CN112575125A - 用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法，基于液相芯片技术，可同时进行17种呼吸道病原微生物检测，具有高通量、操作简单快速、灵敏度高、特异性强、准确度高、费用低等优点。

Description

用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，主要涉及用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法。
背景技术
呼吸道病毒感染不仅可以引起多重严重的并发症，还具有潜在引发局部范围甚至世界大流行的可能。近年来，新发呼吸道传染病如新型冠状肺炎、SARS等的爆发，为人类社会和国民经济带来巨大的冲击。及时快速与准确地鉴别病原微生物，对预防疾病的传播与患者的诊断治疗至关重要。目前传统实验室诊断技术多数操作繁琐、耗时费力，不利于早期快速诊断与疫情的应急处理，因此建立快速有效的检测多种常见呼吸道病原微生物的鉴别诊断平台，实现多种呼吸道病原微生物基因的同时快速检测，可为及时应对突发呼吸道传染病以及疫情监测提供技术手段。
由于病原种类很多，而病毒的分离培养周期长，技术难，用免疫学检测方法很难快速确定病原体。自1988年首次提出多重PCR这个概念，经过多年的发展，多重PCR技术逐渐成熟。基于多重PCR的检测方法也逐渐成熟，如CN112176109A 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法；CN112176112A 一种禽流感病毒H5，H7，H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用等。检测手段主要有毛细管电泳（或凝胶电泳）、实时荧光定量PCR检测、质谱、液相芯片等方式，其中，毛细管电泳操作繁琐，凝胶电压检测灵敏度有限；实时荧光定量PCR检测通量低；质谱仪器昂贵且检测耗时较长。液相芯片技术是一种被用于高通量临床诊断的新型生物芯片技术，具有高通量、灵敏度高、重复性好、灵活性大等特点。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法，针对呼吸道病原微生物检测的高通量多重检测需求，开发基于液相芯片技术的呼吸道传染病检测系统，重点解决编码微球制备技术、多重扩增技术、高通量检测技术等关键技术，为呼吸道病原微生物快速检测提供有力的工具。
本发明的技术方案如下：
用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其中，包括以下18种引物对中的至少一种引物对：
用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.3-4所示；
用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.7-8所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.9-10所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.11-12所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.13-14所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.15-16所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.17-18所示；
用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.19-20所示；
用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.21-22所示；
用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 23-24所示；
用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 25-26所示；
用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 27-28所示；
用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 29-30所示；
用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.31-32所示；
用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.33-36所示。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其中，所述引物组包括18种引物对。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其中，引物的修饰物为5’Biotin或5’NH2C12。
用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，其中，包括以下18种探针微球中的至少一种探针微球：
用于检测甲型H1N1流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.37所示；
用于检测甲型H3N2流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.38所示；
用于检测甲型H7N9流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.39所示；
用于检测乙型流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.40所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒A的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQID NO.41所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒B的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQID NO.42所示；
用于检测人副流感病毒Ⅰ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.43所示；
用于检测人副流感病毒Ⅱ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.44所示；
用于检测人副流感病毒Ⅲ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.45所示；
用于检测人偏肺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.46所示；
用于检测人博卡病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.47所示；
用于检测人腺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 48所示；
用于检测人冠状病毒OC43的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.49所示；
用于检测人冠状病毒NL63的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.50所示；
用于检测人冠状病毒229E的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.51所示；
用于检测人冠状病毒HKU1的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.52所示；
用于检测2019新型冠状病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.53-54所示。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，其中，所述探针微球组包括18种探针微球。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，其中，特异性核酸探针的修饰物为5’NH2C12或5’Biotin。
用于检测呼吸道病原微生物的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如上所述的引物组和如上所述的探针微球组。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的试剂盒，其中，所述试剂盒分为PCR扩增试剂和杂交染色试剂；
所述PCR扩增试剂包括所述引物组、PCR Mix混合液、逆转录酶；
所述杂交染色试剂包括所述探针微球组、杂交缓冲液、TE缓冲溶液、染料。
用于检测呼吸道病原微生物的方法，其中，包括以下步骤：
（1）将待检测样品的基因，用如上所述的引物组进行PCR扩增；
（2）将PCR扩增产物与如上所述的探针微球组进行杂交、染色；
（3）将染色后的杂交产物用Bio-plex 200液相芯片仪进行检测。
所述的用于检测呼吸道病原微生物的方法，其中，所述PCR扩增的反应条件为热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持；
所述杂交的反应条件为95℃，5min；50℃10min；4℃保持。
有益效果：本发明的用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法，基于液相芯片技术，可同时进行17种呼吸道病原微生物检测，具有高通量、操作简单快速、灵敏度高、特异性强、准确度高、费用低等优点。
附图说明
图1-2为本发明实施例2中105个拷贝下单模板多引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3-7为本发明实施例2中液相芯片技术检测结果图。
图8为本发明实施例3中模板浓度为102个拷贝下多模板多引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图9为本发明实施例4中液相芯片技术检测结果图。
具体实施方式
本发明提供用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法，是基于液相芯片技术，可以用于同时检测17种人呼吸道病毒：甲型H1N1流感病毒（H1N1），甲型H3N2流感病毒（H3N2），甲型H7N9流感病毒（H7N9），乙型流感病毒（IBV），呼吸道合胞体病毒A（RSVA），呼吸道合胞体病毒B（RSVB），人副流感病毒Ⅰ型（HPIVⅠ），人副流感病毒Ⅱ型（HPIVⅡ），人副流感病毒Ⅲ型（HPIVⅢ），人博卡病毒（HBoV），人腺病毒（HADV），人偏肺病毒（HMPV），人冠状病毒HKU1（HKU1），人冠状病毒OC43（OC43），人冠状病毒NL63（NL63），人冠状病毒229E（229E）及2019年末流行的新型冠状病毒（其中2019年末流行的新型冠状病毒设计两对引物及相应探针（COVID19-1，COVID19-2）），总共包括15种RNA病毒、2种DNA病毒，参考序列见表1。
表1
病原体 参考NCBI号 病毒核酸类型
甲型H1N1流感病毒（INVA-H1N1） MT423013.1 ssRNA
甲型H3N2流感病毒（INVA-H3N2） MT556943.1 ssRNA
甲型H7N9流感病毒（INVA-H7N9） KR905377.1 ssRNA
乙型流感病毒（INVB） MT314443.1 ssRNA
人呼吸道合胞体病毒A（RSVA） MN630096.1 ssRNA
人呼吸道合胞体病毒B（RSVB） MT040088.1 ssRNA
人副流感病毒Ⅰ型（HPIVⅠ） KY967353.1 ssRNA
人副流感病毒Ⅱ型（HPIVⅡ） MK167028.1 ssRNA
人副流感病毒Ⅲ型（HPIVⅢ） MN306039.1 ssRNA
人偏肺病毒（HMPV） MN745084.1 ssRNA
人博卡病毒（HBoV） KP710203.1 ssDNA
人腺病毒（HADV） MK883612.1 dsDNA
人冠状病毒OC43（HCoV-OC43） KF530098.1 ssRNA
人冠状病毒NL63（HCoV-NL63） MN026166.1 ssRNA
人冠状病毒229E（HCoV-229E） MT438699.1 ssRNA
人冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1） HM034837.1 ssRNA
新型冠状病毒（CoVID19） MW386177.1 ssRNA
本发明提供用于检测呼吸道病原微生物的引物组，包括以下至少一种引物对：
用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.3-4所示；
用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.7-8所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.9-10所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.11-12所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.13-14所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.15-16所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.17-18所示；
用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.19-20所示；
用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.21-22所示；
用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 23-24所示；
用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 25-26所示；
用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 27-28所示；
用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 29-30所示；
用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.31-32所示；
用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.33-36所示。
具体地，所述用于检测呼吸道病原微生物的引物组，各引物序列如表2所示。其中，引物的修饰物可以为5’Biotin或5’NH2C12，但并不限于5’Biotin或5’ NH2C12。
表2
Figure 997860DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，包括以下至少一种探针微球：
用于检测甲型H1N1流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.37所示；
用于检测甲型H3N2流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.38所示；
用于检测甲型H7N9流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.39所示；
用于检测乙型流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.40所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒A的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQID NO.41所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒B的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQID NO.42所示；
用于检测人副流感病毒Ⅰ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.43所示；
用于检测人副流感病毒Ⅱ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.44所示；
用于检测人副流感病毒Ⅲ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.45所示；
用于检测人偏肺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.46所示；
用于检测人博卡病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.47所示；
用于检测人腺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 48所示；
用于检测人冠状病毒OC43的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.49所示；
用于检测人冠状病毒NL63的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.50所示；
用于检测人冠状病毒229E的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.51所示；
用于检测人冠状病毒HKU1的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.52所示；
用于检测2019新型冠状病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.53-54所示。
具体地，所述用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，各特异性核酸探针序列如表3所示。其中，特异性核酸探针的修饰物可以为5’ NH2C12或5’Biotin，但并不限于5’NH2C12或5’Biotin。
表3
Figure 180580DEST_PATH_IMAGE002
本发明提供还用于检测呼吸道病原微生物的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组和如上所述的探针微球组。
进一步地，所述试剂盒分为PCR扩增试剂和杂交染色试剂；
所述PCR扩增试剂包括所述引物组、PCR Mix混合液、逆转录酶；
所述杂交染色试剂包括所述探针微球组、杂交缓冲液、TE缓冲溶液、染料。
其中，PCR Mix混合液、逆转录酶、杂交缓冲液、TE缓冲溶液、染料均为市面可购产品。染料可以为PE-SA，但不限于PE-SA。
本发明中还提供用于检测呼吸道病原微生物的方法，包括以下步骤：
（1）将待检测样品的基因，用所述引物组进行PCR扩增；
（2）将PCR扩增产物与所述探针微球组进行杂交、染色；
（3）将染色后的杂交产物用Bio-plex 200液相芯片仪进行检测。
其中，所述PCR扩增的反应条件为热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持。
所述杂交的反应条件为95℃，5min；50℃10min；4℃保持。
根据文献报道，选用17种人呼吸道病毒相对应的保守区作为本发明试剂盒的目标基因，针对2019年末流行的新型冠状病毒设计两对引物及相应探针，其余每种病毒分别设计了1对引物及相对应的探针。扩增片段在 70-170bp之间。
本发明中设计的引物组可以同时检测包含新冠病毒在内的17种呼吸道病原微生物（其中2019年末流行的新型冠状病毒设计两对引物及相应探针（COVID19-1，COVID19-2）），具有通量高的优点，可以在一种激发光下，同时检测17种呼吸道病原微生物。
本发明中设计的探针微球组，具有较强的特异性，通过实验验证可以看出每种探针仅对识别相应的呼吸道病原微生物序列。
本发明中采用液相芯片技术，混合18种探针微球，可以同时区分出人呼吸道的17种病毒，是目前最全面的病毒性呼吸道感染病原体检测方法，且灵敏度可以到100copies，为全面判断病毒性呼吸道感染病原体，为临床检验提供实验室辅助诊断的依据。
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
引物组和探针微球组的制备：
引物序列和探针序列由课题组设计，引物组序列与探针序列分别参见表2和表3，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。探针微球的制备过程如下：
（1）分别取18种微球各40 μl离心弃上清后，与40μl的100mM MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）、10μl的10mM的探针序列和5μl的10mg/ml EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）混合涡旋，室温避光1000rpm离心30min；
（2）再次加入5μl的10mg/ml EDC混合涡旋，室温避光1000rpm离心30min，离心弃上清；
（3）加入250μl的PBST（磷酸盐吐温缓冲液）混合后离心弃上清；
（4）加入250μl的0.1%SDS缓冲液混合后离心弃上清，重新分散于100μl TE溶液中，混合均匀后2-8℃避光保存。
实施例2
本实施例中所采用的试剂组成列表如表4和表5所示，其中表4为PCR扩增试剂组分列表，表5为杂交缓冲液组成列表。
表4
组成成分 组分
2*PCR MIX 购于北京天根生物
逆转录酶 SMART<sup>®</sup> MMLV Reverse Transcriptase购自大连宝生物
100uM混合引物 含甲型H1N1流感病毒，甲型H3N2流感病毒，甲型H7N9流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞体病毒A，呼吸道合胞体病毒B，副流感病毒1，副流感病毒2，副流感病毒3，人博卡病毒，人腺病毒，人偏肺病毒，人冠状病毒HKU1，人冠状病毒OC43，人冠状病毒NL63，人冠状病毒229E及2019年末流行的新型冠状病毒共17种病原微生物的18对上下游引物混合物
表5
组成成分 组分
2*杂交缓冲液 EDTA、Tris-HCL、TMAC、去离子水以及SDS
TE溶液 Tris-HCL, EDTA以及水
（1）PCR反应体系的建立
根据表6建立20μL的18个PCR反应体系，每个PCR反应体系中的包含18种引物对，以及，其中一种病原微生物序列。
表6
组分 用量
2*PCR MIX 10 μL
100uM混合引物 2.42μL（含以上18种引物对）
提取好的模板 0.25μL（仅含一种病原微生物序列，模板浓度为10<sup>5</sup>拷贝）
逆转录酶 0.5μL
水 补足至20μL
（2）以每种病原微生物序列为样本分别进行逆转录及多重PCR扩增，反应条件：热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持。
（3）各取5μL PCR产物，分别加入25μL混有18种探针微球的杂交缓冲液和20μL的TE溶液，进行杂交，杂交条件：95℃，5min；50℃10min；4℃保持。
（4）分别使用50μL的3ug/mL PE染料对各个杂交后的产物进行染色，通过Bio-plex200液相芯片仪进行检测。
图1-图2为105个拷贝下单模板多引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。从图1-图2可以看出，混合引物对单模板能进行有效的扩增。其中，H1代表甲型H1N1流感病毒模板，H3代表甲型H3N2流感病毒模板，H7代表甲型H7N9流感病毒模板，B代表乙型流感病毒模板，VA代表人呼吸道合胞体病毒A模板，VB代表人呼吸道合胞体病毒B模板，PIVⅠ代表人副流感病毒Ⅰ型模板，PIVⅡ代表人副流感病毒Ⅱ型模板，PIVⅢ代表人副流感病毒Ⅲ型模板，MPV代表人偏肺病毒模板，BoV代表人博卡病毒模板，ADV代表人腺病毒模板，OC代表人冠状病毒OC43模板，NL代表人冠状病毒NL63模板，229E代表人冠状病毒229E模板，HKU1代表人冠状病毒HKU1模板，191和192分别代表2019新型冠状病毒模板。
图3-图7为液相芯片技术检测18种杂交产物的结果，从图3-图7的结果可以看出，各个引物和探针微球的特异性强、准确度高。
实施例3
本实施例中所采用的试剂与实施例2相同。
（1）PCR反应体系的建立
根据表7建立20μL的PCR反应体系， PCR反应体系中的包含18种引物对，以及， 102拷贝的17种病原微生物序列。
表7
组分 用量
2*PCR MIX 10 μL
100uM混合引物 2.42 μL
提取好的模板 5 μL（含每种病院微生物序列的10<sup>2</sup>拷贝）
逆转录酶 0.5 μL
水 补足至20 μL
（2）进行逆转录及多重PCR扩增，反应条件：热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持。
图8为不同模板梯度下多模板多引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。从图8的结果可以看出，引物组的灵敏度高。
实施例4
本实施例中所采用的试剂与实施例2相同。
（1）PCR反应体系的建立
根据表8建立20μL的PCR反应体系， PCR反应体系中的包含18种引物对，以及，17种病原微生物序列。
表8
组分 用量
2*PCR MIX 10 μL
100uM混合引物 2.42 μL
提取好的模板 5 μL（含每种病院微生物序列浓度10<sup>2</sup>拷贝）
逆转录酶 0.5 μL
水 补足至20 μL
（2）进行逆转录及多重PCR扩增，反应条件：热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持。
（3）取5μL PCR产物，加入25μL混有18种探针微球的杂交缓冲液和20μL的TE溶液，进行杂交，杂交条件：95℃，5min；50℃10min；4℃保持。
（4）使用50μL的3ug/mL PE染料对杂交后的产物进行染色，通过Bio-plex 200液相芯片仪进行检测。
图9为液相芯片技术检测模板浓度为102拷贝数杂交产物的结果，从图8的结果可以看出，各个引物和探针微球的灵敏度高达100个拷贝。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 季华实验室
<120> 用于检测呼吸道病原微生物的引物组、探针微球组、试剂盒及方法
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H1N1流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggggtagc cccattgcat ttgg 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H1N1流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattgtctg aactaggtgt t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H3N2流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 3
taggggttac ttcaaaatac ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H3N2流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggaatggt ttgtcattgg ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H7N9流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 5
aaactaagca gcggctacaa ag 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增甲型H7N9流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcaccgcat gtttccattc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增乙型流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttcaatac tccatgaggt c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增乙型流感病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgagaagat tgggtagttg tc 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增人呼吸道合胞体病毒A的引物(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcggcaaac cacaaagtc 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增人呼吸道合胞体病毒A的引物(Artificial Sequence)
<400> 10
ggattctggg tgaggtatgt t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 用于扩增人呼吸道合胞体病毒B的引物(Artificial Sequence)
<400> 11
tcatcatctc tgccaatcac 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人呼吸道合胞体病毒B的引物(Artificial Sequence)
<400> 12
gacttgagta aggtaagtgg tt 22
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅰ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 13
aagtcctgtc acgaccag 18
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅰ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 14
tacacctgat atgcattctc tc 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅱ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctcgtcct ggagtcat 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅱ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 16
ccacacatct gcgtacac 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅲ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 17
ctagcatctc agggttaaga aa 22
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人副流感病毒Ⅲ型的引物(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgtgtcacc gctcaaca 18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人偏肺病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 19
cacaataaag agagatgtag gc 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增人偏肺病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 20
ctctgaccct agagctgtg 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增人博卡病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 21
ggctcatatc atcaggaaca c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 用于扩增人博卡病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 22
cgtcttcatc acttggtctg 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增人腺病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 23
ccctgagaac cagatcctc 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人腺病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 24
cggatactgc tgcgtaac 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒OC43的引物(Artificial Sequence)
<400> 25
gcaaccaggc tgatgtca 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒OC43的引物(Artificial Sequence)
<400> 26
gcggaaacct agtcggaat 19
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒NL63的引物(Artificial Sequence)
<400> 27
tagcacttca agacaacagt c 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒NL63的引物(Artificial Sequence)
<400> 28
gccaaagtaa cagcagcaa 19
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒229E的引物(Artificial Sequence)
<400> 29
aatggtgtta ctgttgctga ag 22
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒229E的引物(Artificial Sequence)
<400> 30
acgactgcga ctctgaga 18
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒HKU1的引物(Artificial Sequence)
<400> 31
ctattatgtt aagcctggtg gt 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增人冠状病毒HKU1的引物(Artificial Sequence)
<400> 32
cattagcagt aacagcctga c 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 用于扩增2019新型冠状病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 33
aacacagtct gtaccgtctg 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 用于扩增2019新型冠状病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 34
tacaccgcaa acccgttta 19
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 用于扩增2019新型冠状病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 35
aactccaggc agcagtag 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 用于扩增2019新型冠状病毒的引物(Artificial Sequence)
<400> 36
agctggttca atctgtcaag 20
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 甲型H1N1流感病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atgtaacatt gctggctgga tcctg 25
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 甲型H3N2流感病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gggaaaagct caataatgag atcagatg 28
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 甲型H7N9流感病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgtttcatac ttctagccat tgtaatgggc c 31
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 乙型流感病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccgggtgctt tcctataatg cacg 24
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞体病毒A探针序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atgcaacgaa ccagatcaag aacacaac 28
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞体病毒B探针序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgcactcgtt ctgattctaa ccagtc 26
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人副流感病毒Ⅰ型探针序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caggaaaccc aractgyaac tggtt 25
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人副流感病毒Ⅱ型探针序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cctggagtca tgcyatgyaa tg 22
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人副流感病毒Ⅲ型探针序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggaacagtgc aggcaggg 18
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人偏肺病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caachgcagt nacaccytca tcattgca 28
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人博卡病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggaacaccca atcarccacc tatc 24
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人腺病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tcctgctctc acagatcacg g 21
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人冠状病毒OC43探针序列(Artificial Sequence)
<400> 49
caataccccg rctgacattg tcg 23
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人冠状病毒NL63探针序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cgttctgatt ctaaccagtc ttcttca 27
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人冠状病毒229E探针序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acctgrctcc crtgctc 17
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人冠状病毒HKU1探针序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtggtgatgc aactactgct tttgc 25
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> 2019新型冠状病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 2019新型冠状病毒探针序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cttgctttgc tgctgcttga cagat 25

Claims (10)

1.用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其特征在于，包括以下18种引物对中的至少一种引物对：
用于扩增甲型H1N1流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于扩增甲型H3N2流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.3-4所示；
用于扩增甲型H7N9流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
用于扩增乙型流感病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.7-8所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒A基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.9-10所示；
用于扩增人呼吸道合胞体病毒B基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.11-12所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅰ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.13-14所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅱ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.15-16所示；
用于扩增人副流感病毒Ⅲ型基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.17-18所示；
用于扩增人偏肺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.19-20所示；
用于扩增人博卡病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.21-22所示；
用于扩增人腺病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 23-24所示；
用于扩增人冠状病毒OC43基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 25-26所示；
用于扩增人冠状病毒NL63基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 27-28所示；
用于扩增人冠状病毒229E基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO. 29-30所示；
用于扩增人冠状病毒HKU1基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.31-32所示；
用于扩增2019新型冠状病毒基因的引物对，引物序列如SEQ ID NO.33-36所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其特征在于，所述引物组包括18种引物对。
3.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道病原微生物的引物组，其特征在于，引物的修饰物为5’Biotin或5’ NH2C12。
4.用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，其特征在于，包括以下18种探针微球中的至少一种探针微球：
用于检测甲型H1N1流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.37所示；
用于检测甲型H3N2流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.38所示；
用于检测甲型H7N9流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.39所示；
用于检测乙型流感病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.40所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒A的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.41所示；
用于检测人呼吸道合胞体病毒B的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.42所示；
用于检测人副流感病毒Ⅰ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.43所示；
用于检测人副流感病毒Ⅱ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.44所示；
用于检测人副流感病毒Ⅲ型的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.45所示；
用于检测人偏肺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.46所示；
用于检测人博卡病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.47所示；
用于检测人腺病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 48所示；
用于检测人冠状病毒OC43的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 49所示；
用于检测人冠状病毒NL63的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 50所示；
用于检测人冠状病毒229E的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO. 51所示；
用于检测人冠状病毒HKU1的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ ID NO.52所示；
用于检测2019新型冠状病毒的探针微球，连接的特异性核酸探针序列如SEQ IDNO.53-54所示。
5.根据权利要求4所述的用于检测呼吸道病原微生物的探针微球组，其特征在于，所述探针微球组包括18种探针微球。
6.根据权利要求4所述的用于检测呼吸道病原微生物的探针微球，其特征在于，特异性核酸探针的修饰物为5’NH2C12或5’Biotin。
7.用于检测呼吸道病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一所述的引物组和如权利要求4-6任一所述的探针微球组。
8.根据权利要求7用于检测呼吸道病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒分为PCR扩增试剂和杂交染色试剂；
所述PCR扩增试剂包括所述引物组、PCR Mix混合液、逆转录酶；
所述杂交染色试剂包括所述探针微球组、杂交缓冲液、TE缓冲溶液、染料。
9.用于检测呼吸道病原微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将待检测样品的基因，用如权利要求1-3任一所述的引物组进行PCR扩增；
（2）将PCR扩增产物与如权利要求4-6任一所述的探针微球组进行杂交、染色；
（3）将染色后的杂交产物用Bio-plex 200液相芯片仪进行检测。
10.根据权利要求9所述的用于检测呼吸道病原微生物的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为热循环温度50℃，20min；94℃，3min；94℃30s，48℃30s，72℃15s，35个循环；72℃，5min；4℃保持；
所述杂交的反应条件为95℃，5min；50℃10min；4℃保持。
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