荡混匀2min。然后再加入600μl去蛋白缓冲液，吹吸6次，然后振荡混匀2min。
(10)将上述(9)中的深孔板放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
(11)将上述(10)中的深孔板从磁力架上取下，加入100μl漂洗液，振荡混匀1min。然后加入600μl漂洗液，吹吸6次，然后振荡混匀2min。
(12)将上述(11)中的深孔板放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，吸去液体。
(13)重复上述步骤(11)和(12)一次。
(14)将上述(13)中的深孔板置于磁力架上，37℃晾干5min。
(15)将上述(14)中的深孔板从磁力架上取下，加入200μl洗脱缓冲液，置于65℃，振荡混匀10min。
(16)将上述(15)中的深孔板放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移至收集板中，并于适当条件保存。
使用Nano Drop 2000将上述提取的基因组DNA进行测值，结果如下：
编号 浓度 单位 260/280 260/230 得率(ug)
1 133.8 ng/μl 1.9 2.01 26.76
2 275.1 ng/μl 1.83 2.14 55.02
3 433.7 ng/μl 1.88 2.23 86.74
4 175.7 ng/μl 1.92 2.11 35.14
5 221.1 ng/μl 1.88 1.89 44.22
6 215.4 ng/μl 1.9 2.14 43.08
7 80.3 ng/μl 1.76 1.79 16.06
8 250.3 ng/μl 1.9 2.19 50.06
9 354 ng/μl 1.88 2.18 70.8
10 445.8 ng/μl 1.87 2.1 89.16
11 24.3 ng/μl 1.77 1.05 4.86
12 287.8 ng/μl 1.88 2.17 57.56
13 380.7 ng/μl 1.88 2.23 76.14
14 162.9 ng/μl 1.91 2.16 32.58
15 404.9 ng/μl 1.87 2.2 80.98
16 387.6 ng/μl 1.87 2.1 77.52
从实施例3的提取结果看，本实施例所采用的磁珠法提取方法提取2ml血液得到的DNA纯度高，OD 260/280的平均比值为1.87，OD 260/230的平均比值为2.04，所提取得到的基因组DNA的平均得率为52.9μg。
实施例2所采用的方法同样适用于在高通量仪器上进行96通道的样品提取，步骤同上。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种试剂盒，其特征在于，包含：
细胞核分离液，其中，所述细胞核分离液包含：
20-50mmol/LTris；
0.01-0.2％Triton X-100；
1-10mmol/L EDTA；
5-50mmol/L MgCl2；以及
5-50mmol/LKCl。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞核分离液的pH值为7-8。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：细胞核裂解液，其中所述细胞核裂解液包含：
4-5mol/L盐酸胍；
1-2mol/L异硫氢酸胍；
30-50mmol/L Tris(pH＝8.0)；
30-50mmol/L EDTA；
2-5％Triton X-100；以及
0.2-0.5％脱氧胆酸钠。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述细胞核裂解液的pH值为7.5-8.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：玻璃珠，
任选地，所述玻璃珠直径为0.5-1mm。
6.根据权利要求1-5任一项所述试剂盒，其特征在于，进一步包含：去蛋白缓冲液，漂洗液，洗脱液以及磁珠G悬浮液，
任选地，所述去蛋白缓冲液包含：
5-6mol/L盐酸胍；
30-50mmol/L Tris(pH＝8.0)；
30-50mmol/L EDTA；
1％-2％月桂酰肌氨酸钠；以及
30％乙醇，
任选地，所述漂洗液包含：
10-20mmol/L Tris(pH＝8.0)，以及
80％乙醇，
任选地，所述洗脱液包含：
10mmol/L Tris(pH＝8.0)，
任选的，所述磁珠G悬浮液的浓度为150-250mg/mL。
7.一种利用权利要求1-6任一项试剂盒制备血液基因组DNA的方法，其特征在于，包括：
(1)将血液样品进行预处理，以便去除血浆；
(2)将细胞核分离液以及玻璃珠加入步骤(1)中获得的经过预处理后的血液样品中，混合，离心，除去上清，以便获得细胞核沉淀；
(3)将细胞核裂解液加入所述细胞核沉淀中，混合，加入异丙醇，以便获得第一混合液；
(4)将磁珠G悬浮液加入所述第一混合液中，混合，除去液体，以便获得第一磁珠G；
(5)将所述第一磁珠G进行漂洗，以便获得第二磁珠G；
(6)将所述第二磁珠G进行洗脱，收集洗脱液，以便获得血液基因组DNA。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：
(5-1)将所述第一磁珠G中加入去蛋白缓冲液，静置于磁力架上，去除液体；
(5-2)将步骤(5-1)处理后的磁珠G中加入漂洗液，静置与磁力加上，去除液体，以便获得所述第二磁珠G。
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