CN105648115A - 用于检测多种呼吸道病原体的pcr引物组、探针组及试剂盒 - Google Patents

用于检测多种呼吸道病原体的pcr引物组、探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组及试剂盒；其中所述PCR引物的各序列为SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.12，所述探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的6条呼吸道病原体的分子信标探针中的至少两条，各序列为SEQ？ID？NO.13～SEQ？ID？NO.18。本发明还公开包含以上PCR引物和探针的PCR反应液，以及包含至少一人份PCR反应液的试剂盒。利用本发明，可以快速准确地分型检测6种呼吸道病原体。

Description

用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组及试剂盒
技术领域
本发明涉及用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组及试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，可由多种病原体引起，其中包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。其中急性呼吸道感染(AcuteRespiratoryTractInfection，ARTI)是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。世界卫生组织(WHO)2005年在《柳叶刀》杂志发表文章报道：在2000-2003年，每年1060万5岁以下死亡儿童中，因传染性疾病死亡占54％，其中因肺炎死亡的患儿占19％。ARTI的严格定义是所有的呼吸道感染，然而，实际上，在严重呼吸道疾病中急性下呼吸道占据大多数，占世界范围内学龄前儿童死亡总数的20％，其中90％为肺炎。大量的证据表明，营养不良、低出生体重、被动吸烟、人工喂养、经济困难、居住环境拥挤、免疫功能缺陷、HIV感染是严重ARTI的危险因素，因此，大多数因急性呼吸道感染死亡的病例发生在发展中国家。ARTI主要的致病微生物包括细菌和病毒，还包括一些非典型病原体，如真菌、支原体、衣原体等，根据临床症状和影像报告临床工作者很难将它们区分，因此病原分析对于临床诊断和治疗至关重要。
传统检测呼吸道病原体的方法主要有培养方法、生化方法和免疫方法等，培养法操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、快速，费用低，是目前门诊检验的常规检测方法；但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素多，不能区分病原体的具体种类。免疫检测方法快速简便；但一个检测只能针对其中一种病原体。
随着医疗水平的发展，用上述传统的方法已经不能满足对呼吸道病原体的检测，临床上需要一种能够灵敏、特异，并且快速、简便的呼吸道多病原体鉴定检测方法，以便能够更好的做到个体化的治疗、并满足对卫生防疫和疫情控制、进行传染病流行病学研究的需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提出一种准确、快速、灵敏的用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。
其中，所述PCR引物组包括以下至少两对引物对：
由序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两条序列组成的针对博卡病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌的引物对；
由序列表中SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两条序列组成的针对百日咳博德特氏菌的引物对；
由序列表中SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体的引物对；
由序列表中SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的两条序列组成的针对肺炎支原体的引物对。
所述探针组包括以下至少两条分子信标探针：
由序列表中SEQIDNO.13所示的序列或其反向互补序列组成的针对腺病毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.14所示的序列或其反向互补序列组成的针对博卡病毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.15所示的序列或其反向互补序列组成的针对嗜肺军团菌的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.16所示的序列或其反向互补序列组成的针对百日咳博德特氏菌的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.17所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎衣原体的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.18所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎支原体的分子信标探针；
每一条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
优选地，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间为与对应呼吸道病原体扩增产物特异杂交的环状结构。
优选地，每一条所述分子信标探针的熔解温度范围在55℃～80℃，至少两条所述分子信标探针中若具有相同的荧光基团，则具有相同荧光基团标记的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，差异在2℃以上。
优选地，所述荧光基团选自FAM、HEX和TAMRA，所述淬灭基团为Dabcyl。
其中，所述PCR反应液，包含所述的PCR引物组和所述的探针组
所述的试剂盒包括至少一人份所述的PCR反应液。
本发明的有益效果包括：
采用本发明的技术方案，可以检测并鉴别多种呼吸道病原体，而且该方法操作简便、检测准确、灵敏、快速，4小时内可出结果。本发明利用多重PCR荧光分子信标熔解曲线技术，PCR扩增后直接对产物进行熔解曲线分析，无需开盖分析，可有效避免产物污染；多色荧光和熔解曲线相结合，保证了检测的足够通量，可进行多病原体的分型检测，应用分子信标探针技术，检测的特异性高，成本较低，适合在临床大量推广使用。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中的腺病毒(AdV)、博卡病毒(HBoV)的荧光熔解曲线图；
图2为本发明具体实施方式中的嗜肺军团菌(LP)、百日咳博德特氏菌(BP)的荧光熔解曲线图；
图3为本发明具体实施方式中的肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)的荧光熔解曲线图。
具体实施方式
本发明涉及对多种呼吸道病原体分型检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。下面结合具体实施方式及附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
根据本发明的实施例，对多种呼吸道病原体检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒将用于以下6种呼吸道病原体中的至少2种的分型检测，分别为：腺病毒、博卡病毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌、肺炎衣原体和肺炎支原体。
在一些实施例中，可以通过PCR扩增待检者的鼻咽拭子呼吸道病原体的保守基因片段，其中PCR引物序列优选为以下表1中的至少一对：
表1
其中，“F”表示上游引物，“R”表示下游引物。
在一些实施例中，采用如下6条针对呼吸道病原体的分子信标探针中的至少两条，分子信标探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，探针序列如下表2：
表2
其中FAM、HEX、TAMRA为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团。每一条分子信标探针的熔解温度范围在55℃～80℃，具有相同的荧光基团的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，即差异在2℃以上。
当然，在其他实施例中，每一条分子信标探针的荧光基团可以相同也可以不同，各序列对应的荧光基团和淬灭基团不限于上述特定类型，且荧光基团和淬灭基团的位置也可以互换。
在其他实施例中，除了上述表2中的序列之外，本发明的分子信标探针的序列还可以是对应于上述各序列的反向互补序列。
在一些实施例中，用于检测多种呼吸道病原体的PCR反应液包括上述至少两对PCR引物对以及相应的至少两条分子信标探针。较优的是，在PCR反应液中，还可以设有内参照引物和内参照探针，内参照引物和内参照探针可以根据人基因组保守基因或样品提取中另外加入的已知阳性质控品常规设计。
在一些实施例中，PCR反应液中除上述引物和探针外，还可以包括DNA聚合酶、10×Buffer、dNTP等，以进行PCR反应液的配制和一步法PCR扩增。扩增程序可以包括高温变性、低温复性、72℃延伸等。
在一些实施例中，探针与PCR产物的结合及熔解程序如下：在低温(例如30℃-40℃范围内)下，各探针与对应病原体的PCR产物结合后，随着温度的逐步升高，探针依其Tm顺序，逐个与产物解链分离，荧光信号减弱。最终依靠荧光变化时的温度，确定待检样品的基因型。
在一些实施例中，用于检测多种呼吸道病原体的试剂盒包括至少一人份上述PCR反应液。
以下通过具体的实施例进行进一步说明。
(a)样品收集
收集待检者鼻咽拭子样品。
(b)样品病原体的DNA提取
使用市售DNA提取试剂盒提取病原体DNA，具体操作过程按其说明书进行。
(c)引物设计
从GenBank中找出拟检测的6种病原体的保守基因序列，分别设计扩增引物，确保每对引物能够扩增出病原体的种类，并且不与其它病原体发生非特异扩增。
(d)多重PCR扩增6种不同类型的病原体
针对6种病原体，可以直接进行多重PCR扩增。即在一管中同时加入这6种病原体的引物进行PCR扩增。
(e)分子信标探针设计
在引物的扩增区域内，分别设计这6种病原体的分子信标探针，每一条探针整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间为能与每种PCR产物特异杂交的环状结构。应保证每个探针的特异性，使非特异杂交的Tm值低于特异熔解曲线峰值范围(也即非特异杂交的Tm值小于55℃)，以免对熔解曲线分析造成影响。所有探针可以用相同的荧光基团标记，也可以用不同的荧光基团标记，本例中分成三种荧光标记，相同荧光标记探针的Tm设计成一定的梯度，一般差异在2℃以上，熔解温度范围在55℃～80℃。
将所有分子信标探针加入PCR反应液中，最终的一管PCR反应液基本组成如下：
(f)多重PCR熔解曲线分析
多重PCR扩增及熔解曲线分析基本程序设置如下：
最后根据熔解曲线峰图，确定样品是否感染了待检的这6种病原体，若为感染阳性，则可根据荧光类型和熔解曲线峰对应的温度，判断出所感染的病原体类型，整个检测流程约为4小时。
参见图1至图3所示的实验检测数据，其中，图1示出了腺病毒(AdV)、博卡病毒(HBoV)的FAM荧光熔解曲线，图2示出了嗜肺军团菌(LP)、百日咳博德特氏菌(BP)的HEX荧光熔解曲线。图3示出了肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)的TAMRA荧光熔解曲线。最后根据熔解曲线峰图，确定样品流感病原体种类。各型流感病原体对应的熔解峰值见下表3：
表3
以上实施例是可以同时检测6种呼吸道病原体的示例，在其他实施例中，也可以同时只检测其中2种或3种或4种或5种呼吸道病原体。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下至少两对引物对：
由序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两条序列组成的针对博卡病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌的引物对；
由序列表中SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两条序列组成的针对百日咳博德特氏菌的引物对；
由序列表中SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体的引物对；
由序列表中SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的两条序列组成的针对肺炎支原体的引物对。
2.用于检测多种呼吸道病原体的探针组，其特征在于，所述探针组包括以下至少两条分子信标探针：
由序列表中SEQIDNO.13所示的序列或其反向互补序列组成的针对腺病毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.14所示的序列或其反向互补序列组成的针对博卡病毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.15所示的序列或其反向互补序列组成的针对嗜肺军团菌的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.16所示的序列或其反向互补序列组成的针对百日咳博德特氏菌的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.17所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎衣原体的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.18所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎支原体的分子信标探针；
每一条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
3.如权利要求2所述的探针组，其特征在于，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间为与对应呼吸道病原体扩增产物特异杂交的环状结构。
4.如权利要求2所述的探针组，其特征在于，每一条所述分子信标探针的熔解温度范围在55℃～80℃，至少两条所述分子信标探针中若具有相同的荧光基团，则具有相同荧光基团标记的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，差异在2℃以上。
5.如权利要求2-4任意一项所述的探针组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX和TAMRA，所述淬灭基团为Dabcyl。
6.用于检测多种呼吸道病原体的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包含权利要求1中所述的PCR引物组和权利要求2-5任一项所述的探针组。
7.用于检测多种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括至少一人份权利要求6所述的PCR反应液。
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