CN101250593A - 乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片 - Google Patents

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CN101250593A CNA2008100262757A CN200810026275A CN101250593A CN 101250593 A CN101250593 A CN 101250593A CN A2008100262757 A CNA2008100262757 A CN A2008100262757A CN 200810026275 A CN200810026275 A CN 200810026275A CN 101250593 A CN101250593 A CN 101250593A
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Abstract

本发明公开了一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片及其用于检测与分型乳头瘤病毒的方法。该液相芯片主要包括有：分别包被有特异的anti－tag标签序列的微球，anti－tag标签序列与微球连接中间还设有7－10个T的间隔臂序列；所述anti－tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.47中的2种或2种以上的序列；针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；扩增出具有突变位点的目标序列的引物。本发明对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

Description

乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及一种用于人乳头瘤病毒检测与分型的方法及其液相芯片。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种小分子环状双链DNA病毒，通过性接触、直接或间接接触污染物品等途径在人群中广为传播，特异性地感染人体皮肤和粘膜的鳞状上皮细胞，引起多种良性或恶性病变，严重威胁着人类的健康。根据HPV基因的序列变异可将其分为多种类型。目前确定的HPV型别有100余种，其中约40种可以感染人生殖器官，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为高危型和低危型，低危型HPV如HPV6、11、40、42、43、44、53和54等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82及83等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。
大量流行病学和分子生物学研究资料表明HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关，HPV感染是宫颈癌的主要病因。大约80％的低度宫颈癌前病变的病人体内可以分离出HPV，高度宫颈癌前病变的病人中有90％可以分离出HPV，几乎所有患浸润性宫颈癌的妇女体内都能分离出HPV。而宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率高居女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年有45万的宫颈癌新发病例，导致死亡的接近25万例。因此，HPV DNA检测及分型对宫颈癌的早期诊断、判断预后以及指导治疗具有重要价值。
由于HPV体外增殖非常困难，到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测，如巴氏涂片法，薄层液基细胞学检查，阴道镜检查，组织病理学检查，电镜直接观察HPV病毒颗粒，放射免疫沉淀法检测患者血清HPV16抗体水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6，E7特异性抗体等。然而这些方法的检测灵敏度和特异性均不够理想，存在较高的假阳性率和假阴性率，同时无法做到早期诊断，更不能对HPV进行分型。HPV常用的分型方法有核酸杂交(包括斑点杂交法、荧光原位杂交法、southern杂交法以及杂交捕获法)，聚合酶链反应(PCR)技术(直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及目前很具影响力的基因芯片法)等。Southern杂交法是HPV基因分型的金标准，但此方法敏感性低、耗时、需要大量高度纯化的DNA，而且需要新鲜样本，不能用于DNA已降解的组织，故不适合于临床HPV分型的检测应用。荧光原位杂交法(ISH)能够在组织病理中估计目的核酸或基因的表达，但ISH测定HPV序列的敏感性很低。杂交捕获法(Digene公司HCII)是目前唯一通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术。该技术敏感性较好，重复性高，但不能确定具体的HPV亚型，且存在交叉反应，影响其检测的准确性。PCR技术检测灵敏度高，操作简单，但具有样品易污染、假阳性率高等缺点，同时，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。随着越来越多高危型HPV种类的确定，必须建立一种能同时检测至少15种高危型HPV的方法。基因芯片技术用于HPV分型检测，能一次检测多种常见类型的HPV，但传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。将液相芯片技术应用于人乳头瘤病毒HPV检测与分型将具有极大的优势。
公开号分别为CN1948503A及CN1814796A的中国专利申请分别公开了一种人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片。其主要步骤是：将针对不同HPV亚型核苷酸序列的特异性寡核苷酸探针包被在不同荧光编码的微球表面形成核酸探针微球集。同时，提取样本DNA，设计5’端生物素标记的HPV型特异的引物，进行多重PCR扩增。扩增产物与微球表面的特异性寡核苷酸探针进行杂交，反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白，最后通过Luminex仪器检测信号。由于需要把特异性的寡核苷酸探针包被到微球上，增加了包被步骤，同时所包被的微球仅能用于乳头瘤病毒HPV分型。此外，现有的HPV检测液相芯片技术在PCR扩增时采用5’端标记生物素的方式，因此荧光信号比较低，限制了检测的灵敏度。同时在PCR扩增以后没有对体系中多余的游离核苷酸(如生物素标记的引物及dNTP)进行处理，使得后续的杂交反应存在更多非特异性结合的可能，从而使检测结果的信噪比差。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片。
一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，包括有：
(1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQID NO.47中的2种或2种以上的序列；
(2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；
(3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。
优选地，扩增出具有突变位点的目标序列的引物为通用引物：
5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’
5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。
本发明的另一目的是使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法。
一种使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法，主要包括以下步骤：
1.提取样本中的DNA；
2.PCR扩增待测样品；
3.PCR反应产物用虾碱性磷酸酶及内切酶I进行酶切处理；
4.酶切处理后的PCR反应产物用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
5.将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
6.杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
7.通过荧光检测仪检测。
本发明所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能对HPV进行准确的分型，与测序法的吻合率高达100％。所选择的每种微球与相应的扩增产物杂交的信号基本上都大于5000，同时所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别HPV的感染，并能够准确诊断HPV混合感染。
利用本发明所提供的HPV检测与分型液相芯片系统能一次检测22种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染漏检的缺陷，真正实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测。还可根据临床检测的实际需要，选择相应的ASPE型特异性引物进行所需型别的分型检测。本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
附图说明
图1是本发明检测分型的方法原理示意图。
具体实施方式
实施例1人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片试剂盒，主要包括有：
一、特异性引物序列(ASPE引物)
针对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70、73、82、06、11、42、43、44共22种型别分别设计特异性的引物序列(18-22bp)，引物5’端分别加上一段24bp的特异的tag标签序列，这些tag标签序列能分别与对应的微球上的anti-tag序列特异地互补配对。ASPE序列如下表所示：
表1  ASPE引物序列
  SEQ NO.   型别   NCBI序列号   Sequence(5’→3’)
  1   HPV06   X00203   AATCTACAAATCCAATAATCTCATTCCGTAACTACATCTTCCA
  2   HPV11   M14119   CAATTCAAATCACAATAATCAATCTCTGTGTCTAAATCTGCTAC
  3   HPV16   K02718   CAATTCATTTCATTCACAATCAATTACCTACGACATGGGGAG
  4   HPV18   X05015   TCAACAATCTTTTACAATCAAATCTGCTTCTACACAGTCTCCT
  5   HPV31   J04353   TATATACACTTCTCAATAACTAACGCAATTGCAAACAGTGATAC
  6   HPV33   M12732   ATTATTCACTTCAAACTAATCTACTGCACACAAGTAACTAGTGA
  7   HPV35   M74117   CAATTTCATCATTCATTCATTTCACTGCTGTGTCTTCTAGTGA
  8   HPV39   M62849   TAATCTTCTATATCAACATCTTACTACATTATCTACCTCTATAGA
  9   HPV42   M73236   TTCAATCATTCAAATCTCAACTTTGCCACTGCAACATCTGGTG
  10   HPV43   AJ620205   CTTTTACAATACTTCAATACAATCTCTACTGACCCTACTGTG
  11   HPV44   U31788   CTACAAACAAACAAACATTATCAATACTAGTGAACAATATAAGCA
  12   HPV45   X74479   TCAATTACCTTTTCAATACAATACTAATTTAACATTATGTGCCTC
  13   HPV51   M62877   AATCCTTTTTACTCAATTCAATCATGCTGCGGTTTCCCCAA
  14   HPV52   X74481   TACATCAACAATTCATTCAATACAGAATACCTTCGTCATGGC
  15   HPV56   X74483   TACACAATCTTTTCATTACATCATGATGCACGAAAAATTAATCAG
  16   HPV58   D90400   TACAAATCATCAATCACTTTAATCTATGCACTGAAGTAACTAAG
  17   HPV59   X77858   CTACTAATTCATTAACATTACTACAGAATATGCCAGACATGTG
  18   HPV66   U31794   TACACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCGTGAAATCAATCAATACCTTC
  19   HPV68   AJ831568   TTACTACACAATATACTCATCAATCTGAATCAGCTGTACCAAA
  20   HPV70   U22461   CTACTTCATATACTTTATACTACATTTACATTGTCTGCCTGCA
  21   HPV73   NC_006165   CAATATACCAATATCATCATTTACGTATGCCAACTCTAATTTTAA
  22   HPV82   AB027021   CTTTATCAATACATACTACAATCAACTCCAACAAACTTTAAGCAGT
  23   β-globin   -   TCATTTACTCAACAATTACAAATCCCCTGACTTTTATGCCCAG
  24   阴性对照   CGTTAGGTCGGAGCTTGATC
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，3’端为HPV型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用ddH2O配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag标签序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的23种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 ASPE特异性引物右端的Tag序列及微球上对应的anti-tag序列
  HPV型别   微球编号   SEQ NO.   微球上对应的anti-tag序列
  HPV06   LUA60   25   ATGAGATTATTGGATTTGTAGATT
  HPV11   LUA05   26   GATTGATTATTGTGATTTGAATTG
  HPV16   LUA36   27   ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
  HPV18   LUA06   28   GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
  HPV31   LUA55   29   GTTAGTTATTGAGAAGTGTATATA
  HPV33   LUA32   30   GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT
  HPV35   LUA35   31   TGAAATGAATGAATGATGAAATTG
  HPV39   LUA09   32   GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA
  HPV42   LUA23   33   AAAGTTGAGATTTGAATGATTGAA
  HPV43   LUA20   34   GATTGTATTGAAGTATTGTAAAAG
  HPV44   LUA28   35   TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
  HPV45   LUA24   36   GTATTGTATTGAAAAGGTAATTGA
  HPV51   LUA22   37   TGATTGAATTGAGTAAAAAGGATT
  HPV52   LUA46   38   TGTATTGAATGAATTGTTGATGTA
  HPV56   LUA39   39   ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA
  HPV58   LUA11   40   GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA
  HPV59   LUA58   41   GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
  HPV66   LUA12   42   AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGTGTA
  HPV68   LUA41   43   ATTGATGAGTATATTGTGTAGTAA
  HPV70   LUA63   44   TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG
  HPV73   LUA50   45   GTAAATGATGATATTGGTATATTG
  HPV82   LUA02   46   TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
  β-globin   LUA67   47   GATTTGTAATTGTTGAGTAAATGA
选择的23种微球(FlexMAP微球)购自美国Luminex公司，也可自己合成tag序列，购买Luminex公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下：
根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列，每个anti-tag序列前加上一段10个T的“TTTTTTTTTT”的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，避光孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再避光孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤-次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA]中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物(SEQ NO.48-49)：
GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’
GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。
也可针对每一型别分别使用一对特异的引物进行多重PCR扩增，扩增出具有突变位点的目标序列，扩增产物混合后备用。
实施例2运用HPV检测与分型液相芯片对临床样本的检测与分型
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid) Sigma M-2933 0.05M 2.44g
  5MNaOH   Fisher SS256-500   ---   5滴
2×Tm杂交缓冲液
  试剂   来源   终浓度  每250ml的用量
  1MTris-HCl，pH8.0   SigmaT3038   0.2M   50ml
  5M NaCl   Sigma S5150   0.4M   20ml
  Triton X-100   Sigma T8787   0.16％   0.4ml
过滤后贮存于4℃
生物素标记的dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的选择及样本的DNA提取
选择20份经测序法进行HPV检测与分型的宫颈样本。其中8份为低危型HPV单型感染，包括3份HPV06型感染和5份HPV11型感染。10份为高危型HPV单型感染，包括4份HPV16型感染，4份HPV18型感染以及1份HPV52型感染，1份HPV58型感染。另外2份为混合型感染，其中1份为HPV06型与HPV18型混合感染，另外一份为HPV11型，HPV16型以及HPV18型混合感染。待测组织样本的DNA提取方法如下：
1.将宫颈脱落细胞的组织样本用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；
2.洗涤后的宫颈脱落细胞重悬于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/L Na2EDTA，0.5％Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K200，pH8.5)，55℃水浴消化1小时，99℃水浴15min灭活蛋白酶K；
3.12000转/分钟离心10分钟；
4.取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。
二、待测样品的PCR扩增
利用通用型引物GP5+/GP6+用于扩增HPV L1片段的高度保守区，产物大小为150bp。通用引物序列(SEQ NO.50-51)如下：
GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’
GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’
反应体系如下：
10×缓冲液           2ul
MgCl2                3ul
dNTP              1.5ul
Taq酶             0.5ul
上游引物GP5+      0.5ul
下游引物GP6+      0.5ul
模板DNA           5ul
ddH2O             12ul
                                            
共                25ul
PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 5min；4℃保存备用。
采用PC03/05通用引物对扩增β-globin基因，以验证DNA模板质量，并排除PCR反应体系中抑制因子的影响。引物序列如下：
PC03：5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’
PC05：5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’
人β-globin基因扩增的反应体系与扩增程序同HPV DNA的扩增，但引物分别替换为0.5uM的PC03和0.5uM的PC05。
三、PCR产物的酶切处理
1.取25ul PCR反应后的产物，加入2ul虾碱性磷酸酶(2U)和5ul的内切酶I(5U)
2.37℃孵育30min。99℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取HPV06，HPV11，HPV16，HPV18，HPV33，HPV35，HPV45，HPV52，HPV58型以及β-globin相应的ASPE引物贮存液2ul于1.5ml微量离心管中，加入182ul的ddH2O补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液              2ul
MgCl2                   3ul
Biotin-dCTP             5uM
dATP、dGTP、dTTP        各5uM
Tsp酶                   0.5ul
混合的ASPE引物工作液    2ul
PCR扩增产物             5ul
ddH2O                   4ul
                                       
共                      20ul
六、杂交反应
1.根据设计的HPV型特异的ASPE引物以及β-globin的ASPE引物，选择相应的最优的9种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检测中都分别选择LUA60，LUA05，LUA36，LUA18，LUA32，LUA35，LUA46，LUA11，LUA67共9种微球；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥8000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡漩震荡约20s，超声处理约20s；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，空白孔加25ul的dH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，96℃90s，37℃30min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥2250g离心3min ；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥2250g离心3min；
11.重复步骤9-10一次；
12.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
13.37℃孵育15min；
七、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，Luminex仪器检测，红色激光检测微球的荧光编号，从而确定HPV的型别，绿色激光检测报告分子的荧光信号，从而确定各型别DNA片段的浓度。
检测结果如表3和表4所示。
实验结果表明，对于对应的HPV亚型，该样品的荧光值(MFI)都是最高的，要比其他型别ASPE特异性引物检测的MFI值高出250倍以上。以阴性对照的MFI值为标准，各种型别检测的MFI值除以阴性对照的MFI值得出一个比值R作为阳性判定值(cut-off值)。高于cut-off值就视为该型的感染。以测序法检测与分型结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率(除去两个混合感染的样本，即样本号5和13，因为测序法分型技术本身存在缺陷，对于混合型感染，在测序过程中将遇到杂峰图形，因此无法准确地进行HPV混合型感染的判断)。以R≥200作为cut-off值，本方法检测20份样本的HPV分型结果与测序结果吻合率达到100％；以R≥100作为cut-off值，本方法检测20份样本的HPV分型结果与测序结果的吻合率仍为100％，以R≥50作为cut-off值，检测结果的吻合率还是100％，可见本发明所提供的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能够对HPV进行准确的分型，且结果稳定可靠。而现有的HPV检测与分型液相芯片由于采用探针末端标上一个生物素的方法，因此荧光信号值比较低(MFI值通常在1000左右)，信噪比相对较差；对于一些假阳性样本及混合感染型样本无法准确地进行判断，同时增加了分析结果判断过程中的主观因素。采用本发明的方法，则能够有效克服这些缺点，大大提高分型结果的可靠性。
表3 样本检测结果(MFI值)
  样本号   β-globin   阴性对照   06型 11型 16型 18型 31型 33型 35型 52型 58型
  1   6833   12   5345   136   8   12   7   6   6   9   10
  2   6526   15   15   20   6844   16   15   20   22   86   19
  3   6974   9   18   18   5675   15   20   20   18   105   16
  4   6058   8   12   10   10   16   12   14   13   8251   10
  5   5975   8   5574   122   23   5800   18   22   20   24   22
  6   6344   11   8   8   7   5498   6   9   6   6   8
  7   6820   7   164   6987   25   20   16   18   10   15   18
  8   6485   6   185   5658   20   15   14   14   17   10   16
  9   6650   7   5243   116   10   8   8   7   6   6   9
  10   6902   8   45   33   42   6781   21   20   25   32   33
  11   6238   8   9   7   7   6615   40   24   9   11   15
  12   6405   9   201   5114   16   17   16   15   15   9   7
  13   6853   13   85   4625   5243   6746   36   27   35   140   45
  14   5986   6   157   5610   22   18   21   25   13   18   20
  15   6742   7   27   43   7864   40   19   26   25   125   18
  16   6397   8   5432   172   18   18   23   25   13   20   21
  17   6725   13   24   10   12   6973   9   8   12   8   8
  18   6551   15   13   12   12   6   12   15   23   13   8069
  19   6479   10   14   34   5425   23   9   11   15   117   1320
  20   6269   12   108   6045   45   20   24   23   15   13   9
表4、样本分型结果
  样本号 测序分型结果   液相芯片分型结果
  1 HPV06单型   HPV06单型
  2 HPV16单型   HPV16单型
  3 HPV16单型   HPV16单型
  4 HPV52单型   HPV52单型
  5 HPV06&？？混合型   HPV06&HPV18混合型
  6 HPV18单型   HPV18单型
  7 HPV11单型   HPV11单型
  8 HPV11单型   HPV11单型
  9 HPV06单型   HPV06单型
  10 HPV18单型   HPV18单型
  11 HPV18单型   HPV18单型
  12 HPV11单型   HPV11单型
  13 HPV11&？？混合型   HPV11&HPV16&HPV18混合型
  14 HPV11单型   HPV11单型
  15 HPV16单型   HPV16单型
  16 HPV06单型   HPV06单型
  17 HPV18单型   HPV18单型
  18 HPV58单型   HPV58单型
  19 HPV16单型   HPV16单型
  20 HPV11单型 HPV11单型
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片
<160>51
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aatctacaaa tccaataatc tcattccgta actacatctt cca                            43
<210>2
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
caattcaaat cacaataatc aatctctgtg tctaaatctg ctac                           44
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
caattcattt cattcacaat caattaccta cgacatgggg ag                             42
<210>4
<211>43<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcaacaatct tttacaatca aatctgcttc tacacagtct cct                            43
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tatatacact tctcaataac taacgcaatt gcaaacagtg atac                            44
<210>6
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
attattcact tcaaactaat ctactgcaca caagtaacta gtga                            44
<210>7
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
caatttcatc attcattcat ttcactgctg tgtcttctag tga                             43
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
taatcttcta tatcaacatc ttactacatt atctacctct ataga                           45
<210>9
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ttcaatcatt caaatctcaa ctttgccact gcaacatctg gtg                             43
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cttttacaat acttcaatac aatctctact gaccctactg tg                       42
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ctacaaacaa acaaacatta tcaatactag tgaacaatat aagca                   45
<210>12
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tcaattacct tttcaataca atactaattt aacattatgt gcctc                   45
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
aatccttttt actcaattca atcatgctgc ggtttcccca a                       41
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tacatcaaca attcattcaa tacagaatac cttcgtcatg gc                      42
<210>15
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tacacaatct tttcattaca tcatgatgca cgaaaaatta atcag                        45
<210>16
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tacaaatcat caatcacttt aatctatgca ctgaagtaac taag                         44
<210>17
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ctactaattc attaacatta ctacagaata tgccagacat gtg                          43
<210>18
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tacactttct ttctttcttt ctttcgtgaa atcaatcaat accttc                       46
<210>19
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ttactacaca atatactcat caatctgaat cagctgtacc aaa                         43
<210>20
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ctacttcata tactttatac tacatttaca ttgtctgcct gca                         43
<210>21
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
caatatacca atatcatcat ttacgtatgc caactctaat tttaa                      45
<210>22
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctttatcaat acatactaca atcaactcca acaaacttta agcagt                      46
<210>23
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tcatttactc aacaattaca aatcccctga cttttatgcc cag                         43
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cgttaggtcg gagcttgatc                         20
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
atgagattat tggatttgta gatt                    24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gattgattat tgtgatttga attg                    24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
attgattgtg aatgaaatga attg                    24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
gatttgattg taaaagattg ttga                    24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
gttagttatt gagaagtgta tata                         24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
gtagattagt ttgaagtgaa taat                         24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tgaaatgaat gaatgatgaa  attg                        24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gtaagatgtt gatatagaag atta                         24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
aaagttgaga tttgaatgat tgaa                         24
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
gattgtattg aagtattgta aaag                        24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
ttgataatgt ttgtttgttt gtag                        24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga                        24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tgattgaatt gagtaaaaag gatt                        24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tgtattgaat gaattgttga tgta                        24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
atgatgtaat gaaaagattg tgta                         24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gattaaagtg attgatgatt tgta                         24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gtagtaatgt taatgaatta gtag                         24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
aaagaaagaa agaaagaaag tgta                         24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
attgatgagt atattgtgta gtaa                         24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tgtagtataa agtatatgaa gtag                       24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
gtaaatgatg atattggtat attg                       24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
tgattgtagt atgtattgat aaag                       24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
gatttgtaat tgttgagtaa atga                       24
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
tttgttactg tggtagatac                            20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
gaaaaataaa ctgtaaatca                         20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
acacaactgt gttcactagc                        20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
gaaacccaag agtcttctct                        20

Claims (4)

1.一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，其特征是，主要包括有：
(1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQID NO.47中的2种或2种以上的序列；
(2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；
(3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征是，所述扩增出具有突变位点的目标序列的引物为具有以下序列组成的通用引物：
5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’
5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。
3.使用权利要求1所述液相芯片试剂盒对乳头瘤病毒检测与分型的方法，其特征是，
主要包括以下步骤：
(1)提取样本中的DNA；
(2)PCR扩增待测样品；
(3)PCR反应产物用虾碱性磷酸酶及内切酶I进行酶切处理；
(4)酶切处理后的PCR反应产物用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(5)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(6)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(7)通过荧光检测仪检测。
4.根据权利要求3所述的对乳头瘤病毒检测与分型的方法，其特征是，所述步骤(5)和步骤(6)为：
a.分别取浓度为2.5×105个/ml的每种包被有特异的anti-tag标签序列微球1ul于微量离心管中；≥8000g离心1-2min；
b.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡漩震荡约20s，超声处理约20s；
c.取25ul上述微球悬液于滤板相应的孔中，空白孔加25ul的dH2O；
d.取5-25ul的特异性引物延伸反应后的产物于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
e.用锡箔纸包住96孔板以避光，96℃90s，37℃30min孵育杂交；
f.杂交后的微球于≥2250g离心3min；
g.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；微球于≥2250g离心3min；重复该步骤一次；
h.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白；37℃孵育15min。
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