CN105838826A - 一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光pcr引物、探针及方法 - Google Patents

一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光pcr引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引物、探针及方法。该方法结合了实时荧光PCR技术及熔解曲线分析技术，根据熔解曲线峰型及Tm值差异鉴定犬细小病毒疫苗与野毒株；操作简单：只需一个反应即可实现三种基因型野毒株及两种疫苗与的鉴别检测；检测速度快且高通量：全部操作过程不需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了病毒三种不同基因型及两种疫苗与野毒株的鉴别检测所需时间；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引 物、探针及方法
技术领域
本发明涉及病毒疫苗毒与野毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光检测方法和试剂盒，该方法是一种基于两条双标记自猝灭探针的探针熔解曲线分析技术，用于犬细小病毒野毒株与疫苗株的检测方法。
背景技术
犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）为单链小DNA病毒，是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。CPV-2在20世纪70年代后期出现，但在几年内就被新的抗原变异型所取代。目前，国内CPV主要流行株为CPV-2a/2b，在2010年，夏咸柱等首次报道了CPV-2c型变异株，2014年Gali Bingga等人通过PCR-HRM方法鉴定出在江苏某地CPV-2c型变异株在腹泻犬中的检出率高达10%，表明在我国CPV抗原型也在不断变化。因此，对CPV不同抗原型进行基因分型检测对监控该病毒的进化和变异有着重要意义。
而原始型CPV-2基因型已被新出现的上述三种抗原变异型完全取代，仅以弱毒活疫苗的形式用于CPV的防控。目前，国内用于预防犬细小病毒病的疫苗株主要有：硕腾动物保健品有限公司的四联活疫苗-卫佳®伍（含弱毒活疫苗株NL-35-D株）和英特威国际有限公司的宠必威®优免康（含弱毒活疫苗株154株），以上两个疫苗株均为原始CPV-2型的弱毒株。虽然接种疫苗可预防犬细小病毒病的流行，但有报道称接种犬细小病毒弱毒活疫苗株的犬依然发生犬细小病毒感染发病的现象。此外，接种疫苗也对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度，从而影响其疾病治疗效果。因此，快速区分犬细小病毒的疫苗株和野毒株对疫苗株的安全评价及疾病的快速准确诊断具有一定的临床意义。
传统的CPV分型方法有病毒分离与鉴定（VI）、血凝抑制试验（HI）、普通PCR方法、限制性片段长度多态性（RFLP）方法、MGB探针方法、测序和高分辨率熔解曲线（HRM）法等。其中病毒分离与鉴定方法需借助3种不同单克隆抗体才能完成分型，费时、费力，不易快速鉴别CPV不同亚型；血凝抑制试验方法对CPV病毒滴度要求较高，一般滴度大于1：64才可利用相应单克隆抗体来鉴别，而滴度小于1：32则需通过在MDCK或F81细胞上扩增后方能用单克隆抗体来检测；PCR方法利用CPV-2b序列引物3ˊ末段碱基错配方式区分CPV-2a和CPV-2b型，此方法虽然能区分CPV-2a和CPV-2b，但特异性不高、容易同时扩增出两个基因型，此外，新出现的CPV变异株表明，3ˊ末段碱基错配法保守性差，易受到病毒核酸序列突变影响，因此，普通PCR方法很难对CPV进行准确分型；限制性片段长度多态性方法能够区分CPV-2b和CPV-2c型，但区分不了CPV-2a和CPV-2b型，因为MboⅡ酶对CPV-2a和CPV-2b酶切结果相同，此方法只能在用单克隆抗体确认为CPV-2b的前体下才能鉴别CPV-2b和CPV-2c基因型；MGB探针方法虽然能够区分CPV不同基因型，但需同时合成两个或两个以上探针，价格昂贵，不易在临床检测中使用；测序方法虽然准确率高，但价格偏高、所需时间较长，一般至少要24小时才能完成。上述方法均存在操作复杂、费时、费用高等缺点，在临床实践中的应用受限。PCR-HRM分析法可以很好的区分CPV不同基因型，但由于起始模板浓度及不同批次样品离子浓度差异，需要进行两轮PCR扩增，且由于CPV-2b和CPV-2c在426位点的较小差异，很难在首轮熔解曲线上直观区分，需要进行杂交后二次熔解曲线分析，操作相对繁琐、费时（Bingga G,Liμ Z, Zhang J, Zhμ Y, Lin L, Ding S, et al. High resolμtion melting cμrveanalysis as a new tool for rapid identification of canine parvovirμs type 2strains. Mol Cell Probes. 2014, 28(5): 271-278）。
区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的传统的方法有MGB探针方法、测序和高分辨率熔解曲线（HRM）法等。这几种方法上面已经详细描述了各自缺点，均存在操作复杂、费时等缺点，在临床实践中的推广应用受限。
因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且可快速的区分不同基因型犬细小病毒，及疫苗株与野毒株的方法。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光检测方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。
本发明的目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光检测的引物及探针。
本发明的另一目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光检测方法。
本发明的再一目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：
F1：5'-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'（SEQ ID NO：1），
R1：5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'（SEQ ID NO：2），
F2：5'-TGGAAATCACAGCAAACTC-3'（SEQ ID NO：4），
R2：5'-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3'（SEQ ID NO：5）。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：
探针P1：5'- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3'（SEQ ID NO：3），
探针P2：5'- CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3'（SEQ ID NO：6）。
进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针P1和P2的5’端标记的荧光基团不相同。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
进一步的，所述试剂盒中还含有上述所述的探针。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以提取的DNA为模板，用引物对F1、R1、F2和R2，及探针P1和探针P2进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型。
进一步的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应体系为：
ddH2O 2.8μl
Premix Ex-Taq 5.0μl
1μM引物F1 0.2μl
10μM 引物R1 0.2μl
10μM 探针P1 0.2μl
1μM引物F2 0.2μl
10μM引物R2 0.2μl
10μM 探针P2 0.2μl
DNA模板 1.0μl
总体积 10μl。
进一步的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环55次。
进一步的，步骤3）中的熔解曲线分析程序为：95℃变性3min；37℃退火3min；45℃到75℃以0.1℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P1和P2的荧光信号，进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤3）中所述熔解曲线分析的具体分析过程为：
1）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-pfu熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-pfu；
2）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-int熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-2a峰型的基部开口宽，且宽4±0.5℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-int；
3）在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2c；
4）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2b熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2b；
5）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-int的基部开口窄，且窄4±0.5℃；同时在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2a熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2a。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗与野毒株的双色荧光检测方法、引物及探针。操作简单：只需一个反应即可实现三种不同基因型野毒与两种疫苗株的鉴别检测；检测速度快且高通量：全部操作过程不需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了病毒三种不同基因型野毒株与两种疫苗株鉴别检测所需时间；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2）本发明的PCR引物对F1/R1，对犬细小病毒CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。PCR引物对F2/R2，对犬细小病毒疫苗（包括辉瑞卫佳®伍和英特威宠必威®优免康）与野毒株可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别的时间。探针P1可特异性与犬细小病毒CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c鉴别位点杂交，特异性较好。探针P2可特异性与犬细小病毒两种疫苗与野毒株鉴别位点杂交，特异性较好。引物对F1/R1、F2/R2，探针P1和P2，均不与其他常见犬类腹泻病毒核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性。
3）本发明的一种快速区分犬细小病毒疫苗与野毒株的双色荧光检测方法的最低检测限可达到单拷贝，灵敏度较高。
附图说明
图1为标准化样品双色荧光检测方法熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图（即B和C图的叠加），B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；标准样品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗CPV-int、疫苗CPV-pfu、水对照分别重复三个样本；
图2 为双色荧光检测方法特异性试验熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图（即B和C图的叠加），B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；标准样品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗CPV-int、疫苗CPV-pfu，及水对照、CDV、CAV-2、CCV、CRV和CPIV分别重复三个样本；
图3 为双色荧光检测方法灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为CPV-2a的FAM和HEX双通道同时检测的扩增曲线图，即C和D图中曲线的叠加图；B为CPV-2a的 FAM和HEX双通道同时检测的熔解曲线图，即E和F图中曲线的叠加图；C和D分别为FAM单通道和HEX单通道检测的扩增曲线图；E和F分别为FAM单通道和HEX单通道检测的熔解曲线图；
图4 为临床样品双色荧光检测方法熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图（即B和C图的叠加），B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；标准样品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗CPV-int、疫苗CPV-pfu、水对照分别重复三个样本，临床样本33个，编号分别为GD1-3，JS1-30，无重复；结果显示样本JS11号为基因型CPV-2a和CPV-2b混合感染样本，GD3、JS1、JS3、JS5-6、JS8-10、JS12-13、JS15-18、JS23-27、JS29共20个样本为CPV-2a基因型，GD1-2、JS2、JS7、JS19、JS21-22、JS28、JS30共9个样本为CPV-2b基因型，JS4、JS14、JS20共3个样本为CPV-2c基因型，这33个样本共34个毒株NCBI登录号为KJ754509-KJ754542。
具体实施方式
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：
F1：5'-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'（SEQ ID NO：1），
R1：5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'（SEQ ID NO：2），
F2：5'-TGGAAATCACAGCAAACTC-3'（SEQ ID NO：4），
R2：5'-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3'（SEQ ID NO：5）。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：
探针P1：5'- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3'（SEQ ID NO：3），
探针P2：5'- CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3'（SEQ ID NO：6）。
优选的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针P1和P2的5’端标记的荧光基团不相同。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
优选的，所述试剂盒中还含有上述所述的探针。
一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以提取的DNA为模板，用引物对F1、R1、F2和R2，及探针P1和探针P2进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型。
优选的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应体系为：
ddH2O 2.8μl
Premix Ex-Taq 5.0μl
1μM引物F1 0.2μl
10μM 引物R1 0.2μl
10μM 探针P1 0.2μl
1μM引物F2 0.2μl
10μM引物R2 0.2μl
10μM 探针P2 0.2μl
DNA模板 1.0μl
总体积 10μl。
优选的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环55次。
优选的，步骤3）中的熔解曲线分析程序为：95℃变性3min；37℃退火3min；45℃到75℃以0.1℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P1和P2的荧光信号，进行熔解曲线分析。
优选的，步骤3）中所述熔解曲线分析的具体分析过程为：
1）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-pfu熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-pfu；
2）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-int熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-2a峰型的基部开口宽，且宽4±0.5℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-int；
3）在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2c；
4）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2b熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2b；
5）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-int的基部开口窄，且窄4±0.5℃；同时在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2a熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2a。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物及探针
经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现引物对F1/R1、F2/R2，及探针P1和P2对双色荧光法区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的效果最好，其碱基序列如下所示。
F1：5'-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'（SEQ ID NO：1），
R1：5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'（SEQ ID NO：2），
探针P1：5'-FAM- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -BHQ1-3'（SEQ ID NO：3），
F2：5'-TGGAAATCACAGCAAACTC-3'（SEQ ID NO：4），
R2：5'-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3'（SEQ ID NO：5），
探针P2：5'-HEX-CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG-BHQ1-3'（SEQ ID NO：6）。
实施例2 标准样品的制备、双色荧光PCR扩增及熔解曲线分析
1）犬细小病毒DNA的提取
分别取感染有CPV的病料样品，病料样品可以是全血、粪便、直肠拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的样品，全血可直接取200μl备用，粪便和直肠试子需取一定量溶解于1mL PBS盐酸缓冲溶液中，静置10-20min后取200μl备用；CPV疫苗，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行溶解，取200μL备用。按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.4.0的说明书进行核酸提取。
2）标准样品的制备
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品（经序列测定正确），为之后的临床样品检测提供阳性对照，本发明需优先制备犬细小病毒三个不同基因型的野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c阳性标准样品，以及疫苗株CPV-int、CPV-pfu的阳性标准样品。标准样品的制备步骤如下：取经过测序确定基因型为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c的野毒株，购买硕腾动物保健品有限公司的四联活疫苗-卫佳®伍，其中含CPV-2弱毒活疫苗株NL-35-D株，命名为CPV-pfu；购买英特威国际有限公司的宠必威®优免康，其中含CPV-2弱毒活疫苗株154株，命名为CPV-int；分别提取上述野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，疫苗株CPV-int、CPV-pfu的核酸，并进行PCR扩增，扩增引物均为：CPV-1270F:5’-TGGAAATCACAGCAAA CTC-3’(SEQID NO：7),CPV-1270R:5’-AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC-3’(SEQ ID NO：8)。分别回收纯化扩增的产物，分别100倍稀释后作为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-int、CPV-pfu的阳性对照样品。
3）阳性标准样品的双色荧光PCR
分别以上述获得的5种阳性标准样品为DNA模板，分别进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；
PCR反应体系：
ddH2O 2.8μl
Premix Ex-Taq 5.0μl
1μM引物F1 0.2μl
10μM 引物R1 0.2μl
10μM 探针P1 0.2μl
1μM引物F2 0.2μl
10μM引物R2 0.2μl
10μM 探针P2 0.2μl
DNA模板 1.0μl
总体积 10μl。
PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环55次。
熔解曲线分析程序如下：
95℃变性3min；37℃退火3min；45℃到75℃以0.1℃/s的速率，5次/℃连续采集FAM和HEX荧光信号，进行熔解曲线分析。
4）阳性标准样品熔解曲线分析结果分析
PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。犬细小病毒三种不同基因型野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，及疫苗株CPV-int、CPV-pfu标准样品熔解曲线分析结果如图1所示。
图1C为HEX荧光通道的分析结果（即引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果），从中可以看出，疫苗CPV-pfu熔解温度较高为57.70±0.08℃，CPV-int熔解温度较低为53.1±0.06℃，而3种野毒株（CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c）的熔解温度最低且几乎重叠在一起，均为52.43±0.13℃；且3种野毒株熔解峰基部的开口比CPV-int的窄（窄4±0.5℃），根据现有信息（Kylie Hewson，Amir H. Noormohammadi et al. Rapid detection and non-subjectivecharacterisation of infectious bronchitis virus isolates using high-resolution melt curve analysis and a mathematical model. Arch Virol (2009)154:649–660），也可将3种野毒株的熔解峰称为尖锐峰（Sharp Peak），相对比，CPV-int的熔解峰可被称为宽峰（Broad Peak）。
图1C的结果说明，引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果可以将疫苗株CPV-pfu、CPV-int和野毒株区分开，而不能将3种野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c作进一步的区分。
图1B为FAM荧光通道分析结果（即引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果），从中可以看出，CPV-2a熔解温度较高为61.38±0.08℃（但疫苗株CPV-int的熔解温度与其非常接近，难以区分），CPV-2c熔解温度最低为51.92±0.11℃，CPV-2b熔解温度位于两者之间为55.15±0.37℃（但疫苗株CPV-pfu的熔解温度与其非常接近，难以区分）。
图1B的结果说明，引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果可以将CPV-2a或CPV-int、CPV-2b或CPV-pfu、CPV-2c区分开，而不能将CPV-2a和CPV-int作进一步的区分，也不能将CPV-2b和CPV-pfu作进一步的区分。
图1A为图1B和图1C荧光曲线的叠加图。
结合上述图1C、图1B和图1A中的结果，可获知：
1）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若熔解温度为57.70±0.08℃，则为犬细小病毒疫苗株CPV-pfu；
2）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若熔解温度为53.1±0.06℃，则为犬细小病毒疫苗株CPV-int，且CPV-int熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-2a的基部开口宽（宽4±0.5℃），为了更好地描述二者峰型的差异，根据现有信息，可将野毒株CPV-2a的熔解峰称为尖锐峰（Sharp Peak），相对比，CPV-int的熔解峰可被称为宽峰（Broad Peak）。
3）在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，若熔解温度为51.92±0.11℃，则为犬细小病毒野毒株CPV-2c；
4）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中的熔解温度为52.43±0.13℃，且在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中的熔解温度为55.15±0.37℃，则为犬细小病毒野毒株CPV-2b；
5）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中的熔解温度为52.43±0.13℃，且熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-int的基部开口窄（窄4±0.5℃）；同时在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中的熔解温度为61.38±0.08℃，则为犬细小病毒野毒株CPV-2a。
上述该结论已通过测序方法得到证实。
实施例3 特异性实验
下面对本发明建立的检测方法作特异性检测。
分别提取其他常见犬腹泻病毒核酸，如提取犬瘟热（Canine distemper virμs,CDV）、犬腺病毒-2（Canine adenovirμs type 2，CAV-2）、犬冠状病毒（Caninecoronavirus，CCV）、犬轮状病毒（Canine rotavirus，CRV）和犬副流感病毒（Canineparainflμenza virμs，CPIV），将CDV、CCV、CRV和CPIV的RNA反转录为cDNA，以上面病毒的cDNA、CAV-2的核酸及水分别作为PCR模板，以上述实施例2中的PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与犬细小病毒野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗株CPV-int、CPV-pfu的标准样品进行对比分析，熔解曲线峰型化图如图2所示。
从图2A~C中可以看出，本发明检测方法只能特异性扩增出犬细小病毒三种不同基因型野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c及疫苗株CPV-int、CPV-pfu的熔解峰，而对其它犬腹泻常见病毒，如CDV、CAV-2、CCV、CRV和CPIV都没有扩增出特异熔解峰。表明本发明引物组F1/R1、F2/R2及探针P1、P2具有很好的特异性，可以用于犬细小病毒疫苗株及野毒株的荧光检测。
实施例4 灵敏度实验
下面对本发明建立的检测方法作灵敏度检测。
将实施例2中标准样品CPV-2a克隆至PMD18T-Vector中，形成阳性质粒p-2a，对p-2a做核酸检测，换算质粒数，做10倍梯度稀释，形成1.29x109、1.29x108、1.29x107、1.29x106、1.29x105、1.29x104、1.29x103、1.29x102、1.29x101、1.29x100 copies/μl共10个梯度，按上述实施例2中的荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，扩增曲线图和熔解曲线峰型化图如图3所示。
图3 为CPV-2a的双色荧光检测方法灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为CPV-2a的FAM和HEX双通道同时检测的扩增曲线图，即C和D图中曲线的叠加图；B为CPV-2a的 FAM和HEX双通道同时检测的熔解曲线图，即E和F图中曲线的叠加图；C和D分别为FAM单通道和HEX单通道检测的扩增曲线图；E和F分别为FAM单通道和HEX单通道检测的熔解曲线图；
从图3中可以明显看出，本发明检测方法随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，当质粒浓度降低至1.29 copies/μl，FAM通道和HEX通道还可以检测到相应明显的荧光信号。本发明方法灵敏度较高。
实施例5 临床样品荧光PCR扩增及熔解曲线分析
1）从样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。
2）以提取的病毒核酸为模板，方法同上述实施例2中荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中所述的阳性标准品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-int、CPV-pfu作为阳性对照。
3）临床样品熔解曲线分析结果分析。
荧光PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。本发明检测了33份临床样品，熔解曲线分析结果如图4所示。
从图4所示的犬细小病毒临床样品检测峰型化熔解曲线图上可以看出，所检测的33份临床样品在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果（即HEX荧光通道的分析结果）中（见图4A和C），以野毒株CPV-2a、疫苗株CPV-int、疫苗株CPV-pfu阳性标准样品作为对照，33份样品的熔解峰和阳性对照CPV-2a熔解峰∆Tm值的绝对值均小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口相对阳性CPV-int熔解峰的基部开口窄（窄4±0.5℃），说明33份临床样品均为野毒株。
另外，在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果（即FAM荧光通道的分析结果）中（见图4A和B），以犬细小病毒CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c阳性标准样品熔解曲线作为对照时，其中20份样本只有1个熔解峰，且与CPV-2a阳性标准品熔解峰的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，说明这20份样本中只含有CPV-2a型；其中9份样本只有1个熔解峰，且与CPV-2b阳性标准品熔解峰的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，说明这9份样本中只含CPV-2b型；其中3份样本只有1个熔解峰，且与CPV-2c阳性标准品熔解峰的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，说明这3份样本中只含CPV-2c型；其中1份样品有2个熔解峰，且分别与CPV-2a、CPV-2b阳性标准品熔解峰的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，说明这1份（编号为JS11）样本中含有CPV-2a型和CPV-2b型。
实施例6一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR方法
1）从样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。
2）以提取的病毒核酸为模板，分别进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中所述的阳性标准品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-int、CPV-pfu作为阳性对照。
PCR反应体系：
ddH2O 2.8μl
Premix Ex-Taq 5.0μl
1μM引物F1 0.2μl
10μM 引物R1 0.2μl
10μM 探针P1 0.2μl
1μM引物F2 0.2μl
10μM引物R2 0.2μl
10μM 探针P2 0.2μl
DNA模板 1.0μl
总体积 10μl。
PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环55次。
熔解曲线分析程序如下：
95℃变性3min；37℃退火3min；45℃到75℃以0.1℃/s的速率，5次/℃连续采集FAM和HEX荧光信号，进行熔解曲线分析。
3）样品熔解曲线分析结果分析
1）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-pfu熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-pfu；
2）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-int熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-2a峰型的基部开口宽（宽4±0.5℃），则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-int，
3）在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2c；
4）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2b熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2b；
5）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-int的基部开口窄（窄4±0.5℃）；同时在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2a熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2a。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引物、探针及方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tatagcacat caagatacag gaaga 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccaattgga tctgttgg 18
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctatcatct tcctgtaaca aatgatag 28
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaaatcac agcaaactc 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaaagccat gtttccgt 18
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgaccgtaaa taatatggat aaaactgcgg tcg 33
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggaaatcac agcaaactc 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtcttggtt ttaagtcagt atc 23

Claims (10)

1.一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：
F1：5'-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'（SEQ ID NO：1），
R1：5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'（SEQ ID NO：2），
F2：5'-TGGAAATCACAGCAAACTC-3'（SEQ ID NO：4），
R2：5'-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3'（SEQ ID NO：5）。
2.一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：
探针P1：5'- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3'（SEQ ID NO：3），
探针P2：5'- CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3'（SEQ ID NO：6）。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针P1和P2的5’端标记的荧光基团不相同。
4.一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有权利要求2或3所述的探针。
6.一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物对F1、R1、F2和R2，及权利要求2或3所述探针P1和探针P2进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）中的荧光PCR扩增反应体系为：
ddH2O 2.8μl
Premix Ex-Taq 5.0μl
1μM引物F1 0.2μl
10μM 引物R1 0.2μl
10μM 探针P1 0.2μl
1μM引物F2 0.2μl
10μM引物R2 0.2μl
10μM 探针P2 0.2μl
DNA模板 1.0μl
总体积 10μl。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环55次。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3）中的熔解曲线分析程序为：95℃变性3min；37℃退火3min；45℃到75℃以0.1℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P1和P2的荧光信号，进行熔解曲线分析。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述熔解曲线分析的具体分析过程为：
1）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-pfu熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-pfu；
2）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-int熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-2a峰型的基部开口宽，则判定样品中含有犬细小病毒疫苗株CPV-int；
3）在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2c；
4）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2b熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2b；
5）在引物F2、R2和探针P2的荧光检测结果中，若样品熔解温度与阳性对照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，且样品熔解峰基部的开口比阳性野毒株CPV-int的基部开口窄；同时在引物F1、R1和探针P1的荧光检测结果中，该样品熔解温度与阳性对照CPV-2a熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃，则判定该样品中含有犬细小病毒野毒株CPV-2a。
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