CN102839223A

CN102839223A - GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用

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Publication number: CN102839223A
Application number: CN201110168721XA
Authority: CN
Inventors: 马学军; 李瑾; 毛乃颖; 许文波; 谭文杰
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-06-22
Also published as: CN102839223B

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构、哨点医院等用于呼吸道相关疾病患者鼻咽抽提物标本的16种呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sH1N1、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1和Adv)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载16种呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(18重)PCR检测16种呼吸道病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为呼吸道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为呼吸道疾病相关病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国呼吸道病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。

Description

GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用

发明领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于呼吸道相关疾病患者鼻咽抽提物标本的16种呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sH1N1、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1和Adv)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载16种呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(18重)PCR检测16种呼吸道病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利克服了病毒培养法、直接荧光抗体法、芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为呼吸道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为呼吸道疾病相关病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国呼吸道病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。

发明背景

急性呼吸道感染是广泛分布于成年人和儿童的感染性疾病之一，具有相当高的发病率和死亡率。大部分急性上呼吸道疾病和下呼吸道疾病主要是由呼吸道病毒引起的。传统认为，引起呼吸道疾病的主要病毒病原体有流感病毒A型(FluA)和B型(FluB)、人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4)、腺病毒(Adv)等。然而，近十年来，新的呼吸道病毒不断被发现，人偏肺病毒(HMPV)、冠状病毒(NL63、HKU1、OC43、229E)、博卡(HBoV)病毒等也成为呼吸道疾病的重要病原，给人类的健康构成很大的威胁。由于这些病毒引起的感染症状和流行症状相似，仅靠临床症状及常规检测方法进行病毒病原的确定是非常不可靠的，因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性的方法可以同时检测传统的和新兴出现的呼吸道病原体，为临床诊断提供实验室依据，预防院内感染。

对于病毒性呼吸道感染的诊断，病毒培养法、直接荧光抗体法等传统方法依然是实验室诊断的的常用方法。病毒培养法虽然特异性良好，但耗时耗力，难以应用于临床早期诊断和指导治疗，一些病毒培养条件苛刻甚至不能培养。直接荧光抗体法(DFA)虽然快速，但需要专业的技术人员，特异性的抗体等。由于传统病毒诊断技术存在明显缺陷，其在临床中的应用受限。随着分子生物学的进步，核酸扩增法近年来被认为是是简便、快速、灵敏、特异性强的病毒检测方法。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR技术，能够同时扩增出多条目的DNA片段，从而实现多病原体的快速鉴别和诊断，降低检验成本。为了在单个反应体系中同时检测更多常见呼吸道病毒，以实现快速、灵敏、特异的检测呼吸道病毒混合感染，本研究建立了基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(MultiplexRT-PCR)体系同时快速检测常见的16种呼吸道病毒：FluA、FluB、sH1N1、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1和Adv，并对该方法的特异性和敏感性进行了分析。

发明内容

1.在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)下载上述16种呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，输入GeXP eXpress Profiler软件设计多重特异性引物(Specific-Primer，SP-Primer)。将设计的引物通过NCBI Primer-Blast，Primer Premier 5.0分析评价，使各引物具有相对一致的Tm值。参考多序列比对结果，在突变位置设置简并碱基。在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5(Cy5-Tag-F)。在整个引物体系中加入一对扩增人类RNase P基因的引物Rnasep(F/R)，以检验人源样品质量。引物信息见表1。

2.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成引物：引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag-F采用HPLC纯化外，其余引物均PAGE纯化。

(2)使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，洗脱体积为50μl，分装置于-80℃保存。

(3)建立同时检测16种呼吸道病毒的多重RT-PCR反应体系，并对其特异性和灵敏度进行验证。

(4)用该18重RT-PCR检验临床标本，对体系进行验证评估。

(5)将18对引物分成两个体系，每个体系分别检测9种、7种病毒，用QIAxcel全自动电泳仪检测RT-PCR产物，为体系推广做评定。

表1 GeXP 18重RT-PCR检测16种呼吸道疾病相关病毒引物信息表

兼并碱基代码：M＝A/C R＝A/G W＝A/T S＝G/C Y＝C/T K＝G/T V＝A/G/C H＝A/C/T D＝A/G/T B＝G/C/T

注：下划线表示的是上、下游通用引物序列(tag F、tag R)

具体实施方式

实施方案1：单重RT-PCR验证引物

分别用多株已知病毒核酸的单一感染阳性标本作为模板，阴性临床样品为阴性对照，重蒸水作为空白对照，进行单引物PCR反应。采用Qiagen公司One-step RT-PCR试剂盒。25μl PCR反应体系：5*buffer5ul，dNTP Mix 1ul，enzyme mix 1ul，上、下游嵌合引物(1μmol/L)各1.25μl，上、下游通用引物各(10μmol/L)各1.25μl，模板RNA 2μl，RNase抑制剂0.1ul，去RNase水补足至25μl。反应条件为：逆转录50℃30min；预变性95℃15min；特异性引物扩增95℃30s、55℃30s、72℃30s，10个循环；嵌合引物扩增95℃30s、65℃30s、72℃30s，10个循环；通用引物扩增95℃30s、48℃30s、72℃30s，20个循环。取2ul PCR产物进行GeXP system分析，确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。

实施方案2：多重反应体系特异性验证

配制多重混合引物(Mix-Primer)工作液，使RT-PCR体系中各SP-Primer终浓度为50nmol/L，其余成分与引物验证的相同。以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板，进行多引物PCR反应。

实施方案3：多重检测体系单模板灵敏度试验

以不含tag的特异性引物扩增靶核酸区域，PCR产物连接至pGEM-T载体进行单克隆，提取克隆质粒，Spe I酶切使之线性化，使用RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，RNeasy MinElute Cleanup Kit对体外转录的RNA片段纯化，利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计定量，根据分子量和核酸浓度计算RNA的拷贝数。体外转录RNA梯度稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10²、10¹copies/μL，各取1μl作为模板，检测多重体系的灵敏度。非同日三次平行实验。

实施方案4：多重检测体系多模板灵敏度试验

根据多引物单模板灵敏度实验结果及扩增片段长度调整各对引物浓度，确定PCR体系中各对引物最佳引物浓度：Rnasep(F/R)30nmol/L，PIV3(F/R)75nmol/L，PIV1(F/R)75nmol/L，Adv(S/A)100nmol/L，BOCA(S/A)100nmol/L，RSVB(F/R)100nmol/L，HMPV(S/A)100nmol/L，其余嵌合引物浓度均为50nmol/L，通用引物(Cy5-Tag-F和Tag-R)各500nmol/L。将16种体外转录RNA等拷贝混合，并梯度稀释至10⁵、10⁴、10³、10²、10copies/μL，其余反应成分和反应程序不变，非同日三次重复。

实施方案5：临床标本检测验证体系

中国CDC麻疹室提供124份临床标本验证体系。标本均为1个月至5岁呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽提物，患儿多伴有发热或肺炎。提取病毒RNA进行单管18重RT-PCR，Gexp毛细管电泳检测。以realtimeRT-PCR检测结果作为金标准，验证体系。

实施方案6：双管QIAxcel体系检测临床标本

将18对引物分成两个体系，体系A中包含FluA、FluB、sH1N1、PIV1、HRV、CoV OC43、CoV 229E、CoVHKU1和Adv共9种呼吸道病毒的引物和RNase P引物，体系B包含PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、CoVNL63、HMPV、HBoV共8种呼吸道病毒的引物和RNase P引物，其他成分和反应条件不变。用这两个体系分别对124份临床标本进行双管多重(10重和9重)RT-PCR检验，用QIAxcel全自动电泳仪检测RT-PCR产物，以realtime RT-PCR检测结果作为金标准，为体系推广做初步评定。

Claims

1.一种单管18重PCR同时检测16种呼吸道病毒，包括：用于检测呼吸道病毒FluA、FluB、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1、Adv的型特异性引物和检测sH1N1的亚型特异性引物，另外包括一对扩增人类RNase P基因的引物检验人源样品质量。

2.双管多重(10重和9重)PCR同时检测16种呼吸道病毒，体系A包括：FluA、FluB、sH1N1、PIV1、HRV、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1、Adv和RNase P引物，体系B包含PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、CoVNL63、HMPV、HBoV和RNase P引物，用QIAxcel全自动电泳仪检测。

3.权利要求1所述的18重PCR技术的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。

4.权利要求1所述的18重PCR检测技术包括呼吸道疾病相关病毒FluA、FluB、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1、Adv和sH1N1。

5.权利要求2所述的双管多重PCR检测技术分别包括呼吸道疾病相关病毒FluA、FluB、sH1N1、PIV1、HRV、CoVOC43、CoV229E、CoVHKU1、Adv和PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、CoVNL63、HMPV、HBoV。

6.权利要求4所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，哨点医院用于呼吸道疾病相关病毒FluA、FluB、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoVNL63、CoVOC43、CoV 229E、CoV HKU1、Adv和sH1N1同时检测和分型。

7.权利要求1所述的同时检测呼吸道疾病相关病毒FluA、FluB、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1、Adv和sH1N1的多重PCR技术的反应程序和检测程序。