CN105925569A - 一种从临床样本中快速提取细菌基因组dna的试剂盒和方法 - Google Patents

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陶金程
王晓艳
张志强
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Abstract

本发明公开了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和方法，其中，所述试剂盒采用两种不同粒径的玻璃珠来破坏细菌细胞壁，使其破壁效果好，能同时适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，提高了试剂盒的通用性，同时利用磁珠对基因组的高效提取，使试剂盒具有很好的灵敏度，从而可以适用于被不同细菌污染且细菌含量较低的临床样本。而本发明公开的提取方法克服了现有技术操作繁琐费时的缺陷，其仅包括样品裂解、磁性分离、洗涤、洗脱四个步骤，无需离心沉淀，操作简便省时使用自动化。

Description

一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒和一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法。
背景技术
细菌感染是临床常见的感染性疾病，一旦细菌感染进入血液很容易发生败血症，通过血脑屏障进入脑脊液引起严重的脑膜炎或脑脊髓膜炎，如果早期不能得到及时的诊断和治疗，就会严重威胁患者健康甚至危及患者生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法，缺乏敏感性和特异性，诊断周期长，不能早期快速的诊断病原菌感染，因此，寻找快速的诊断方法至关重要。
随着分子生物学技术的发展，PCR技术以快速、敏感和特异等优点迅速地应用到微生物检测领域，PCR方法应用于临床细菌的检测，首要难题是临床标本中细菌DNA的制备。高效快速的细菌DNA制备方法是使用PCR方法对临床标本进行细菌检测的前提，也是提高PCR方法检测细菌灵敏度的关键。实际情况中临床标本中细菌丰度低、标本量有限以及样本中PCR反应抑制剂的存在严重限制着PCR技术在临床感染性疾病病原学诊断中的广泛应用，获得一定浓度和纯度的基因组DNA是进行细菌分子生物学研究的基础。
目前，细菌基因组DNA提取方法常见的有细菌DNA提取试剂盒法、碱裂解法、溶菌酶法、煮沸法等，但是这些方法在处理临床标本中都具有一定的局限性。其中，应用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA效果好但成本较高，提取步骤多时间长，受细菌量的影响较大，临床应用受到限制；碱裂解法操作简单，提取DNA纯度高，但提取时间长(通常需要2h以上)，并且有一定的腐蚀性；煮沸法时间较短、容易操作，但难以提取革兰阳性菌基因组DNA；溶菌酶法适用于革兰阳性菌和革兰阴性菌，但操作繁琐，成本较高，提取时间长，且溶菌酶对不同细菌的消化能力存在较大差异性，比如金黄色葡萄球菌对溶菌酶消化耐受较强，还有一些细菌能完全抵抗溶菌酶消化。因此需要建立一种通用于革兰阳性菌和革兰阴性菌、高效快速、简便并应用于临床标本中细菌DNA提取的方法。
磁珠法是近几年才发展起来的DNA提取方法，其涉及的试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化。比如专利文献CN200910307632.1公开了“一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法”，专利文献CN201110204053.1公开了“磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法”，但是上述提取方法在用于提取临床样本中可能含有的细菌基因组DNA时，仍然存在提取效率较低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服目前的DNA提取方法在用于提取临床样本中可能含有的细菌基因组DNA时所存在的提取效率较低的缺陷，提供一种从临床样本(包括血清、血液、脑脊液、尿液等)中能够以较高提取效率分离纯化出高收率和高纯度的细菌基因组DNA的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、磁珠结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。
本发明还提供了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将临床样本与裂解缓冲液、蛋白酶K、粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合并进行裂解，得到裂解产物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2-5)；(2)将步骤(1)得到的裂解产物与磁珠结合液混合并进行结合和磁分离且弃去液体，得到磁分离产物；(3)将步骤(2)得到的磁分离产物与洗涤缓冲液混合进行洗涤，得到洗涤产物；(4)将步骤(3)中的洗涤产物与洗脱缓冲液混合进行洗脱，得到洗脱产物。
通过上述技术方案，本发明能够从临床样本(包括血清、血液、脑脊液、尿液等)中将可能含有的细菌基因组DNA以较高的收率和纯度提取出来。此外，本发明的具有以下几个优点：(1)通用性强，本发明采用混合玻璃珠破碎细菌细胞壁，其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均起作用，而临床样品中通常同时含有多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，这样扩大了试剂盒的应用范围，并且提取到的核酸纯度高完整性好，可以直接用来进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究及临床检测；(2)灵敏度高，本发明采用粒径为710-1180μm和425-600μm的两种规格玻璃珠混合，效果明显优于单一玻璃珠的破壁效果，避免了由于破壁不完全造成的漏提漏检，同时超顺磁性氧化硅纳米微珠对基因有非常好的富集效果，因而混合玻璃珠和磁珠的结合能够有效提高试剂盒的检测灵敏度，降低检测限，减少假阳性率，这样即使临床样本中的细菌量很少也能够得到正确的检测结果；(3)简便快速适于自动化，本发明只需要四步便完成细菌基因组的提取，克服了现有方法步骤繁多的缺点，省去了现有技术中的离心、沉淀等耗时步骤，约15min完成特定样品的提取，操作简单，并且可配合自动化核酸提取仪进行高通量提取；(4)安全环保，使用本发明方法提取核酸，不需要使用酚、氯仿等有毒的有机溶剂抽提，减少了对实验人员身体的伤害及对环境的影响。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、超顺磁性氧化硅纳米微珠、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；其中，该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。
其中，本发明采用的粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合，效果明显优于单一粒径玻璃珠的破壁效果，且通用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的破壁；不仅避免了由于破壁不完全造成的漏提漏检，而且显著节省了实验操作时间。
其中，根据本发明一种优选的实施方式，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2.5-3.5)。在该优选实施方式中，本发明能够进一步提高从临床样本中提取可能含有的细菌基因组DNA的收率和纯度。
其中，所述裂解缓冲液可以含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值可以为6.2-7.2。所述磁珠结合液可以含有直径可以为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液可以含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠。每1mL的磁珠结合液还可以含有50-99体积％的乙醇和余量的水。所述洗涤缓冲液可以10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值可以为7.0-7.2；可选地，所述洗涤缓冲液还可以含有2-4M的变性剂、1-6mM的离子螯合剂。所述洗脱缓冲液可以含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离子螯合剂，且pH值可以为8.0-8.5，所述洗脱缓冲液也可以为无菌水。
本发明涉及的临床样品中细菌丰度低、标本量有限，因此，本发明采用磁珠的方式吸附核酸。本发明涉及的变性剂可导致细胞结构及核蛋白二级结构破坏，解离核酸与核蛋白，并且利于基因组DNA和超顺磁性氧化硅纳米微珠的结合。本发明涉及的缓冲盐提供稳定的pH值条件，以保护核酸。本发明涉及的螯合剂能够与金属离子相结合，从而降低溶液中游离金属离子的浓度，由此能够有效防止DNA被核酸酶降解、起到保护DNA完整性的作用。本发明涉及的磁珠结合液含有超顺磁性氧化硅纳米微珠，超顺磁性氧化硅纳米微珠具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳；在乙醇存在下超顺磁性氧化硅纳米微珠能够吸附核酸，从而在磁分离和洗涤的过程中将核酸与其它样品成分分离开来，而在洗脱过程中，吸附在超顺磁性氧化硅纳米微珠上的核酸在洗脱液中可以从超顺磁性氧化硅纳米微珠上解离，溶解在洗脱液中。
其中，所述裂解缓冲液中的变性剂可以包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的至少一种；所述缓冲盐可以为Tris-HCl；所述离子螯合剂可以为EDTA；所述表面活性剂可以包括Triton X-100、NP-40、Tween 20和SDS中的至少一种；所述洗涤缓冲液中的变性剂可以包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的一种；所述洗脱缓冲液中的缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA。
本发明还提供了一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将临床样本与裂解缓冲液、蛋白酶K、粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合并进行裂解，得到裂解产物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2-5)；(2)将步骤(1)得到的裂解产物与磁珠结合液混合并进行结合和磁分离且弃去液体，得到磁分离产物；(3)将步骤(2)得到的磁分离产物与洗涤缓冲液混合进行洗涤，得到洗涤产物；(4)将步骤(3)中的洗涤产物与洗脱缓冲液混合进行洗脱，得到洗脱产物。
其中，作为本发明优选的实施方式，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2.5-3.5)。在该优选实施方式中，本发明能够进一步提高从临床样本中提取可能含有的细菌基因组DNA的收率和纯度。
其中，相对于每毫升所述临床样本，所述裂解缓冲液的用量可以为0.8-2.4mL，蛋白酶K的用量可以为1-3mg，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的总用量可以为0.1-2g，磁珠结合液的用量可以为1-2.5mL，洗涤缓冲液的用量可以为2-15mL，洗脱缓冲液的用量可以为150-1250μL。
其中，所述裂解缓冲液可以含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值可以为6.2-7.2。所述磁珠结合液含有直径为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠。每1mL的磁珠结合液还可以含有50-99体积％的乙醇。所述洗涤缓冲液可以含有10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值可以为7.0-7.2；可选地所述洗涤缓冲液还含有2-4M的变性剂和1-6mM的离子螯合剂。所述洗脱缓冲液可以含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离子螯合剂，且pH值可以为8.0-8.5。
其中，所述裂解缓冲液中的变性剂可以包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的至少一种。所述缓冲盐可以为Tris-HCl。所述离子螯合剂可以为EDTA。所述表面活性剂可以包括Triton X-100、NP-40、Tween 20和SDS中的至少一种。所述洗涤缓冲液中的变性剂可以包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的一种。所述洗脱缓冲液中的缓冲盐可以为Tris-HCl。所述离子螯合剂可以为EDTA。
其中，进行裂解的操作可以包括震荡，例如可以在涡旋器上，以100-5000rpm的转速震荡2-10分钟。
其中，所述临床样本可以为需要进行细菌基因组DNA检测的临床样本。所述临床样本可以为液态的临床样本。所述临床样本可以包括血液、血清、脑脊液和尿液的至少一种。所述细菌可以包括革兰阳性菌和/或革兰阴性菌。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。例如，粒径为710-1180μm的第一玻璃珠购自Sigma公司，货号为G1152；粒径为425-600μm的第二玻璃珠购自Sigma公司，货号为G8772。
实施例1
取较难破壁的金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)作为模拟的提取对象，将已知菌体浓度为109CFU/mL的培养液(培养基为LB培养基)用无菌水分别梯度稀释到108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL以及102CFU/mL的菌体浓度，作为含有细菌的模拟临床样本，取100μL模拟临床样本，进行提取，每个浓度提取3个重复。
提取的操作包括：在离心管中，将100μL的裂解缓冲液(6M盐酸胍，50mM Tris-HCl，10mM的EDTA，1重量％的Triton X-100，1重量％的NP-40(pH＝6.5))、10μL蛋白酶K(含0.2mg蛋白酶K)和0.2g玻璃珠(粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠按1:3的重量比混合)混合，在涡旋器上2500rpm，振荡5min，得到裂解产物；将上述裂解产物与210μL磁珠结合液(10μL磁珠，1mg的直径为200nm的磁珠，200μL无水乙醇)充分混合，然后置于磁力架上，磁吸附10s，使磁珠完全吸附于管壁，吸弃上清；将离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤缓冲液Ⅰ(0.05M的NaCl，1mM的EDTA，10mM的Tris-HCl，70体积％的乙醇，pH值为7.0)，移液器吹吸或涡旋振荡混匀，再将离心管置于磁力架上，磁吸附10s，吸弃上清；加入600μL洗涤缓冲液Ⅱ(10mM的Tris-HCl，80体积％的乙醇，pH值为7)，用移液器吹吸或涡旋振荡混匀，再将离心管置于磁力架上，磁吸附10s，吸弃上清，放置晾干；将离心管从磁力架上取下，加入50μL洗脱缓冲液(10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA)，用移液器吹吸混匀，使核酸充分洗脱；离心管置于磁力架上，磁吸附10s，使磁珠吸附于离心管壁，将上清转移至干净的离心管中，即得到洗脱产物，该洗脱产物即为含有细菌基因组DNA的产品。
测定不同菌体浓度的样品所提取得到的洗脱产物的OD值(即260nm处的OD值与280nm处的OD值的比例)，结果见表1-1。用荧光定量法评估细菌基因组DNA的提取效果：结果见表1-1。
按照如下操作配置反应体系：Taq DNA聚合酶1μL(5U/μL)，10×PCRBuffer(100mM Tris-HCl(pH8.8)，200mM(NH4)2SO4，0.1％Tween-20)2.5μL，dNTP 0.75μL(10mM)，MgCl2 4μL(25mM)，引物1μL(10μM)，探针0.5μL(10μM)；模板(上述洗脱产物)2μL，去离子水补至25μL。将PCR管放入Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪中，按照如下反应条件进行PCR扩增，扩增的Ct值见表1-2。其中，引物的序列如下：
上游：CAAGCACCAAAAGACCAATT(SEQ ID NO.1)，下游：
CACCAGGTTTAACGACATAAT(SEQ ID NO.2)，探针：
CACCAAAAGACCAATTAGCTT(SEQ ID NO.3)。
表1-1混合玻璃珠的提取结果的OD值
表1-2混合玻璃珠的提取结果的Ct值
根据表1-1的数据可见，本发明能够将较难破壁的金黄色葡萄球菌的基因组DNA在各浓度下均可以以较高的纯度提取出来。根据表1-2的数据可见，本发明在菌液浓度较低的情况下均可以以较高的提取效率提取出来，最低提取量可达102CFU/mL。
对比例1
按照实施例1相同的方法进行细菌基因组DNA的提取，所不同的是，所用的玻璃珠全部为粒径为710-1180μm的玻璃珠，或者全部为粒径为425-600μm的玻璃珠，提取的结果分别如表2-1/2和表3-1/2所示。
表2-1单一粒径(710-1180μm)玻璃珠的提取结果的OD值
表2-2单一粒径(710-1180μm)玻璃珠的提取结果的Ct值
表3-1单一粒径(425-600μm)玻璃珠的提取结果的OD值
表3-2单一粒径(425-600μm)玻璃珠的提取结果的Ct值
根据表2-1/2-2和表3-1/3-2的数据可见，单一粒径的玻璃珠在提取效率和纯度上均不如本发明涉及的混合型的玻璃珠。
实施例2
按照实施例1相同的方法进行细菌基因组DNA的提取，所不同的是，模拟的提取对象分别为蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)和单增李斯特菌(ATCC19115)。提取的结果分别如表4-1/2和表5-1/2所示。
表4-1蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)的提取结果的OD值
表4-2蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)的提取结果的Ct值
表5-1单增李斯特菌(ATCC 19115)的提取结果的OD值
表5-2单增李斯特菌(ATCC 19115)的提取结果的Ct值
根据表4-1/4-2和表5-1/5-2的数据可见，本发明涉及的提取试剂盒和提取方法能够对不同的细菌实现较高的基因组DNA的提取效率及提取纯度。
实施例3
取已知有细菌感染(根据体外培养实验和显微镜检测，确定是鲍曼不动杆菌的感染)的脑脊液(感染浓度为103CFU/mL)、全血(感染浓度为104CFU/mL)；用生理盐水做10倍、100倍稀释，连同原液作为评估用的检测样本，按照实施例1所述的方法，裂解、吸附、洗涤、洗脱后，取2μL洗脱产物作为PCR模板，采用引物及探针(具体序列为上游：
CCTGAATCTTCTGGTAAAC(SEQ ID NO.4)、下游：
TCTGGGCTGCCAAACATT(SEQ ID NO.5)和探针：
AACCATCACTTTGCAAGC(SEQ ID NO.6))，进行荧光定量PCR定量检测，检测结果如表6和表7所示。
表6鲍曼不动杆菌感染的脑脊液临床样品的提取和检测结果
表7鲍曼不动杆菌感染的全血临床样品的提取和检测结果
根据表6和表7的数据可见，本发明涉及的提取试剂盒和提取方法能够对含有细菌的临床样本的实现较高的细菌基因组DNA的提取效率。
实施例4
取已知有细菌感染(根据体外培养实验和显微镜检测，确定是肺炎链球菌的感染，感染浓度为104CFU/mL)的全血作为评估用的检测样本，按照实施例1所述的方法，裂解、吸附、洗涤、洗脱后，取2μL洗脱产物作为PCR模板，采用引物及探针(具体序列为上游：ACG CAA TCT AGC AGA TGAAGC A(SEQ ID NO.7)、下游：TCG TGC GTT TTA ATT CCA GCT(SEQ IDNO.8)和探针：TGC CGA AAA CGCTTG ATA CAG GGA G(SEQ ID NO.9))，进行荧光定量PCR定量检测，检测结果如表8所示。其中，粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合的重量分别为1:2、1:3、1:4和1:5
表8肺炎链球菌感染的脑脊液临床样品的提取和检测结果
根据表8的数据可见，在优选所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：3的情况下，本发明能够进一步提高从临床样本中提取细菌基因组DNA的提取效率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、磁珠结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；其特征在于，该试剂盒还包括粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2-5)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(2.5-3.5)。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述裂解缓冲液含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值为6.2-7.2；所述磁珠结合液含有直径为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠；所述洗涤缓冲液含有10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值为7.0-7.2；可选地所述洗涤缓冲液还含有2-4M的变性剂和1-6mM的离子螯合剂；所述洗脱缓冲液含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离子螯合剂，且pH值为8.0-8.5。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述裂解缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的至少一种；所述缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA；所述表面活性剂包括Triton X-100、NP-40、Tween 20和SDS中的至少一种；所述洗涤缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的一种；所述洗脱缓冲液中的缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA。
5.一种从临床样本中快速提取细菌基因组DNA的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将临床样本与裂解缓冲液、蛋白酶K、粒径为710-1180μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合并进行裂解，得到裂解产物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2-5)；
(2)将步骤(1)得到的裂解产物与磁珠结合液混合并进行结合和磁分离且弃去液体，得到磁分离产物；
(3)将步骤(2)得到的磁分离产物与洗涤缓冲液混合进行洗涤，得到洗涤产物；
(4)将步骤(3)中的洗涤产物与洗脱缓冲液混合进行洗脱，得到洗脱产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(2.5-3.5)。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，相对于每毫升所述临床样本，所述裂解缓冲液的用量为0.8-2.4mL，蛋白酶K的用量为1-3mg，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的总用量为0.1-2g，磁珠结合液的用量为1-2.5mL，洗涤缓冲液的用量为2-15mL，洗脱缓冲液的用量为150-1250μL。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述裂解缓冲液含有2-6M的变性剂、20-100mM的缓冲盐、10-100mM的离子螯合剂和0.5-10重量％的表面活性剂，且pH值为6.2-7.2；所述磁珠结合液含有直径为200-400nm的超顺磁性氧化硅纳米微珠和乙醇，每1mL的磁珠结合液含有2-6mg的超顺磁性氧化硅纳米微珠；所述洗涤缓冲液含有10-20mM的缓冲盐和50-80体积％的乙醇，且pH值为7.0-7.2；可选地所述洗涤缓冲液还含有2-4M的变性剂和1-6mM的离子螯合剂；所述洗脱缓冲液含有0-20mM的缓冲盐和0-2mM的离子螯合剂，且pH值为8.0-8.5。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述裂解缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的至少一种；所述缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA中的至少一种；所述表面活性剂包括Triton X-100、NP-40、Tween 20和SDS中的至少一种；所述洗涤缓冲液中的变性剂包括盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠和碘化钾中的一种；所述洗脱缓冲液中的缓冲盐为Tris-HCl；所述离子螯合剂为EDTA。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述临床样本为需要进行细菌基因组DNA检测的临床样本，且所述临床样本包括血液、血清、脑脊液和尿液中的至少一种；所述细菌包括革兰阳性菌和/或革兰阴性菌。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434638A (zh) * 2016-11-11 2017-02-22 河南省农业科学院小麦研究所 一种大量提取细菌质粒的方法
CN106754884A (zh) * 2017-01-10 2017-05-31 天根生化科技（北京）有限公司 试剂盒及其应用
CN107653241A (zh) * 2017-10-20 2018-02-02 南通柯侎克生物科技有限公司 一种人全血中细菌基因组dna提取试剂盒及方法
CN107746843A (zh) * 2017-10-20 2018-03-02 南通柯侎克生物科技有限公司 一种败血症专用细菌基因组dna提取试剂盒及方法
CN108342383A (zh) * 2018-02-28 2018-07-31 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种高纯度dna或rna的快速提取试剂盒及其提取方法
CN109266642A (zh) * 2017-07-18 2019-01-25 天根生化科技（北京）有限公司 磁珠法提取粪便微生物基因组的试剂盒及提取方法
CN109762807A (zh) * 2019-03-01 2019-05-17 华中农业大学 一种肉类中细菌dna提取的试剂盒及应用方法
CN110452902A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒
CN110452903A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种无酶法全核酸提取试剂盒
CN110494550A (zh) * 2017-03-28 2019-11-22 孟山都技术公司 用于高通量基因组dna提取的方法
CN110819625A (zh) * 2019-11-13 2020-02-21 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种适用于细菌和/或真菌的基因组dna提取方法
CN113215151A (zh) * 2021-06-29 2021-08-06 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种细菌、真菌、病毒dna核酸提取的方法
CN114958610A (zh) * 2022-06-21 2022-08-30 浙大宁波理工学院 苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560951A (zh) * 2014-12-03 2015-04-29 复旦大学泰州健康科学研究院 一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒
CN104673783A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
CN104694382A (zh) * 2015-03-09 2015-06-10 余家昌 一种核酸快速提取装置及方法
CN105132410A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 上海派森诺生物科技有限公司 一种微生物基因组dna的提取方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560951A (zh) * 2014-12-03 2015-04-29 复旦大学泰州健康科学研究院 一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒
CN104673783A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
CN104694382A (zh) * 2015-03-09 2015-06-10 余家昌 一种核酸快速提取装置及方法
CN105132410A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 上海派森诺生物科技有限公司 一种微生物基因组dna的提取方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨瑞馥: "从土壤中分离DNA的研究进展", 《微生物学免疫学进展》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434638A (zh) * 2016-11-11 2017-02-22 河南省农业科学院小麦研究所 一种大量提取细菌质粒的方法
CN106754884A (zh) * 2017-01-10 2017-05-31 天根生化科技（北京）有限公司 试剂盒及其应用
CN106754884B (zh) * 2017-01-10 2020-06-09 天根生化科技（北京）有限公司 试剂盒及其应用
CN110494550A (zh) * 2017-03-28 2019-11-22 孟山都技术公司 用于高通量基因组dna提取的方法
CN109266642A (zh) * 2017-07-18 2019-01-25 天根生化科技（北京）有限公司 磁珠法提取粪便微生物基因组的试剂盒及提取方法
CN107653241A (zh) * 2017-10-20 2018-02-02 南通柯侎克生物科技有限公司 一种人全血中细菌基因组dna提取试剂盒及方法
CN107746843A (zh) * 2017-10-20 2018-03-02 南通柯侎克生物科技有限公司 一种败血症专用细菌基因组dna提取试剂盒及方法
CN108342383A (zh) * 2018-02-28 2018-07-31 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种高纯度dna或rna的快速提取试剂盒及其提取方法
CN110452903A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种无酶法全核酸提取试剂盒
CN110452902A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒
CN110452902B (zh) * 2018-05-08 2021-07-30 北京中科生仪科技有限公司 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒
CN110452903B (zh) * 2018-05-08 2021-08-27 北京中科生仪科技有限公司 一种无酶法全核酸提取试剂盒
CN109762807A (zh) * 2019-03-01 2019-05-17 华中农业大学 一种肉类中细菌dna提取的试剂盒及应用方法
CN110819625A (zh) * 2019-11-13 2020-02-21 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种适用于细菌和/或真菌的基因组dna提取方法
CN113215151A (zh) * 2021-06-29 2021-08-06 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种细菌、真菌、病毒dna核酸提取的方法
CN114958610A (zh) * 2022-06-21 2022-08-30 浙大宁波理工学院 苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法
CN114958610B (zh) * 2022-06-21 2023-08-18 浙大宁波理工学院 苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法

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