JP2023536601A

JP2023536601A - 分析物検出のためのサンプルのプール方法

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Publication number: JP2023536601A
Application number: JP2023507303A
Authority: JP
Inventors: レーバー，アヒム
Original assignee: シンラボホールディングドイッチュラントジーエムビーエイチ
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-08-28
Also published as: US20230314421A1; WO2022023551A1; CN116323964A; EP3945318C0; EP3945318A1; CA3187894A1; EP3945318B1

Abstract

本発明は、サンプル材料を実質的にプールすることなく、分析物分子のみを組み合わせることによって、複数のサンプルから分析物をプールする方法に関する。大規模な診断スクリーニングでは、多くの場合、患者のサンプルプールを使用してサンプル処理量を増大させる。このような患者プールを使用すると、陰性試験ではプール内のすべてのサンプルが陰性であることを示すが、陽性検出では、サンプルプールのデコンボリューションと個々の患者サンプルテストにつながり、１以上の陽性サンプルを特定する。本発明は、磁気捕捉粒子を使用して、検出される分析物種の好ましくない希釈につながるサンプル材料の実質的な組み合わせなしに、複数のサンプルから分析物をプールする。

Description

本発明は、サンプル材料を実質的にプールすることなく、分析物分子のみを組み合わせることによって、複数のサンプルから分析物をプールする方法に関する。大規模な(Large scape)診断スクリーニングでは、多くの場合、患者のサンプルプールを使用してサンプル処理量(throughput)を増大させる。このような患者プールを使用すると、陰性試験(negativetest)ではプール内のすべてのサンプルが陰性であることを示すが、陽性検出(appositive detection)では、サンプルプールのデコンボリューション(deconvolution)と個々の患者サンプルテストにつながり、１以上の陽性サンプルを特定する。本発明は、磁気捕捉粒子(magneticcapture particle)を使用して、検出される分析物種(analytespecies)の好ましくない希釈につながるサンプル材料の実質的な組み合わせなしに、複数のサンプルから分析物をプールする。

例えば定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)を使用した診断アッセイでは、患者のサンプルを１つずつ処理するのが最も一般的である。これは通常、効果的で信頼性の高い方法であるが、2020 年の COVID-19 パンデミックのようにアッセイの処理量が重要な場合は、より効率的な対策が求められる。診断アッセイは、サンプルプーリングによるハイスループット qPCR の方法によってスケールアップできる。複数のサンプルを１つのチューブにまとめる行為であるプールは、標的分析物が陽性で検出される可能性が低い場合に最も効果的である。このような場合、すべてのサンプルを個別にテストする必要はなく、プールされたサンプルを１回テストするだけで、サンプルの大規模なグループを最終的に陰性として分類できる。

しかしながら、液体サンプルを互いに組み合わせるなど、サンプル材料の単純なプールは、このような場合、各プール内のごく一部のサンプルのみにウイルス核酸などの標的分析物種が含まれると想定されるため、検出される標的分析物の希釈が発生することになる。標的分析物の希釈は、アッセイ精度の低下、偽陰性率の増加、および十分なアッセイ精度を維持しながらプールできるサンプル数の制限をもたらす。

細胞からDNAまたはRNAを取得するための従来のプロトコルは、細胞を溶液に懸濁し、酵素および／または化学物質を使用して細胞を溶解し、それによって細胞内に含まれる核酸を結果として得られる溶解液に放出することを必要とする。ガラス粒子、シリカ粒子、シリカゲル、およびこれらの混合物は、カオトロピック剤のような結合誘導剤の存在下で核酸物質を含む媒体と接触させたときに、表面への吸着によって核酸物質を可逆的に結合できるマトリックスを製造するために、さまざまな異なる形態で構成されてきた。このようなマトリックスは、マトリックスおよびそこに吸着された核酸物質を残りの培地成分から分離するための遠心分離または真空ろ過などの外力にさらされている間、核酸物質が吸着されたままであるように設計されている。次いで、核酸物質は、マトリックスを水または溶出バッファーなどの溶出液にさらすことによって、通常、マトリックスから溶出される。遠心分離および／またはろ過分離システムで使用するために設計されたシリカベースのマトリックスは、数多くの商業的な供給元から提供されている(例えば、QIAGEN, Hilden, Germanyの核酸分離システムのラインナップであるQiaPrep（登録商標）、QIAamp（登録商標）およびAHPrep（登録商標）)。

磁気応答粒子(magnetically responsive particle)（本明細書では「磁性粒子(magnetic particle)」という）およびそれらを使用する方法は、核酸物質の分離のために開発されている。核酸の分離に使用するために設計されたいくつかの異なるタイプの磁性粒子が文献に記載されており、市販の販売元から入手できる。このような磁性粒子は、一般に、核酸物質に直接可逆的に結合するように設計されたものと、間接的に、すなわち少なくとも１つの中間物質を介して可逆的に結合するように設計されたものの２つのカテゴリのいずれかに分類される。中間物質は、本明細書では「標識」と呼ばれる。例えば、そのような一般的に使用される標識の１つであるビオチン化オリゴヌクレオチドデオキシチミジン (オリゴdT) は、媒体中でmRNA分子のポリアデノシンテールと水素結合を形成する。

したがって、本発明の目的は、プール中の標的分析物を実質的に希釈することなく、分析物をプールする方法を提供することである。

一般的に、および本明細書により、本発明の主な態様は以下のように記載できる：

第１の態様において、本発明は、複数の異なるサンプルから分析物をプールする方法であって、プールされる各サンプルに含まれる分析物分子を１つまたは複数の磁気捕捉粒子に結合する工程を含むものであり、各サンプルの分析物分子は、（ｉ）１つまたは複数の磁気捕捉粒子を、プールされる各サンプルと順次接触させることによって、または（ｉｉ）各サンプルを個々の１つまたは複数の磁気捕捉粒子と接触させ、およびその後の工程において前記個々の１つまたは複数の磁気捕捉粒子を組み合わせることによって、互いにプールされるものであり、前記方法は、サンプル（好ましくは液体サンプル）を互いに直接組み合わせる工程を含まないか、または本質的に含まないものである、方法に関する。

第２の態様において、本発明は、核酸検出のために複数の核酸サンプルをプールする方法であって、該方法は第１の態様の方法を使用して各サンプルの核酸分析物を組み合わせることを含む、方法に関する。

第３の態様において、本発明は、患者サンプル中の病原体由来の分析物種を検出する方法であって、該方法は、異なる患者からサンプルを提供する工程と、各サンプルの分析物を第１または第２の態様の方法でプールする工程と、プールされた分析物を用いて分析物種検出を実施する工程を含むものであり、プールされた分析物中に分析物種が検出された場合、別の検出が患者サンプルごとに個別に別の検出を実行し、１つまたは複数のサンプルのどれが分析物種を含むかを同定する、方法に関する。

図１は、先行技術のサンプル処理のセットアップを示す。同上図２は、本発明の第１の態様のセットアップを示す。同上

以下に、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、追加の実施形態を作成するために、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。さまざまに説明された例および好ましい実施形態は、明示的に説明された実施形態のみに本発明を限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施形態の２つ以上を組み合わせた実施形態、または明示的に説明された実施形態の１つ以上を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本願に記載されたすべての要素の順列および組み合わせは、文脈が別段の指示をしない限り、本願の説明によって開示されているとみなされるべきである。

「磁性粒子」または「磁気捕捉粒子」という用語は、磁場によって引き付けられる粒子を指す。本発明において、磁性粒子は、好ましくは最大で１０００μｍ、特に少なくとも０．１μｍから１０００μｍ未満の平均直径を有し、磁性微粒子（magnetic microparticle、MMP）とも呼ばれる。好ましくは、磁性粒子は、約０．５μｍから約１００μｍまでの平均直径を有する。磁性粒子は、約０．５μｍから２０μｍ、好ましくは約０．６μｍから約１０μｍ、より好ましくは約０．８μｍから約５μｍの平均直径を有することができる。磁性粒子は商業的供給業者から得ることができ、当業者はそれを調製する方法も知っている。

好ましくは、磁気捕捉粒子は、例えばイオン相互作用などによる、本発明の用語において、核酸に可逆的に結合することができる磁気応答粒子を含む。そのような粒子は、当業者に周知である。本明細書で使用されるとおり、「磁性」という用語は、強磁性、フェリ磁性、常磁性または超常磁性材料などの磁性材料を包含する。これらの磁性材料は、上述の磁性粒子の一部であり、任意の適切な方法によって粒子に含めることができる。

本発明の１つの好ましい実施形態において、磁性粒子はシリカを含む。シリカは、シリカゲル、ケイ質酸化物、ガラスまたはケイソウ土などの固体シリカ、または上記の２つ以上の混合物の形態であり得る。シリカはビーズの表面に少なくとも部分的に存在するべきである。効率的な結合のためには、シリカが粒子の表面全体に存在することが好ましい。

磁性粒子は、シリカ被覆磁性粒子であってよい。「シリカ被覆磁性粒子」という用語は、シリカで被覆された磁性粒子を指す。これらの粒子は当業者にはよく知られている。いかなる種類のシリカ被覆磁性粒子も、原則として、本発明の方法に適している。しかしながら、好ましくは、磁性粒子は陰イオン交換粒子ではない。

[17] ガラス粒子は、好ましくは、結晶質シリカ（例えば、α石英、ガラス質シリカ）の粒子である。結晶質シリカは非晶質ではないため正式には「ガラス」ではないが、あるいは、主にシリカでできたガラスの粒子であるためである。ガラス粒子も当業者に周知である。

シリカ系酸化物で被覆された磁性粒子は、本発明で使用されるシリカ磁性粒子の最も好ましい形態である。ケイ酸酸化物被覆磁性粒子は、フェリ磁性、強磁性、超常磁性または常磁性材料の少なくとも１つの粒子を含むコアを被覆するケイ酸酸化物を含む。本発明で使用するケイ酸酸化物被覆磁性粒子は、含水ケイ酸酸化物の吸着面も有する。DNAやRNAなどの標的核酸は、粒子の吸着面に付着するが、核酸の供給源からの他の物質、特にヌクレアーゼなどの有害な混入物（contaminant）は、ケイ酸酸化物被覆磁性粒子に付着したり、核酸と一緒に共溶出したりしない。ケイ酸酸化物被覆磁性粒子は、当業者に周知であり、市販されている（例えば、MagAttract（登録商標）磁性粒子、QIAGEN、Hilden、Germany）。

磁性粒子は、例えば、イオン相互作用などによって、核酸などの分析物を可逆的に結合することにより、水溶液中で核酸などの本発明の分析物分子と複合体を形成する能力を有する。本発明は、核酸と複合体を形成する特性を有する任意のシリカ被覆磁性粒子を使用して実施することができる。

「磁気収集デバイス」という用語は、本明細書では、磁化可能なロッド形状の（rod-shaped）磁石；または、サンプル液を受け取るための１つまたは複数の受け取りコンパートメント (ウェルプレートなど) を備えた磁化可能なプレート、あるいは、磁石の上に置かれるウェルプレートなどの磁石を説明するために使用される。

磁石は、高性能磁石などの任意の材料にすることができる。磁石は、希土類磁石、またはＲ－コバルト磁石およびＲ－Ｆｅ－Ｂ磁石から選択される磁石であってよく、Ｒは、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、およびイットリウム（Ｙ）から選択される。磁石は、組成Nd2Fe14Bの合金など、ネオジム、鉄、およびホウ素を含むネオジム磁石であり得る。磁石は、SmCO5およびSm2CO17の中から選択される組成を有する磁石などのサマリウム－コバルト磁石であり得る。

好ましくは、磁気収集デバイスは、磁気ロッド（magnetic rod）とサンプルと磁気捕捉粒子とを接触させるためにサンプル液体中に導入できる磁気ロッドである、または、磁気収集デバイスは、磁気コンパートメントとサンプル液体と磁気捕捉粒子とを接触させるためにサンプル液体を保持できる磁気コンパートメントである。

「分析物分子」という用語は、本明細書では、特定の種が本発明の検出の標的である分子またはその一部を指すために使用される。分析物分子は、本発明の実施形態による検出およびプール方法の対象である。分析物分子には、生物学的分子（タンパク質、ペプチド、脂質、核酸、脂肪酸、またはオリゴ糖などの炭水化物などであるが、これらに限定されない）および非生物学的分子 (小分子薬や小分子リガンドなどの小分子を含む)が含まれる。核酸は、本発明の好ましい分析物分子である。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、特に、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル結合によって（場合によっては、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって）共有結合されたリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを指す。核酸には、すべてのタイプのDNAおよび／またはRNA、例えば、gDNA；プラスミド DNA、環状DNA；循環DNA；hnRNA；mRNA；rRNA、tRNA、IncRNA (長鎖ノンコーディングRNA)、lincRNA (長鎖遺伝子間ノンコーディング RNA)、miRNA (マイクロRNA)、siRNA(低分子干渉RNA)、snoRNA (核小体低分子RNA)、snRNA (核内低分子RNA)およびstRNA (小分子RNA)、piRNA (piwi結合RNA)、tiRNA (転写開始RNA)、PASR (promoterassociated RNA、プロモーター関連RNA)、CUT(cryptic unstable transcripts、暗号化された不安定な転写物)、細胞外RNAまたは循環RNAを含むがこれらに限定されない非翻訳RNA (ncRNA)；断片化核酸；ミトコンドリアや葉緑体などの細胞内小器官から得られる核酸; ならびに、生物学的サンプルに存在する可能性のある微生物、寄生虫、または DNAウイルスもしくは RNA ウイルスから得られる核酸が含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルに追加または「スパイク(spike)」されるヌクレオチド類似体を含むもしくは含まない場合がある合成核酸配列も本発明の範囲内である。スモールRNAまたはスモールRNA種という用語は、特に長さが500nt未満のRNAを指す。１つの実施形態において、核酸はDNAである。サンプルは、２種類以上の核酸を含み得る。意図する用途に応じて、サンプルからすべてのタイプの核酸 (例えば DNA および RNA)、または特定のタイプの核酸または特定のタイプの核酸のみ（例えば、DNAではなくRNAのみ、またはその逆、または別々に取得する必要があるDNAとRNA）を分離することが望ましい場合がある。これらの変形はすべて本発明の範囲内である。DNAまたはRNAのいずれか、または両方のタイプの核酸を並行して単離するための適切な方法は、先行技術において知られている。

「サンプル」という用語は、本明細書では広い意味で使用され、核酸を含む様々な供給源を含むことを意図している。サンプルは生物学的サンプルであってもよいが、この用語には他の、例えば核酸を含む人工サンプルも含まれる。サンプルの例は以下が含まれるが、これらに限定されない：体液全般、全血; 血清; 血漿; 赤血球; 白血球; バフィーコート; これらに限定されないが口腔スワブ、喉スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、頸部スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどを含むスワブ; 尿; 喀痰; 唾液; 精液; リンパ液; 肉汁（liquor）; 羊水; 脳脊髄液; 腹水; 胸水; 嚢胞からの液体;滑液; 硝子体液; 房水; 嚢液; 洗眼; 目吸引; 血漿; 血清; 肺洗浄; 肺吸引物; およびこれらに限定されないが肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓を含む組織、細胞培養物、ならびにサンプル上またはサンプル内に存在する可能性のある細胞および微生物およびウイルスから得られた溶解物、抽出物、または材料など。核酸を含む臨床または法医学の設定から得られた材料も、サンプルという用語の意図した意味の範囲内である。さらに、当業者は、上記の例示的なサンプルのいずれかから得られた溶解物、抽出物、または材料またはそれらの部分もサンプルという用語の範囲内であることを理解するであろう。好ましくは、サンプルは、ヒト、動物、植物、バクテリア、または菌類に由来する生物学的サンプルである。特に、「サンプル」という用語は、タンパク質も含む核酸含有サンプルを指す。好ましくは、サンプルは、細胞、組織、細菌、ウイルス、および例えば血液などの体液、バフィーコート、血漿および血清などの血液製剤、尿、肉汁（liquor）、喀痰、便、CSF および精子、上皮スワブ、生検、骨髄サンプルおよび組織サンプル、好ましくは、肺および肝臓などの臓器組織サンプルからなる群から選択される。好ましくは、サンプルは、全血およびバフィーコート、血清または血漿などの血液製剤から選択される。核酸は、例えばPCR反応からなどの人工的に合成された核酸であってもよい。本方法で使用されるサンプル溶液は、例えば、細胞または組織の溶解によって、または体液の分画および／または前処理によって、生物材料から直接得ることができる。あるいは、サンプル溶液は、PCRまたはアガロースゲルからの精製などの精製、合成または改変のための方法であり得る核酸処理方法から得ることができる。

本発明の好ましい一実施形態では、（異なる供給源からの）複数の異なるサンプルから分析物をプールする方法は、以下の工程を含む：
(a) 第１のサンプルを磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子と接触させる工程、
(b) まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、
(c) 磁気収集デバイスから磁気捕捉粒子を放出することなく、磁気収集デバイスから第１のサンプルを除去すること、またはその逆を行う工程、
(d) 磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子を少なくとも１つのさらなるサンプルと接触させる工程であって、該少なくとも１つのさらなるサンプルは第１のサンプルとは異なるものである工程、
または、代わりに、
(a') 第１のサンプルを磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子と接触させる工程、
(b') まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、
(c') 少なくとも１つのさらなるサンプルを磁気収集デバイスおよび少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子と接触させる工程、
(d') まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、および
(e') 第１のサンプルと少なくとも１つのさらなるサンプルのうちのいずれか２つの液体を組み合わせることなく、磁気捕捉粒子と少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子を組み合わせる工程。

したがって、本発明の方法は、２つの代替実施形態で実現することができ、１つ（工程ａからｄ）では、磁気捕捉粒子の単一セットを複数のサンプルと接触させて収集し、それによって磁性粒子に結合した分析物をプールする。別の実施形態（工程ａ’からｅ’）は、それぞれ個別にサンプルと接触させられる磁性粒子の複数のセットを使用し、次いで磁気収集デバイスを使用することによって、粒子のみが互いにプールされる。いずれにせよ、本発明の方法は、潜在的な陽性サンプルプールにおいて標的分析物の望ましくない希釈をもたらすサンプル材料を直接プールする工程を回避する。

本発明の好ましい一実施形態において、少なくとも１つのさらなるサンプルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０、または１１から１５、または１１から２０、または２０から５０、１００、１５０またはそれ以上の個々のサンプルを含む。本発明の方法の１つの利点は、標的分析物の濃度の希釈または低下を回避することにより、先行技術の方法と比較して、１つのプール内でより多くのサンプルを組み合わせることができることである。

前述のとおり、本発明の方法は、好ましくは、第１のサンプルおよび少なくとも１つのさらなるサンプルのうちの任意の２つの液体の直接的および／または実質的な組み合わせを含まない。

さらに、本発明の方法は、例えば任意のフィルター、遠心分離（例えば沈殿後）、または結合カラムを使用して分析物分子を濃縮する追加の工程を必要とせず、したがって好ましくはこれらの工程を含まない。

本発明の特定の好ましい一実施形態では、第１のサンプルまたは少なくとも１つのさらなるサンプルを、磁気捕捉粒子または少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子とそれぞれ接触させる工程は、サンプル中に潜在的に存在する分析物を磁気捕捉粒子に捕捉するのに十分な時間接触させる工程を含む。通常、「接触する」という用語は、２つ以上の実体が互いに相互作用できるように空間的に近接していることを意味し、例えば、磁気収集デバイスと磁気捕捉粒子の場合、磁気収集デバイスが磁化されると、磁気捕捉粒子は磁場内を移動し、磁気収集デバイスの表面に付着できるような空間的近接状態にあることを意味する。

好ましくは第１のサンプルの各サンプルと、少なくとも１つのさらなるサンプルの各サンプルは、互いに異なるものであって、好ましくは、前記サンプルのそれぞれは、独立して標的分析物を含むか、または含まないものであってよい。「標的分析物」という用語は、宿主の核酸などの他の多くの非標的核酸を通常含む生体サンプル中で検出されるウイルス核酸など、検出方法の対象である分析物分子の一種を指すものとする。本発明の文脈における別個のサンプルは、好ましくは、異なる患者または対象に由来するサンプルである。

本発明のさらに別の実施形態は、分析物が磁気捕捉粒子に特異的に結合できる分子化合物であることを必要とするものであり、好ましくは、分析物は、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物（糖）、またはそれらの任意の組み合わせなどの生物学的分子である。例えばシリカ粒子については、それらが核酸に結合できることが知られている。しかしながら、他の分析物は、異なる粒子材料またはコーティングが必要になる場合があり、例えば、特定のタンパク質を捕捉するための抗体などである。

本発明のいくつかの実施形態において、工程（ｃ）と（ｄ）の間で、または代替の工程（ｅ’）の前で、磁気捕捉粒子が洗浄される。このような洗浄工程は、複数回繰り返され得る。

いくつかの実施形態において、磁気捕捉粒子は、磁気捕捉粒子を磁気捕捉デバイスからサンプル液体中に放出することによって、各サンプル内の分析物と接触する。このような放出は、磁気収集デバイスを減磁することによって、場合によってはサンプル液体中でデバイスをさらに撹拌することによって行うことができる。代替的な他の手段、または、当業者に知られている別の磁石または分離装置を使用して粒子を除去することも、本発明の範囲に含まれるものとする。

本発明の方法の（ｅ’）の工程が、磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子からサンプル液体を除去することを含むことはさらに好ましい可能性がある。さらなる実施形態において、工程（ａ）、（ｄ）、（ａ’）および／または（ｃ’）は、サンプル液体を撹拌する工程を含む。

本明細書に従って実施された本発明の方法は、２つ以上の磁気捕捉粒子をそれぞれ異なるサンプルと接触させ、それぞれが異なるサンプルからの分析物と潜在的に結合するように組み合わせおよび／または混合することになる。

さらに、本発明の方法は、１つまたは複数の磁気捕捉粒子から潜在的に結合した分析物を除去する工程を含むことができる。続いて、溶出された分析物は、溶出された分析物プール中の標的分析物の有無を決定するために、ＰＣＲに基づく方法などの検出方法に供され得る。

第２の態様において、本発明は、核酸検出のために複数の核酸サンプルをプールする方法であって、該方法は、第１の態様の方法を使用して各サンプルの核酸分析物を組み合わせる工程を含む、方法に関する。

第３の態様において、本発明は、患者サンプル中の病原体由来の分析物種を検出する方法であって、該方法は、異なる患者からサンプルを提供する工程、各サンプルの分析物を第１または第２の態様の方法でプールする工程、プールされた分析物を使用して分析物種を検出する方法を実行する工程を含むものであって、プールされた分析物中に分析物種が検出される場合、別の検出が患者サンプルごとに個別に実行され、１つまたは複数のサンプルのどれが分析物種を含むかを同定する、方法に関する。

本明細書で使用される、「（本）発明の」、「本発明による」、「本発明に従う」などの用語は、本明細書に記載および／または本特許請求の範囲に記載される本発明のすべての態様および実施形態を参照することを意図する。

本明細書で使用されるように、「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」および「からなる（consisting of）」の両方を包含すると解釈されるべきであり、両方の意味が具体的に意図され、したがって、本発明による実施形態を個別に開示する。本明細書で使用される「および／または」は、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示と見なされるべきである。例えば、「Aおよび／またはB」は、(i) A、(ii) B、および (iii) AおよびBのそれぞれの特定の開示として、あたかもそれぞれが個別に本明細書に記載されているかのように解釈されるべきである。本発明の文脈において、「約」および「およそ」という用語は、問題の特徴の技術的効果を確実にするために当業者が理解する精度の間隔を示す。この用語は通常、示された数値から±20%、±15%、±10%、例えば±5%の偏差を示す。当業者に理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然または生物学的な技術的効果は、一般に、人為的または工学的な技術的効果の偏差よりも大きな偏差を有する可能性がある。当業者に理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然または生物学的な技術的効果は、一般に、人為的または工学的な技術的効果の偏差よりも大きな偏差を有する可能性がある。単数名詞を参照するときに不定冠詞または定冠詞が使用される場合、たとえば「a」、「an」、または「the」は、他に何かが特に述べられていない限り、その名詞の複数形を含む。

本発明の教示を特定の課題または環境に適用し、本発明の変形または追加機能を（例えばさらなる態様および実施形態に）含めることは、本明細書に含まれる教示に照らして当業者の能力の範囲内であることを理解されたい。

文脈上別段の指示がない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。

本明細書で引用されるすべての参考文献、特許、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ここで、本発明の特定の態様および実施形態を、実施例として、および本明細書に記載の説明、図および表を参照して説明する。本発明の方法、使用および他の態様のそのような実施例は代表的なものにすぎず、本発明の範囲をそのような代表的な実施例のみに限定するものと解釈されるべきではない。

実施例を以下に示す：

比較例１：先行技術の核酸単離

図１Ａおよび図１Ｂは、磁気捕捉ビーズを使用して核酸を捕捉する先行技術の方法を示す。個々のサンプルまたはプールされたサンプルのライセートを磁気ビーズと混合し、磁石を使用して分析物の核酸を結合する。次に、ビーズを磁石で洗浄液に移し、その後、最終分析のために溶出する。

実施例１

図２Ａは本発明の方法の好ましい実施形態を実施するための典型的なプレートレイアウトを示す。各溶解プレートは、本発明の方法に従ってプールされる個々のサンプル（患者サンプル）のライセートを含む。プレートが複数のウェルを含む場合、複数のプール手順が並行して実行される。次に、１つのプレート座標（plate coordinate）のサンプルが互いにプールされる。プレートの数は、３人の患者をプールするための３つの溶解プレート、７人の患者をプールするための７つの溶解プレートなどを使用してカスタマイズできるプールサイズを示す。プールする工程は、ＬＰ１、Ａ１（ＬＰ２）、Ａ１（ＬＰ３）、Ａ１（ＬＰ４）およびＡ１（ＬＰ５）の位置Ａ１から核酸を連続的に収集することによって行われる。96 ロッドヘッド（rod head）を使用して、すべてのウェルが並列にプールされる。他の形式も可能である (348、12、6 など)。

核酸精製の一般的なセットアップ (ビーズ、洗浄バッファー、および溶出プレート) は、使用される調製化学物質によって異なる場合がある。示されているセットアップは、Chemagen （登録商標）の V300 の準備である。ビーズベースのプールする工程では、さまざまな会社の他の抽出キットも使用でき、必要な基本条件は、磁気ビーズをあるプレートから次のプレートに移動できることだけである。したがって、King Fisher Flex （登録商標）、IDEAL（登録商標） 96抽出ロボットまたはBiosprint（登録商標） 96のようなシステムも使用できる。

図２Ｂに示されるとおり、次に、磁気ロッドヘッドを各サンプルプレートと順次接触させ、従来技術の方法と同様に可能な洗浄工程が可能である。サンプル溶解中のプールする工程は、対応するウェルから核酸を収集するために、すべての溶解プレートに移される１セットのビーズによって達成される。その後、洗浄および溶出工程は通常どおりに実行される。

実施例２

実施例２では、粒子を各溶解プレートに移す代わりに、粒子を収集用の磁気プレートに追加し、粒子を保持しているプレートに複数のライセートを順次追加する。インキュベーション後、粒子はプレートの底に付着し、ライセートが吸引され、任意でプレートが洗浄され、その後別のサンプルと接触して分析物がプールされる。プールする工程の後、通常の洗浄および溶出工程を経て抽出を継続する。

図面の用語
Setup for normal single sample nucleic acid purification通常のシングルサンプル核酸精製のセットアップ
Beads ビーズ
Lysisplate 溶解プレート
Washbuffer 洗浄バッファー
Elutionplate 溶出プレート
Mix 混合
Magnetic Rod 磁気ロッド
Magnetic Adsorption 磁気吸着
Transfer 移動
Lysis 溶解
Wash 洗浄
Elution 溶出
Setup for bead based pooling process (example shown for pooling of 5 patients) ビーズベースのプールする工程のセットアップ（５人の患者をプールした例）

Claims

（異なる供給源からの）複数の異なるサンプルから分析物をプールする方法であって、
（ａ）第１のサンプルを磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子と接触させる工程、
（ｂ）まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、
（ｃ）磁気収集デバイスから磁気捕捉粒子を放出することなく、磁気収集デバイスから第１のサンプルを除去すること、またはその逆を行う工程、
（ｄ）磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子を少なくとも１つのさらなるサンプルと接触させる工程であって、該少なくとも１つのさらなるサンプルは第１のサンプルとは異なるものである工程、
または、代わりに、
（ａ’）第１のサンプルを磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子と接触させる工程、
（ｂ’）まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、
（ｃ’）少なくとも１つのさらなるサンプルを磁気収集デバイスおよび少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子と接触させる工程、
（ｄ’）まだ結合されていない場合、磁力を適用することによって、少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスに結合する工程、および
（ｅ’）第１のサンプルと少なくとも１つのさらなるサンプルのうちのいずれか２つの液体を組み合わせることなく、磁気捕捉粒子と少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子を組み合わせる工程、
を含む、方法。
少なくとも１つのさらなるサンプルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０、または１１から１５、または１１から２０、または２０から５０、１００、１５０またはそれ以上の個々のサンプルを含む、請求項１に記載の方法。
第１のサンプルと少なくとも１つのさらなるサンプルのうちのいずれか２つの液体の直接的および／または実質的な組み合わせを含まない、請求項１または２に記載の方法。
第１のサンプルまたは少なくとも１つのさらなるサンプルを、磁気捕捉粒子または少なくとも１つのさらなる磁気捕捉粒子とそれぞれ接触させる工程は、サンプル中に潜在的に存在する分析物を磁気捕捉粒子に捕捉するのに十分な時間接触させる工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
サンプルが生物学的サンプルである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
第１のサンプルの各サンプルと少なくとも１つのさらなるサンプルの各サンプルは、互いに異なるものであって、好ましくは、前記サンプルのそれぞれは、独立して分析物を含むか、または含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
分析物が磁気捕捉粒子に特異的に結合できる分子化合物であって、好ましくは、該分析物は、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物（糖）、またはそれらの任意の組み合わせなどの生物学的分子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
磁気収集デバイスは、磁気ロッドとサンプルと磁気捕捉粒子とを接触させるためにサンプル液体中に導入できる磁気ロッドである、または、
磁気収集デバイスは、磁気コンパートメントとサンプル液体と磁気捕捉粒子と接触させるためにサンプル液体を保持できる磁気コンパートメントである、
請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｃ）と（ｄ）の間で、または代替の工程（ｅ’）の前で、磁気捕捉粒子が洗浄される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
各サンプルは液体サンプルであり、および前記液体は分析物を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
磁気捕捉粒子は、磁気捕捉粒子を磁気収集デバイスからサンプル液体中に放出することによって、各サンプル内の分析物と接触する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
（ｅ’）の工程が、磁気収集デバイスおよび磁気捕捉粒子からサンプル液体を除去することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
工程（ａ）、（ｄ）、（ａ’）および／または（ｃ’）は、サンプル液体を撹拌する工程を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
核酸検出のために複数の核酸サンプルをプールする方法であって、該方法は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法を使用して各サンプルの核酸分析物を組み合わせる工程を含む、方法。
患者サンプル中の病原体由来の分析物種を検出する方法であって、該方法は、さまざまな患者からサンプルを提供する工程、各サンプルの分析物を請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法でプールする工程、プールされた分析物を使用して分析物種を検出する方法を実行する工程を含むものであって、プールされた分析物中に分析物種が検出される場合、別の検出が患者サンプルごとに個別に実行され、１つまたは複数のサンプルのどれが分析物種を含むかを同定する、方法。