CN108411037A

CN108411037A - 一种能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂

Info

Publication number: CN108411037A
Application number: CN201810249842.9A
Authority: CN
Inventors: 肖李亚; 高利飞; 李进福; 李振红; 李静静; 付光宇; 鲁清月; 吴学炜; 苗拥军
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明公开了一种核酸诊断冻干试剂，包括含有2%‑10%海藻糖，2%‑5%葡聚糖，0.5%‑2%PEG8000，0.01mg‑0.02mg/ml BSA蛋白的冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针。本发明的优点在于冻干试剂中同时含有肺炎支原体，肺炎衣原体，腺病毒三种病原体核酸，能实现对多种病原体核酸的扩增检测，即采用一个反应体系可同时检测三个靶标，大大节约了试剂和检测耗材，检测通量高，扩大了临床应用范围。本发明的冻干试剂在冻干处理时，首先采用液氮对液态试剂进行快速预冻，缩短了后续冻干过程，提高了冻干试剂的稳定性。

Description

一种能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂。

背景技术

PCR（聚合酶链式反应）是一种用于特定核酸片段的扩增放大技术，该技术广泛应用于基因检测和病原体检测，具有灵敏度高，特异性好，简便，快捷等特点，对生物和医学研究及临床诊断意义重大。

肺炎支原体（M.Pneumonia）是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎，儿童易造成重症肺炎，所以及时检测并用药对患者治疗意义重大。

人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。人类肺炎衣原体感染一年四季均可能发生，不呈季节性特征，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。尤其免疫低下者易引起肺部感染，及时检测并用药对患者治疗意义重大。

腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等；冬春流行季节尽量少去人员密集的公共场所，外出时戴口罩，避免接触病人，以防感染。腺病毒及时检测并用药对患者治疗意义重大。

传统用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒的荧光PCR检测试剂多为液态的单重检测试剂，一个反应体系只能检测一个靶标，收费高、检测项目单一，耗材和试剂成本高，检测通量低，不能满足临床检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三种核酸的冻干试剂。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，包括含有2%-10%海藻糖，2%-5%葡聚糖，0.5%-2% PEG8000，0.01mg-0.02mg/ml BSA蛋白的冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针。

所述肺炎支原体引物包括肺炎支原体上游引物ccaaaaatggtcctacaccgact，肺炎支原体下游引物cgtgttcccaaaataggtttcca；所述肺炎支原体探针为ctccccgcttacggcgaggtgaatggg。

所述肺炎衣原体引物包括肺炎衣原体上游引物caactttgggagctgaattcca，肺炎衣原体下游引物ttacagagaattgcgatacgt；所述肺炎衣原体探针为cagtccaaacctaaagttgaagaacttaat。

所述腺病毒引物包括腺病毒上游引物gttgaccgggaagacaataccta，腺病毒下游引物gaatgtgctggccatgtcaag；所述腺病毒探针为cgctacacgctggctgtaggcgacaac。

所述冻干试剂的冻干过程为：

将含有2%-10%海藻糖，2%-5%葡聚糖，0.5%-2% PEG8000，0.01mg-0.02mg/ml BSA蛋白的保护剂与肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针按常规方法配制成液态试剂，然后将液体试剂加入涂覆有疏水材料层的预冻板凹坑内，使凹坑内的液体试剂呈现出球形液滴状，最后将预冻板浸入液氮中预冻2~5分钟，收集凝固的球形预冻试剂直接放入冻干机中进行真空冷冻干燥即可。

本发明的优点在于冻干试剂中同时含有肺炎支原体，肺炎衣原体，腺病毒三种病原体核酸，能实现对多种病原体核酸的扩增检测，即采用一个反应体系可同时检测三个靶标，大大节约了试剂和检测耗材，检测通量高，扩大了临床应用范围。本发明的冻干试剂在冻干处理时，首先采用液氮对液态试剂进行快速预冻，缩短了后续冻干过程，提高了冻干试剂的稳定性。

附图说明

图1是本发明的球形冻干试剂。

具体实施方式

本发明所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其成分含有2%-10%海藻糖，2%-5%葡聚糖，0.5%-2% PEG8000，0.01mg-0.02mg/ml BSA蛋白的冻干保护剂，Tris缓冲盐，氯化钾，dNTPs，镁离子，引物，探针，Taq酶。在冻干试剂中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针，可同时对三种病原体核酸进行检测。

实际配制时，该冻干试剂的各成分可按下表量取：

注：表中所述“肺支”为肺炎支原体，“肺衣”为肺炎衣原体。

按上表中成分配制成液态试剂后，将液体试剂加入涂覆有疏水材料层的预冻板凹坑内（预冻板有一定厚度，上面均匀设置有多个凹坑），由于疏水材料层的作用，加入凹坑内的液体试剂会呈现出球形液滴状（如图1所示），将预冻板浸入液氮中预冻2~5分钟（注意预冻时液氮不能进入凹坑内，保证试剂的洁净度），最后收集凝固的球形预冻试剂，将其直接放入冻干机中进行真空冷冻干燥即可。

本发明冻干试剂的检测效果：

核酸诊断虽被广泛应用于各种病原体的检测上，但是核酸扩增反应试剂在常温下保存并不稳定，而且常规液态核酸检测试剂每次使用都必须要反复冻融，这对试剂的活性也有很大的影响，并且各组分不能混合在一起，用时需混合，操作繁琐，试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的影响，容易因保存温度的不当而使其性能下降甚至完全失效。本发明为全预混冻干的多重PCR联检试剂可有效克服上述缺点，完全满足了临床的检测需求。

Claims

1.一种能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其特征在于：包括含有2%-10%海藻糖，2%-5%葡聚糖，0.5%-2% PEG8000，0.01mg-0.02mg/ml BSA蛋白的冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针。

2.根据权利要求1所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其特征在于：所述肺炎支原体引物包括肺炎支原体上游引物ccaaaaatggtcctacaccgact，肺炎支原体下游引物cgtgttcccaaaataggtttcca；所述肺炎支原体探针为ctccccgcttacggcgaggtgaatggg。

3.根据权利要求1所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其特征在于：所述肺炎衣原体引物包括肺炎衣原体上游引物caactttgggagctgaattcca，肺炎衣原体下游引物ttacagagaattgcgatacgt；所述肺炎衣原体探针为cagtccaaacctaaagttgaagaacttaat。

4.根据权利要求1所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其特征在于：所述腺病毒引物包括腺病毒上游引物gttgaccgggaagacaataccta，腺病毒下游引物gaatgtgctggccatgtcaag；所述腺病毒探针为cgctacacgctggctgtaggcgacaac。

5.根据权利要求1所述的能同时区分三种病原体核酸的冻干试剂，其特征在于：所述冻干试剂的冻干过程为：

将含有2%-10%海藻糖，2%-5%葡聚糖，0.5%-2% PEG8000，0.01mg-0.02mg/ml BSA蛋白的保护剂与肺炎支原体、肺炎衣原体和腺病毒三套引物和探针按常规方法配制成液态试剂，然后将液体试剂加入涂覆有疏水材料层的预冻板凹坑内，使凹坑内的液体试剂呈现出球形液滴状，最后将预冻板浸入液氮中预冻2~5分钟，收集凝固的球形预冻试剂直接放入冻干机中进行真空冷冻干燥。