ITUB20155706A1 - Procedimento di rivelazione di acidi nucleici e relativo kit. - Google Patents

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Pier Paolo Pompa
Paola Valentini
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Description

''Procedimento di rivelazione di acidi nucleici e relativo kit"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un nuovo procedimento di rivelazione di acidi nucleici bersaglio ed il relativo kit.
La rivelazione di sequenze di DNA e RNA bersaglio è della massima importanza nella diagnostica molecolare e, in questo settore, vi è il problema generale dell'amplificazione delle sequenze di acido nucleico, che risulta necessaria per poter conseguire l'identificazione del bersaglio, che usualmente si trova diluito in una miscela di materiale genetico interferente.
Nei test standard di laboratorio, l'amplificazione degli acidi nucleici viene generalmente effettuata tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) o attraverso altre tecniche basate sulla PCR, come ad esempio la reai time-PCR (RT-PCR) o la digitai PCR. Queste tecniche richiedono la variazione ciclica della temperatura di reazione, l'uso di strumentazione dedicata, 1'impiego di personale addestrato e, in alcuni casi, l'utilizzo di reagenti costosi.
La necessità di consentire 1'impiego dei saggi molecolari basati sulla rivelazione degli acidi nucleici al di fuori dei laboratori specializzati, allo scopo di implementare saggi diagnostici che possano essere effettuati in prossimità del sito di cura ed assistenza del paziente (point-of-care diagnostic testa), ha portato allo sviluppo di numerose tecniche di amplificazione isotermiche, che non richiedono la variazione ciclica della temperatura e che pertanto permettono l'uso di una strumentazione più semplificata. Tuttavia, molte di queste tecniche isotermiche presentano inconvenienti di tipo tecnico che, finora, non ne hanno consentito una reale applicazione estensiva in saggi molecolari commerciali. Un elenco non esaustivo di tali inconvenienti è fornito qui di seguito:
Necessità di miscele complesse di enzimi/proteine, come ad esempio nella Helicase Dependent Amplification (HDA) (Vincent, Μ,, Y. Xu, and H. Kong, Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep, 2004. 5(8): p. 795-800), nella Recombinase Polymerase Amplification (RPA) (Piepenburg, 0., et al., DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol, 2006. 4(7): p. e204) e nella Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) (Compton, J., Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 1991.
350(6313): p. 91-2). Questa necessità implica a sua volta elevati costi e un attento processamento e stoccaggio dei reagenti.
Necessità di alcune operazioni postprocessamento, allo scopo di ottenere l'effettivo bersaglio, come nel caso della Rolling Circle Amplification (RCA) (Liu, D., et al., Rolling Circle DNA Synthesis: Small Circular Oligonucleotides as Efficient Templates for DNA Polymerases. J Am Chem Soc, 1996. 118(7): p. 1587-1594), che necessita del taglio con endonucleasi di restrizione.
- Problemi di amplificazione aspecifica, che sono tipici delle tecniche basate sulla combinazione di una polimerasi e di un'endonucleasi atta a tagliare su un singolo filamento (nicking, intacco), come la Exponential Amplification Reaction (EXPAR) (Van Ness, J., L.K. Van Ness, and D.J. Galas, Isothermal reactions for thè amplificat ion of oligonucleotides . Proc Nati Acad Sci U S A, 2003.
100(8): p. 4504-9) o la Primer Generation-Rolling Circle Amplification (PG-RCA) (Murakami, T., J. Sumaoka, and M. Komiyama, Sensitive isothermal detection of nucleic-acid sequence by primer generation-rolling circle amplification. Nucleic Acids Res, 2009. 37(3): p. el9).
Progettazione di una miscela complessa di primers, come nel caso della Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) (Notomi, T., et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 2000. 28(12): ρ. E63) e della Cross-Priming Amplification (CPA) (EP 2382330 Al). - Complessità del prodotto di amplificazione, uno svantaggio che accomuna molte tecniche, quali la LAMP, la CPA, la RCA, il che a sua volta limita il novero di procedure applicabili per la rivelazione del risultato.
Alcune procedure isotermiche più semplici richiedono comunque l'impiego di due enzimi. Ad esempio, la Strand Displacement Amplification (SDA) (Walker, G.T,, et al ., Isothermal in vitro amplif ication of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase System. Proc Nati Acad Sci U S A, 1992.
89(1) ; p. 392-6) e la Nicking and Extension Ampli fication Reaction (NEAR) (US 2009/0081670 Al) richiedono entrambe sia una polimerasi sia una endonucleasi nicking, mentre la Rami fication Ampli fication (RAM) richiede una ligasi e una polimerasi (Yao, B., et al., Quantitative analysis of zeptomole microRNAs based on isothermal ramification amplif ication . RNA, 2009. 15(9): p.
1787-94) .
Onde superare questi ed altri inconvenienti della tecnica nota, la presente invenzione mette a disposizione una nuova tecnica di rivelazione di acidi nucleici, chiamata "amplificazione isotermica degli acidi nucleici mediata da ibridazione cooperativa" ("Cooperative Hybridization Mediated Isothermal Ampli fication of Nucleic Acids", CHAMP) ). Si tratta di una procedura semplice, che può essere realizzata in una singola provetta e che consente l'amplificazione di una sequenza di acido nucleico, ad esempio un DNA bersaglio o una sequenza reporter, impiegando un solo enzima, segnatamente una endonucleasi atta a tagliare su un singolo filamento (nicking, intacco) . Ciò è ottenuto grazie a un'intelligente progettazione di sonde che sfruttano l'ibridazione cooperativa di oligonucleotidi (anche chiamata "stabilizzazione per impilamento delle basi", "base-stacking stabilization") . Questo fenomeno si riferisce alla stabilizzazione dell'ibridazione di un corto oligonucleotide su un filamento stampo di DNA, dovuta ad interazioni base-stacking della base terminale del primo oligonucleotide con quella di un secondo oligonucleotide adiacente, che si ibrida in tandem sullo stesso filamento stampo (Khrapko, K.R., et al., A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Seq, 1991. 1(6): p. 375-88; Zhang, D.Y., Cooperative hybridization of oligonucleotides. J Am Chem Soc, 2011, 133(4): p. 1077-86; Lane, M.J., et al., The thermodynamic advantage of DNA oligonucleotide 'stacking hybridization' reactions: energetics of a DNA nick. Nucleic Acids Res, 1997. 25(3): p. 611-7; Broude, N.E., et al., Enhanced DNA sequencing by hybridization. Proc Nati Acad Sci U S A, 1994.
91(8): p. 3072-6; Fu, D.J., et al., A DNA sequencing strategy that requires only five bases of known terminal sequence for priming. Proc Nati Acad Sci U S A, 1995. 92(22): p. 10162-6; Valentini, P., et al., Gold-Nanoparticle-Based Colorimetrie Discrimination of Cancer-Related Point Mutations with Picomolar Sensitivity. ACS Nano, 2013. 7 (6): p. 5530-8).
La tecnica di amplificazione che forma oggetto della presente invenzione presenta il vantaggio di essere estremamente semplice ed universale. Il sito di intacco ("nicking site") è fornito dalla sonda, il che determina l'assenza di qualsivoglia limitazione relativamente alla scelta del bersaglio, che può possedere qualsiasi sequenza. Inoltre, la CHAMP non risente di nessuno dei summenzionati problemi della tecnica anteriore. Caratteristica unica e distintiva della CHAMP è il fatto di essere una reazione polimerasi-free.
La tecnica di rivelazione di acidi nucleici che forma oggetto della presente invenzione è declinata in due forme di realizzazione alternative. La prima fornisce un'amplificazione lineare di una sequenza di DNA reporter. Tale prima forma di realizzazione è denominata "CHAMP lineare". La seconda forma di realizzazione provvede un'amplificazione esponenziale della sequenza bersaglio. Essa viene denominata "CHAMP esponenziale".
Entrambe le forme di realizzazione possono essere accoppiate con varie tecniche di rivelazione successive; ad esempio, in maniera non limitativa, con una rivelazione mediante fluorescenza per una lettura in tempo reale del risultato ("real-time readout") oppure con una rivelazione colorimetrica, ad esempio basata su nanoparticelle d'oro.
Un primo oggetto della presente invenzione è quindi un procedimento di rivelazione di una sequenza di acido nucleico bersaglio (T) in un campione di acido nucleico, il procedimento comprendendo le fasi di:
a) aggiungere al campione di acido nucleico una miscela di reazione comprendente:
i) un enzima endonucleasi;
ii) un eccesso di una sonda lunga (LP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza 3' reporter (R),
un sito di riconoscimento di un enzima di un'endonucleasi (ERS), e
- una sequenza 5' AcT complementare a una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio da rivelare; e
iii) un eccesso di una sonda corta (SP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza 5' AcR complementare a una porzione della sequenza reporter, e
- una sequenza 3' cERS complementare al sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione,
in cui sia la sequenza 5' AcT sia la sequenza 5' AcR sono sufficientemente corte affinché l'ibridazione della sonda corta sulla sonda lunga non avvenga in assenza della sequenza di acido nucleico bersaglio, e
in cui la miscela di reazione non contiene un enzima polimerasi;
b) lasciare che la miscela di reazione reagisca con il campione di acido nucleico ad una temperatura a cui 1'endonucleasi è attiva cosicché, se la sequenza di acido nucleico bersaglio è presente nel campione di acido nucleico, si formi un sito di riconoscimento a doppio filamento per l'enzima endonucleasi mediante ibridazione cooperativa della sonda corta e della sequenza di acido nucleico bersaglio sulla sonda lunga, ed il sito di riconoscimento a doppio filamento per l'enzima endonucleasi venga quindi intaccato o tagliato dall'endonucleasi, cosicché una sequenza reporter libera sia rilasciata dalla sonda lunga; e c) rivelare la sequenza reporter libera come indicatore della presenza della sequenza di acido nucleico bersaglio nel campione di acido nucleico.
Il procedimento di rivelazione sopra descritto corrisponde alla tecnica di rivelazione di acidi nucleici chiamata "CHAMP lineare".
Un secondo oggetto della presente invenzione è un kit per l'esecuzione della CHAMP lineare, il kit comprendendo:
i) un enzima endonucleasi;
ii) una sonda lunga (LP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 3' reporter (R),
un sito di riconoscimento di un'endonucleasi (ERS), e
- una sequenza 5' AcT complementare a una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio da rivelare; e
iii) una sonda corta (SP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 5' AcR complementare a una porzione della sequenza reporter, e
- una sequenza 3' cERS complementare al sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione,
in cui sia la sequenza 5' AcT sia la sequenza 5' AcR sono sufficientemente corte affinché l'ibridazione della sonda corta sulla sonda lunga non avvenga in assenza della sequenza di acido nucleico bersaglio, e
e in cui il kit non contiene un enzima poiime rasi.
Un terzo oggetto della presente invenzione è un procedimento di rivelazione di una sequenza di acido nucleico bersaglio (T) in un campione di acido nucleico, il procedimento comprendendo le fasi di:
a) aggiungere al campione di acido nucleico una miscela di reazione comprendente:
i) un enzima endonucleasi;
ii) un eccesso di una sonda lunga (LP-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza 3' consistente nella sequenza di acido nucleico bersaglio (T) o una sua porzione (ΔΤ),
un sito di riconoscimento di un'endonucleasi (ERS), e
- una sequenza 5' AlcT che è complementare a una prima porzione della sequenza di acido nucleico da rivelare;
iii) un eccesso di una prima sonda corta (SP1-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza 5' A2cT che è complementare a una seconda porzione della sequenza di acido nucleico da rivelare, e
- una sequenza 3' AlcERS che è complementare a una prima porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi; e
iv) un eccesso di una seconda corta (SP2-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza A2cERS che è complementare a una seconda porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi, in cui la sequenza AlcERS della prima sonda corta e la sequenza A2cERS della seconda sonda corta insieme l'una con l'altra costituiscono il complemento dell'intero sito di riconoscimento dell'endonucleasi,
in cui la sequenza A2cERS è sufficientemente corta affinché 1'ibridazione della seconda sonda corta sulla sonda lunga non avvenga in assenza della sequenza di acido nucleico bersaglio,
e in cui la miscela di reazione non comprende un enzima polimerasi;
b) lasciare che la miscela di reazione reagisca con il campione di acido nucleico ad una temperatura a cui 1'endonucleasi è attiva cosicché, se la sequenza di acido nucleico bersaglio è presente nel campione di acido nucleico, si formi un sito di riconoscimento a doppio filamento dell'endonucleasi mediante ibridazione cooperativa della prima sonda corta, della seconda sonda corta e della sequenza di acido nucleico bersaglio sulla sonda lunga, e il sito di riconoscimento a doppio filamento dell'endonucleasi sia intaccato o tagliato dall'endonucleasi, cosicché una sequenza di acido nucleico bersaglio libera o una sua porzione sia rilasciata dalla sonda lunga; e
c) rivelare la sequenza di acido nucleico bersaglio libera o una sua porzione come indicatore della presenza della sequenza di acido nucleico bersaglio nel campione di acido nucleico.
Il procedimento di rivelazione sopra descritto corrisponde alla tecnica di rivelazione di acidi nucleici chiamata "CHAMP esponenziale".
Un quarto oggetto della presente invenzione è un kit per l'esecuzione della CHAMP esponenziale, il kit comprendendo:
i) un enzima endonucleasi;
ii) una sonda lunga (LP-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 3' consistente nella sequenza di acido nucleico bersaglio o una sua porzione (ΔΤ), un sito di riconoscimento di un'endonucleasi (ERS), e
- una sequenza 5' Alci che è complementare a una prima porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio da rivelare;
iii) una prima sonda corta (SPl-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza 5' A2cT che è complementare a una seconda porzione della sequenza di acido nucleico da rivelare, e
- una sequenza 3' AlcERS che è complementare a una prima porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi; e
iv) una seconda sonda corta (SP2-exp) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di:
- una sequenza A2cERS che è complementare a una seconda porzione del sito di riconoscimento dell' endonucleasi, in cui la sequenza AlcERS della prima sonda corta e la sequenza A2cERS della seconda sonda corta insieme una con l'altra costituiscono il complemento dell' intero sito di riconoscimento dell'endonucleasi,
in cui la sequenza A2cERS è sufficientemente corta affinché 1'ibridazione della seconda sonda corta sulla sonda lunga non avvenga in assenza della sequenza di acido nucleico bersaglio,
e in cui il kit non comprende un enzima polimerasi .
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell' invenzione appariranno dalla descrizione dettagliata che segue, effettuata a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
le figure 1 e 2 illustrano schematicamente le fasi procedimento di CHAMP lineare secondo 1 'invenzione;
le figure 3 e 4 illustrano schematicamente le fasi procedimento di CHAMP esponenziale secondo 1'invenzione;
le figure 5 e 6 illustrano schematicamente una forma di realizzazione della CHAMP lineare che prevede l'impiego di una sonda aggiuntiva, denominata ''sonda di spiazzamento".
Nella figura 1 è rappresentata la versione lineare della CHAMP che forma un oggetto della presente invenzione. Essa fa uso di uno stampo di acido nucleico sintetico a singolo filamento (ad esempio ssDNA) chiamato sonda lunga (LP) comprendente una sequenza reporter (R) al 3', un sito di riconoscimento di un'endonucleasi nicking (NE) e una sequenza 5' che è parzialmente complementare a quella del bersaglio di interesse (ΔοΤ). Questo stampo è in soluzione a concentrazione molto elevata, insieme a un acido nucleico a singolo filamento (ad esempio ssDNA) più corto, detto sonda corta (SP), che comprende una sequenza 5' (AcR) che è parzialmente complementare alla sequenza reporter e una sequenza 3' (cNE) che è complementare al sito NE. Pertanto, la sequenza della sonda corta è complementare a una porzione della sequenza della sonda lunga.
La sequenza 5' ΔοΤ ha preferibilmente una lunghezza compresa fra 10 e 20 nucleotidi.
La sequenza 5' AcR ha preferibilmente una lunghezza compresa fra 0 e 10 nucleotidi. Infatti, nel caso in cui fosse selezionata una endonucleasi avente una temperatura di utilizzo bassa, come ad esempio 37 °C, la lunghezza della sonda corta dovrebbe essere ridotta al minimo per evitare l'ibridazione in assenza di bersaglio. La sequenza minima utilizzabile per la sonda lunga deve includere interamente il sito di riconoscimento dell' endonucleasi ma non necessariamente parte della sequenza reporter, onde per cui, in questo caso, AcR potrebbe non essere presente.
Oltre alla sonda corta e alla sonda lunga, la miscela di reazione comprende altresì un enzima endonucleasi nicking, che intacca su un singolo filamento. Un'endonucleasi nicking preferita è la Nt.BstNBI. La miscela di reazione contiene altresì un tampone che fornisce le condizioni appropriate richieste per l'attività enzimatica.
La reazione viene condotta ad una temperatura costante a cui l'enzima impiegato è attivo, ad esempio compresa fra 50°C e 70°C, preferibilmente a circa 55°C. La temperatura di reazione viene selezionata in funzione della temperatura ottimale per lo specifico enzima impiegato. A questa temperatura, la sonda corta non è in grado di ibridarsi sulla sonda lunga, per cui le due sonde a singolo filamento si trovano in soluzione come due filamenti separati. Tuttavia, in presenza del bersaglio (T), l'ibridazione della sonda corta e del bersaglio con la porzione complementare della sonda lunga diventa possibile, grazie alle interazioni hase-stacking fra la base 3' terminale della sonda corta e la base 5' terminale del bersaglio.
L'ibridazione cooperativa delle tre sequenze (sonda corta, sonda lunga e bersaglio) ricostituisce il sito di riconoscimento a doppio filamento funzionale dell'endonucleasi e permette quindi l'intacco su un filamento della sonda lunga da parte dell'endonucleasi . In presenza di un intacco, la sequenza reporter R della sonda lunga si de-ibridizza spontaneamente dalla sonda corta, in quanto la porzione complementare AcR è troppo corta per mantenere 1'ibridazione alla temperatura di reazione. In conseguenza della deibridizzazione, anche la sonda corta si deibridizza, e ciò a sua volta destabilizza l'ibridazione del bersaglio, portando al rilascio del bersaglio in soluzione. La molecola bersaglio sarà così libera di iniziare un nuovo ciclo di ibridazione cooperativa, intacco e rilascio. In ciascun ciclo si libererà in soluzione una sequenza reporter. E' da notare che, a causa del riciclo, ciascun bersaglio rilascerà parecchie copie della sequenza reporter, portando all'amplificazione del segnale. Questa sequenza reporter può essere rivelata con qualsiasi metodologia di rivelazione a valle, ad esempio mediante strategie di rivelazione colorimetrica basate su nanoparticelle d'oro oppure in reai time usando una strategia di de-quenching della fluorescenza, come illustrato in Figura 2. In questo caso, un fluoroforo e un quencher sono legati a due basi che fiancheggiano il sito di riconoscimento dell'endonucleasi, sulla sonda lunga. In una forma di realizzazione preferita, il quencher (Q) è legato al terminale 5' della sequenza reporter o in prossimità di esso e il fluoroforo (F) è legato al terminale 3' del sito di riconoscimento dell'endonucleasi o in prossimità di esso. Finché la sonda lunga è intatta, la fluorescenza di background è molto bassa, a causa della presenza del quencher. Tuttavia, quando il bersaglio in soluzione causa l'intacco della sonda lunga, il fluoroforo viene separato dal quencher e il segnale di fluorescenza aumenta. Ciascun evento di ibridazione del bersaglio causa il rilascio di una sequenza reporter e il de-quenching della molecola di fluoroforo.
In una forma di realizzazione alternativa, 1'endonucleasi può essere un'endonucleasi di restrizione (che taglia su due filamenti) invece che un'endonucleasi nicking. In tal caso, il sito di riconoscimento dell'endonucleasi di restrizione sostituisce il sito NE illustrato nelle Figure 1 e 2, e la reazione viene effettuata alla temperatura ottimale richiesta per lo specifico enzima selezionato. In questa forma di realizzazione, le sequenze di tutte le sonde vengono disegnate in modo tale che le loro temperature di fusione siano adatte al sistema alla temperatura di reazione dell'enzima.
Nella figura 3 è rappresentata la versione esponenziale della CHAMP che forma un oggetto della presente invenzione. In questo caso, la sonda lunga (LP-exp), comprende una sequenza 3' identica al bersaglio di interesse (T) o, in alternativa, una sequenza identica a una porzione del bersaglio di interesse includente almeno la porzione complementare a ΔΐοΤ, vedi sotto), un sito di riconoscimento di un'endonucleasi nicking (NE) e una sequenza 5' complementare a una prima porzione del bersaglio di interesse (ΔΐοΤ). In soluzione vi sono inoltre due differenti sonde corte: una prima sonda corta (SPl-exp) include una sequenza 5' complementare a una seconda porzione del bersaglio di interesse (Δ2οΤ), e una sequenza 3' complementare a una porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi nicking (ΔΐοΝΕ); la seconda sonda corta (SP2-exp) include solo una sequenza che è complementare alla rimanente porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi nicking (Δ2οΝΕ).
La sequenza ΔΐοΤ ha preferibilmente una lunghezza compresa fra 10 e 20 nucleotidi.
La sequenza Δ2οΤ ha preferibilmente una lunghezza compresa fra 10 e 20 nucleotidi.
La sequenza Δ2οΝΕ ha preferibilmente una lunghezza compresa fra 0 e 5 nucleotidi. Nel caso in cui A2cNE non sia presente, ΔΙοΝΕ sarebbe complementare all'intera sequenza NE e il sistema includerebbe una sola sonda corta, analogamente a quello della CHAMP lineare.
In assenza di bersaglio, LP-exp e SPl-exp sono ibridate a formare una struttura che è stabile alla temperatura di reazione (ad esempio 55°C), chiamata ''complesso sonda". Al contrario, SP2-exp è libera in soluzione poiché è disegnata per essere troppo corta per ibridarsi alla temperatura di reazione. L'ibridazione di SP2-exp e del bersaglio sulla parte corrispondente di LP-exp diventa possibile, grazie all'ibridazione cooperativa, analogamente a quanto descritto sopra con riferimento alla CHAMP lineare.
E' da notare che l'ibridazione del solo bersaglio, in assenza di SP2-exp, non può verificarsi.
Pertanto, analogamente alla versione lineare della CHAMP, l'ibridazione cooperativa del bersaglio e di SP2-exp al complesso sonda ricostituisce il sito di riconoscimento intatto per l'enzima endonucleasi, consentendo la scissione enzimatica di LP-exp. La scissione rilascia la porzione T di LP-exp, che a sua volta destabilizza il legame di SPl-exp causando il suo rilascio. Ciò, a sua volta, causa la de-ibridizzazione sia di SP2-exp sia del bersaglio.
Sia la porzione T di LP-exp sia il bersaglio, che hanno sequenze identiche, sono libere di iniziare un nuovo ciclo di ibridazione cooperativa, intacco e rilascio. Pertanto, in ciascun ciclo, due copie del bersaglio vengono rese disponibili per il ciclo successivo. Ciò produce un'amplificazione esponenziale del bersaglio.
Come per la versione lineare della CHAMP, anche la versione esponenziale può essere accoppiata a una rivelazione in reai time basata su fluorescenza per analisi quantitative. In una forma di realizzazione fornita a titolo illustrativo, il fluoroforo è legato ad una base interna vicino all'estremità 3' della porzione T di LP-exp, mentre il quencher è legato all'estremità 5' di SPl-exp. Pertanto, nel complesso sonda di partenza, il fluoroforo e il quencher sono molto vicini l'uno all'altro, come mostrato in Figura 4, e la fluorescenza è spenta. Ogni evento di legame del bersaglio attiva l'intacco di LP-exp e il rilascio della sua porzione T, che porta il fluoroforo, portando quindi al de-quenching della fluorescenza (aumento del segnale di fluorescenza).
In una forma di realizzazione alternativa, 1'endonucleasi può essere un'endonucleasi di restrizione (che taglia su due filamenti) invece che un'endonucleasi nicking. In tal caso, il sito di riconoscimento dell'endonucleasi di restrizione sostituisce il sito NE illustrato nelle Figure 3 e 4, e la reazione viene effettuata alla temperatura ottimale richiesta per lo specifico enzima selezionato. In questa forma di realizzazione, le sequenze di tutte le sonde vengono disegnate in modo tale che le loro temperature di fusione siano adatte al sistema alla temperatura di reazione dell'enzima.
In tutte le forme di realizzazione descritte, sia con riferimento alla CHAMP lineare che con riferimento alla CHAMP esponenziale, una sonda di spiazzamento può essere aggiunta alla miscela di reazione, per favorire il riciclo del bersaglio e accelerare la velocità di reazione. La sonda di spiazzamento compete con il bersaglio per il legame alla sonda lunga, dopo il taglio o l'intacco da parte dell'endonucleasi.
Come illustrato in Figura 5 con riferimento alla CHAMP lineare, la sonda di spiazzamento è un oligonucleotide a singolo filamento che comprende;
una sequenza 5' AcERS complementare a una porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi, e
- una sequenza 3' ΔΤ che comprende una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio.
La sonda di spiazzamento ha un'affinità per il frammento della sonda lunga maggiore di quella del bersaglio, e spiazza il bersaglio mediante "toehold-mediated strand displacement" (spiazzamento del filamento mediato da un appiglio). La sonda di spiazzamento è presente nella miscela di reazione insieme al bersaglio, anche prima del taglio o intacco enzimatico. Tuttavia, essa non impedisce al bersaglio di legarsi alla sonda lunga intatta poiché, quando è presente la sonda lunga intatta, la sonda corta e il bersaglio insieme competono con la sonda di spiazzamento per il legame a due regioni sulla sonda lunga, parzialmente sovrapposte al sito di legame della sonda di spiazzamento, impedendo il legame della sonda di spiazzamento. E' da notare che in assenza di bersaglio, la sonda di spiazzamento impedisce anche il legame della sonda corta da sola (un legame instabile può verificarsi in assenza di stabilizzazione cooperativa) impedendo così la scissione aspecifica (indipendente dal bersaglio) della sonda lunga (Figura 6). In questo modo la sonda di spiazzamento ha una doppia funzione; favorire il riciclo del bersaglio, dopo la scissione; impedire il legame della sonda corta indipendente dal bersaglio e quindi impedire la scissione aspecifica.
In una forma di realizzazione non illustrata, che riguarda la CHAMP esponenziale, la sonda di spiazzamento è un oligonucleotide a singolo filamento che comprende:
una sequenza 5' A3cERS complementare a una porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi, e
- una sequenza 3' ΔΤ che comprende una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio.
Entrambe le tecniche di rivelazione di acidi nucleici che formano oggetto della presente invenzione (CHAMP lineare e CHAMP esponenziale) presentano i seguenti vantaggi:
semplicità della reazione (una provetta, un singola fase di reazione, una temperatura, un enzima), pertanto possono essere impiegate con dispositivi semplici per analisi sul campo e nel sito di cura del paziente;
- sono basate sull'ibridazione cooperativa, che non richiede la progettazione di sonde complesse, inneschi multipli o acidi nucleici con strutture secondarie (hairpin); questa caratteristica, insieme alla semplicità della reazione, fa sì che la CHAMP possa essere impiegata con qualsiasi acido nucleico bersaglio;
- possono essere realizzate anche con bersagli di RNA, senza retrotrascrizione, il che consente ad esempio l'analisi diretta e la quantificazione di miRNA;
- non richiedono una polimerasi, il che esclude che possano avvenire amplificazione aspecifiche in assenza di bersaglio;
possono essere accoppiate alla rivelazione fluorescente in reai time, il che consente quindi non solo la rivelazione ma anche la quantificazione del bersaglio.
Gli esempi che seguono sono forniti a scopo illustrativo e non limitativo della portata della presente invenzione, come definita nelle annesse rivendicazioni .
Esempio 1: rivelazione di miRNA21
MÌRNA21 è overespresso in molti tipi di tumore, pertanto la quantificazione del suo livello di espressione è rilevante nella diagnostica tumorale, MÌRNA21 è stato scelto come bersaglio modello sia per la CHAMP lineare sia per la CHAMP esponenziale.
Per la versione lineare della CHAMP, sono state usate le seguenti sequenze sintetiche:
• LP = 5' ATCAGACTGAT GTTGAGAGT CCTTTAGTGAG AGAATAGA 3' (SEQ ID NO:1)
• SP = 5' ACTAAAGGACTC 3' (SEQ ID NO;2)
• Bersaglio (T) = 5' TCAACATCAGTCTGATAAGCTA 3' (SEQ ID NO:3)
La sequenza bersaglio corrisponde al cDNA di miRNA2 1, come sarebbe ottenuto mediante trascrizione inversa standard; tuttavia la sequenza di miRNA può essere usata direttamente nel saggio.
LP e SP, ciascuna alla concentrazione finale di 500 nM, sono state miscelate in soluzione con 15 U di enzima nicking Nt.BstNBI e con il buffer di reazione dell'enzima, in un volume finale di 50 μΐ.
Per la versione esponenziale della CHAMP, sono state utilizzate le seguenti sequenze:
• LP-exp = 5' TATCAGACTGATGTTGAGAGTCGGAGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA 3 ' (SEQ ID NO:4)
• SPl-exp = 5' CAGACTGATGTTGACT 3' (SEQ ID NO:5) SP2-exp = 5' CCGACTC 3'
• Bersaglio (T) = 5' TCAACATCAGTCTGATAAGCTA 3' (SEQ ID NO:6)
E' stata preparata una miscela di reazione contenente LP-exp alla concentrazione finale di 1 μΜ, SPl-exp alla concentrazione finale di 5 μΜ, in buffer di reazione Nt.BstNBl. Questa soluzione è stata riscaldata a 90°C per 5 minuti, per distruggere la struttura secondaria in LP-exp (cioè un hairpin stabile con un gambo di 16 bp), e poi raffreddata lentamente a temperatura ambiente, per favorire l'ibridazione fra LP-exp e SPl-exp e la formazione del complesso sonda. Poi, 15 U di enzima nicking Nt.BstNBl sono stati aggiunti alla miscela in un volume finale di 50 μΐ.
Esempio 2 : esempio di sequenze per la rivelazione fluorescente real-time:
• LP = 5' ATCAGACTGAT GTTGAGAGT CCTTTAGTGAC AGAATAGA 3' (CHAMP Lineare Real-Time) (SEQ ID NO:7)
• LP-exp = 5' TATCAGAC TGATGT TGAGAGTCGGAGT CAACATCAGTCT GATAAGCT A 3' (CHAMP Esponenziale Real-Time) (SEQ ID NO:8)
• SPl-exp = 5' £AGAC TGATGTT GACT 3' (CHAMP Esponenziale Real-Time) (SEQ ID NO:9)
In LP, la posizione del fluoroforo e quella del quencher sono sottolineate rispettivamente con una sottolineatura singola e doppia.
In LP-exp, la posizione del fluoroforo è sottolineata con una sottolineatura singola. In SPl-exp, la posizione del quencher è sottolineata con una sottolineatura doppia.
Esempio 3: Rivelazione di un bersaglio di DNA genomico
Il DNA genomico è a doppio filamento e pertanto, prima della CHAMP, deve essere generato un bersaglio a singolo filamento. Questa fase preliminare può essere effettuata facilmente con varie strategie, ed è una fase necessaria anche per la maggior parte degli schemi di amplificazione isotermica della tecnica nota e pertanto non rappresenta una limitazione per l'ampia applicabilità della CHAMP. Ad esempio, un bersaglio di ssDNA può essere generato nello stesso tubo di reazione, scegliendo una regione del genoma contenente due siti per 1'endonucleasi impiegata, ad esempio Nt.BstNBl. Ad esempio, il plasmide pNL4,3, che contiene il genoma del virus HIV-1, contiene la sequenza GAGTCGAAGGTGTCCTTTTGCGCCGAGTC (SEQ ID NO:10) (i Siti Nt.BstNBl sono sottolineati), che genera un ssDNA di 24mer, che è un substrato adatto per la CHAMP.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Kit per la rivelazione di una sequenza di acido nucleico bersaglio (T), il kit comprendendo: i) un enzima endonucleasi; ii) una sonda lunga (LP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 3' reporter (R), un sito di riconoscimento di un'endonucleasi (ERS), e - una sequenza 5' AcT complementare a una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio da rivelare; e iii) una sonda corta (SP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 5' AcR complementare a una porzione della sequenza reporter, e - una sequenza 3' cERS complementare al sito di riconoscimento dell'endonucleasi, in cui sia la sequenza 5' AcT sia la sequenza 5' AcR sono sufficientemente corte affinché l'ibridazione della sonda corta alla sonda lunga non avvenga in assenza di sequenza di acido nucleico bersaglio, ed in cui il kit non comprende un enzima polimerasi.
  2. 2. Kit secondo la rivendicazione 1 in cui la sequenza 5' ΔοΤ è da 10 a 20 nucleotidi di lunghezza e la sequenza 5' AcR è da 0 a 10 nucleotidi di lunghezza.
  3. 3. Kit secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la sequenza reporter è marcata con un quencher (Q) e il sito di riconoscimento dell'endonucleasi è marcato con un fluoroforo (F).
  4. 4. Kit secondo la rivendicazione 3, in cui il quencher si trova sull'estremità 5' della sequenza reporter o in prossimità di essa e il fluoroforo si trova sull'estremità 3' del sito di riconoscimento dell'endonucleasi o in prossimità di essa.
  5. 5. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, che comprende inoltre una sonda di spiazzamento (DP) che è un oligonucleotide a singolo filamento comprendente: una sequenza 5' AcERS complementare a una porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi, e una sequenza 3' ΔΤ comprendente una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio.
  6. 6. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui l'endonucleasi è scelta fra un'endonucleasi nicking e un'endonucleasi di restrizione.
  7. 7. Procedimento di rivelazione di una sequenza di acido nucleico bersaglio (T) in un campione di acido nucleico, il procedimento comprendendo le fasi di: a) aggiungere al campione di acido nucleico una miscela di reazione comprendente: i) un enzima endonucleasi; ii) un eccesso di una sonda lunga (LP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 3' reporter (R), un sito di riconoscimento di un'endonucleasi (ERS), e - una sequenza 5' AcT complementare a una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio da rivelare; e iii) un eccesso di una sonda corta (SP) consistente in un oligonucleotide a singolo filamento consistente di: - una sequenza 5' AcR complementare a una porzione della sequenza reporter, e - una sequenza 3' cERS complementare al sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione, in cui sia la sequenza 5' ΔοΤ sia la sequenza 5' AcR sono sufficientemente corte affinché l'ibridazione della sonda corta sulla sonda lunga non avvenga in assenza della sequenza di acido nucleico bersaglio, e in cui la miscela di reazione non contiene un enzima polimerasi; b) lasciare che la miscela di reazione reagisca con il campione di acido nucleico ad una temperatura a cui 1'endonucleasi è attiva cosicché, se la sequenza di acido nucleico bersaglio è presente nel campione di acido nucleico, si formi un sito di riconoscimento a doppio filamento per l'enzima endonucleasi mediante ibridazione cooperativa della sonda corta e della sequenza di acido nucleico bersaglio sulla sonda lunga, ed il sito di riconoscimento a doppio filamento per l'enzima endonucleasi venga quindi intaccato o tagliato dall'endonucleasi, cosicché una sequenza reporter libera sia rilasciata dalla sonda lunga; e c) rivelare la sequenza reporter libera come indicatore della presenza della sequenza di acido nucleico bersaglio nel campione di acido nucleico.
  8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui la temperatura a cui la miscela di reazione è lasciata reagire con il campione di acido nucleico nella fase b) è compresa fra 50°C e 70°C, preferibilmente è di circa 55°C.
  9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui la sequenza 5' AcT è da 10 a 20 nucleotidi di lunghezza e la sequenza 5' AcR è da 0 a 10 nucleotidi di lunghezza.
  10. 10, Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 9, in cui la sequenza reporter libera è rivelata mediante un cambiamento in un parametro di fluorescenza, preferibilmente una diminuzione o un aumento dell'intensità di fluorescenza.
  11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 10, in cui la miscela di reazione comprende inoltre una sonda di spiazzamento (DP) che è un oligonucleotide a singolo filamento comprendente: una sequenza 5' AcERS complementare a una porzione del sito di riconoscimento dell'endonucleasi, e una sequenza 3' ΔΤ comprendente una porzione della sequenza di acido nucleico bersaglio.
  12. 12, Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a il, in cui l'enzima endonucleasi è scelto fra un'endonucleasi nicking e un'endonucleasi di restrizione.
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