CN102686747A

CN102686747A - 使用探针杂交和限制性通过信号扩大而检测靶核酸的方法

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Publication number: CN102686747A
Application number: CN2010800606469A
Authority: CN
Inventors: J·纳德乌; T·赫雷尔
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2012-09-19
Also published as: WO2011063388A3; JP2013511292A; EP2504453A4; WO2011063388A2; EP2504453A2; US8916349B2; US20120322067A1

Abstract

用于检测样品中的核酸的寡核苷酸，其通过重复利用探针和探针片段而提供扩大的信号。

Description

使用探针杂交和限制性通过信号扩大而检测靶核酸的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年11月23日提交的美国临时专利申请号61/263,596的优先权日效益，其公开内容通过引用方式并入本文。

发明领域和背景

本发明涉及用于检测样品中的靶核酸序列的寡核苷酸探针和方法。更具体地，本发明涉及这样的寡核苷酸探针：仅当与靶核酸序列杂交时，才被切割。探针的直接或间接切割导致信号的产生和信号的扩大(通过探针的重复利用)。

靶核酸序列的鉴定在生物研究和医学诊断中具有重要意义。靶序列的检测可用于鉴定特异性DNA或RNA分子或对其进行分型，并用于揭示突变。

本领域存在多种能够进行靶序列的检测和/或鉴定的方法和技术。例如，多核苷酸测序方法可用于确定靶DNA或RNA分子的核苷酸序列。用于测序的方法通常包括Sanger双脱氧法，见例如，Sanger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)，或Maxam和Gilbert的方法，见例如Maxam et al,Methods in Enzymology,65:499-559(1980)。

聚合酶链式反应(PCR)也可用于检测样品中靶序列的存在。PCR利用特异性结合靶序列内的区域的寡核苷酸引物，以扩增靶核酸序列，扩增产物的产生指示着靶序列的存在。

鉴定靶核酸的另一种方法包括：使寡核苷酸探针与靶核酸序列杂交，其中杂交指示着其存在。

寡核苷酸探针通过在靶标与寡核苷酸之间碱基形成氢键而与靶核酸结合。常见的B-DNA具有常规的腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)和鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)沃森和克里克碱基配对，分别在其中形成2个和3个氢键。常规杂交技术是基于序列特异性DNA或RNA寡核苷酸探针通过沃森-克里克氢键与互补性靶核酸结合的能力。然而，也已知其它类型的核苷酸间氢键模式，其中与第一个核苷酸的沃森-克里克碱基配对中不涉及的原子可以与另一个核苷酸形成氢键。例如，胸腺嘧啶(T)能够通过与腺嘌呤之间的氢键而与AT沃森-克里克碱基对结合，从而形成T-AT碱基三元组。Hoogsteen,Acta Crystallographica 12:822(1959)首次描述了存在于T-AT和C-GC碱基三元组中的交替氢键。更近年以来，观察到了G-TA碱基三元组，其中鸟嘌呤与中间的胸腺嘧啶形成氢键，见Griffin et al.,Science,245:967-971(1989)。

能通过沃森-克里克和非沃森-克里克氢键与靶核酸结合的寡核苷酸探针与靶核酸形成特别稳定的复合物，因此，具有多种研究和诊断上的应用。

例如，寡核苷酸可用作针对于固定在过滤器或膜上或存在于组织中的靶核酸的探针，例如，描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Vols.1-3,(1989)。然而，该文献中描述的寡核苷酸探针具有结合稳定性和选择性差的局限性。

另一个实例包括溶液相检测方法。已知有数种溶液相检测方法，有时被称作匀质测定(homogeneous assay)。术语“匀质”在本领域中用于指这样的方法：不将未杂交的寡核苷酸探针从探针-靶标杂交体中分离。这些方法通常依赖于下列事实：寡核苷酸探针的构象或直接的化学环境可以影响很多荧光标记物的荧光。

Livak等人的美国专利号5,876,930公开了用于鉴定靶核酸序列的方法。该方法利用了寡核苷酸探针，所述探针包括荧光报告分子和能够猝灭报告分子的荧光的猝灭剂分子。根据该方法的寡核苷酸探针被构建为使得，当未杂交时，探针以至少一种单链构象存在：其中猝灭剂分子与报告分子足够靠近，以猝灭报告分子荧光。当与靶核酸杂交时，寡核苷酸探针也以至少一种构象存在：其中猝灭剂分子与报告分子不足以靠近使得报告分子的荧光猝灭。通过采用这些杂交和非杂交构象，探针上的报告分子和猝灭剂分子在探针杂交和非杂交时显示不同的荧光信号强度。因此，该方法能够基于报告分子、猝灭分子或二者的组合的荧光强度的变化而确定特异性靶核酸序列的存在。该方法的局限性在于不能进行信号扩大，这使得不能检测低浓度靶标。另外，该方法内在地特征在于具有高背景信号。

Tyagi等人的美国专利号5,925,517公开了用于检测核酸靶序列的单分子和双分子杂交探针。所述探针包括靶标互补序列、使探针在不存在靶序列的情况下处于封闭构象的亲和对，以及，当探针处于封闭构象时相互作用的标记物对，或者，非相互作用的标记物(对于某些单分子探针)。靶标与靶标互补序列的杂交使探针转变为开放构象。由于标记物对的减少的相互作用，或通过降低来自非相互作用的标记物的信号，该转变是可以被检出的。某些单分子探针能够区分差别仅有一个核苷酸的靶标和非靶标序列。该方法的局限性是不能进行信号扩大，这使得不能检测低浓度靶标。另外，该方法内在地特征在于具有高背景信号。

Nazarenko等人的美国专利号5,866,336描述了标记的核酸扩增寡核苷酸，其可以是线性的或发夹引物或封闭寡核苷酸。Nazarenko公开的寡核苷酸被分子能量转移对的供体和/或受体部分标记。所述部分可以是荧光团，从而供体发射的荧光能量被受体吸收。受体可以是在不同于供体部分的波长发荧光的荧光团，或者可以为非荧光暗猝灭剂。这些寡核苷酸配置为：供体部分和受体部分被掺入扩增产物中。该发明还提供了使用核酸扩增引物直接检测扩增产物的方法和试剂盒。当使用标记的线性引物时，以核酸外切酶进行的处理或者特异性温度的使用使得无需分离未掺入的引物。这种“封闭管”形式大大降低了扩增产物的遗留污染(carryover contamination)的可能性，提供了样品的高通量检测，并且可以完全自动化。

Diamond等人的美国专利号4,766,062描述了一种诊断试剂，其包含通过嘌呤/嘧啶氢键与标记的多核苷酸结合的探针多核苷酸的复合物。所述探针包含能够结合生物样品的靶序列的靶标结合区。Diamond等人进一步描述了一种方法，其中与含有靶核苷酸序列的样品的接触引起结合，最初是靶标与探针的靶标结合区的单链部分的结合。然后，标记的多核苷酸从产生的复合物中被置换出来。对该置换的标记的多核苷酸的检测给出一个数值，该数值与样品中靶核酸序列的存在和浓度成函数关系。

Hogan等人的美国专利号5,451,503描述了一种核酸杂交探针，其具有至少一个核酸链，所述核酸链具有与靶核酸序列杂交的至少两个分开的靶标特异性区域，以及不与靶核酸杂交但是具有能够彼此杂交的互补区域的至少两个不同的臂区域。这些区域设计为：在合适的杂交条件下，在不存在靶核酸的情况下，互补臂区域彼此将不杂交；但是，在存在靶核酸的情况下，探针的靶标特异性区域将与靶核酸退火，并且互补臂区域将彼此退火，从而形成分枝的核酸结构，其可用于靶核酸序列的检测。Alajem等人的美国专利号6,887,662自述为Hogan等人专利的改进，改进在于：靶核酸被释放，并且可用于随后的扩增循环。

虽然以上描述的方法相对于简单的寡核苷酸探针检测方法例如Sambrook等人描述的方法(其中寡核苷酸探针用于检测固定于过滤器或膜上的靶核酸)不那么复杂，当仍然存在一些局限性。例如，Livak等人描述的易于执行的方法会产生假阳性结果，因为也会产生与非靶序列的杂交，在一些情况下是阳性结果。

一般而言，上述方法的特征在于信号低、背景高。Hogan等人教导了通过模板重复利用而扩大信号以及通过适当选择所用的寡核苷酸的臂区域的长度来减少背景。旨在产生更精确结果的方法通常更难以执行。

致瘤性人乳头瘤病毒(HPV)的检测是严峻的挑战，因为HPV基因组具有多个相关的基因型和异质性。目前，仅有两种FDA批准的用于高风险HPV株系的筛选测定法(Qiagen的Hybrid Capture 2High-Risk HPV DNA Test(digene HC2);Hologic的Cervista HPV)。HC2测定法利用了多个基于长RNA的探针以克服靶DNA中的序列差异性并确保完全株系覆盖。然而，该设计的本性使得Digene测定法具有特异性差的问题并显示出与HPV的多种低风险基因型的交叉反应。基于靶核酸扩增的其他的检测HPV的测定法比较复杂，因为需要使用简并引物和探针以解决序列异质性的问题。当混合在一起时，寡核苷酸的这种混合物容易发生非特异性引物相互作用，这会导致产生引物二聚体的短扩增子，这会降低靶标特异性扩增和检测的效率。这就是为何实时的基于探针的HPV DNA的扩增和检测无法广泛实施并一般局限于检测单一基因型[见例如下列文献中的描述Flores-Munguia,Roberto,et al,"Performance Assessment of Eight High-ThroughputPCR Assays for Viral Load Quantitation of Ocongenic HPV Types,"Journal of Molecular Diagnostics,Vol.6,No.2,pp.115-124(May2004);Hesselink,A.T.,et al,"Comparison of Three Different PCRMethods for Quantifying Human Papillomavirus Type 16DNA inCervical Scrape Specimens,"Journal of Clinical Microbiology,Vol.43,No.9,p.4868-4871(Sept.2005);Tucker,Ruth Ann et al,"Real-time PCR-based Fluorescent Assay for Quantiation of HumanPapillomavirus Types 6,11,16,and 18,Molecular Diagnosis,Vol.6,No.1,pp.39-47(2001)]或有限的多重测定形式、在单一反应中涉及检测至多3种基因型[见例如下列文献的描述Moberg,Martin,et al.,"Real-Time PCR-Based System for Simultaneous Quantification ofHuman Papillomavirus Types Associated with High Risk of CervicalCancer" Journal of Clinical Microbiology,Vol.41,No.7,pp.3221-3228(July 2003); Peitsaro, Panu et al,"Integrated HumanPapillomavirus Type 16 Is Frequently Found in Cervical CancerPrecursors as Demonstrated by a Novel Quantitative Real-Time PCRTechnique," Journal of Clinical Microbiology,Vol.40,No.3,pp.886-891(2002)]的原因之一。已经报道了使用插入染料“SYBR绿”实时检测PCR扩增产物，但是该技术缺乏足够的特异性以用于可靠的临床诊断，并且通常需要熔解曲线分析以精确判读阳性结果。该测定法描述于Lillo,F.B.,et al,"Determination of Human Papillomavirus(HPV)Load and Type in High-Grade Cervical Lesions SurgicallyResected from HIV-Infected Women during Follow-up of HPVInfection," Clinical Infectious Diseases,Vol.40,pp.451-457(2005)和Payan,C.,et al.,"Human Papillomavirus Quantification in Urine andCervical Samples by Using the Mx4000and Light Cycler GeneralReal-Time PCR Systems,Journal of Clinical Microbiology,Vol.45,No.3p.897-901(2007)。

除了引物与探针之间的潜在相互作用所造成的测定法设计局限性之外，目前可用的PCR仪器只能提供不多于4至6个光学通道用于检测多重反应。因此，特异性检测所有14种高风险HPV基因型通常需要多个单独的PCR，这限制了仪器的通量并对于上游样品处理、测定法的质控和试剂生产具有潜在的不良影响。

目前在寻求使用常见的光学通道在单一的多重反应中检测HPV的高风险株系的测定法和方法。还寻求改善的信号扩大和降低背景的方法，以便以易于高度多重化和无需使用混杂的DNA聚合酶(这会导致假阳性结果)的形式检测中等高至高丰度的核酸靶序列(例如来自HPV高风险株系的DNA)。

发明内容

本发明涉使用匀质、等温、多重相容性信号扩大系统检测靶核酸的寡核苷酸探针和方法。在一个实施方式中，靶核酸以中等高至高的浓度存在。本文描述的方法被称作通过探针杂交和限制性扩大信号[Amplification by Probe Hybridization and Restriction(SAPHyR)]。

在优选实施方式中，该方法利用限制性核酸内切酶的良好表征的产生单链DNA缺口的活性。限制性核酸内切酶的一个实例是BsoBI酶。将反应温度与探针熔解温度之间的关系选择为：使得循环产生切割的寡核苷酸片段。这些片段进一步激发次级循环切割反应以产生信号(荧光)。

在一个实施方式中，该方法检测样品中的靶核酸的存在或不存在，所述样品通过制备怀疑含有靶核酸的样品而获得。用于制备样品(以用于检测靶核酸是否存在的测定法)的方法是本领域技术人员熟知的，在本文中不详细讨论。从样品中提取核酸的一个实例是BD Viper^TMSystem，使用位于Franklin,Lakes New Jersey的Becton Dickinson(BD)的XTR^TM技术。

从样品提取的核酸与反应混合物混合，所述反应混合物具有第一和第二寡核苷酸探针，和序列特异性核酸内切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探针各自具有第一序列和第二序列。第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列互补。第一和第二寡核苷酸探针各自的第二序列彼此互补并形成双链限制性位点，所述限制性位点被序列特异性核酸内切酶识别。第一和第二寡核苷酸探针中的至少一个具有位于所述限制性位点的一侧的可检测标记物和位于所述限制性位点另一侧的猝灭部分。这种相对位置允许第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列选择性杂交，并且第一和第二寡核苷酸探针的第二序列彼此选择性杂交。这些探针的杂交形成双链限制性位点，从而使得：如果样品中存在靶核酸，则序列特异性核酸内切酶在该限制性位点切割该双链体。按照这种方式切割探针允许检测所述标记物。切割探针还使寡核苷酸探针的其余部分从靶核酸变性，并彼此变性。

在第二实施方式中，将制备的样品与反应混合物混合，所述反应混合物包含第一、第二和第三寡核苷酸探针，和序列特异性核酸内切酶。所述第一和第二寡核苷酸探针各自具有第一序列和第二序列。第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列互补。第一和第二寡核苷酸探针各自的第二序列彼此至少部分互补，并且当探针与靶标杂交时，形成双链限制性位点，从而使第一和第二探针彼此靠近。优选地，当不与靶序列杂交时，第一和第二探针中的至少一个具有发夹构象，从而确保在不存在靶核酸时探针彼此不杂交。所述第一和第二寡核苷酸探针为非标记的，并且所述第二寡核苷酸探针还具有第三序列。所述第三序列的至少一部分与第二寡核苷酸探针的第二序列形成发夹，其防止当第一和第二寡核苷酸探针不与靶核酸结合时第二寡核苷酸探针与第一寡核苷酸探针杂交。所述第三序列的至少一部分与第三寡核苷酸探针杂交以形成双链限制性位点。第三寡核苷酸探针为非靶标特异性寡核苷酸探针，其具有位于第一序列的一侧的可检测标记物，所述第一序列与第二寡核苷酸探针的第三序列形成双链限制性位点。第三寡核苷酸探针还具有位于第三寡核苷酸探针的第一序列的另一侧的猝灭剂部分。

在该实施方式中，如果靶核酸存在于样品中，则第一和第二寡核苷酸探针的第一序列（通过发夹结构的变性）与靶核酸的非重叠序列选择性杂交。发夹环的变性允许第一和第二寡核苷酸探针的第二序列之间发生杂交、之前在限制性位点处形成的双链体被序列特异性核酸内切酶切割，以及第三序列从第二寡核苷酸探针分离，以及第一和第二寡核苷酸探针从靶核酸分离。然后，在反应混合物中发生多个下列循环：i）第二寡核苷酸探针的第三序列与第三寡核苷酸探针杂交，由此形成化学修饰的双链限制性位点，ii）通过序列特异性限制性核酸内切酶使该化学修饰的双链限制性位点的单链产生缺口，iii）从猝灭剂释放标记物，和iv）第三寡核苷酸探针从第二寡核苷酸探针的第三序列分离。然后使用常规技术检测由此释放的标记物，以检测可检测标记物(例如荧光团)的存在，从而信号的检测指示样品中靶核酸的存在。

通过参考图4A-D描述的第三实施方式，将提取的怀疑含有靶核酸的核酸与具有第一序列和第二序列的第一寡核苷酸探针(P1)、具有第一序列和第二序列的第二寡核苷酸探针(P2)，和具有第一序列和第二序列的第三寡核苷酸探针(P3)，以及序列特异性核酸内切酶混合。

为了清楚，以图4A-D中的示意性序列名称描述该实施方式中的序列。这些名称无意暗示序列组成或序列长度，而仅仅是为了提供序列描述与其示意图之间的关联。在该实施方式中，第一寡核苷酸探针(P1)具有与靶核酸序列互补的第一序列(b'-i')和与第二寡核苷酸探针(P2)的第一序列(a'-f′)互补的第二序列(a-c')。第一探针的第二序列(a-c')的第一部分(d-e)是限制性位点的单链化学修饰部分。本文中更详细地描述了化学修饰的限制性位点。第一寡核苷酸探针(P1)的第一序列(b'-i')的一部分和所有的第二序列(a-c')形成次级结构(例如发夹)。

第二寡核苷酸探针(P2)是不直接与靶标杂交的探针(虽然其可以具有一些靶标特异性核苷酸，但是靶标特异性序列的长度太短无法在反应条件下与靶标形成稳定的杂交体)，其中第二探针(P2)的第一序列(a'-f′)的一部分(d'-e')与第一探针(P1)的第二序列(a-c')的单链化学修饰部分(d-e)互补。第二寡核苷酸探针的第二序列(b-e')与第三寡核苷酸探针(P3)的第一序列(b'-e)互补，其中第二探针的第二序列(b-e')的一部分(d-e)是限制性位点的单链化学修饰部分。第二寡核苷酸探针的第一序列和第二序列部分重叠(e'-f′)，并且其中第二寡核苷酸探针的第一序列的至少一部分(部分b'-d')和第二序列(部分b-e')形成次级结构(例如发夹)。

第三寡核苷酸探针(P3)是不与靶标直接杂交的探针(虽然其可以具有一些靶标特异性核苷酸，但是靶标特异性序列的长度太短无法在反应条件下与靶标形成稳定的杂交体)，其中第一序列(b'-e)包括与第二寡核苷酸探针(P2)的限制性位点的单链化学修饰部分(d-e)互补的部分(d'-e')，并进一步包括位于其上的可检测标记物(264)或猝灭剂(266)部分，第二序列(d-k)与第一序列(b'-e)的一部分(b'-d')形成发夹环，并具有位于其上的可检测标记物(264)或猝灭剂(266)部分，从而猝灭剂部分阻断来自可检测标记物的信号(由于它们在第三寡核苷酸探针中的相对位置)。

在该实施方式中，如果靶核酸存在于样品中，则靶核酸与第一寡核苷酸探针(P1)的第一序列(b'-i')选择性杂交以形成第一复合物(P1:T)。此外，在多个循环中，该方法允许i)第一寡核苷酸探针(P1)的第二序列(a-c')的至少一部分(a-f)与第二寡核苷酸探针(P2)的第一序列(a'-f′)选择性杂交以形成第二复合物(P2:P1:T);ii)切割双链限制性位点[通过形成双链限制性位点的化学修饰单链的第一寡核苷酸探针的第二序列(a-c')的部分(d-e)与第二探针(P2)上的互补性序列(a'-f′)的杂交而形成]的单链部分(d'-e')，从而从第二寡核苷酸探针(P2)的第一序列的非重叠部分(a'-d')分离第二寡核苷酸探针的第二序列(b-e')；和iii)第二寡核苷酸探针从第一复合物(P1:T)分离。

此外，根据该实施方式，在多个循环中，i)允许第二寡核苷酸探针(P2)的第二序列(b-e')与第三寡核苷酸探针(P3)的第一序列(b'-e)选择性杂交，以形成第三复合物，从而从猝灭剂分离标记物并释放信号，ii)切割双链限制性位点[通过第二寡核苷酸探针的第二序列的部分(b-e')与第三寡核苷酸探针的第一序列的互补序列(b'-e)的杂交而形成]的单链(d'-e')，iii)从猝灭剂释放信号，并且第二寡核苷酸探针的第二序列(b-e')从第三寡核苷酸探针(P3)的其余部分分离。在该方法中，从标记物产生的信号被检测，其指示样品中靶核酸的存在。

附图说明

图1A和1B例示了本发明的一个实施方式，其利用了两个靶标特异性探针以及两个探针与靶核酸形成的复合物。

图2A-2C例示了一种方法，其利用三个探针，其中之一为非靶标特异性标记的报告探针，但是其中，当不与靶标结合时，探针不具有次级结构。

图3A-3D例示了本发明的第三实施方式，其利用了三个探针，其中一个靶标特异性探针带有发夹结构，以阻断靶标-特异性探针之间的靶标非依赖性杂交。

图4A-4D例示了第四实施方式，其中仅有一个探针是靶标特异性的。

图5例示了图4A-4D中描述的三个探针的一个实例。

图6例示了利用封闭探针的本发明的一个实施方式。

图7A例示了HPV-16的靶序列。

图7B例示了HPV-58的靶序列。

发明详述

本发明涉及一组寡核苷酸和使用可用于检测靶核酸序列的该组寡核苷酸的方法。具体地，本发明的方法可用于检测特异性靶核酸序列的存在或不存在，其使用寡核苷酸探针，当所述寡核苷酸探针与模板序列退火时，在它们之间形成内在(内源性)切割位点。随后，该切割位点的切割引起可检测信号的产生，并且引起一个或多个寡核苷酸从靶核酸序列分离，从而允许模板重复利用和信号扩大。

通过参考附图和随附的说明将更好地理解根据本发明的寡核苷酸和方法的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解本发明的应用不限于以下描述所记载的或实施例所例示的细节。本发明能够以其它实施方式或以多种方式实施或实行。同样应理解，本文使用的术语和命名是为了描述的目的，不应被理解为限制性的。

如本文使用的术语“寡核苷酸”和“探针”以及词语“寡核苷酸探针”可相互替换地使用，是指单链核酸分子或单链核酸分子的组装体，其能够显示出一个或多个部分双链的构象。此类分子可以根据本发明用于检测单链或双链（在适当变性之后）靶核酸序列的存在或不存在，如本文进一步描述。

如通篇使用的术语“模板”或词语“靶核酸序列”是指核酸模板，其天然是单链形式，例如信使RNA，或者被变性成为单链形式，例如DNA。根据本发明的靶核酸序列可以是粗制的、部分纯化的，或纯化的形式，并且可以具有不同程度的复杂性，这取决于其来源。如本文使用的特异性靶核酸序列可以与另一特异性靶核酸序列仅有单一核苷酸的差别，例如，点突变，或多个核苷酸的差别。

如本文使用的术语“互补或实质上互补”是指在预先确定的温度和离子强度的杂交条件下和/或模板的存在下可以碱基配对的序列。具体地，“互补或实质上互补”是指至少70%互补，优选至少80%互补，有利地90%-100%互补。“完全互补”是指100%互补。

如本文使用，术语“发夹”用于描述单链DNA或RNA中的茎环分子内碱基配对。发夹或发夹环是由同一探针的至少实质上彼此互补的两个区域形成的。在核苷酸序列中，互补序列碱基配对以形成双螺旋“茎”，其终止于非配对的环。

如本文使用的词语“嗜热限制性酶”是识别并切割特异性核酸序列的限制性核酸内切酶。嗜热限制性酶较不易受热的影响。此类酶具有大约50℃或更高的反应温度。合适的嗜热限制性核酸内切酶的一个实例是BsoB1限制性核酸内切酶。这些酶切割限制性核酸内切酶限制性位点(RERS)。此类限制性位点描述于美国专利号6,743,582、美国专利号5,846,726和美国专利号5,919,630，这些文献全部通过引用方式并入本文。BsoB1将切割具有一定程度简并性(即差异性)的序列。BsoB1切割的简并序列是熟知的，包括ctcgag,cccgag,cccggg和ctcggg。当处于单链形式时，这些RERS序列不被酶切割。然而，当RERS序列与其互补物杂交时，能被限制性核酸内切酶切割。所需的互补程度将根据特异性RERS而有一定的变化。然而，一般而言，对于6个碱基对的限制性位点，优选地，在位点内没有错配(虽然，例如，BsoBI，可以具有错配，只要不是位于1,3,4或6位)。在可切割的RERS序列之一被化学修饰的情况下，仅有未被化学修饰的RERS序列被存在的酶切割。BsoBI是能够识别半修饰的RERS的限制性酶的实例，其能够切割未被修饰的链，虽然也已知其它的具有这些性质的酶，包括但不限于：Hinc II,Ava I,Nci I和Fnu 4H。

考虑到修饰的限制性位点探针用于本发明。通过在杂交的探针的一条链的识别位点引入修饰，可以阻止被修饰的链的酶促切割。此类修饰的一个实例是在互补于被限制性核酸内切酶切割的RERS序列的探针序列中引入的硫代修饰。由于该修饰，仅有限制性位点的一条链被切割。在本发明的情况下（其中探针在多个循环中被使用），这具有重要意义。该方法由于整个温育过程中反应物的较高浓度而获益，因此，产生较高的产物形成效率。技术人员知晓很多化学修饰的限制性位点，因此在本文中未详细描述。技术人员理解：不是所有的限制性位点都易于被化学修饰而产生单链缺口。因此，只有某些酶的RERS序列可以被化学修饰以实现本文描述的单链缺口。

在本发明的一些实施方式中，化学修饰的限制性位点是回收再利用的探针的一部分。某些实施方式涉及回收探针以进一步扩大从靶序列检测所产生的信号。一旦靶标/探针复合物变性，则未被切割的探针被回收用于再利用。类似于首次产生配对的探针，只有当双数目的配对探针杂交以形成双链限制性位点时，限制性核酸内切酶才识别并切割完整限制性位点(5'----3')。然而，仅有杂交的探针对的未经修饰的链被切割。将探针的熔解温度（在所选的反应温度）选择为使得：当未被化学修饰的探针被切割时，至少切割的探针从其复合物变性。在其它实施方式中，单链未被化学修饰的限制性位点的缺口引起所有探针从其靶标变性。

在一些实施方式中，为了能够检测，本发明的寡核苷酸探针组装体优选经检测部分标记。然而将认识到，并且如下文进一步详述，根据本发明的检测也可以在不向结合于靶标的寡核苷酸掺入此类检测部分的情况下进行。而是，与靶标的结合产生探针片段，该探针片段结合非靶标特异性报告分子探针，并且该报告分子探针与该探针片段杂交。

如本文详述，使用任何常规的检测机制进行探针及其限制性产物的检测。例如，可以使用侧翼于同一链的限制性位点的荧光报告染料和猝灭基团。猝灭剂能够捕获荧光基团发射的能量，因此，只要两个基团彼此足够靠近，则当荧光基团被激发时不会发射荧光。技术人员对于配置具有猝灭和信号部分的探针(其中，当与猝灭部分处于一定的靠近时，来自信号部分的信号被猝灭；当间距增加时发射信号)或具有两个信号部分的探针(其中，当距离增加时信号减少或消失)的考虑是完全清楚的。为了保持猝灭部分与信号部分之间的足够的靠近，可以将探针配置为发夹。在该结构中，序列的折叠部分使猝灭部分与信号部分的靠近程度相对于序列不折叠时更近。在这样的配置下，当发夹变性时，信号部分能够发射信号，因此使猝灭部分与信号部分分离。如果探针具有RERS序列，则限制性核酸内切酶切割RERS，使具有猝灭部分的探针的部分从具有信号部分的探针的部分释放。这进一步使猝灭部分与信号部分分离，从而允许更多信号从信号部分发射。技术人员对于实现信号猝灭和信号发射所需的分离的量是知晓的。如果要配置RERS序列，则通常在荧光报告染料与猝灭基团之间需要4-18个碱基的间隔，这取决于所使用的限制性酶。在酶促切割之后，荧光报告染料与猝灭基团彼此分离并在溶液中变得分散。因此，不存在从荧光基团向猝灭剂的能量转移，荧光可以被检测到。

由于可以随着反应进行而检测荧光，所以可以进行扩增的实时测定。荧光的强度和速率的增加可以允许评估存在于混合物中的靶分子的数目和扩增速率。

如上所述，本发明的探针可以使用多种荧光/猝灭剂或供体/受体组合。本领域普遍使用这样的组合：其中供体来自染料的夹氧杂蒽(xanthene)基团，包括荧光素，猝灭剂来自染料(例如6-FAM和TAMRA)的若丹明基团。Cy5和ROX是可以使用的另一对染料。当利用两个信号部分例如荧光素/若丹明配对时，荧光素供体被激发并将能量转移至若丹明受体，其在特定波长发射荧光，从而使得能够进行检测。如果荧光素和若丹明之间的距离增加，则检测到减少的信号或无信号。

也可以使用非荧光猝灭剂，例如DABCYL和QSF-7；这些猝灭剂允许在选择荧光染料时的高度灵活性。染料对的选择需要：当二者靠近时，猝灭剂将吸收荧光染料的能量。优选地，在染料分离之后荧光的增加要尽可能大(对于多种能量转移系统报告了3-20倍的荧光增加)。当仅使用一种荧光染料时，应该选择具有最高的荧光强度的染料（通常具有宽发射谱）。如果设计携带相同的荧光/猝灭基团的两个探针用于检测同一靶标的两个不同区域，则可以增加测定的灵敏性。或者，可以使用两个或更多个靶向不同靶标的探针，条件是使用荧光/猝灭染料的不同组合。然而，在使用两个或更多个荧光染料的情况下，测定的灵敏性可能被削弱，以区分多种染料的荧光。这可以通过检测更窄的发射谱来进行，其中多种染料的荧光将不会重叠。

以下段落描述了现有技术中教导的但用于本发明的寡核苷酸探针，具有某些限制性，如下文所强调，这些限制性引起靶核酸的更优越的检测，这是由于信号的扩大和/或背景信号的降低。

图1A例示了第一实施方式，其使用靶标特异性探针10和20，其中成像部分特异于靶标。在图1A中，(a)和(e)代表的序列特异于靶序列(a')和(e')。选择序列(c)和(c')以提供用于嗜热限制性酶的限制性位点。嗜热限制性酶的一个实例是BsoB1。

图1B例示了由图1A图示例示的探针10和20形成的复合物。探针10和20与它们各自的靶序列(a')和(e')杂交，反应温度(T_Hyb)小于偶联于靶标21的探针10的熔解温度(T_mA)或偶联于靶标的探针20的熔解温度(T_mB)。由于T_Hyb大于T_mA或T_mB至少之一，所以探针10和/或20随着探针:靶标复合物的形成在靶标上循环依附和脱离，并且探针10或20中的至少一个被切割，引起探针从靶标21或靶标/探针复合物变性。在一些实施方式中，这种探针循环通过温度循环实现和/或伴随温度循环。这种探针循环通过允许更多的探针与靶标结合而促进信号的扩大。技术人员知晓熔解/杂交温度是序列长度和组成的函数。技术人员可以选择适合于在给定的T_HYB使用的序列长度和序列组成。

在该实施方式中，复合物的三个杂交部分的熔解温育与杂交温度之间的热力学关系是：T_mC<[T_mA或T_mB]<T_Hyb(其中T_mC是探针10和20的区域(b c d)和(b'c'd')之间形成的杂交体的熔解温度)。该关系阻止了在不存在靶标核酸序列的情况下在溶液中形成探针10：探针20的复合物。在优选实施方式中，选择序列以提供具有碱基堆积(basestacking)的复合物。本领域技术人员知晓碱基堆积促成图1B中例示的复合物的稳定性的方式。

(a)和(e)与它们各自的靶标的杂交使得互补区域(b)和(b’),(c)和(c’)以及(d)和(d’)靠近，增加了它们的局部浓度，从而发生杂交以形成三重复合物：其具有双链限制性位点60。然后，该新形成的限制性位点60被适当的酶(例如BsoB1)切割以从猝灭剂80分离荧光团70，这会以靶标依赖性方式产生荧光。

在优选实施方式中，(a):(a’)或(e):(e’)的熔解温度T_m高于(b,c,d):(b’,c’,d')的熔解温度。反应在升高的温度T_Hyb进行，以阻止(b,c,d):(b’,c’,d')双链体的靶标非依赖性形成。在该实施方式中，限制性酶也是嗜热的以确保在反应过程中维持酶活性。

杂交区域(a):(a’)和(e):(e’)中的配对碱基的堆积也可以增强三重探针:靶标复合物的稳定性。配对碱基的堆积描述于Lane,M,et al,"Thethermodynamic advantage of DNA oligonucleotide'stackinghybridization'reactions:energetics of a DNA nick," Nucleic AcidsResearch Vol.25,No.3(1997);Yakovchuk et al.,"Base-stacking andbase-pairing contributes into thermal stability of the DNA doublehelix," Nucleic Acids Research,Vol.34,pp.564-574(2006);Zhu,L.,etal，"Development of a base stacking hybridization-based microarraymethod for rapid identification of clinical isolates," DiagnosticMicrobiology和Infectious Disease,Vol.59,pp.149-156(2007)，这些文献全部通过引用方式并入本文。可选地，在多重反应中，区域(b-d)和(b’-d')的序列特异于每个探针对以减少多重反应中多组探针之间的探针10和20的靶标非依赖性杂交的潜在可能。探针20和标记的探针10之一或二者可以配置为具有发夹结构，其将防止两个探针进行靶标非依赖性杂交。然而，鉴于通过该实施方式可以实现的信号扩大的缓慢动力学(如下文更详细地讨论)，配置探针使其具有发夹结构将更加限制其应用。

图1A-B例示的实施方式的一个缺点是探针10和20在靶标上依附和脱离的速率。在该实施方式中，荧光的积累依赖于切割的探针从靶标的分离以及探针10和20与靶标杂交以形成另外的复合物。将该实施方式与链置换扩增(SDA)进行比较，在SDA中，加倍时间是大约30秒(见Spargo,et al.,"detection of M. tuberculosis DNA usingthermophilic strand displacement amplification," Mol.Cellular Probes,Vol.10,pp.247-256(1996))，并且在基于实时荧光的系统中扩增的靶标的检测需要累积大约10⁸个切割的探针分子。因此，从10³个靶标分子的输入水平，需要10⁵倍的扩增(假设每个拷贝的靶标都产生1个探针分子的切割)，大约log 10⁵循环(加倍)除以log 2或大约16.6x 30秒=8.5分钟。与此相反，在图1A-B例示的实施方式中，假设循环时间是大约3秒(即，SDA的1/10)，则从10³个拷贝的靶标产生10⁸个切割的探针所需的时间为：10⁸÷10³x 3秒=300,000秒=83.3小时，这对于多数应用是不可接受的时间长度。

在优选的实施方式中，次级的、自我持续的探针切割方式增加了切割的探针的积累速率。这些实施方式提供了激发探针切割的机制。在这些实施方式中，靶标被连续回收再利用，并且在一些实施方式中，一个或多个探针被连续回收再利用。在一些实施方式中，回收的组分诱导另外的探针切割轮次，无需另外的分析物特异性杂交事件。

在图2A-2C中例示了自我持续的探针切割。在该实施方式中有3个探针：探针10、探针20和探针22。探针10具有第一序列(a)，其为靶核酸上的序列(a')的互补物。探针10还具有序列(b,c和d)，其将与探针20上的序列b',c'和d'杂交。

在图2A中，探针10或探针20上都不提供报告分子（如图1A和1B中例示的荧光团70和猝灭剂80）。相反，探针20上提供序列(e')，其将与非特异性标记的报告探针22上的互补序列(e)杂交。

图2A-C例示了被修饰以包含具有两个BsoBI限制性位点的5’尾巴的探针20，所述限制性位点之一是硫代的以防止被切割。为了使探针10和20与它们的互补序列((b,c,d):(b’,c’,d’))的靶标非依赖性杂交最小化，在高温度T_Hyb进行反应，其等于或高于靶标特异性探针区域(a)和(g')的熔解温度T_m。

探针10中的(a)与探针20中的(g')与靶标中的它们的互补靶序列(a'和g)的杂交使探针10的区域(b,c,d)和探针20的(b’,c’,d’)靠近，这继而导致它们的杂交并形成双链限制性位点60。该限制性位点60被BsoBI酶切割以从探针20释放单链片段23(d’,e’,f’)，其在探针10中不具有互补物。探针20的片段23(d’,e’,f’)互补于标记的报告探针22的序列(d,e,f)。片段(d’,e’,f’)与报告探针22的杂交引起形成半硫代的BsoBI限制性位点90，如图2B所示。该双链体的未经修饰（标记）的链被BsoBI酶产生缺口，以产生片段24(d)和25(e,f)，如图2C所示，它们从它们的互补序列分离，从而使荧光团70与猝灭剂80分离并以靶标依赖性方式产生荧光。该实施方式的重要方面是硫代的DNA链(f’,d’,e’)进行另外的探针杂交轮次和单链产生缺口的能力，从而引起荧光的累积，这与进一步的分析物特异性探针杂交无关。对于多重应用（其中检测多于一种靶标分析物），报告探针22可以包含互补于多个分析物特异性探针20序列的5’尾巴的通用序列。即，多个不同的靶标特异性探针20将在它们的5’尾巴具有相同的序列(f′,e',d')。

虽然图2A-2C中描述的机制可用作学究式的工具以描述本发明的概念，但是该机制提供了靶标非依赖性信号的可能性，这是由于在不存在互补于区域(a)和(g’)的序列的情况下(即不存在靶标)溶液中的(b,c,d)与(b’,c’,d’)的杂交。一旦形成该复合物，限制性位点60被切割，这会产生片段(d’,e’,f’)，与靶标的存在无关；产生假阳性。

第二种实施方式减少了靶标非依赖性信号的潜在可能并在图3A-D中例示。在该实施方式中，探针20被配置为具有稳定的发夹结构100。当两个探针在溶液中游离时，发夹100阻断与探针10的3’尾巴的杂交。注意：发夹结构具有两个RERS序列60和90。由于这些RERS序列至少部分位于发夹结构的环内，并优选配置为针对同一限制性核酸内切酶的简并识别序列，所以它们不形成易于被限制性酶切割的双链限制性位点。当两个探针10、20通过它们各自的区域(a)和(g')与它们各自的靶序列(a’)和(g)杂交而在一起时，条件为使得所述双链发夹变性。见图3B，当探针10和20与特异性靶标杂交时，探针10和20的两个互补尾巴序列(分别为序列b,c,d和序列b',c',d')的局部浓度足够高，使得发生(b,c,d):(b’,c’,d’)的分子间杂交。注意：在图3A例示的配置中，探针10和20二者都具有序列b。序列b的互补物是探针22中的(b')。发夹结构100使探针20(在溶液中游离并且不与靶标杂交)不与通用的标记的报告探针22结合。探针10和探针22具有各自的互补序列(b,c,d和b',c',d')，但是被配置为当都在溶液中游离时，不杂交。在替代性实施方式中，探针10也具有发夹。一旦探针10和20由于与靶标结合而靠近，则探针10中的(b,c,d)与探针20中的(b’,c’,d’)发生杂交。这例示于图3B。杂交产生双链识别位点60，其被限制性酶(BsoB1)切割以产生片段23(d’,e’,b)，该片段互补于标记的报告探针22中的(b',e)。

探针20的片段23(d’,e’,b)与探针22的杂交产生双链的半硫代的限制性位点90，其被限制性酶在对应于探针22的链上产生缺口。见图3D，一个具有缺口的片段110具有序列(b')和猝灭剂部分80。猝灭剂部分80的一个实例是Dabcyl。然而，这仅是一个实例，本领域技术人员知晓之前说明的很多合适的猝灭剂部分。报告探针22的另一个有缺口的片段120携带荧光部分70（例如荧光团）。

报告探针22的有缺口的片段110、120从探针20的它们的互补片段23(b,e',d')的分离以及彼此的分离导致产生荧光和再生单链探针B片段23(b,e’,d′)。然后，DNA的经保护的(例如硫代的)单链片段23经历进一步的自我再生探针杂交和单链切割轮次，产生荧光信号的积累（和扩大）。

见图4A-4D，未经标记的发夹探针200用作产生靶标特异性荧光的中间体。探针200具有第一序列(b'-i')，其是靶序列201的部分的互补物(b-i)。探针200具有第二序列(a-c ')，其具有部分(d-e)，该部分是限制性位点205的单链硫代部分。注意：第一寡核苷酸探针200的第一序列的一部分(b’-i’)和所有的第二序列(a-c’)形成发夹结构。由于发夹包括与靶标结合序列结合的探针200序列的一部分，所以探针200与靶标201的杂交引起探针200的发夹变性(即变为未杂交的)。单链的硫代的限制性位点不被限制性核酸内切酶消化（即产生缺口）。

探针200与互补性靶标杂交并形成热力学上更稳定的异双链复合物210。见图4B，复合物210与发夹探针230杂交。发夹探针230具有第一序列(a'-f′)，其与复合物210的序列(a-f)杂交。探针230具有第二序列(b-e')，其与第三寡核苷酸探针260上的第一序列(b'-e)互补并杂交（图4D）。所有的第一序列和部分的第二序列形成第二寡核苷酸探针230上的发夹结构(b-b')。探针230的第一序列(a'-f′)的部分255(d',e')与探针200的第二序列(c'-a)的部分205(d,e)在复合物240中形成限制性位点。探针230的第二序列(b-e')的部分250(d-e)与探针序列260的第一序列(b'-e)的部分262(d'-e')形成半硫代限制性位点(图4D)。

探针230的杂交形成热力学上有利的三重结构240(探针230:探针200:靶标201)。探针230具有经保护的(例如硫代的)限制性位点250和未经保护的(例如非硫代的)限制性位点255。见图4C，限制性位点的未经保护的链255的缺口导致形成从探针200分离的亚片段242(d'-a')和244(b-e')。

片段244(b-e')互补于标记的发夹报告探针的第一序列(b'-e)，如图4D所示。由于它们的互补序列的长度，244与探针260的杂交相对于维持探针260的发夹结构而言在热力学上是有利的。因此，探针260的分子内碱基配对被破坏，这导致形成复合物270(探针260:亚片段244)。探针260还具有信号部分264(例如荧光团)和猝灭部分266。探针260中的分子内碱基配对的破坏使信号部分264从猝灭部分266分离，并导致信号增加。然后，未经保护的限制性位点262(d'-e')被限制性核酸内切酶产生缺口，这进一步使荧光团264与猝灭剂266分离，这导致荧光的进一步增加。片段244(b-e')从探针260的切割的部分变性，并且自由结合另一个探针260，其中重复下列循环：i)杂交以形成复合物270；ii)半硫代的双链限制性位点的未经保护的链(d'-e')的切割；和探针230从片段244的释放。

图5是用于图4A-D所示的实施方式中使用的探针200、230和260的具体SEQ ID的一个实施方式。探针200是58-mer，特异于HPV 16靶标。探针200见SEQ ID NO:1。HPV 16靶标见SEQ ID NO:2。HPV-16的靶序列示于图7A。HPV 16序列(以粗斜体着重显示)互补于探针200的3’末端的27个核苷酸并与之杂交(图5；SEQ ID NO:1)。

考虑到探针200也将与HPV-58靶标杂交。HPV-58靶标示于图7B。图7B中的SEQ ID NO:3。HPV-58序列中的着重显示的序列包含与200(图5)具有互补性的区域(通过大写字母核苷酸标示)，其中散布着5个错配的核苷酸(以小写字母标示)。基于3-态平衡模型(Bonnetet al Proc.Natl.Acad.Sci.96:6171-6176(1999))的计算(其考虑到在形成P1:靶标复合物过程中解折叠200发夹消耗的自由能)表明：在通常的反应温度(~50°C)与200杂交的匹配的靶标(HPV-16)的分数将是杂交的错配靶标(HPV-58)的分数的大约10,000倍。因此，该模型预测：相对于匹配的(HPV-16)靶标，错配的(HPV-58)靶标的信号低得多。

探针200中的核苷酸1-18互补于探针200中的核苷酸31-48，并形成探针200中的发夹结构。探针200中的硫代的RERS序列205是核苷酸19-24，序列为ctcggg，其是易于被BsoBI切割的序列之一。然而，由于其化学修饰，当其与探针230中的255形成双链限制性位点时，RERS序列205不被切割。如上所述，当探针200被置于靠近靶序列时，热力学平衡有利于发夹的变性，这会促进探针200与靶序列形成复合物。探针200具有等于大约-13.086kcal/mole的dG值。本文报告的dG值是根据Markham,N.R.,和Zuker,M.,"DINAMelt webserver for nucleic acid melting prediction," Nucl.Acid Res.Vol.33,pp.w577-w581(2005),Markham,N.R.&Zuker,M."UNAFold:software for nucleic acid folding and hybridization," Bioinformatics,"Vol.II:Structure,Functions和Applications,No.453(Keith,J.M.,ed.,2008);Methods in Molecular Biology,Ch.1,pp.3–31(Humana Press,Totowa,NJ 2008)计算的。该值是探针的次级结构的自由能，并表示给定条件组(盐浓度、温度、DNA浓度等)下的发夹的相对稳定性。该值越高(更负性)，变性发夹所需的能量越大。

技术人员知晓在设计探针时(特别是等温过程)考虑的很多因素。具体地，限制性核酸内切酶具有确定的其具有最佳活性的温度范围。因此，基于等温过程的温度选择限制性核酸内切酶。同样，探针稳定性与温度相关。相对于较短的探针(即具有较少的互补核苷酸的探针)，较长的探针(即具有更多的与靶序列的互补核苷酸的探针)将在较高的温度杂交。探针组成(即构成序列的特定核苷酸)将影响探针的熔解温度和杂交温度。很多其它因素也影响探针设计，这些因素是技术人员熟知的。在图5所示的实施方式中，等温过程的温度是大约55°C至大约60°C。

探针230是45-mer，如SEQ ID NO:4所示。在探针230中，核苷酸17-45是互补的并特异于探针200的核苷酸2-30。核苷酸1-14和25-37构成探针230的发夹。探针230的核苷酸10-15是保护的RERS序列250，核苷酸23-28是未经保护的RERS序列255。未经保护的限制性位点255是探针200上的经保护的限制性位点205的互补物。如之前所述，RERS序列250是RERS序列255的简并序列。如上所述，当探针230被置于靠近复合物210(探针200:靶序列201)时，热力学平衡有利于发夹的变性，有利于形成复合物240与复合物210。在此，探针230的dG值是-10.79kcal/mole。

探针260(无信号和猝灭部分)的核苷酸序列是40-mer，见SEQ IDNO:5。核苷酸1-17互补于探针230上的片段244的核苷酸7-23并与其结合(在探针230被限制性核酸内切酶产生缺口以形成从复合物240变性的片段242和244之后)。探针260具有-12.059kcal/mole的dG值。热力学为：探针260与来自探针230的片段244的靠近引起探针260的发夹(由核苷酸11-24及其互补序列核苷酸28-40形成)变性，使发夹解折叠。探针260在核苷酸9-14具有未经保护的RERS序列262。其与片段244的硫代的RERS序列250(核苷酸10-15)互补并对齐。得到的双链限制性位点被限制性核酸内切酶产生缺口，产生探针260的两个片段。第一片段为核苷酸1-9，具有信号部分264(例如荧光团)。第二片段是核苷酸10-40，具有猝灭剂部分266。

图6例示了另一个实施方式，其中封闭探针用于增强探针杂交的特异性。封闭探针320与探针300竞争与靶序列310的一部分的杂交。封闭探针320被探针300的置换取决于竞争性杂交体序列(a,b):(a’,b’)和(b,c):(b’,c’)的相对热力学稳定性。为了使特异性最大化，将探针300设计为只有靶标310中的序列(b,c)和(b’,c’)之间的完美互补才导致封闭探针320的置换。此类封闭技术的原理适用于本文描述的所有实施方式。使用封闭探针320所提供的一个优点是，在用于检测单核苷酸多态性的实施方式中(其中完美匹配与错配的靶序列之间的探针Tm的差异小)。此类封闭探针可以被设计为与靶序列部分互补，如图6所示，或者与一个或多个靶标特异性探针部分互补。在后者的情况下，探针与其特异性靶标的杂交相对于探针与封闭寡核苷酸的杂交在热力学上是有利的，从而促进在存在靶标特异性探针的情况下，封闭探针从靶标的置换。

一般地，如本文使用的命名法是分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术中常规使用的。此类技术在文献中有详细的解释。见，例如"Molecular Cloning:A laboratory Manual" Sandbrook et al.,(1989);"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-IIIAusubel,R.M.,et ed.(1994);Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);"Current Protocols inImmunology" Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994);"Oligonucleotide Synthesis" Gait,M.J.,ed.(1984);"Nucleic AcidHybridization" Hames,B.D.,和Higgins S.J.,eds.(1985);"Transcription and Translation" Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture" Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986);"A PracticalGuide to Molecular Cloning" Perbal,B.,(1984)and "Methods inEnzymology" Vol.1-317Academic Press。

虽然已经通过具体实施方式描述了本发明，但是明显的是，很多替代、修饰和变异对于本领域技术人员是显而易见的。因此，意在包括落在随附的权利要求的精神和宽范围内的所有此类替代、修饰和变异。本说明书中提及的所有公开物、专利和专利申请都通过引用方式全文并入本说明书，达到如同各篇公开物、专利或专利申请都特别且单独地被指明通过引用方式并入本文一样的程度。另外，本申请中引用或提及任何参考文献都不应被解释为承认此类文献是本发明的现有技术。

序列表

<110>BECTON DICKINSON

<120>使用探针杂交和限制性通过信号扩大而检测靶核酸的方法

<130>Becton 329

<160>序列个数:5

<170>PatentIn version 3.5

<210>SEQ ID NO 1

<211>长度:58

<212>类型:DNA

<213>来源：人工序列

<223>合成的探针

<400>序列:1

ccaaaattcc agtcctctct cgggtttttt agaggactgg aattttggtc tacaacct

<210>SEQ ID NO 2

<211>长度:50

<212>类型:DNA

<213>来源：人乳头瘤病毒；类型16

<400>序列:2

GTGTGCCTCC TGGGGGAGGT TGTAGACCAA AATTCCAGTC CTCCAAAATA

<210>SEQ ID NO 3

<211>长度:50

<212>类型:DNA

<213>来源：人乳头瘤病毒；类型58

<220>

<400>序列:3

AACTGGCAGA CGGAGGAGGT gtTAaACCAA AtTgCCAGTC CTCCAAAATA

<210>SEQ ID NO 4

<211>长度:45

<212>类型:DNA

<213>来源：人工序列

<220>

<223>合成的探针

<400>序列:4

cactcctctc tcgagaaaaa aacccgagag aggagtggaa ttttg

<210>SEQ ID NO 5

<211>长度:40

<212>类型:DNA

<213>来源：人工序列

<220>

<223>合成的探针

<400>序列:5

gtttttttct cgagagagga ctgttttcag tcctctctcg

Claims

1.检测样品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括：

a）制备怀疑含有靶核酸的样品；

b）制备反应混合物，所述反应混合物包含样品，第一和第二寡核苷酸探针，和序列特异性核酸内切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探针各自包含第一序列和第二序列，其中第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列互补，并且其中第一和第二寡核苷酸探针各自的第二序列彼此互补，由此形成双链限制性位点，所述限制性位点被序列特异性核酸内切酶识别，并且其中第一和第二寡核苷酸探针中的至少一个包含位于所述限制性位点的一侧的可检测标记物和位于所述限制性位点另一侧的猝灭部分，由此允许第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列选择性杂交，并且第一和第二寡核苷酸探针的第二序列彼此选择性杂交，从而形成双链限制性位点，从而使得：如果样品中存在靶核酸，则序列特异性核酸内切酶在该限制性位点切割双链体，允许检测所述标记物，并使寡核苷酸探针的其余部分从靶生物的核酸变性，以及从彼此变性。

2.权利要求1的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是选自BsoBI,Hinc II,Ava I,Nci I和Fnu 4H的酶。

3.权利要求2的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是BsoBI。

4.权利要求1的方法，其中所述反应混合物经历热循环以使切割的寡核苷酸从靶核酸变性。

5.权利要求4的方法，其中参考熔解曲线选择热循环温度。

6.权利要求4的方法，其中所述反应混合物维持在大于下列温度的杂交温度：i）偶联于靶核酸的第一寡核苷酸探针的熔解温度；ii）偶联于靶核酸的第二寡核苷酸探针的熔解温度；和iii）第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针形成的杂交体的熔解温度。

7.权利要求1的方法，其中所述可检测标记物是荧光团。

8.权利要求7的方法，其中所述荧光团是夹氧杂蒽染料。

9.权利要求7的方法，其中猝灭剂是若丹明染料。

10.权利要求1的方法，其中所述反应混合物还包含封闭探针。

11.检测样品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括：

a）制备怀疑含有靶核酸的样品；

b）制备反应混合物，所述反应混合物包含样品，第一、第二和第三寡核苷酸探针，和序列特异性核酸内切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探针各自包含第一序列和第二序列，其中第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列互补，并且其中第一和第二寡核苷酸探针各自的第二序列彼此互补，由此形成双链限制性位点，并且其中第一和第二寡核苷酸探针是未标记的，并且所述第二寡核苷酸探针还包含第三序列，所述第三序列的至少一部分与第二寡核苷酸探针的第二序列形成发夹，其防止当第一和第二寡核苷酸探针不与靶核酸结合时第二寡核苷酸探针与第一寡核苷酸探针杂交，其中所述第三序列的一部分与第三寡核苷酸探针杂交以形成双链限制性位点；其中第三寡核苷酸探针为非靶标特异性寡核苷酸探针，其包含位于第一序列的一侧的可检测标记物，所述第一序列与第二寡核苷酸探针的第三序列杂交以形成双链限制性位点；和位于第三寡核苷酸探针的第一序列的另一侧的猝灭部分；

如果靶核酸存在于样品中，则第一和第二寡核苷酸探针的第一序列与靶核酸的非重叠序列选择性杂交；

由此允许发夹环的变性以及第一和第二寡核苷酸探针的第二序列之间发生杂交，之前在限制性位点处形成的双链体被序列特异性核酸内切酶切割，以及第三序列从第二寡核苷酸探针分离，以及第一和第二寡核苷酸探针从靶核酸分离，以及多个下列循环：i）第二寡核苷酸探针的第三序列与第三寡核苷酸探针杂交，由此形成化学修饰的双链限制性位点，ii）通过序列特异性限制性核酸内切酶使该化学修饰的双链限制性位点的单链产生缺口，iii）从猝灭剂释放标记物，和iv）第三寡核苷酸探针从第二寡核苷酸探针的第三序列分离；和

检测从标记物产生的信号，其指示样品中靶核酸的存在或不存在。

12.权利要求10的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是选自BsoBI,Hinc II,Ava I,Nci I和Fnu 4H的酶。

13.权利要求10的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是BsoBI。

14.权利要求10的方法，其中所述反应混合物经历热循环以使切割的寡核苷酸从靶核酸变性。

15.权利要求14的方法，其中参考熔解曲线选择热循环温度。

16.权利要求14的方法，其中所述反应混合物维持在大于下列温度的杂交温度：i）偶联于靶核酸的第一寡核苷酸探针的熔解温度；ii）偶联于靶核酸的第二寡核苷酸探针的熔解温度；和iii）第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针形成的杂交体的熔解温度。

17.权利要求10的方法，其中所述可检测标记物是荧光团。

18.权利要求17的方法，其中所述荧光团是夹氧杂蒽染料。

19.权利要求17的方法，其中猝灭剂是若丹明染料。

20.权利要求10的方法，其中所述化学修饰的反应位点是半修饰的。

21.权利要求10的方法，其中所述反应混合物还包含封闭探针。

22.检测样品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括：

a）制备怀疑含有靶核酸的样品；

b）制备反应混合物，所述反应混合物包含：

i）样品；

ii）具有第一序列和第二序列的第一寡核苷酸探针、具有第一序列和第二序列的第二寡核苷酸探针，和具有第一序列和第二序列的第三寡核苷酸探针；和

iii）序列特异性核酸内切酶；其中

第一寡核苷酸探针具有与靶核酸序列互补的第一序列和与第二寡核苷酸探针的第一序列互补的第二序列，其中第二序列的第一部分是限制性位点的单链化学修饰部分，其中第一寡核苷酸探针的第一序列的一部分和第二序列形成次级结构；

第二寡核苷酸探针是不直接与靶标杂交的探针，其中第二探针的第一序列的一部分与第一探针的第二序列的单链化学修饰部分互补，第二寡核苷酸探针的第二序列与第三寡核苷酸探针的第一序列互补，其中第二探针的第二序列的一部分是限制性位点的单链化学修饰部分，第二寡核苷酸探针的第一序列和第二序列部分重叠，并且其中第二寡核苷酸探针的第一序列的至少一部分和第二序列形成次级结构；

第三寡核苷酸探针是不与靶标直接杂交的探针，其中第一序列包括与第二寡核苷酸探针的限制性位点的单链化学修饰部分互补的部分，并进一步包括位于其上的可检测标记物或猝灭剂部分，并且第二序列与第一序列的一部分形成发夹环，并具有位于其上的可检测标记物或猝灭剂部分，从而，由于它们在第三寡核苷酸探针上的相对位置，猝灭剂部分阻断来自可检测标记物的信号；

并且，如果靶核酸存在于样品中，则靶核酸与第一寡核苷酸探针的第一序列选择性杂交以形成第一复合物，在多个循环中，i)允许第一寡核苷酸探针的第二序列的至少一部分与第二寡核苷酸探针的第一序列选择性杂交以形成第二复合物;ii)切割双链限制性位点的单链部分，所述双链限制性位点是通过形成双链限制性位点的化学修饰单链的第一寡核苷酸探针的第二序列的部分与第二探针上的互补性序列杂交而形成的，从而从第二寡核苷酸探针的第一序列的非重叠部分分离第二寡核苷酸探针的第二序列；和iii)第二寡核苷酸探针从第一复合物分离；

并且，在多个循环中，i)允许第二寡核苷酸探针的第二序列与第三寡核苷酸探针的第一序列选择性杂交，以形成第三复合物，从而从猝灭剂分离标记物并释放信号，ii)切割双链限制性位点的单链，所述双链限制性位点是通过第二寡核苷酸探针的第二序列的部分与第三寡核苷酸探针的第一序列上的互补序列的杂交而形成的，iii)从猝灭剂释放标记物，和iv)使第二寡核苷酸探针的第二序列从第三寡核苷酸探针分离；

和检测从标记物产生的信号，其表示样品中靶核酸的存在。

23.权利要求22的方法，其中所述次级结构是发夹。

24.权利要求22的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是选自BsoBI,Hinc II,Ava I,Nci I和Fnu 4H的酶。

25.权利要求24的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是BsoBI。

26.权利要求22的方法，其中所述可检测标记物是荧光团。

27.权利要求22的方法，其中所述荧光团是夹氧杂蒽染料。

28.权利要求26的方法，其中猝灭剂是若丹明染料。

29.权利要求22的方法，其中所述核酸靶序列是人乳头瘤病毒核酸。

30.权利要求29的方法，其中所述人乳头瘤病毒核酸选自人乳头瘤病毒类型16和人乳头瘤病毒类型58。

31.权利要求30的方法，其中所述靶核酸选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

32.权利要求22的方法，其中所述第一寡核苷酸探针是SEQ IDNO:1，所述第二寡核苷酸探针是SEQ ID NO:2，并且所述第三寡核苷酸探针是SEQ ID NO:3。

33.权利要求22的方法，其中所述化学修饰的限制性位点是半修饰的。

34.权利要求22的方法，其中所述反应混合物还包含封闭探针。