CN102181532B - 用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明是用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针及方法，其用于9种临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原的检测。本发明基于MASA液相芯片技术对9种临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原进行检测，主要根据基因库中能够检索到的9种目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计简并引物和特异性探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex100系统检测，确定样本中所含病原体的种类。本发明提供的对这9种临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原的检测及早期诊断，对于采取正确的治疗方案和及时的应对措施以防止疾病的传播至关重要。本发明具有检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性好和利于推广应用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种涵盖9种临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原的检测，尤其是一种借助液相芯片对9种临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原进行检测，属于医学监测技术领域。
背景技术
乙型脑炎病毒（JEV）、登格热病毒I型（DEN -1）、登格热病毒II型（DEN -2）、登格热病毒III型（DEN -3）、登格热病毒IV型（DEN -4）、肠道病毒EV71型、腺病毒（ADV）、单纯疱疹病毒I型（Herpes Virus 1）和单纯疱疹病毒II型（Herpes Virus 2）是我国临床常见的9种人类重大传染病病原。其中乙型脑炎病毒，登格热病I-IV型和肠道病毒EV71型为法定乙类传染病。这9种病原体主要通过接触或虫媒传播，易引起较大规模的流行，造成突发公共卫生事件，危机人民的健康和社会的稳定。对这些病原的早期诊断对于采取正确的治疗方案和及时的应对措施以防止疾病的传播至关重要。
目前临床用于病毒检测的常规方法主要有：病原体的培养和分离，免疫学检测和核酸PCR检测。病原体培养和分离检测方法是一种传统的检测技术，检测结果准确可靠，但是敏感性较低，检测周期较长，不利于病毒感染早期的诊断；免疫学检测敏感性和特异性较强，但是检测需要材料较多且测定的结果与抗体来源及亲和力有关；核酸PCR检测方法是目前灵敏度较高的一种检测方法，较病原体分离方法的检出率高，但是当PCR的靶序列发生突变则容易造成假阴性结果。
MASA液相芯片（Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪）技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过Luminex检测仪时，该检测仪上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病病原体的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针，还提供一种利用上述引物和探针检测临床常见呼吸道传染病病原的方法。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的是一种基于MASA液相芯片对临床常见的虫媒或接触传播的传染病病原进行检测的引物，该引物为特异性检测引物，是根据基因库中能够检索到的目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：
（1）用于检测乙型脑炎病毒的引物F、引物R的DNA序列：
JEV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG
JEV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC
（2）用于检测登格热病毒I型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 1-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG
DEN 1-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
（3）用于检测登格热病毒II型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 2-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG
DEN 2-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
（4）用于检测登格热病毒III型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 3-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC
DEN 3-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
（5）用于检测登格热病毒IV型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 4-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC
DEN 4-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG
（6）用于检测肠道病毒EV71的引物F、引物R的DNA序列：
EV71-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC
EV71-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT
（7）用于检测腺病毒的引物F、引物R的DNA序列：
ADV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC
ADV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
（8）用于检测单纯疱疹病毒I型和II型的引物F、引物R的DNA序列相同，序列为：
Herpes Virus-F：
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC
Herpes Virus-R：
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT。
本发明提供的用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的探针有9种，它们分别与上述的8种引物对应设计制成，所述探针为特异性检测探针，其DNA序列为：
（1）用于检测乙型脑炎病毒的JEV-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT
（2）用于检测登格热病毒I型的DEN 1-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
（3）用于检测登格热病毒II型的DEN 2-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
（4）用于检测登格热病毒III型的DEN 3-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12TCACGCGAGAACCAGTGGT
（5）用于检测登格热病毒IV型的DEN 4-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CTCTGCCAAACCAGTGATCT
（6）用于检测肠道病毒EV71的EV71-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
（7）用于检测腺病毒的ADV-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12GCRCGGGCRAACTGCACCA
（8）用于检测单纯疱疹病毒I型的Herpes Virus 1-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
（9）用于检测单纯疱疹病毒II型的Herpes Virus 2-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。
本发明提供的用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的方法，是采用上述的引物和探针，通过两轮PCR反应，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
所述方法可以按下列步骤顺序进行：
a.分别提取样本中总DNA和RNA。
b. 第一轮PCR反应：
先以步骤a中提取的样本总DNA为模版，分别用腺病毒特异性PCR引物ADV-F和ADV-R、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型通用特异性PCR引物Herpes Virus-F和Herpes Virus-R进行第一轮PCR；
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、Taq DNA聚合酶 0.5uL、DNA模板 0.5uL和超纯水20.5uL；
然后使用Biometra T personal PCR仪进行第一轮PCR反应，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
c. 第一轮RT-PCR反应：
以步骤a中提取的样本总RNA为模版，进行一步法RT-PCR，所用引物分别为乙型脑炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格热病毒I型正向和反向引物DEN 1-F和DEN 1-R、登格热病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格热病毒III型正向和反向引物DEN 3-F和DEN 3-R、登格热病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F和DEN 4-R、肠道病毒EV71型正向和反向引物EV71-F和EV71-R；
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、酶1uL、每个反应中加入RNA酶抑制剂0.5u L、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、RNA模板1uL，超纯水21uL；
然后将PCR管放入PCR仪中进行第一轮RT-PCR反应，得到的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
d. 第二轮PCR反应：
以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR；
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液 5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、Taq DNA聚合酶 1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
然后将PCR管放入PCR仪中进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。
e. 杂交：
分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵；
然后将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
f. 检测：
用Luminex100仪器分别读取经步骤e杂交后的9种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；然后根据荧光检测值旁定样本中是否含探针对应的病毒种类。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第一轮PCR反应时，其反应条件建议为： b1.94℃，5分钟；b2.94℃，30秒；b3.57℃，30秒；b4.72℃，30秒；b5.重复29次步骤b2～b4；b6.72℃，10分钟；b7.降温至4℃。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第一轮RT-PCR反应，其条件建议为：
c1.50℃，30分钟； c2.94℃，15分钟；c3.94℃，30秒；c4.50℃，30秒；c5.72℃，30秒；c6.重复29次步骤c3～c5；c7.72℃，10分钟；c8.降温至4℃。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第二轮PCR反应时，其条件建议为：
d1.94℃，5分钟；d2. 94℃，30秒；d3. 60℃，30秒；d4. 72℃，30秒；d5.重复29次步骤 d2～d4 ；d6. 72℃，10分钟；d7.降温至4℃。
第二轮PCR反应使用的通用引物（生物素修饰的通用引物）的序列为：
Universal-F： TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R： biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。
本发明可以采用以下方法进行杂交：杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL； 96℃变性5min后，55℃杂交15min；加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min。
所述方法包括PCR产物的获得及与探针的杂交，检测结果的判定步骤。其中：
所述PCR产物的获得及与探针的杂交：用于液相芯片检测的PCR产物通过两轮PCR反应获得。第一轮反应用病毒特异性检测引物分别进行PCR和RT-PCR扩增目标基因片段。腺病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型为DNA病毒，第一轮扩增以样本总DNA为模版进行PCR。其他6种病原为RNA病毒，第一轮扩增以样本总RNA为模版进行RT-PCR。第二轮反应利用生物素标记的通用引物以第一轮反应产物为模板进行PCR，使所获得PCR产物带有生物素标记，同时第二轮PCR反应具有将第一轮PCR信号放大的作用，增加检测的灵敏度。获得的PCR产物与偶联在不同微球上的病毒特异性探针杂交。
所述检测结果的判定：杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，使之带有荧光。通过Luminex检测仪读取微球上的荧光数值对检测结果进行判定。
本发明可以采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的病毒种类：对登格热病毒I型、登格热病毒II型、登格热病毒III型、登格热病毒IV型、肠道病毒EV71型、腺病毒、单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒II型的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞200，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜100，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当100≤荧光检测值<200时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
本发明可以采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的病毒种类：对乙型脑炎病毒病原体的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞1000，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜500，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当500≤荧光检测值<1000时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
本发明设计了针对9种临床常见虫媒或接触传播的传染病病原的特异性检测引物和探针，使用9种荧光编码微球，利用液相芯片技术对标本进行检测分析。发现基于液相芯片技术研制的针对9种临床常见虫媒或接触传播的传染病病原的特异性检测引物和探针具有特异性高、灵敏度高的特点，对所有9种病原体都可进行明确的区分。
本发明提供的用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的方法，不仅检测速度快，完成一次检测仅需3.5小时，一次检测可以进行多个样本的同时检测，且操作简单，检测费用低，适合大范围推广应用。在对临床常见虫媒或接触传播的传染病病原进行快速检测和进行早期诊断方面具有重要的应用价值。
总之，本发明具有速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合对9种临床常见虫媒或接触传播的传染病病原的检测及早期诊断；因而能为这些常见虫媒或接触传播传染病病原的早期诊断和治疗及防止这些常见呼吸道传染病病原的传播作出重要贡献。
具体实施方式
本发明基于MASA液相芯片技术对病原进行检测。运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在美国NCBI与日本DDBJ基因库中能够检索到的9种目标病毒的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计简并引物和特异性探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实例１：
已知样品1中含有乙型脑炎病毒（JEV），按本发明的方法进行检测，具体步骤如下：
a.分别提取样本中总DNA和RNA；
b.以步骤a中提取的样本总DNA为模版，分别用腺病毒特异性PCR引物ADV-F和ADV-R、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型通用特异性PCR引物Herpes Virus-F和Herpes Virus-R进行第一轮PCR。各引物序列如下：
ADV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC
ADV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
Herpes Virus-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC
Herpes Virus-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT。
c.在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、Taq DNA聚合酶 0.5uL、DNA模板 0.5uL和超纯水20.5uL。
使用Biometra T personal PCR仪，PCR过程条件为：c1.94℃，5分钟；c2. 94℃，30秒；c3. 57℃，30秒； c4. 72℃，30秒； c5.重复29次步骤c2～c4； c6. 72℃，10分钟；c7.降温至4℃；
所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
d.以步骤a中提取的样本总RNA为模版，进行一步法RT-PCR。所用引物分别为乙型脑炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格热病毒I型正向和反向引物DEN 1-F和DEN 1-R、登格热病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格热病毒III型正向和反向引物DEN 3-F和DEN 3-R、登格热病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F和DEN 4-R、肠道病毒EV71型正向和反向引物EV71-F和EV71-R。各引物序列如下：
JEV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG
JEV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC
DEN 1-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG
DEN 1-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
DEN 2-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG
DEN 2-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
DEN 3-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC
DEN 3-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
DEN 4-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC
DEN 4-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG
EV71-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC
EV71-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT。
e.在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、酶1uL、RNA酶抑制剂0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、RNA模板1uL，超纯水21uL。
使用Biometra T personal PCR仪，PCR过程条件为：e1.50℃，30分钟；e2. 94℃，15分钟；e3. 94℃，30秒； e4. 50℃，30秒； e5. 72℃，30秒； e6.重复29次步骤e3～e5；e7. 72℃，10分钟；e8.降温至4℃；
所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
f. 以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液 5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、Taq DNA聚合酶 1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
g.将PCR管放入PCR仪，PCR反应过程条件为：g1.94℃，5分钟； g2. 94℃，30秒；g3. 60℃，30秒； g4. 72℃，30秒； g5. 重复29次步骤 g2～g4； g6. 72℃，10分钟；g7.降温至4℃；
得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。
h.分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液(1.5×TMAC，氯化四甲铵)稀释，使得每微升含有100个微球,各探针序列如下：
JEV-probe：NH2-(CH2)12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT
DEN 1-probe：NH2-(CH2)12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
DEN 2-probe：NH2-(CH2)12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
DEN 3-probe：NH2-(CH2)12TCACGCGAGAACCAGTGGT
DEN 4-probe：NH2-(CH2)12CTCTGCCAAACCAGTGATCT
EV71-probe：NH2-(CH2)12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
ADV-probe：NH2-(CH2)12GCRCGGGCRAACTGCACCA
Herpes Virus 1-probe: NH2-(CH2)12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
Herpes Virus 2-probe: NH2-(CH2)12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。
i.将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL。96℃变性5min后，55℃杂交15min, 加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
j.用Luminex100仪器分别读取经步骤i杂交后的9种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值。
k.当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为1844, 确认样品含有乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为15, 确认样品不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为19, 确认样品不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为23, 确认样品不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为10, 确认样品不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为18, 确认样品不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为54, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为93, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为98, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例2：
已知样品中含有登格热病毒I型（DEN -1），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为414, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为915, 确认样品中含有登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为44, 确认样品不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为9, 确认样品不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为11, 确认样品不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为31, 确认样品不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为8, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为13, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为29, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例3：
已知样品中含有登格热病毒II型（DEN -2），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为479, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为15, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为744, 确认样品中含有登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为19, 确认样品不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为1, 确认样品不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为33, 确认样品不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为23, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为41, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为14, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例4：
已知样品中含有登格热病毒III型（DEN -3），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为212, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为22, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为19, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为619, 确认样品中含有登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为33, 确认样品不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为6, 确认样品不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为11, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为20, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为32, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例5：
已知样品中含有登格热病毒IV型（DEN -4），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为465, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为124, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为44, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为19, 确认样品中不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为933, 确认样品中含有登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为91, 确认样品不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为31, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为55, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为42, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例6：
已知样品中含有肠道病毒EV71型，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为324, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为24, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为74, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为19, 确认样品中不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为90, 确认样品中不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为1901, 确认样品中含有肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为3, 确认样品不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为12, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为40, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例7：
已知样品中含有腺病毒（ADV），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为257, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为34, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为45, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为76, 确认样品中不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为23, 确认样品中不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为8, 确认样品中不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为1090, 确认样品中含有腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为51, 确认样品不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为47, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例8：
已知样品中含有单纯疱疹病毒I型（Herpes Virus 1），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为260, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为4, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为38, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为82, 确认样品中不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为46, 确认样品中不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为38, 确认样品中不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为10, 确认样品中不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为951, 确认样品中含有单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为36, 确认样品不含单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例9：
已知样品中含有单纯疱疹病毒II型（Herpes Virus 2），按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例１相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为乙型脑炎病毒引物JEV-F及JEV-R，步骤h的探针为乙型脑炎病毒探针JEV-probe时，荧光检测值为109, 确认样品中不含乙型脑炎病毒；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒I型引物DEN 1-F及DEN 1-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 1-probe时，荧光检测值为26, 确认样品中不含登格热病毒I型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒II型引物DEN 2-F及DEN 2-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 2-probe时，荧光检测值为61, 确认样品中不含登格热病毒II型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒III型引物DEN 3-F及DEN 3-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 3-probe时，荧光检测值为13, 确认样品中不含登格热病毒III型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为登格热病毒IV型引物DEN 4-F及DEN 4-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针DEN 4-probe时，荧光检测值为53, 确认样品中不含登格热病毒IV型；
当步骤d第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为肠道病毒EV71引物EV71-F及EV71-R，步骤g的探针为登格热病毒I型探针EV71-probe时，荧光检测值为38, 确认样品中不含肠道病毒EV71；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步骤g的探针为流感病毒B型探针ADV-probe时，荧光检测值为10, 确认样品中不含腺病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒I型探针Herpes Virus 1-probe时，荧光检测值为51, 确认样品中不含单纯疱疹病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为单纯疱疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步骤g的探针为单纯疱疹病毒II型探针Herpes Virus 2-probe时，荧光检测值为2096, 确认样品中含有单纯疱疹病毒II型；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
上述实施例中，因为有些样品中可能含有一种以上的病原体，因此，即使已检测到某一种病原体，还需要检测其是否还含有其它种类的病原体。
上述实施例中，所采用的试剂盒由MASA液相芯片制成。
序列表
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120>用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针及方法
<140>
<141>
<160>1
<170>
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测乙型脑炎病毒的引物JEV-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>1
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>用于检测乙型脑炎病毒的引物JEV-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>2
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒I型的引物DEN 1-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>3
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒I型的引物DEN 1-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>4
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒II型的引物DEN 2-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>5
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒II型的引物DEN 2-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>6
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒III型的引物DEN 3-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>7
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒III型的引物DEN 3-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>8
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
<210>9
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒IV型的引物DEN 4-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>9
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒IV型的引物DEN 4-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>10
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测肠道病毒EV71的引物EV71-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>11
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测肠道病毒EV71的引物EV71-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>12
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测腺病毒的引物ADV-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>13
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测腺病毒的引物ADV-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>14
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>用于检测单纯疱疹病毒I型和II型的引物Herpes Virus-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>15
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测单纯疱疹病毒I型和II型的引物Herpes Virus-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>16
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>用于检测乙型脑炎病毒的JEV-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>17
NH2-(CH2)12CCAGCTATGTCACGGAGGAT
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒I型的DEN 1-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>18
NH2-(CH2)12GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒II型的DEN 2-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>19
NH2-(CH2)12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒III型的DEN 3-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>20
NH2-(CH2)12TCACGCGAGAACCAGTGGT
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>用于检测登格热病毒IV型的DEN 4-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>21
NH2-(CH2)12CTCTGCCAAACCAGTGATCT
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>用于检测肠道病毒EV71的EV71-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>22
NH2-(CH2)12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>用于检测腺病毒的ADV-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>23
NH2-(CH2)12GCRCGGGCRAACTGCACCA
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测单纯疱疹病毒I型的Herpes Virus 1-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>24
NH2-(CH2)12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测单纯疱疹病毒II型的Herpes Virus 2-probe探针
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>25
NH2-(CH2)12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>第二轮PCR反应使用的通用引物Universal-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>26
TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>第二轮PCR反应使用的通用引物Universal-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>27
biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG
Claims (10)
1.一种用于检测虫媒或接触传播病原的液相芯片，其特征是该液相芯片用于检测临床常见的由虫媒或接触传播的乙型脑炎病毒，其由以下探针制成，所述探针的DNA序列分别为：
（1）用于检测乙型脑炎病毒的JEV-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT
（2）用于检测登格热病毒I型的DEN 1-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
（3）用于检测登格热病毒II型的DEN 2-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
（4）用于检测登格热病毒III型的DEN 3-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12TCACGCGAGAACCAGTGGT
（5）用于检测登格热病毒IV型的DEN 4-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CTCTGCCAAACCAGTGATCT
（6）用于检测肠道病毒EV71的EV71-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
（7）用于检测腺病毒的ADV-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12GCRCGGGCRAACTGCACCA
（8）用于检测单纯疱疹病毒I型的Herpes Virus 1-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
（9）用于检测单纯疱疹病毒II型的Herpes Virus 2-probe探针的DNA序列：
NH2-(CH2)12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。
2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征是所述的探针分别由以下引物F、引物R的DNA序列对应设计而成：
（1）用于检测乙型脑炎病毒的引物F、引物R的DNA序列：
JEV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG
JEV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC
（2）用于检测登格热病毒I型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 1-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG
DEN 1-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
（3）用于检测登格热病毒II型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 2-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG
DEN 2-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
（4）用于检测登格热病毒III型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 3-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC
DEN 3-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
（5）用于检测登格热病毒IV型的引物F、引物R的DNA序列：
DEN 4-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC
DEN 4-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG
（6）用于检测肠道病毒EV71的引物F、引物R的DNA序列：
EV71-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC
EV71-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT
（7）用于检测腺病毒的引物F、引物R的DNA序列：
ADV-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC
ADV-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
（8）用于检测单纯疱疹病毒I型和II型的引物F、引物R的DNA序列相同，序列为：
Herpes Virus-F：
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC
Herpes Virus-R：
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT。
3.根据权利要求1或2所述的液相芯片，其特征是所述的探针或所述的引物，通过两轮PCR反应，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
4.根据权利要求3所述的液相芯片，其特征在于按下列步骤顺序进行：
a.分别提取样本中总DNA和RNA；
b. 第一轮PCR反应：
先以步骤a中提取的样本总DNA为模版，分别用腺病毒特异性PCR引物ADV-F和ADV-R、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型通用特异性PCR引物Herpes Virus-F和Herpes Virus-R进行第一轮PCR，
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、Taq DNA聚合酶 0.5uL、DNA模板 0.5uL和超纯水20.5uL，
将PCR管放入PCR仪中进行第一轮PCR反应，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
c. 第一轮RT-PCR反应：
以步骤a中提取的样本总RNA为模版，进行一步法RT-PCR，所用引物分别为乙型脑炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格热病毒I型正向和反向引物DEN 1-F和DEN 1-R、登格热病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格热病毒III型正向和反向引物DEN 3-F和DEN 3-R、登格热病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F和DEN 4-R、肠道病毒EV71型正向和反向引物EV71-F和EV71-R，
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、酶1uL、RNA酶抑制剂0.5u L、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R 0.25uL、RNA模板1uL，超纯水21uL，
然后将PCR管放入PCR仪中进行PCR反应，得到的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
d. 第二轮PCR反应：
以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液 5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、Taq DNA聚合酶 1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
然后将PCR管放入PCR仪中进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液；
e. 杂交：
分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性检测探针为权利要求1所述探针，
然后将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；
f. 检测：
用Luminex100仪器分别读取经步骤e杂交后的9种微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；然后根据荧光检测值判定样品中是否含探针对应的病毒种类。
5.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于第一轮PCR反应条件为：b1.94℃，5分钟；b2.94℃，30秒；b3.57℃，30秒；b4.72℃，30秒；b5.重复29次步骤b2～b4；b6.72℃，10分钟；b7.降温至4℃。
6.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于第一轮RT-PCR反应，其反应条件为：c1.50℃，30分钟； c2.94℃，15分钟；c3.94℃，30秒；c4.50℃，30秒；c5.72℃，30秒；c6.重复29次步骤c3～c5；c7.72℃，10分钟；c8.降温至4℃。
7.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于第二轮PCR反应的条件为：d1.94℃，5分钟；d2. 94℃，30秒；d3. 60℃，30秒；d4. 72℃，30秒；d5.重复29次步骤 d2～d4 ；d6. 72℃，10分钟； d7.降温至4℃；
该PCR反应使用的通用引物序列为：
Universal-F： TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R： biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。
8.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于采用以下方法进行杂交：杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL；96℃变性5min后，55℃杂交15min；加入亲和素-藻红蛋白 55℃杂交5min。
9.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的病毒种类：对登格热病毒I型、登格热病毒II型、登格热病毒III型、登格热病毒IV型、肠道病毒EV71型、腺病毒、单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒II型的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞200，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜100，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当100≤荧光检测值<200时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
10.根据权利要求4所述的液相芯片，其特征在于采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的病毒种类：对乙型脑炎病毒病原体的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞1000，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜500，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当500≤荧光检测值<1000时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
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