CN101215600A

CN101215600A - 核酸目的序列的检测探针及检测方法

Info

Publication number: CN101215600A
Application number: CNA2007100262023A
Authority: CN
Inventors: 彭涛; 高文娟; 曾令文; 李翔
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: GUANGDONG HEXIN HEALTH TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2007-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2027-01-04
Also published as: CN101215600B

Abstract

本发明涉及一种运用免疫层析试纸检测核酸目的序列的方法。检测探针含有切刻内切酶识别位点，并且在探针的3’部分标记生物素，5’部分标记SMD(磺胺对甲氧嘧啶)。探针通过与链酶亲合素标记的磁珠孵育，形成完整的反应探针。这种完整的检测探针与核酸目的序列杂交后，切刻内切酶识别探针上的酶切位点并将探针切刻为两段，降低了其与目的序列结合的稳定性并与目的序列分离。目的序列能与另一完整的探针再次杂交并被切刻内切酶切刻。因此，在反应体系中，形成一种检测信号的放大模式。反应液在磁场作用后，带磁珠一段的探针被吸附而沉积下来，而带SMD的一段探针在溶液中呈游离状态。用免疫层析试纸可以检测溶液中带SMD的探针而达到检测目的序列的效果。该方法简单、快速、经济、适合于大规模现场筛查的检测核酸目的序列。

Description

核酸目的序列的检测探针及检测方法

技术领域：

本发明涉及分子生物学领域，具体地说是一种运用免疫层析试纸来检测核酸目的序列的方法。更具体的说，是一种涉及应用限制性切刻内切酶、修饰的寡核苷酸的探针及免疫层析试纸检测目标序列的方法。

背景技术：

荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末发展起来的，该技术将荧光素标记的探针与引物放在一起，在荧光PCR仪中反应，电脑对整个反应进行实时监测，避免了交叉污染，提高了检测敏感性，已成功用于人丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等的检测，但此类以RT-PCR为基础的检测方法需要昂贵的PCR仪来进行反应，耗时较长，一般需要1～2小时反应，不利于现场检测，局限了其应用于基层及家庭。

为了克服传统PCR的这个缺点，在近几年里，等温PCR的方法得到了发展和应用。由于等温PCR没有升降温过程，反应条件易于控制，设备简单，而且在灵敏度和特异性方面丝毫不逊色于传统的PCR，因而成为未来核酸检测的主要发展方向。目前常用的等温技术有以下几类：

①基于DNA解旋酶的等温扩增(Helicase-dependent isothermal DNAamplification，HDA)：它主要是利用DNA解旋酶将DNA双螺旋打开成单链，随后单链结合蛋白与单链DNA相结合，稳定单链DNA，然后扩增引物与单链DNA模板相结合，在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。

②链替代扩增(Strand displacement amplification，SDA)：它主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶两种酶的共同协作来完成。目前该方法已应用于细菌的检测、建立体外进化模型、核酸定量及芯片杂交等多个方面。

③核酸依赖的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)：该反应由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。反应在42℃进行，扩增速度与PCR一样快，在3小时内可扩增1000万倍。由于反应不需高温变性步骤，所以NASBA不会受到双链DNA的污染。同时由于外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，这就大大提高了NASBA反应的特异性。NASBA均一地等温扩增特性扩大了它的应用范围，技术适于检测和定量特异RNA，并且用NASBA也可以应用于扩增双链DNA。

④Qβ复制：Qβ复制是依赖于Qβ复制酶(Q-beta replicase)可以指数式放大重组DNA分子。

⑤转录介导的扩增(Transcription-mediated amplification，TMA)：TMA是利用RNA聚合酶和反转录酶在等温条件下扩增目的DNA或RNA的扩增方法。该方法用于HIV的定量检测，灵敏度高于RT-PCR和bDNA方法。TMA主要用于RNA扩增。

⑥滚环复制(Rolling circle amplification，RCA)：该方法既可以进行靶基因的扩增又可以用于信号放大扩增。该方法可直接应用于突变检测和SNP的检测。

等温扩增是核酸检测的发展趋势，但以上等温技术仍存在严重不足，如：

①这些方法的实现都需要多种酶的配合，反应体系复杂，优化反应条件不易，且在这些方法中的所用到的酶或试剂大多价格昂贵，如：HAD反应中的解旋酶、Q-β反应中的Qβ复制酶、RCA反应中的Φ29DNA聚合酶等。

②反应过程虽然简单，但反应前的模板要处理或精制，这部分的抵消了等温扩增的优势。

③RCA反应是所有等温扩增中敏感性最高的，但是它的反应过程复杂，中间有多次的更换反应体系的过程。

④等温扩增的后期检测仍然没能摆脱仪器的限制，这使得此类方法的运用受到很大的局限性，不便于在公共场所、偏远地区开展快速的筛查。

正是由于上述的不足，使得在现阶段等温扩增未能得到大规模的运用。如何简化等温扩增的反应体系，简化反应前模板的处理过程，增强特异性和敏感性，并且运用一些快速检测的技术平台，开发出快速、简便的核酸诊断产品，将是未来等温扩增进一步的发展方向。因此，迫切需要建立一种简单、快速、经济、适合于大规模现场筛查的检测核酸目的序列的方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供一种检测系统简单、使用快速方便、适于大规模现场筛查核酸目的序列的方法。

本发明的目的通过以下的方案来实现：

设计单链DNA“报告探针”，所说的“报告探针”与目标基因序列互补，形成核酸切刻内切酶识别位点，并可使核酸切刻内切酶在“报告探针”上切刻。反应后的溶液在磁场作用下，未被切刻的探针和切刻后生物素标记的一段探针被吸附下来，而特定物质标记的探针游离于溶液中，因此，可以用试纸直接检测反应液。

核酸目的序列的检测探针，其与目标基因序列互补，形成核酸切刻内切酶识别位点，并且探针上的适当位置分别修饰了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。例如：探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质；或者探针的5’端修饰了生物素，3’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质；或者探针的中间不同位置分别标记了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质，例如SMD或SM₂。

核酸目的序列的检测方法包括：在待检样品中加入如权利要求1所述的探针及切刻内切酶、探针与磁珠孵育、等温反应、探针分离、检测等步骤。可以先将探针与磁珠孵育，形成带磁珠的探针，再在待检样品中加入这样的探针及切刻内切酶进行等温反应，然后放置于磁场，分离3’端探针和5’端探针，用试纸条检测；也可以在待检样品中直接加入探针及切刻内切酶进行等温反应，反应完后，反应液再与磁珠孵育，然后放置于磁场中，分离3’端探针和5’端探针，用试纸条检测。探针与磁珠孵育的时间为30分钟。用免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在，例如用SMD免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在；或者用SM₂免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在。

所述的切刻内切酶为Nt.BstNBI或者为Nt.BstNBI的同功酶。

用本发明的方法检测核酸目的序列样品，包括按以下顺序进行的步骤：

(1)在待检样品中加入“报告探针”及切刻内切酶，“报告探针”与核酸目标基因序列杂交，形成切刻内切酶识别序列位点，该位点仅可以使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在恒定的反应温度下，短片段形成的双链不稳定，与目标基因脱离，成为3’部分“报告探针”和5’部分“报告探针”；

(2)与被切刻的“报告探针”分离的目标基因序列又与另一完整的“报告探针”杂交，重复(1)中所述反应，产生新的3’部分“报告探针”和5’部分“报告探针”；

(3)将反应液放置于磁场中，一部分“报告探针”由于交联在磁珠上，而被吸附沉积下来，另一部分标记有特定物质的“报告探针”游离于溶液中。

(4)通过用针对特定物质的免疫层析试纸检测部分“报告探针”中所标记的这种物质从而检测待检样品中是否有目标基因序列存在。

本发明同其他核酸检测方法相比，有如下优点：

①在同一个温度条件下完成反应，避免了使用价格昂贵的PCR温度循环仪，可不受条件限制而可以普遍使用；②通过设计合成特殊结构的检测探针，以便分离检测，消除背景干扰，具有很好的特异性；③不需要DNA聚合酶等复杂酶及反应体系，反应体系简单；④检测速度快，5-10分钟内完成反应，20-30分钟完成检测并得到结果；⑤可同时检测多种不同目标序列，可用于病毒的分型；⑥可同时检测DNA及RNA；⑦原理简单，操作简便，易于推广应用；⑧工艺易于实现，容易实现产业化。

本发明可应用于检测各种DNA、RNA。本发明的检测系统主要使用单位有医院、公检法部门、防疫站等国家监测部门等，特别是偏远基层单位、家庭以及机场车站等公共场所提供一种机简便、快捷的核酸筛查手段。本发明的技术方案的最显著的特点是成本低、操作简便、快速、不需仪器设备，因此，最适合于不具专业人员和设备的场所，包括：传染病的疫情监测、进出口快速检验检疫、可疑标本排查、密切接触者筛查。

附图说明：

图1为本发明技术方案的等温反应步骤流程示意图；

图2为本发明使用第一种修饰方法修饰的“报告探针”示意图；

图3为本发明使用“报告探针”第一种检测模式步骤流程示意图；

图4为本发明SMD免疫层析试纸结构示意图；

图5为本发明运用SMD免疫层析试纸检测反应步骤及检测结果示意图；

图6为本发明技术方案运用SMD免疫层析试纸及第一种检测模式检测RNA的结果；

图7为H5N1 HA基因的目标序列与探针的结合形式。

图8为本发明将SMD连接到DNA探针上的原理示意图。

图9为本发明将SM2连接到DNA探针上的原理示意图。

图10为本发明方案将具有琥珀酰胺酯结构的物质连接到DNA探针上的原理示意图。

图11为本发明方案检测目标基因的第二种模式示意图。

图12为用本发明方案检测目标基因的第二种模式检测H5N1 HA基因的结果。

以下为对上述各图的说明：

在图1中，A表示探针和目标序列互补，形成核酸切刻内切酶的识别位点，切刻内切酶可以识别该位点并在探针上进行切刻，将探针切刻成两个小片段。B表示反应过程，(1)：模板与N个拷贝的“报告探针”反应，一个拷贝的探针与目标基因序列杂交，形成核酸切刻内切酶的识别位点；余下N-1个拷贝的“报告探针”；(2)：切刻内切酶可以识别该位点并在探针上进行切刻，将探针切刻成两个小片段，在恒定的反应温度下，小片段与目标基因序列的结合不稳定，而从目标序列上脱离下来，使目标序列又形成单链。(3)：目标序列又可以重新与余下的N-1个拷贝的“报告探针”杂交，重复(1)中的反应。

在图2中，“报告探针”的一部分修饰了生物素，另一部分修饰了SMD，“报告探针”中的生物素与磁珠上的链霉亲和素结合，形成完整的“报告探针”。

对图3的A-D的图示过程说明如下：A：在反应液中加入足够量的完整的“报告探针”；B.在恒定的温度下，反应液中存在的目标序列可以与完整的“报告探针”进行杂交；C.切刻内切酶可以识别酶切位点并在探针上进行切刻，将探针切刻成游离的修饰了SMD的一段探针和连接在磁珠上的一段探针，在恒定的反应温度下，两个小片段探针与目标基因序列的结合不稳定，而从目标序列上脱离下来，使目标序列又形成单链并又可以重新与新的“报告探针”杂交，重复B-C的反应；D：反应结束后，将反应液置于磁场中，生物素修饰的一段探针随磁珠而沉积下来，上清中含有SMD修饰的一段探针。

在图4中，免疫层析试纸的结合垫上是胶体金标记的SMD的单抗，检测线上是BSA-SMD，质控线上是二抗。

在图5中，A为免疫层析试纸检测SMD结果为阳性的示意图，当反应液中含有SMD，SMD可以与胶体金标记的SMD单抗结合，封闭了其与检测线上的BSA-SMD的结合位点，使检测线上不出现红色条带；结合了SMD的胶体金标记的SMD单抗在质控线上结合二抗，使质控线上出现红色条带。B为免疫层析试纸检测SMD阴性的示意图，当反应液中不含有SMD，胶体金标记的SMD单抗可以与检测线上的BSA-SMD结合，使检测线上出现红色条带；胶体金标记的SMD单抗在质控线上结合二抗，使质控线上也出现红色条带。

在图6中，1，2，3号试纸分别为检测RNA模板浓度为2.5×10¹²、6.25×10¹¹、7.8×10¹⁰拷贝的检测结果，4号为用水检测的结果，5号为用其他无关的RNA做目标序列检测的结果。

图7所示为H5N1 HA基因的目标基因序列与探针的结合形式。所检测的目标序列选用H5N1 HA基因的一段序列，报告探针序列为5’-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3’

图8为本发明将SMD连接到DNA探针上的原理示意图。先对DNA探针上5’端磷酸化后加入琥珀酰胺酯对其进行酯化，形成琥珀酰胺酯的结构，然后可以和SMD的氨基进行反应。

图9为本发明将SM2连接到DNA探针上的原理示意图。先对DNA探针上5’端磷酸化后加入琥珀酰胺酯对其进行酯化，形成琥珀酰胺酯的结构，然后可以和SM2的氨基进行反应。

图10为将具有琥珀酰胺酯结构的物质连接到DNA探针上的原理示意图。

图11为本发明方案检测目标基因的第二种模式示意图。A：在待检目标序列中加入标记了生物素和特定物质的探针以及切刻内切酶。B：在恒定的温度下，探针和反应液中待检目标序列进行杂交，切刻内切酶识别切刻位点，并将探针切刻为标记了生物素的一段探针及标记了特定物质的一段探针。在恒定的反应温度下，两个小片段探针与目标基因序列的结合不稳定，而从目标序列上脱离下来，使目标序列又形成单链并又可以重新与新的“报告探针”杂交，重复A-B的反应；C：反应结束后，将反应液与磁珠孵育30min后置于磁场中，生物素修饰的一段探针随磁珠而沉积下来，上清中含有特定物质修饰的一段探针，可以直接用检测这种特定物质的试纸来检测反应液从而达到检测目标基因序列的目的。

图12为用本发明方案检测目标基因的第二种模式检测H5N1 HA基因的结果。1号试纸为检测RNA模板的检测结果，2号为用水检测的结果。

具体实施方式：

以下通过应用本发明方案检测H5N1对本发明的具体实施细节作进一步的说明。

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起禽类(家禽和野禽)感染的一种烈性传染病。该病是世界动物卫生组织规定的A类传染病，我国也列为一类动物疾病。禽流感不但对养禽业造成巨大的损失，也能直接感染人并且致人死亡。

禽流感病毒传染性高，变异性强，流行性快，危害大。据报道，截至2006年5月12日，世界卫生组织公布2003年至2006年期间，仅我国就有18例禽流感病例，死亡数达12例，仅2006年禽流感病例数就达10例，死亡数为7例。

禽流感病毒为负链单股RNA病毒，基因组是分节段的，由8个片段组成，共编码8种结构蛋自和2种非结构蛋白。每个RNA片段都由核蛋白包被形成RNP复合体。我们的检测是针对其中HA基因的一段保守序列进行的，因而可以达到检测的要求。

我们针对H5N1病毒基因的HA基因中一段保守区域相对应的序列进行检测。

实施例一：本发明的技术方案针对H5N1 RNA的检测

目的在于演示本发明方案对RNA目标基因检测的可行性及其灵敏度和特异性。

本方法检测过程如图3所示，“目标基因序列”是H5N1 RNA病毒HA基因的一段区域，根据该目标序列，设计单链DNA“报告探针”(RP)。在RP的3’部分标记生物素，5’部分标记SMD(磺胺对甲氧嘧啶)，并用磁珠与之交联，在55℃恒温反应条件下，RP与“目标基因序列”结合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成两段较短的片段，与目标基因结合不稳定，而与其脱离，新的探针又可以结合在目标序列上，重复上述反应，最终形成被切刻探针的拷贝数增多，即检测信号的放大。将反应液置于磁场中，标记生物素的一部分探针及未参与反应的探针由于磁珠的作用沉积下来，而被切刻的标记SMD的一段较短探针游离于溶液中，用SMD检测试纸对此溶液进行检测，以实现通过检测被切刻探针上的SMD而达到检测目标序列基因。

以下为目标基因序列与探针的结合形式：

所检测的目标序列选用H5N1 HA基因的一段序列，其序列如下：cgcaagcttGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGACGCTATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGatccggg(3’端和5’端分别含有HindIII和BamHI的酶切位点)

报告探针序列：

5’-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3’

如图7所示为目标基因序列与探针的结合形式。

以下为SMD-H5-RP-Magnabead的制备方法：

磁珠(Pierce)用同体积的PBS缓冲液洗3次，足够的SMD-H5-RP与磁珠在室温下孵育10-30分钟，孵育后溶液置于磁场中，使磁珠沉积下来，去除上清。磁珠沉积物用10μl的双蒸水重悬，已备后续反应之用。

检测步骤：

(1)在30μl反应体系中分别加入2.5×10¹²、6.25×10¹¹、7.8×10¹⁰拷贝的H5N1 HA RNA和足够的报告探针，以及3μl的10×NEB缓冲液3(NEB England Biolabs)，5个单位的N.BstNI酶(NEB EnglandBiolabs)。

(2)在微量恒温器上或恒温水浴中55℃反应20分钟。

(3)将反应液放置于磁场中1-2分钟，使磁珠全部被吸附下来，

(4)将SMD试纸插入上清溶液中，5-10分钟内读取试纸结果。

反应结果如图6所示：1，2，3号试纸分别为检测RNA模板浓度为2.5×10¹²、6.25×10¹¹、7.8×10¹⁰拷贝的检测结果，4号为用水检测的结果，5号为用其他无关的RNA做目标序列检测的结果。

实施例二：本发明方案中运用探针修饰的第一种方法标记SMD。

探针修饰的第一种方法是在探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质；如图8所示，其标记原理是先对DNA探针上5’端磷酸化后加入琥珀酰胺酯对其进行酯化，形成琥珀酰胺酯的结构，然后可以和SMD的氨基进行反应。

实施例三：本发明方案中运用探针修饰的第一种方法标记SM2。

探针修饰的第一种方法是在探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质；如图9所示，其标记原理是先对DNA探针上5’端磷酸化后加入琥珀酰胺酯对其进行酯化，形成琥珀酰胺酯的结构，然后可以和SM2的氨基进行反应。

实施例四：本发明方案中探针修饰的第二种方法。

探针的5’端修饰了生物素，3’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

实施例五：本发明方案中探针修饰的第三种方法。

探针的中间不同位置分别标记了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

实施例六：本发明方案检测目标基因的第一种检测模式。

本方法检测过程如图3所示，“目标基因序列”是和H5N1 RNA病毒HA基因的一段区域，根据该目标序列，设计单链DNA“报告探针”(RP)。RP按实施例一中的修饰方法修饰之后，即探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰SMD(磺胺对甲氧嘧啶)后，与链霉亲和素标记的磁珠孵育，形成带磁珠的探针，在下述反应条件下，RP与“目标基因序列”结合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成两段较短的片段，与目标基因结合不稳定，而与其脱离，新的探针又可以结合在目标序列上，重复上述反应，最终形成被切刻探针的拷贝数增多，即检测信号的放大。将反应液置于磁场中，被切刻的标记SMD的一段较短探针游离于溶液中，用SMD检测试纸对此溶液进行检测，以实现通过检测被切刻探针上的SMD而达到检测目标序列基因。

以下为目标基因序列与探针的结合形式：

所检测的目标序列选用H5N1 HA基因的一段序列，其序列如下：cgcaagcttGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGACGCTATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGatccggg(3’端和5’分别含有HindIII和BamHI的酶切位点)

报告探针序列：

5’-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3’

如图7所示为目标基因序列与探针的结合形式。

以下为SMD-H5-RP-Magnabead的制备方法：

磁珠(Pierce)用同体积的PBS缓冲液洗3次，足够的SMD-H5-RP与磁珠在室温下孵育30min，孵育后溶液置于磁场中，使磁珠沉积下来，去除上清。磁珠沉积物用10μl的双蒸水重悬，已备后续反应之用。

检测步骤：

(2)在微量恒温器上或恒温水浴中55℃反应20分钟。

(3)将反应液放置于磁场中1-2分钟，使磁珠全部被吸附下来，

(4)将SMD试纸插入上清溶液中，5-10分钟内读取试纸结果。

实施例七：本发明方案检测目标基因的第二种检测模式。

探针按实施例一中的修饰方法修饰之后，直接进行等温反应，反应完后，反应液与磁珠孵育30min，再放置于磁场中，分离3’端探针和5’端探针，用试纸条检测。

本方法检测过程如图11所示，“目标基因序列”是和H5N1 RNA病毒HA基因的一段区域，根据该目标序列，设计单链DNA“报告探针”(RP)。RP按实施例一中的修饰方法修饰之后，即探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰SMD(磺胺对甲氧嘧啶)后，直接进行等温检测反应，在恒温反应条件下，RP与“目标基因序列”结合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成两段较短的片段，与目标基因结合不稳定，而与其脱离，新的探针又可以结合在目标序列上，重复上述反应，最终形成被切刻探针的拷贝数增多，即检测信号的放大。反应完后，反应液与磁珠孵育30min。再将反应液置于磁场中，被切刻的标记SMD的一段较短探针游离于溶液中，用SMD检测试纸对此溶液进行检测，以实现通过检测被切刻探针上的SMD而达到检测目标序列基因。

以下为目标基因序列与探针的结合形式：

报告探针序列：

5’-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3’

如图7所示为目标基因序列与探针的结合形式。

检测步骤：

(1)在30μl反应体系中加入H5N1 HA RNA和足够的报告探针，以及3μl的10×NEB缓冲液3(NEB England Biolabs)，5个单位的N.BstNI酶(NEB England Biolabs)。

(2)在微量恒温器上或恒温水浴中55℃反应20分钟。

(3)将反应液与链霉亲和素标记的磁珠孵育30min。

(4)将反应液放置于磁场中1-2分钟，使磁珠全部被吸附下来，

(5)将SMD试纸插入上清溶液中，5-10分钟内读取试纸结果。

反应结果如图12所示：1号试纸为检测RNA模板的检测结果，2号为用水检测的结果。

实施例八：本发明技术方案针对MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的mecA基因的部分序列的检测。

以下为目标基因序列与探针的结合形式，所检测的目标序列选用MRSA mecA基因的一段序列，其序列如下：

报告探针序列：

5`-NH₂-(A) ₆-cgagtccctttttaccaataactgcatcatc-bio-3`

检测步骤：

(1)在30μl反应体系中加入MRSA mecA和足够的报告探针，以及3μl的10×NEB缓冲液3(NEB England Biolabs)，5个单位的N.BstNI酶(NEB England Biolabs)。

(2)在微量恒温器上或恒温水浴中55℃反应20分钟。

(3)将反应液与链霉亲和素标记的磁珠孵育30min。

(4)将反应液放置于磁场中1-2分钟，使磁珠全部被吸附下来，

(5)将SMD试纸插入上清溶液中，5-10分钟内读取试纸结果。

Claims

1.一种核酸目的序列的检测探针，其与目标基因序列互补，形成核酸切刻内切酶识别位点，并且探针上的适当位置分别修饰了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

2.根据权利要求1所述检测探针，其特征在于探针的3’端修饰了生物素，5’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

3.根据权利要求1所述检测探针，其特征在于探针的5’端修饰了生物素，3’端修饰了具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

4.根据权利要求1所述检测探针，其特征在于探针的中间不同位置分别标记了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基结构的小分子、多肽、蛋白质等物质。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的检测探针，其特征在于所述的小分子、多肽、蛋白质等物质可以为SMD(磺胺对甲氧嘧啶)。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的检测探针，其特征在于所述的小分子、多肽、蛋白质等物质可以为SM₂(磺胺二甲氧嘧啶)。

7.一种核酸目的序列的检测方法，包括：在待检样品中加入如权利要求1所述的探针及切刻内切酶、探针与磁珠孵育、等温反应、探针分离、检测等步骤。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于先将探针与磁珠孵育形成带磁珠的探针后，再在待检样品中加入这样的探针及切刻内切酶，再进行等温反应，然后放置于磁场，分离3’端探针和5’端探针，用试纸条检测。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于在待检样品中加入探针及切刻内切酶后，先直接进行等温反应，反应完后，反应液再与磁珠孵育，然后放置于磁场中，分离3’端探针和5’端探针，用试纸条检测。

10.根据权利要求7或8或9所述的检测方法，其特征在于探针与磁珠孵育的时间为10至30分钟。

11.根据权利要求7或8或9所述的检测方法，其特征在于用免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在。

12.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于用SMD免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在。

13.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于用SM₂免疫层析试纸检测待检样品中是否有目标基因序列存在。

14.根据权利要求7或8或9所述检测方法，其特征在于所述的切刻内切酶为Nt.BstNBI。

15.根据权利要求7或8或9所述检测方法，其特征在于所述的切刻内切酶为Nt.BstNBI的同功酶。