CN107746843A - 一种败血症专用细菌基因组dna提取试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒及方法，试剂盒包括缓冲液GPA、缓冲液GRB、细菌裂解液DA、细菌裂解液DB、缓冲液DC、洗涤液PE、洗脱液EB、蛋白酶K，本发明通过缓冲液GRB分离红/白细胞，尽可能去除人类基因组的影响和干扰，利用SDS和蛋白酶K裂解破碎细菌细胞，并降解蛋白，释放细菌基因组DNA，使用硅胶柱分离纯化方法，获得高质量的细菌基因组DNA。

Description

一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学、分子诊断技术领域，具体为一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒及方法。
背景技术
败血症是致病菌侵入血液系统，并能在血中生长繁殖，产生大量毒素进而引发急性全身性感染。该病危害性大、易导致死亡。因此，快速测定引发败血症的细菌类型，从而指导抗生素的选择和使用，减少盲目用药，缩短患者治疗时间。败血症血液中细菌基因组DNA的提取和纯化的一般程序为：分离红/白细胞、红细胞裂解、细菌裂解和纯化细菌基因组DNA。经典的细菌DNA提取方法为酚氯仿抽提法。这种方法在败血症血液中提取DNA时，难以有效排除人基因组DNA的干扰，且所用到的苯酚、氯仿等有机试剂对操作者有一定的毒害作用。所以，一种低毒性、专一用于败血症的血液中细菌基因组DNA提取试剂盒有极大的科研和临床诊断应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括缓冲液GRA、缓冲液GRB、细菌裂解液DA、细菌裂解液DB、缓冲液DC、洗涤液PE、洗脱液EB、蛋白酶K。
优选的，所述缓冲液GRA由1.32％柠檬酸钠、0.48％柠檬酸、1.47％葡萄糖组成；所述缓冲液GRB由10mM Tris、10mMNaCl、5mM MgCl2，其PH为7.6；所述细菌裂解液DA由25mMTris、20mM EDTA、2％SDS、2M NaCl组成，其pH为7.2-8.0；所述细菌裂解液DB由10mM Tris、4M GUHCl，其pH为5.0-6.0；所述缓冲液DC由25mM Tris、20mM EDTA、2M NaCl、4M GuHCl、30-40％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗涤液PE由25mM Tris、70-80％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗脱液EB由10mM Tris、1mM EDTA组成，其pH为7.5-8.0。
优选的，一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
K、重复步骤J一次；
L、采用12000rpm，离心2min，去除多余液体；
M、将溶液室温静置5-10min，彻底挥发乙醇；
N、加入30-60ul洗脱液EB，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为DNA溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过缓冲液GRB分离红/白细胞，尽可能去除人类基因组的影响和干扰，利用SDS和蛋白酶K裂解破碎细菌细胞，并降解蛋白，释放细菌基因组DNA，使用硅胶柱分离纯化方法，获得高质量的细菌基因组DNA。
附图说明
图1为本发明实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括缓冲液GRA、缓冲液GRB、细菌裂解液DA、细菌裂解液DB、缓冲液DC、洗涤液PE、洗脱液EB、蛋白酶K；其中，缓冲液GRA由1.32％柠檬酸钠、0.48％柠檬酸、1.47％葡萄糖组成；所述缓冲液GRB由10mM Tris、10mMNaCl、5mM MgCl2，其PH为7.6；所述细菌裂解液DA由25mMTris、20mM EDTA、2％SDS、2M NaCl组成，其pH为7.2-8.0；所述细菌裂解液DB由10mM Tris、4M GUHCl，其pH为5.0-6.0；所述缓冲液DC由25mM Tris、20mM EDTA、2M NaCl、4M GuHCl、30-40％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗涤液PE由25mM Tris、70-80％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗脱液EB由10mM Tris、1mM EDTA组成，其pH为7.5-8.0。
实施例一：
采用正常人血液中细菌基因组DNA的提取，方法如下：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
K、重复步骤J一次；
L、采用12000rpm，离心2min，去除多余液体；
M、将溶液室温静置5-10min，彻底挥发乙醇；
N、加入30-60ul洗脱液EB，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为DNA溶液。
实施例二：
正常人血液加入金黄葡萄球菌中的细菌基因组DNA的提取，且每ml血液中加入10000个金黄葡萄球菌，方法如下：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
K、重复步骤J一次；
L、采用12000rpm，离心2min，去除多余液体；
M、将溶液室温静置5-10min，彻底挥发乙醇；
N、加入30-60ul洗脱液EB，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为DNA溶液。
实施例三：
正常人血液加入大肠杆菌中的细菌基因组DNA的提取，且每ml血液中加入10000个金黄葡萄球菌，方法如下：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
K、重复步骤J一次；
L、采用12000rpm，离心2min，去除多余液体；
M、将溶液室温静置5-10min，彻底挥发乙醇；
N、加入30-60ul洗脱液EB，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为DNA溶液。
实施例四：
疑似败血症患者血液中细菌基因组DNA的提取，方法如下：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
K、重复步骤J一次；
L、采用12000rpm，离心2min，去除多余液体；
M、将溶液室温静置5-10min，彻底挥发乙醇；
N、加入30-60ul洗脱液EB，放置2min，12000rpm，离心2min，收集液体，即为DNA溶液。
实施例结果如图1所示：其中，泳道1：正常人血液中细菌基因组DNA的提取，出现细菌DNA条带；泳道2：1ml正常人血液中体外添加104个金黄葡萄球菌后提取的细菌基因组DNA，出现金黄葡萄球菌的基因组DNA；泳道3：1ml正常人血液中体外添加104个大肠杆菌后提取的细菌基因组DNA，出现金黄葡萄球菌的基因组DNA；泳道4：疑似败血症患者血液中提取的细菌基因组DNA，出现细菌基因组DNA。
本发明通过缓冲液GRB分离红/白细胞，尽可能去除人类基因组的影响和干扰，利用SDS和蛋白酶K裂解破碎细菌细胞，并降解蛋白，释放细菌基因组DNA，使用硅胶柱分离纯化方法，获得高质量的细菌基因组DNA。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括缓冲液GRA、缓冲液GRB、细菌裂解液DA、细菌裂解液DB、缓冲液DC、洗涤液PE、洗脱液EB、蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：所述缓冲液GRA由1.32％柠檬酸钠、0.48％柠檬酸、1.47％葡萄糖组成；所述缓冲液GRB由10mMTris、10mMNaCl、5mM MgCl2，其PH为7.6；所述细菌裂解液DA由25mM Tris、20mM EDTA、2％SDS、2M NaCl组成，其pH为7.2-8.0；所述细菌裂解液DB由10mM Tris、4M GUHCl，其pH为5.0-6.0；所述缓冲液DC由25mM Tris、20mM EDTA、2M NaCl、4M GuHCl、30-40％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗涤液PE由25mM Tris、70-80％无水乙醇组成，其pH为4.5-6.5；所述洗脱液EB由10mM Tri s、1mM EDTA组成，其pH为7.5-8.0。
3.实现权利要求1所述的一种败血症专用细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、选取新鲜血液1-5ml，加入0.3倍体积的缓冲液GRA，室温静置10min，2000rpm，离心5min，吸弃上层液体；
B、重复操作步骤A三次；
C、向下层液体中加入等体积的缓冲液GRB，加入离心机中混匀；12000rpm离心2min；弃上清液；
D、重复步骤C共2次到3次，直至所得沉淀无红色；
E、向沉淀中加入200ul细菌裂解液GA，振荡悬浮；
F、向上述液体中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀，65℃水浴0.5-3h；
G、加入200μl细菌裂解液DB，混匀，70℃水浴10min，此时溶液变澄清；
H、加入200μl无水乙醇，充分混匀；将此溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
I、向吸附柱中加入500μl缓冲液DC，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱装回收集管中；
J、向吸附柱中加入750μl洗涤液PE，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；
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