CN113355454A

CN113355454A - 一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用

Info

Publication number: CN113355454A
Application number: CN202010142222.2A
Authority: CN
Inventors: 毛平道; 林钰琼
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明公开了一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用，涉及生物技术领域，具体地，该方法包括将用于检测甲型流感病毒的第一试剂，用于检测乙型流感病毒的第二试剂，用于检测肺炎支原体的第三试剂和/或用于检测肺炎衣原体的第四试剂对待测样品进行检测，为有效检测呼吸道病原体或同时检测多种呼吸道病原体提供了一种新的途径。

Description

一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用。

背景技术

呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死，是威胁人类健康的主要疾病之一。

引起呼吸系统疾病的病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次氏体等，而不同病原体引起的临床症状却很相似，因此，在诊断呼吸系统疾病的病原体时，容易出现误诊或漏诊，进而造成药物(如抗生素)的不当使用。

传统的检测技术主要包括：细菌和病毒培养、抗体免疫检测以及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)等检测技术手段。其中，细菌和病毒培养法的培养周期较长，培养环境苛刻，无法满足短时间快速检测样品病原的要求，可能延误最佳治疗时机；抗体免疫检测虽然可以同时检测多种病原体，但是其检测的是待测样本中病原体入侵引发机体产生的特异性抗体，而特异性抗体的产生需要时间，存在较长的空窗期，且检测灵敏度和特异性也较低，容易出现假阳性。

PCR通常包括凝胶条带分析法和荧光检测法，其中凝胶条带分析法灵敏度低，且条带模糊可能导致判断出现误差，从而造成误诊；荧光检测法通常以荧光染料或荧光探针为标记，能够实现单重或多重PCR的信号识别。呼吸道病原体种类繁多，其中既有DNA病原体，又有RNA病原体，如何有效地针对多种不同的呼吸道病原体进行同时检测是如今亟待解决的问题之一。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法、用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒以及用于检测呼吸道病原体的试剂在制备用于诊断呼吸道相关疾病试剂盒中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法，所述方法包括采用以下试剂中的一种或多种的组合对待测样品中的病原体进行检测：

用于检测甲型流感病毒基因上的靶区域1的第一试剂，用于检测乙型流感病毒基因上的靶区域2的第二试剂，用于检测肺炎支原体基因上的靶区域3的第三试剂以及用于检测肺炎衣原体基因上的靶区域4的第四试剂；

其中，所述靶区域1选自甲型流感病毒M基因的第170～第275位碱基的区域，所述M基因的序列如SEQ ID No.1所示；

所述靶区域2选自乙型流感病毒M1基因的第241～第343位碱基的区域，所述M1基因的序列如SEQ ID No.2所示；

所述靶区域3选自肺炎支原体16S rRNA基因的第479～第557位碱基的区域，所述16S rRNA基因的序列如SEQ ID No.3所示；

所述靶区域4选自肺炎衣原体MOMP基因的第581～第663位碱基的区域，所述MOMP基因的序列如SEQ ID No.4所示。

第二方面，实施例提供一种用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒，其包括如前述实施例所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合。

第三方面，实施例提供用于检测呼吸道病原体的试剂在制备用于诊断呼吸道相关疾病试剂盒中的应用，所述试剂包括如前述实施例所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用，该方法包括采用上述第一试剂～第四试剂中的任意一种或多种的组合对待测样品进行检测，为有效检测呼吸道病原体或同时检测多种呼吸道病原体提供了一种新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明验证例1中的甲型流感病毒的灵敏度试验结果图；

图2为本发明验证例1中的乙型流感病毒的灵敏度试验结果图；

图3为本发明验证例1中的肺炎支原体的灵敏度试验结果图；

图4为本发明验证例1中的肺炎衣原体的灵敏度试验结果图；

图5为本发明验证例1中的甲型流感病毒的特异性试验结果图；

图6为本发明验证例1中的乙型流感病毒的特异性试验结果图；

图7为本发明验证例1中的肺炎支原体的特异性试验结果图；

图8为本发明验证例1中的肺炎衣原体的特异性试验结果图；

图9为本发明验证例2中的检测甲型流感病毒的引物探针组合物选择试验结果图；

图10为本发明验证例2中的检测乙型流感病毒的引物探针组合物选择试验结果图；

图11为本发明验证例2中的检测肺炎支原体的引物探针组合物选择试验结果；

图12为本发明验证例2中检测肺炎衣原体的引物探针组合物选择试验结果图；

图13为本发明验证例2中检测四种病原体引物探针组合物特异性交叉试验结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本说明书所使用的术语“扩增”应从广义上来理解，其包括从RNA或DNA获得DNA的过程，并且包括但不限于PCR反应，逆转录反应，以及其各种变型(例如实时PCR反应)。

本说明书中使用的“待测样品”可以由任何合适的形式提供，例如作为来自患者的生物组织或流体的样本，样本可以来自口腔拭子、鼻咽拭子、唾液、痰液、肺腔灌洗液，还可以来自血液样本、全血、血浆、血清或可以是从以上样本提取的核酸的样本。样本可以是包含核酸的任何样本，包含在样本中的核酸可以是DNA和/或RNA。

样本可来自任何真核或原核或病毒来源，例如可以是微生物(例如细菌或真菌)、植物或动物。优选地，样本为人来源。所述样本可以是来自动物的组织或血液样本。

本发明实施例提供了一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法，所述方法包括采用以下试剂中的一种或多种的组合对待测样品中的病原体进行检测：用于检测甲型流感病毒基因上的靶区域1的第一试剂，用于检测乙型流感病毒基因上的靶区域2的第二试剂，用于检测肺炎支原体基因上的靶区域3的第三试剂以及用于检测肺炎衣原体基因上的靶区域4的第四试剂。

所述靶区域2选自乙型流感病毒M1基因的第241～第343位基的区域，所述M1基因的序列如SEQ ID No.2所示；

需要说明的是，只要是用于检测上述靶区域1～4中任一区域的全长区域或靶区域1～4中任一区域的任意部分区域的试剂，均属于本发明的保护范围内。

在可选实施方式中，所述靶区域1选自甲型流感病毒M基因的第(170～174)～第(271～275)位碱基的区域；

所述靶区域2选自乙型流感病毒M1基因的第(241～245)～第(339～343)位碱基的区域；

所述靶区域3选自肺炎支原体16S rRNA基因的第(479～483)～第(553～557)位碱基的区域；

所述靶区域4选自肺炎衣原体MOMP基因的第(581～585)～第(659～663)位碱基的区域。

在可选的实施方式中，所述靶区域1为甲型流感病毒M基因的第172～第273位碱基的区域1a、第174～第271位碱基的区域1b或第170～第275位碱基的区域1c。需要说明的是，“第174～第271位碱基的区域1b”是指甲型流感病毒M基因的第174～第271位碱基的区域，依此类推。

所述靶区域2为乙型流感病毒M1基因的第243～第341位碱基的区域2a、第245～第339位碱基的区域2b或第241～第343位碱基的区域2c。

所述靶区域3为肺炎支原体16S rRNA基因的第481～第555位碱基的区域3a、第483～第553位碱基的区域3b或第479～第557位碱基的区域3c。

所述靶区域4为肺炎衣原体MOMP基因的第583～第661位碱基的区域4a、第585～第659位碱基的区域4b或第581～第663位碱基的区域4c。

在可选的实施方式中，所述第一试剂包括用于检测所述靶区域1的引物对1。

在可选的实施方式中，当所述靶区域1为所述区域1a时，所述引物对1的序列如SEQID No.5～6所示；

当所述靶区域1为所述区域1b时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.17～18所示；

当所述靶区域1为所述区域1c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.19～20所示。

在可选的实施方式中，所述第二试剂包括用于检测所述靶区域2的引物对2。

在可选的实施方式中，当所述靶区域2为所述区域2a时，所述引物对2的序列如SEQID No.8～9所示；

当所述靶区域2为所述区域2b时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.21～22所示；

当所述靶区域2为所述区域2c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.23～24所示。

在可选的实施方式中，所述第三试剂包括用于检测所述靶区域3的引物对3。

在可选的实施方式中，当所述靶区域3为所述区域3a时，所述引物对3的序列如SEQID No.11～12所示；

当所述靶区域3为所述区域3b时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.25～26所示；

当所述靶区域3为所述区域3c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.27～28所示。

在可选的实施方式中，所述第四试剂包括用于检测所述靶区域4的引物对4。

在可选的实施方式中，当所述靶区域4为所述区域4a时，所述引物对4的序列如SEQID No.14～15所示；

当所述靶区域4为所述区域4b时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.29～30所示；

当所述靶区域4为所述区域4c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.31～32所示。

在可选的实施方式中，所述第一试剂包括用于检测所述靶区域1的探针1，所述探针1的序列如SEQ ID No.7所示。

在可选的实施方式中，所述第二试剂包括用于检测所述靶区域2的探针2，所述探针2的序列如SEQ ID No.10所示。

在可选的实施方式中，所述第三试剂包括用于检测所述靶区域3的探针3，所述探针3的序列如SEQ ID No.13所示。

在可选的实施方式中，所述第四试剂包括用于检测所述靶区域4的探针4，所述探针4的序列如SEQ ID No.16所示。

在可选的实施方式中，所述探针1～4均为Taqman探针，所述探针1～4的5’端分别连接有不同的荧光基团，所述探针1～4的3’端均连接有淬灭基团。

所述荧光基团选自：VIC、FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LCRED640、CY5和LC RED705。

所述淬灭基团选自：BHQ1、BHQ2、Dabcyl和QYS-7。

在可选的实施方式中，所述对待测样品进行检测为进行荧光定量PCR扩增，所述引物对1与引物对2与引物对3与引物对4的浓度比为(65～85):(65～85)：(30～50):(65～85)。

在可选的实施方式中，所述引物对1在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针1在扩增体系中的终浓度为900～1100nM。

在可选的实施方式中，所述引物对2在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针2在扩增体系中的终浓度为900～1100nM；

在可选的实施方式中，所述引物对3在扩增体系中的终浓度为300～500nM，所述探针3在扩增体系中的终浓度为400～600nM；

在可选的实施方式中，所述引物对4在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针4在扩增体系中的终浓度为400～600nM。

进一步地，在一些实施例中，所述引物对1、引物对2和引物对4在扩增体系中的终浓度均可为650nM、660nM、670nM、680nM、690nM、700nM、710nM、720nM、730nM、740nM、750nM、760nM、770nM、780nM、790nM、800nM、810nM、820nM、830nM、840nM或850nM。

所述引物对3在扩增体系中的终浓度可为300nM、310nM、320nM、330nM、340nM、350nM、360nM、370nM、380nM、390nM、400nM、410nM、420nM、430nM、440nM、450nM、460nM、470nM、480nM、490nM或500nM。

所述探针1和探针2在扩增体系中的终浓度可为900nM、910nM、920nM、930nM、940nM、950nM、960nM、970nM、980nM、990nM、1000nM或1100nM。

所述探针3和探针4在扩增体系中的终浓度可为400nM、410nM、420nM、430nM、440nM、450nM、460nM、470nM、480nM、490nM、500nM、510nM、520nM、530nM、540nM、550nM、560nM、570nM、580nM、590nM或600nM。

在可选的实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：50℃逆转录和UNG酶消化15～30min；94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。

在可选的实施方式中，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

本发明实施例还提供了一种用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒，其包括前述任一实施方式所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合。

在可选的实施方式中，所述试剂盒包括所述第一试剂～第四试剂的组合。

在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种或多种的组合：RT-PCR缓冲液、酶混合液以及阳性质控品；

优选地，所述酶混合液包括热启动DNA聚合酶和逆转录酶。

优选地，所述酶混合液还包括RNA酶抑制剂和/或UNG酶。UNG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，消除非特异性扩增。

优选地，所述RT-PCR缓冲液包括PCR缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，dNTPs为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的组合，或dATP、dUTP、dCTP和dGTP的组合。当酶混合液种添加有UNG酶时，dNTPs为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的组合。在可选的实施方式中，所述阳性质控品包括以下任意一种或几种质控品的组合：

用于甲型流感病毒检测对照的质控品1，所述质控品1包括如SEQ ID No.33所示目的序列；

用于乙型流感病毒检测对照的质控品2，所述质控品2包括如SEQ ID No.34所示目的序列；

用于肺炎支原体检测对照的质控品3，所述质控品3包括如SEQ ID No.35所示目的序列；

用于肺炎衣原体测对照的质控品4，所述质控品4包括如SEQ ID No.36所示目的序列。

在可选的实施方式中，所述质控品1和所述质控品2均为包含目的序列的RNA假病毒，所述质控品3和所述质控品4均为包含目的序列的DNA质粒。

此外，本发明实施例还提供了用于检测呼吸道病原体的试剂在制备用于诊断呼吸道相关疾病试剂盒中的应用，所述试剂包括如前述任一实施方式所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合。

在可选实施方式中，所述呼吸道相关疾病包括由以下任一病原体引发的疾病：甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体。

由于上述病原体之间的基因序列相似度很高，为了实现不同病原体在一个反应管中检测，需要对各靶区域进行创造性设计，避免彼此间造成非特异性扩增，引起临床假阳性。同时，上述病原体既有RNA病原体，又有DNA病原体，在一个反应管检测时，需要兼顾逆转录和定量PCR两个过程，避免两个过程相互干扰，相比非一管法，对靶区域的设计要求更高。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测待测样品中呼吸道病原体的试剂，其包括第一试剂～第四试剂，具体如表1所示。

表1序列

备注：表1中“F”是指上游引物，“R”是指下游引物。

表1中的第一试剂～第四试剂的靶区域分别为靶区域1a～4a。

实施例2

本实施例提供一种用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒，其包括实施例1提供的第一～第四试剂、RT-PCR缓冲液、酶混合液以及阳性质控品。

其中，RT-PCR缓冲液包括：包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP和MgCl₂；

酶混合液包括：热启动DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和UNG酶；

阳性质控品包括质控品1～4，质控品1～4包含的目标序列请参照表2。

表2目的序列

。

实施例3

本实施例提供一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法，该方法包括以下步骤。

采用实施例2提供的试剂盒对待测样品按照以下体系和条件进行多重荧光PCR扩增。

所述引物对1在扩增体系中的终浓度为750nM，所述探针1在扩增体系中的终浓度为1000nM；

所述引物对2在扩增体系中的终浓度为750nM，所述探针2在扩增体系中的终浓度为1000nM；

所述引物对3在扩增体系中的终浓度为400nM，所述探针3在扩增体系中的终浓度为500nM；

所述引物对4在扩增体系中的终浓度为750nM，所述探针4在扩增体系中的终浓度为500nM。

将待测样本、超纯水(阴性对照)、阳性质控品各10μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各反应管中加入RT-PCR缓冲液30μL、酶混合液2.5μL以及引物对和探针的混合液7.5μL，配成反应体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。

设置PCR仪器中的PCR扩增条件：50℃逆转录和UNG酶消化25min；95℃预变性5min；95℃变性10s；57℃退火30s，并收集荧光信号；变性至退火重复45个循环。

反应完成后，基线设定为自动调整，阈值设定为100000，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。超纯水检测出的Ct值为Undetermined(未确定的)或45，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效。

检测原理：本发明实施例将逆转录酶和热启动Taq酶混合在同一个PCR反应管中使用，对于RNA基因组的甲型流感病毒和乙型流感病毒，先进行逆转录过程合成cDNA，再进行PCR扩增；对于DNA基因组的肺炎支原体和肺炎衣原体，则直接进行PCR扩增。对于RNA和DNA的检测在同一管中同时进行，检测过程一步完成，无需开盖，能够同时监控RNA逆转录和DNA扩增情况。

验证例1

验证实施例1提供的引物对和探针的灵敏度和特异性。

1)灵敏度

采用实施例2提供的试剂盒，并按照实施例3提供的方法分别对不同浓度(10⁶copies/μl、10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl以及10copies/μl)的甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体以及肺炎衣原体的样本进行检测。

本发明试剂盒检测甲型流感病毒的灵敏度试验结果请参照附图1，检测乙型流感病毒的灵敏度试验结果请参照附图2，检测肺炎支原体的灵敏度试验结果请参照附图3，检测肺炎衣原体的灵敏度试验结果请参照附图4。附图1～4中，从左至右曲线1-7分别为四种病原体浓度为10⁶copies/μl、10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl以及10copies/μl以及阴性质控品(超纯水)的检测结果，检测结果如表3所示。

表3灵敏度实验测试结果(多重测试)

备注：若样本检测孔VIC/CY5/ROX/FAM中Ct值≤38，则该样本结果判断为对应的病原体阳性，否则为阴性。

由附图1～4和表3实验结果可知，实施例2提供的试剂盒对肺炎支原体检测灵敏度为10-100copies/μl，对肺炎衣原体检测灵敏度为10copies/μl，对甲型流感病毒检测灵敏度为10-100copies/μl，对乙型流感病毒检测灵敏度为10copies/μl。

2)特异性

采用实施例2提供的试剂盒，并按照实施例3提供的方法分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体以及肺炎衣原体的阳性样本进行检测。

提供的试剂盒检测甲型流感病毒的特异性试验结果请参照附图5，检测乙型流感病毒的特异性试验结果请参照附图6，检测肺炎支原体的特异性试验结果请参照附图7，检测肺炎衣原体的特异性试验结果请参照附图8。

其中，附图5～8中的曲线1和2分别代表四种病原体阳性样本(曲线1)、交叉测试样本(曲线2)以及阴性质控品(曲线2)，由于交叉测试结果与阴性质控品均无扩增，因此曲线重合。检测结果如表4所示。

表4特异性实验测试结果(多重测试)

。

由图5～8以及表4的实验结果可知，四种病原体之间并无交叉扩增，对人基因组也没有非特异扩增，说明本发明实施例2提供的试剂盒具有良好的特异性。

验证例2

本发明的引物/探针试剂是针对四种病原体的特定基因的特定位置进行设计的，扩增的目的序列的位置直接影响检测特异性和灵敏度，本验证例给出部分针对不同基因上不同位置设计的引物/探针试剂比对结果。

最终优选出扩增效率高、试剂间扩增干扰小，能同时用于逆转录和PCR过程的试剂，从而避免了PCR竞争造成的部分病原体的假阴性，同时减少病原体之间交叉扩增造成的假阳性，同时保证4种病原体扩增的信号差异最小，减少因仪器和分析软件的差异造成判读的难度。

采用实施例2(第一试剂～第四试剂)提供的试剂盒，每组试剂分别设置2组或3组对照引物和探针(引物序列和扩展片段参照表5)，结合实施例3提供的方法进行检测，检测样本为质控品。

表5引物序列和扩增片段

备注：甲型流感病毒1为第一试剂的对照例1，甲型流感病毒2为第一试剂的对照例2，依此类推。

检测结果

具体地，检测甲型流感病毒的引物探针组合物选择试验结果请参照附图9，需要说明的是，图9中，曲线1～3分别代表甲型流感病毒1～3的检测结果曲线。

检测乙型流感病毒的引物探针组合物选择试验结果请参照附图10，图10中，曲线1和2分别代表乙型流感病毒1和2的检测结果曲线。

检测肺炎支原体的引物探针组合物选择试验结果请参照附图11，图11中，曲线1和2分别代表肺炎支原体1和2的检测结果曲线。

检测肺炎衣原体的引物探针组合物选择试验结果请参照附图12，图12中，曲线1～3分别代表肺炎衣原体1～3的检测结果曲线。

检测四种病原体引物探针组合物特异性交叉试验结果请参照附图13，附图13中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂分别为四重体系检测四种病原体阳性样本的曲线；交叉为四重体系检测交叉测试样本的曲线；阴性质控品与交叉测试样本结果均无扩增，因此二者曲线重合。

检测结果具体参照表6和表7。

表6引物探针组合物选择试验结果(单重测试)

表7引物探针组合物特异性交叉试验结果(单重测试)

。

甲型流感病毒

使用甲型流感病毒1进行的靶扩增的效率太低，进行单重PCR扩增时对于低浓度样本的检测阳性率低，检测的灵敏度无法达到预期，检测临床样本时易出现假阴性。

使用甲型流感病毒2进行的靶扩增的效率相较于1来说，有所提高，但是相对于其它病原组来说仍较低，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测阳性率低，检测的灵敏度无法达到预期，检测临床样本时易出现假阴性。

使用甲型流感病毒3进行的靶扩增的效率相较于1来说，有很大的提高，但是相对于其它病原组来说仍较低，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测阳性率低，检测的灵敏度无法达到预期，检测临床样本时易出现假阴性。

使用第一试剂进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好。

乙型流感病毒

乙型流感病毒1进行的靶扩增的效率高，在多重PCR扩增时，对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好，但在多重PCR扩增时，荧光值的高度明显低于其余3种病原体的信号。

乙型流感病毒2进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好，在多重PCR扩增时，荧光值的高度明显低于其余3种病原体的信号。

使用第二试剂进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好。

肺炎支原体

使用肺炎支原体1进行的靶扩增的效率要低于第三试剂，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测阳性率低，检测的灵敏度无法达到预期，检测临床样本时易出现假阴性。

使用肺炎支原体2进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，但是对于其余病原体的交叉测试结果特异性不好，检测临床样本时易出现假阳性。

使用第三试剂进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好。

肺炎衣原体

使用肺炎衣原体1进行的靶扩增的效率太低，单重PCR扩增时对于低浓度样本的检测阳性率低，检测的灵敏度无法达到预期，检测临床样本时易出现假阴性。

使用肺炎衣原体2进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好，在多重PCR扩增时，荧光值的高度明显低于其余3种病原体的信号。

使用肺炎衣原体3进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期。但是对于其余病原体的交叉测试结果特异性不好，检测临床样本时易出现假阳性。

使用第四试剂进行的靶扩增的效率高，多重PCR扩增时对于低浓度样本的检测仍有很高的阳性率，检测的灵敏度达到预期，对于其余病原体的交叉测试结果特异性很好。

验证例3

靶区域验证。

针对靶区域1b、1c、2b、2c、3b和3c进行验证，设置8组引物对，如表8所示。

表8靶区域

。

采用表8中的引物替换验证例1对应的引物进行单重及多重测试，结果如表9和表10所示。

表9引物探针组合物选择试验结果(单重)

表10多重引物探针组合物灵敏度和特异性测试结果

。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东菲鹏生物有限公司

<120> 一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法及其试剂盒和应用

<130> 250

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1027

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 1

agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatagca cagagacttg aagatgtctt 120

tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180

gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaac tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300

catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360

caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420

caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480

acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540

aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600

ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctaggcaaat 660

ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720

tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780

gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840

ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900

cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960

ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020

ttctact 1027

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> Influenza B virus

<400> 2

agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60

tcactaatag aagatggaga aggcaaagca gaactagctg aaaaattaca ctgttggttc 120

ggtgggaaag aatttgacct agattctgct ttggaatgga taaaaaacaa aaggtgccta 180

actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccaa 240

gaaagaaaaa ggagattcat cacagagccc ctgtcaggaa tgggaacaac agcaacaaag 300

aagaaaggcc taattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtaagctt tcatgaagca 360

tttgaaatag cagaaggcca cgaaagctca gcattactat attgtcttat ggtcatgtac 420

ctaaaccctg aaaactattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttatgcgag 480

aaacaagcat cgcactcgca tagagcccat agcagagcag caaggtcttc ggtacctgga 540

gtaagacgag aaatgcagat ggtttcagct atgaacacag caaagacaat gaatggaatg 600

ggaaagggag aagacgtcca aaaactagca gaagagctgc aaaacaacat tggagtgttg 660

agatctctag gagcaagtca aaagaatgga gaaggaattg ccaaagatgt aatggaagtg 720

ctaaaacaga gctctatggg aaattcagct cttgtgagga aatacttata atgctcgaac 780

cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc atggcttgga 840

caatagggca tttgaatcaa ataaaaagag gggtaaactt gaaaatacaa ataaggaatc 900

caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac caaaaggaaa 960

tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta ttgggtgacc 1020

acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa acagttttgg 1080

aggtggaaga attgcaatga gcccaatttt cactgtattt cttactatgc atttaagcaa 1140

attgtaatca atgtcagtga ataaaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac t 1191

<210> 3

<211> 1513

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 3

atttttctga gagtttgatc ctggctcagg attaacgctg gcggcatgcc taatacatgc 60

aagtcgatcg aaagtagtaa tactttagag gcgaacgggt gagtaacacg tatccaatct 120

accttataat gggggataac tagttgaaag actagctaat accgcataag aactttggtt 180

cgcatgaatc aaagttgaaa ggacctgcaa gggttcgtta tttgatgagg gtgcgccata 240

tcagctagtt ggtggggtaa cggcctacca aggcaatgac gtgtagctat gctgagaagt 300

agaatagcca caatgggact gagacacggc ccatactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atttttcaca atgagcgaaa gcttgatgga gcaatgccgc gtgaacgatg aaggtcttta 420

agattgtaaa gttcttttat ttgggaagaa tgactttagc aggtaatggc tagagtttga 480

ctgtaccatt ttgaataagt gacgactaac tatgtgccag cagtcgcggt aatacatagg 540

tcgcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcaagcg caggcggatt gaaaagtctg 600

gtgttaaagg cagctgctta acagttgtat gcattggaaa ctattaatct agagtgtggt 660

agggagtttt ggaatttcat gtggagcggt gaaatgcgta gatatatgaa ggaacaccag 720

tggcgaaggc gaaaacttag gccattactg acgcttaggc ttgaaagtgt ggggagcaaa 780

taggattaga taccctagta gtccacaccg taaacgatag atactagctg tcggggcgat 840

cccctcggta gtgaagttaa cacattaagt atctcgcctg ggtagtacat tcgcaagaat 900

gaaactcaaa cggaattgac ggggacccgc acaagtggtg gagcatgttg cttaattcga 960

cggtacacga aaaaccttac ctagacttga catccttggc aaagttatgg aaacataatg 1020

gaggttaacc gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080

gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cgttagttac attgtctagc gagactgcta 1140

atgcaaattg gaggaaggaa gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gtctagggct 1200

gcaaacgtgc tacaatggcc aatacaaaca gtcgccagct tgtaaaagtg agcaaatctg 1260

taaagttggt ctcagttcgg attgagggct gcaattcgtc ctcatgaagt cggaatcact 1320

agtaatcgcg aatcagctat gtcgcggtga atacgttctc gggtcttgta cacaccgccc 1380

gtcaaactat gaaagctggt aatatttaaa aacgtgttgc taaccattag gaagcgcatg 1440

tcaaggatag caccggtgat tggagttaag tcgtaacaag gtacccctac gagaacgtgg 1500

gggtggatca cct 1513

<210> 4

<211> 1170

<212> DNA

<213> Chlamydia pneumoniae

<400> 4

atgaaaaaac tcttaaagtc ggcgttatta tccgccgcat ttgctggttc tgttggctcc 60

ttacaagcct tgcctgtagg gaacccttct gatccaagct tattaattga tggtacaata 120

tgggaaggtg ctgcaggaga tccttgcgat ccttgcgcta cttggtgcga cgctattagc 180

ttacgtgctg gattttacgg agactatgtt ttcgaccgta tcttaaaagt agatgcacct 240

aaaacatttt ctatgggagc caagcctact ggatccgctg ctgcaaacta tactactgcc 300

gtagatagac ctaacccggc ctacaataag catttacacg atgcagagtg gttcactaat 360

gcaggcttca ttgccttaaa catttgggat cgctttgatg ttttctgtac tttaggagct 420

tctaatggtt acattagagg aaactctaca gcgttcaatc tcgttggttt attcggagtt 480

aaaggtacta ctgtaaatgc aaatgaacta ccaaacgttt ctttaagtaa cggagttgtt 540

gaactttaca cagacacctc tttctcttgg agcgtaggcg ctcgtggagc cttatgggaa 600

tgcggttgtg caactttggg agctgaattc caatatgcac agtccaaacc taaagttgaa 660

gaacttaatg tgatctgtaa cgtatcgcaa ttctctgtaa acaaacccaa gggctataaa 720

ggcgttgctt tccccttgcc aacagacgct ggcgtagcaa cagctactgg aacaaagtct 780

gcgaccatca attatcatga atggcaagta ggagcctctc tatcttacag actaaactct 840

ttagtgccat acattggagt acaatggtct cgagcaactt ttgatgctga taacatccgc 900

attgctcagc caaaactacc tacagctgtt ttaaacttaa ctgcatggaa cccttcttta 960

ctaggaaatg ccacagcatt gtctactact gattcgttct cagacttcat gcaaattgtt 1020

tcctgtcaga tcaacaagtt taaatctaga aaagcttgtg gagttactgt aggagctact 1080

ttagttgatg ctgataaatg gtcacttact gcagaagctc gtttaattaa cgagagagct 1140

gctcacgtat ctggtcagtt cagattctaa 1170

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accaatcctg tcacctctga c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcattttgga caaagcgtct a 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caccgtgccc agtgagcgag gac 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagaaaaaga agattcatca cag 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catcttctca tttttctctc agc 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaggaatgg gaacaacagc aacaa 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgtaccatt ttgaataagt gacg 24

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggataacgct tgcgaccta 19

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tattaccgcg actgctggca catag 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgtggagcct tatgggaatg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttcaacttt aggtttggac tg 22

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgtgcaact ttgggagctg aattcc 26

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caatcctgtc acctctgac 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

attttggaca aagcgtcta 19

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agaccaatcc tgtcacctct gac 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggcattttg gacaaagcgt cta 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gaaaaagaag attcatcaca g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcttctcatt tttctctcag c 21

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaaagaaaaa gaagattcat cacag 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cacatcttct catttttctc tcagc 25

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtaccatttt gaataagtga cg 22

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ataacgcttg cgaccta 17

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gactgtacca ttttgaataa gtgacg 26

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccggataacg cttgcgacct a 21

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tggagcctta tgggaatg 18

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcaactttag gtttggactg 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctcgtggagc cttatgggaa tg 22

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ttcttcaact ttaggtttgg actg 24

<210> 33

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120

gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300

aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360

gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatg 405

<210> 34

<211> 497

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ctgcttttta aaacccaaag accaagaaag aaaaagaaga ttcatcacag agcccctatc 60

aggaatggga acaacagcaa caaaaaagaa aggcctgatt ctagctgaga gaaaaatgag 120

aagatgtgtg agctttcatg aagcatttga aatagcagaa ggccatgaaa gctcagcgct 180

actatattgt ctcatggtca tgtacctgaa ccctggaaat tattcaatgc aagtaaaact 240

aggaacgctc tgtgctttgt gcgagaaaca agcatcacat tcacacaggg ctcatagcag 300

agcagcaaga tcttcagtgc ctggagtgag acgagaaatg cagatggttt cagctatgaa 360

cacagcaaaa acaatgaatg gaatgggaaa aggagaagac gtccaaaaac tggcagaaga 420

gctgcaaagc aacattggag tattgagatc tcttggagca agtcaaaaga atggagaagg 480

aattgcaaag gatgtaa 497

<210> 35

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aatttttcac aatgagcgaa agcttgatgg agcaatgccg cgtgaacgat gaaggtcttt 60

aagattgtaa agttctttta tttgggaaga atgactttag caggtaatgg ctagagtttg 120

actgtaccat tttgaataag tgacgactaa ctatgtgcca gcagtcgcgg taatacatag 180

gtcgcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcaagc gcaggcggat tgaaaagtct 240

ggtgttaaag gcagctgctt aacagttgta tgcattggaa actattaa 288

<210> 36

<211> 362

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

caaacgtttc tttaagtaac ggagttgttg aactttacac agacacctct ttctcttgga 60

gcgtaggcgc tcgtggagcc ttatgggaat gcggttgtgc aactttggga gctgaattcc 120

aatatgcaca gtccaaacct aaagttgaag aacttaatgt gatctgtaac gtatcgcaat 180

tctctgtaaa caaacccaag ggctataaag gcgttgcttt ccccttgcca acagacgctg 240

gcgtagcaac agctactgga acaaagtctg cgaccatcaa ttatcatgaa tggcaagtag 300

gagcctctct atcttacaga ctaaactctt tagtgccata cattggagta caatggtctc 360

ga 362

Claims

1.一种检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述方法包括采用以下试剂中的一种或多种的组合对待测样品中的病原体进行检测：

所述靶区域3选自肺炎支原体16S rRNA基因的第479～第557位碱基的区域，所述16SrRNA基因的序列如SEQ ID No.3所示；

2.根据权利要求1所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述靶区域1选自甲型流感病毒M基因的第(170～174)～第(271～275)位碱基的区域；

所述靶区域4选自肺炎衣原体MOMP基因的第(581～585)～第(659～663)位碱基的区域；

优选地，所述靶区域1为甲型流感病毒M基因的第172～第273位碱基的区域1a、第174～第271位碱基的区域1b或第170～第275位碱基的区域1c；

所述靶区域2为乙型流感病毒M1基因的第243～第341位碱基的区域2a、第245～第339位碱基的区域2b或第241～第343位碱基的区域2c；

所述靶区域3为肺炎支原体16S rRNA基因的第481～第555位碱基的区域3a、第483～第553位碱基的区域3b或第479～第557位碱基的区域3c；

3.根据权利要求2所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述第一试剂包括用于检测所述靶区域1的引物对1；

优选地，当所述靶区域1为所述区域1a时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.5～6所示；

当所述靶区域1为所述区域1c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.19～20所示；

优选地，所述第二试剂包括用于检测所述靶区域2的引物对2；

优选地，当所述靶区域2为所述区域2a时，所述引物对2的序列如SEQ ID No.8～9所示；

当所述靶区域2为所述区域2c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.23～24所示；

优选地，所述第三试剂包括用于检测所述靶区域3的引物对3；

优选地，当所述靶区域3为所述区域3a时，所述引物对3的序列如SEQ ID No.11～12所示；

当所述靶区域3为所述区域3c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.27～28所示；

优选地，所述第四试剂包括用于检测所述靶区域4的引物对4；

优选地，当所述靶区域4为所述区域4a时，所述引物对4的序列如SEQ ID No.14～15所示；

当所述靶区域4为所述区域4c时，所述引物对1的序列如SEQ ID No.31～32所示；

优选地，所述第一试剂包括用于检测所述靶区域1的探针1，所述探针1的序列如SEQ IDNo.7所示；

优选地，所述第二试剂包括用于检测所述靶区域2的探针2，所述探针2的序列如SEQ IDNo.10所示；

优选地，所述第三试剂包括用于检测所述靶区域3的探针3，所述探针3的序列如SEQ IDNo.13所示；

优选地，所述第四试剂包括用于检测所述靶区域4的探针4，所述探针4的序列如SEQ IDNo.16所示。

4.根据权利要求3所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述探针1～4均为Taqman探针，所述探针1～4的5’端分别连接有不同的荧光基团，所述探针1～4的3’端均连接有淬灭基团；

所述荧光基团选自：VIC、FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705；

所述淬灭基团选自：BHQ1、BHQ2、Dabcyl和QYS-7。

5.根据权利要求3所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述对待测样品进行检测为进行荧光定量PCR扩增，所述引物对1与引物对2与引物对3与引物对4的浓度比为(65～85):(65～85)：(30～50):(65～85)；

优选地，所述引物对1在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针1在扩增体系中的终浓度为900～1100nM；

优选地，所述引物对2在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针2在扩增体系中的终浓度为900～1100nM；

优选地，所述引物对3在扩增体系中的终浓度为300～500nM，所述探针3在扩增体系中的终浓度为400～600nM；

优选地，所述引物对4在扩增体系中的终浓度为650～850nM，所述探针4在扩增体系中的终浓度为400～600nM。

6.根据权利要求5所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：49～51℃逆转录和UNG酶消化15～30min；94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。

7.根据权利要求1～6任一项所述的检测待测样品中呼吸道病原体的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

8.一种用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～7中任一项所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合；

优选地，所述试剂盒包括所述第一试剂～第四试剂的组合；

优选地，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种或多种的组合：RT-PCR缓冲液、酶混合液以及阳性质控品；

优选地，所述酶混合液包括热启动DNA聚合酶和逆转录酶；

优选的，所述酶混合液还包括RNA酶抑制剂和/或UNG酶；

优选地，所述RT-PCR缓冲液包括PCR缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，dNTPs为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的组合或dATP、dUTP、dCTP和dGTP的组合。

9.根据权利要求8所述的用于诊断呼吸道相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括以下任意一种或几种质控品的组合：

用于肺炎衣原体测对照的质控品4，所述质控品4包括如SEQ ID No.36所示目的序列；

优选地，所述质控品1和所述质控品2均为包含目的序列的RNA假病毒，所述质控品3和所述质控品3均为包含目的序列的DNA质粒。

10.用于检测呼吸道病原体的试剂在制备用于诊断呼吸道相关疾病试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括如权利要求1～7任一项所述的方法中的第一试剂～第四试剂中的一种或多种的组合；

优选地，所述呼吸道相关疾病包括由以下任一病原体引发的疾病：甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体。