CN102943128B - 一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，还涉及对悬浮芯片非诊断性检测方法中反应条件及步骤的改进。本方法中的芯片主要由带有标签微球、带有标签及生物素化的引物、链霉亲和素－藻红蛋白组成。本发明主要针对野外采集的蚊虫综合检测多种携带的病原体,如黄病毒属病毒、甲病毒属病毒等。将野外采集蚊虫样本同批次处理后高通量检测，经济、高效检测蚊传病原体，可为卫生防病部门提供简化的检测、监测步骤和程序，提高效率和减少重复工作量。
Description
技术领域
本发明提供一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，也是目前核酸检测的主流技术，PCR产物的检测判定方法为琼脂糖凝胶电泳，而琼脂糖凝胶仅可区分相差约100bp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且电泳时常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常接触对身体健康不利。
蚊媒病是一组以蚊虫为媒介而传播的疾病，包括黄热病、登革热、流行性乙型脑炎、西尼罗热等,是重要的公共健康问题。随着全球气候逐渐上升、城市化进程的加快、旅游和贸易的快速发展、生态环境的不断变化，全球蚊媒传染病发病呈上升趋势，原有疾病的流行区域不断扩展、疾病的流行频度不断增加。随着疾病谱发生变化，相应的检测和监测技术要及时跟进，以适应新的疾病监测需求。检测及监测蚊虫携带的病原体，在传染病监测中属于早期监测和发现传染病流行的方法，对于蚊媒传播疾病的有效预警和控制有重要的意义。以往的研究都是针对一种病原体检测，且有些非诊断性检测方法灵敏度不够高，不能够早期发现蚊媒传染病的流行；此外,从生物学分类角度来看，蚊媒病原体涉及微生物学与寄生虫学专业，目前蚊媒病监测也是针对单病种，不同病原体分类专业人员分别从自身专业领域进行检测，浪费人力、财力，且各专业独力实施，不利于高效、综合采取防治措施。因而，对于蚊媒病的检测应当综合考虑。
悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片（liquid array, liquid chip），是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应，从而实现对核酸的多重检测。但传统的悬浮芯片的非诊断性检测方法耗时长，步骤繁琐，在多重检测中，由于多重探针的存在，杂交温度的选择也是一个技术开发时的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性好的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。
为实现上述目的，本发明一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为：
1）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
2）PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
3）微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
4）加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列为：
进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
进一步，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
一种改进的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，包括以下步骤：1）PCR检测引物标记Tag和生物素，2）PCR扩增待检样品；3）加入相应的微球与PCR产物杂交；4）上机对杂交后的微球进行检测；其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’标记不同的Tag,引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’进行生物素标记，以便检测。
进一步，所涉及的引物序列为：
进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
进一步，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
本发明利用悬浮芯片系统作为平台，结合多重PCR技术及TAG技术可以蚊媒病毒进行特异性的识别，检测灵敏度高，特异性好，是一种高通量的蚊虫检测，为蚊媒病监测以及可能传入我国的新型蚊媒病病原体的检测以及预警提供了基础。
附图说明
图1为DNA浓度——编码微球表面的荧光强度剂量反应曲线；编码微球表面荧光强度与加入的模板量在一定的范围内成正相关，其中横坐标为多重PCR时管中加入的模板DNA的量，纵坐标代表相应编码微球表面的荧光强度。可以通过拟合的标准曲线实现对核酸的半定量分析。
图2表示用本发明建立的方法对东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔肯亚病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、版纳病毒、布尼亚病毒、裂谷热病毒进行检测的结果。其中，X轴表示检测样品，Y轴表示检测微球，Z轴表示检测荧光信号（MFI）。
具体实施方式
下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。
本发明公开了本发明提供一种蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，还涉及对悬浮芯片非诊断性检测方法中反应条件及步骤的改进。本方法中的芯片主要由带有标签微球、带有标签及生物素化的引物、链霉亲和素－藻红蛋白组成，所述方法包括：利用带有标签的上游引物和末端生物素化的下游引物多重PCR扩增出带有标签的多重目的产物，并且利用标签之间结合的特异性以及杂交温度的统一性实现杂交的多重性，杂交过程中既实现了微球对PCR产物的捕获，同时完成链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，之后以红色激光激发其球形基质上的分类荧光，依据其球形基质色彩不同确定类型；以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的PCR产物的含量。
本发明主要针对野外采集的蚊虫综合检测多种携带的病原体,如黄病毒属病毒、甲病毒属病毒等。将野外采集蚊虫样本同批次处理后高通量检测，经济、高效检测蚊传病原体，可为卫生防病部门提供简化的检测、监测步骤和程序，提高效率和减少重复工作量。
本发明提供的技术方案是一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，该方法包括：
首先根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。
本发明还提供一种改进的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，包括以下步骤：1、PCR检测引物标记Tag和生物素，2、PCR扩增待检样品；3、加入相应的微球与PCR产物杂交；4.上机对杂交后的微球进行检测。
在本发明的方法中，首先根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’标记不同的Tag,引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’进行生物素标记，以便检测。
在本发明的加入相应的微球与PCR产物杂交的过程中，包括：
1. 取带有Anti-Tag标签的微球每种各3500个加入到杂交液中，使其总量为35μl，根据微球计数结果计算相应加入量；
2. 向各管中加5～17ul 各种蚊媒病毒的PCR产物吹打混匀。
3. 再向各孔加4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，使之总体积变为80 ul。
4. 37℃下杂交一定时间。
5. 转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物再向各孔加入80ul 1× TE溶液，振荡使微球重悬。
6. 反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。
本发明与传统的PCR非诊断性检测方法相比，优点在于：
1. 通过仪器的信号放大系统和生物素亲和素的放大作用，本发明对PCR产物的检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳。
2. 通过特异性探针捕获PCR产物，检测特异性远好于用片段长度对PCR产物进行判断。
3. 对片段长度大小相似或者一样的片段，同样可以进行区分识别，从而使多重PCR引物的设计趋于灵活。
本发明与传统的悬浮芯片非诊断性检测方法相比，优点在于：
1. TAG技术的应用，均一了杂交温度，使多重病原PCR产物的杂交反应更易于在同一温度下进行，提高了检测的通量。
2. 引物合成时上游引物的5’端引入TAG序列，下游引物5’端标记生物素，此设计可以使微球与PCR产物的杂交反应和生物素与链亲和素-藻红蛋白的反应同时进行，节省了反应时间，提高了检测的效率。
本发明的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，可用于十二种蚊媒病毒：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔肯亚病毒、黄热病毒、西尼罗脑炎病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、版纳病毒、布尼亚病毒、裂谷热病毒的十二重PCR产物的检测。
1.确定上述十二种病毒的诊断片段，通过NCBI的GeneBank获取候选基因序列，利用软件设计特异检测引物，并合成相关引物序列，上游引物5’标记Tag，Tag与引物间由C9或C18连接，结果一致；下游引物5’端生物素标记，见表1，并将这些引物稀释成10μmol/L。
表1 引物序列
2.使用以上引物的多重PCR反应扩增以上十二种待检测病原。
模拟检测了共90份采集的蚊样本；检测荧光值大于等于三倍本底荧光值判为阳性，其中检测出登革3份，乙脑4份，与分离培养以及荧光定量PCR结果一致，样本全部正确识别。
捕获探针对待检测的PCR产物的捕获和检测：
i. 取带有Anti-Tag标签的微球每种各3500个加入到杂交液中，使其总量为35μl，根据微球计数结果计算相应加入量；
ii. 向各管中加5～17ul 各种蚊媒病毒的PCR产物吹打混匀。
iii. 再向各孔加4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，使之总体积变为80 ul。
iv. 37℃下杂交一定时间。
v. 转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物再向各孔加入80ul 1× TE溶液，振荡使微球重悬。
vi. 反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。
定量检测：
待检目标核酸系列稀释，一般设6个以上稀释度，同上面的PCR程序和反应条件进行PCR反应，同上面的反应进行PCR产物的检测，根据检测结果，运用Bio-Plex Version 4.0分析系统提供的方程拟合标准曲线，根据标准曲线，代入各个待测样品的MFI值，即可实现待检样品核酸的定量分析。
如登革病毒基因组反转录后10倍系列稀释，2.8fg～280ng，按确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，曲线动态范围28fg～280pg，曲线方程：FI = -25.2499 + (663.894 + 25.2499) / ((1 + (Conc / 20599.2)^-4.5687))^0.0999957，从标准曲线推算检出限为50fg/test。
结果分析：
检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（Median Fluorescence Intensity,MFI），亦即读取的这种编号的微球群（100个或以上）的每个微球信号强度的统计平均值。通过Bio-Plex悬浮芯片系统读取各孔荧光值（MFI）以及本底荧光值（Background MFI,BFI）。
结果判断：
当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
<130> 发明
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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<400> 24
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Claims (5)
1.一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，其特征在于，该方法具体为：
1）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
2）PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
3）微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
4）加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列为：
。
2.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
3.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
4.一种改进的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）PCR检测引物标记Tag和生物素，2）PCR扩增待检样品；3）加入相应的微球与PCR产物杂交；4）上机对杂交后的微球进行检测；其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’标记不同的Tag,引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’进行生物素标记，以便检测；所述非诊断性检测方法涉及的引物序列为：
。
5.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
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