CN110452902A - 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种细菌基因组提取纯化方面，是一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于包括：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液1、洗涤液2、溶解液。本发明在提取过程不需要使用蛋白酶及RNA酶，所用试剂无酚、氯仿等有毒的有机试剂。裂解液的PH值以及适当盐离子成分和浓度使得磁珠会特异性吸附基因组DNA，随后配合洗涤液的洗涤效果，得到产物的纯度较高，并且基因组DNA片段完整性很好，可以直接应用在测序、检测等生物实验领域，本试剂盒也可配合自动化仪器进行提取。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及革兰氏阴性菌基因组提取纯化方面。
背景技术
革兰氏阴性菌是根据对细菌进行革兰氏染色的结果来区分的，将细菌作革兰氏染色，凡染后菌体呈紫色的，称“革兰氏阳性菌”， 菌体呈伊红色，称“革兰氏阴性菌”。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌、卡他（摩拉）菌、不动杆菌属、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌。
基因组DNA是指细胞内所有遗传信息，它涵盖了生物体特征、特性，革兰氏阴性菌作为生活中常见的菌体类别，包括了大量致病菌类，通过对其基因组的研究，可以更加完善地研究其生活习性、细胞结构以及致病机理，对我们的疾病研究和预防有着重大意义，因此，基因组DNA的高效率、高质量的提取也至关重要。
基因组DNA的提取作为分子生物学的基础研究手段，提取方法主要包括酚氯仿抽提法、溴化乙锭-氯化铯（EB-CsCl）梯度密度离心法、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法。酚氯仿法产物纯度较高，但是所用有机试剂有毒性，长期操作会损害操作人员的身体健康；EB-CsCl法产物会有EB残留污染，EB具有毒性且实验所需超速离心机设备费用也较高；CTAB法主要是裂解细胞后与核酸形成复合物，但比较适合用于植物基因组提取；SDS法操作较为简单，所得产物纯度较低，且会伴随大量杂质，影响产物纯度。因此，安全快速提取纯度高的基因组DNA尤为重要。
异硫氰酸胍是一种化学物质，分子式是CH5N3·HSCN。主要用于变性裂解细胞；提取RNA和DNA，抑制RNA酶和DNA酶的活性。作为此试剂盒裂解及去除蛋白质的主要成分，在特定的范围浓度，可以特异性保留目的核酸物质，抑制酶活，且极易去除，不会残留或影响后续实验。
生物磁珠作为目前市场广泛使用的纯化介质，有着独特的优势，便于操作，仅通过外加磁场配合不同的盐离子溶液就可以达到抓取、洗涤、释放基因组DNA的目的，同时也被广泛应用于自动化核酸纯化系统方面，具有广阔的市场前景和开发应用的价值。
现有的磁珠提取方式多依靠于RNA酶和蛋白酶来去除RNA和蛋白质，不仅增加了实验成本，耗费了的实验时间，还会影响产物纯度、操作人员的使用及后续下游实验需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，克服现有的商用试剂盒产量低、纯度差、耗时长、操作繁琐、含有有毒有机试剂的问题，以期达到可以快速安全提取高纯度的基因组DNA的目的。
通过发明人长时间的研究测试和技术改良，发现异硫氰酸胍不仅可以裂解细胞、变性蛋白，而且还可以有效地将DNA及RNA沉淀析出，本发明使用的胍盐浓度配合一定的范围PH值以及其它离子强度，可以有效地选择性优先沉降DNA，同时，依靠裂解液中盐离子成分以及PH值可以有效地促使大部分RNA降解，保证了在不使用RNA酶和蛋白酶的情况下提取产物中无RNA和蛋白质污染。
本发明为一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于各组分组成如下。
1）裂解液成分包括：0.5～2.5M 异硫氰酸胍（GuSCN），0.2～2M 醋酸钠（NaAc），0.03～0.1M 三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），10～30mM 乙二胺四乙酸（EDTA），0.1%～5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，10%～25%（体积比）异丙醇，所述裂解缓冲液的PH值为8.5～10.0。
2）结合液成分为：55～80%（体积比）乙醇、5～100mM Tris-HCl、0.1～0.5M 氯化钠（NaCl）。
3）磁珠液成分包括：3%～10%（质量体积比）磁性微球，0.01%～2%（体积比）Tween-20，10～100mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），其中磁性微球为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，直径为50～1000nm，所述磁性微球也可在表面修饰有羟基、羧基、氨基等基团，所述磁珠液的PH值为7.5～8.0。
4）洗涤液1的成分包括：：30%～70%（体积比） 无水乙醇，0.1～2M NaCl，10～300mM异硫氰酸胍（GuSCN），0.01%～0.5%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100），所述洗涤液1的PH值为8.5～9.2。
5）洗涤液2的成分包括：5～100mM三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），50～80%（体积比）无水乙醇，所述洗涤液2的PH值为7.5～8.0。
6）溶解液的成分包括：5～50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），1～20mM乙二胺四乙酸（EDTA），所述溶解液的PH值为7.0～8.5。
上述试剂盒可用于对革兰氏阴性菌的基因组DNA的提取，试剂盒内含说明书一份，可放置于室温保存，提取后的产物应放于4℃或-20℃保存。
本发明中试剂盒提取使用使用了一种实验方法，其特征在于包括以下的实验步骤：
1）菌体的富集：将过夜培养好的菌液以12，000 rpm 的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml 离心管底部，弃掉上清；
2）裂解：向所述步骤1菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解5分钟；
3）结合：向所述步骤2中加入0.01～0.03ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟；
4）第一次吸附；将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；
5）第一次洗涤：向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；
6）第二次吸附：将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；
7）第二次洗涤：向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；
8）第三次吸附：将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；
9）热风干：将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟；
10）溶解：向所述步骤9中加入0.1～0.5ml的溶解液，放置于56℃烘箱3分钟；
11）回收：将所述步骤10所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管并进行妥善保管或进行下游实验。
本发明优势在于可以快速地在20分钟内完成实验，减少了实验人员操作和时间成本；通过本发明所得产物纯度较高，通过Nanodrop 2000测得260/280在1.75～1.88之间，260/230在1.95～2.10之间，提取产物在琼脂糖凝胶电泳检测图中条带集中、亮度高；本发明的内含各种溶液体系中不含有苯酚、氯仿等有机的有毒试剂，且无需使用RNA酶和蛋白酶即可得到纯度较高的基因组DNA，保证了实验安全，控制了实验成本；本发明试剂盒可用于自动化核酸提取仪等自动化设备，用途广泛。
附图说明。
附图为本发明所述试剂盒提取大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图，分别对应泳道1、2、3、4、5、6、7。
具体实施方式。
为更好说明本发明试剂盒操作和效果，下面将结合实际操作案例进行演示和说明。
实施例1。
1）将过夜培养1ml大肠杆菌菌液以12，000 rpm 的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml 离心管底部，弃掉上清培养基。
2）向所述步骤1菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解3分钟；
其中裂解液成分为：1M GuSCN，0.3NaAc，0.05M Tris-HCl，10mM EDTA，0.5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，17%（体积比）异丙醇。裂解液的PH值为8.8。
3）向所述步骤2中加入0.01ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟，
其中磁珠液成分为：8%（质量体积比）200nm磁性微球，0.05% （体积比）Tween-20，50mMTris-HCl；
磁珠液的PH值为7.7；
其中结合液成分为：75%（体积比）乙醇、50mM Tris-HCl、0.42M NaCl；
结合液的PH值为8.8。
4）将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
5）向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；
其中洗涤液1的成分为：50%（体积比）无水乙醇，0.15M NaCl，100mM GuSCN，0.05%（体积比）Triton-X100；
洗涤液1的PH值为8.6。
6）将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
7）向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；
其中洗涤液2的成分为：10mM Tris-HCl，75%（体积比）无水乙醇；
洗涤液2的PH值为7.5。
8）将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
9）将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟。
10）向所述步骤9中加入0.1ml的溶解液，放置于56℃水浴3分钟；
其中溶解液成分为：25mM Tris-HCl，2.5mM EDTA；
溶解液的PH值为8.2。
11）将所述步骤10）所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管，以Nanodrop 2000进行定量分析并取0.005ml进行琼脂糖凝胶电泳检测。通过Nanodrop定量，浓度可达280μg/mL，产率为28μg/（ml菌液），A260/A280为1.83，A260/A230为2.04。
实施例2。
1）将过夜培养1ml变形杆菌菌液以12，000 rpm 的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml 离心管底部，弃掉上清培养基。
2）重复步骤1两次，并向菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解6分钟；
其中裂解液成分为：1M GuSCN，0.3 NaAc，0.05M Tris-HCl，10mM EDTA，0.5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，17%（体积比）异丙醇；
裂解液的PH值为8.8。
3）向所述步骤2中加入0.02ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟；
其中磁珠液成分为：8%（质量体积比）200nm磁性微球，0.05% （体积比）Tween-20，50mMTris-HCl；
磁珠液的PH值为7.7；
其中结合液成分为：75%（体积比）乙醇、50mM Tris-HCl、0.42M NaCl；
结合液的PH值为8.8。
4）将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
5）向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；
其中洗涤液1的成分为：50%（体积比）无水乙醇，0.15M NaCl，100mM GuSCN，0.05%（体积比）Triton-X100；
洗涤液1的PH值为8.6。
6）将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
7）向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；
其中洗涤液2的成分为：10mM Tris-HCl，75%(体积比) 无水乙醇；
洗涤液2的PH值为7.5。
8）将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。
9）将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟。
10）向所述步骤9中加入0.3ml的溶解液，放置于56℃水浴3分钟；
其中溶解液成分为：25mM Tris-HCl，2.5mM EDTA；
溶解液的PH值为8.2。
11）将所述步骤10所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管，以Nanodrop 2000进行定量分析并取0.005ml进行琼脂糖凝胶电泳检测。通过Nanodrop定量，浓度可达272μg/mL，产率为27.2μg/（ml菌液），A260/A280为1.78，A260/A230为1.97。
实施例3。
实施步骤与实施例1相同，分别测试了痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌这五种革兰氏阴性菌的1ml过夜培养菌液的基因组DNA提取效果，产率分别为29.2、28.0、27.3、23.8、25.1μg/（ml菌液）。
以上实施例仅是对本发明的举例，以便更清楚地说明本发明试剂盒的提取效果，但并不是说本发明仅仅局限于此几种实施例，对于其他革兰氏阴性菌依旧有着同样良好的提取效果，同时也依然在本发明的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于包括以下组成成分：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液1、洗涤液2、溶解液。
2.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液成分包含：0.5～2.5M 异硫氰酸胍(GuSCN)，0.2～2M 醋酸钠（NaAc），0.03～0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，10～30mM 乙二胺四乙酸（EDTA），0.1%～5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，10%～25%（体积比）异丙醇，所述裂解缓冲液的PH值为8.5～10.0；
所述结合液成分为：55～80%（体积比）乙醇、5～100mM Tris-HCl、0.1～0.5M 氯化钠（NaCl）,所述的结合液PH值为7.5～9.0；
所述磁珠液成分包含：3%～10%（质量体积比）磁性微球，0.01%～2%（体积比）Tween-20,10～100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，其中磁性微球为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，直径为50～1000nm，所述磁性微球也可在表面修饰有羟基、羧基、氨基等基团，所述磁珠液的PH值为7.5～8.0；
所述洗涤液1成分包括：30%～70%（体积比） 无水乙醇，0.1～2M NaCl，10～300mM 异硫氰酸胍（GuSCN），0.01%～0.5%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)，所述洗涤液1的PH值为8.5～9.2；
所述洗涤液2成分包括：5～100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，50～80%(体积比) 无水乙醇，所述洗涤液2的PH值为7.5～8.0；
所述溶解液成分包括：5～50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，1～20mM乙二胺四乙酸（EDTA），所述溶解液的PH值为7.0～8.5。
3.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的可提取的生物样品为革兰氏阴性菌。
4.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒在临床诊断、基因测序、基因分析、疾病检测上的应用。
5.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒可以配合溶菌酶、蛋白酶、核糖核酸酶任意一种或多种进行提取。
6.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒既可以手工提取也可配合自动化仪器的提取。
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