TW201712122A - Ｈｐｖ檢測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於使用PCR相關方法對人類乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型，特定言之生殖器人類乳頭狀瘤病毒基因型之檢測。
Description
本發明係關於人類乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型、尤其生殖器人類乳頭狀瘤病毒基因型之檢測。
根據國際衛生組織(WHO)，子宮頸癌係女性之第二最常見癌症死亡原因。全球超過99%之子宮頸癌中涉及HPV感染之存在。如所估計，每年全球超過500,000個女性發生子宮頸癌，且超過273,000個病例係致命的。即使使用Pap篩選程式，每年仍有大量女性死於子宮頸癌。
HPV感染係全球最常發生的性傳播疾病(STD)，且高達60%之性活躍女性在其一生中將受HPV感染生殖道一次。不考慮HPV感染狀態，10,000個女性中少於1個將發生侵襲性子宮頸癌。大多HPV感染之女性不發生細胞學異常或癌症之事實強調了調節HPV感染之女性之子宮頸疾病進展為癌症之因子之重要性。該等因子可包括HPV基因型及分子變體、HPV病毒負載、HPV感染之持久性、與其他STD因子之共感染、宿主之免疫狀態及諸如吸煙等環境因子。
乳頭狀瘤病毒係小DNA病毒，其感染哺乳動物上皮細胞，引起上皮增生性病灶，該等病灶可係良性的，例如纖維乳頭狀瘤(疣)；或可係惡性的。所有乳頭狀瘤病毒均類似，此乃因其共享基因體大小、組織、開放閱讀框及蛋白質功能。在各種乳頭狀瘤病毒之間許多、但
並非所有基因體區域係保守的。
由於乳頭狀瘤病毒生命週期與宿主細胞分化狀態之間之緊密關聯，尚未完全闡明乳頭狀瘤病毒生命週期之細節。已知乳頭狀瘤病毒感染宿主上皮基底細胞，其中病毒基因體係作為與宿主細胞複製協同複製之低拷貝數游離基因體來建立並維持。隨著經感染之細胞分化為角質細胞，病毒DNA擴增，誘導晚期基因，且隨後乳頭狀瘤病毒營養複製。
乳頭狀瘤病毒可感染多種動物，包括人類。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)(包括乳頭瘤病毒科，α-、β-、γ-、δ-、μ乳頭狀瘤病毒及未分類之乳頭瘤病毒屬)係性傳播疾病之常見原因。已藉由DNA序列數據鑑別HPV之若干類型，且迄今為止96個HPV基因型已完全定序。HPV之基因型分型係基於L1、E6及E7基因之DNA序列。相對於先前經確定之品系之10%序列差異足以定義病毒之新類型。
人類乳頭狀瘤病毒群組之異質性大致地闡述於deVilliers,1989,J.Virology 63：4898-4903中，其以引用方式併入本文中。多種HPV類型之基因體已經定序且/或經表徵。
基於可獲得的分子、臨床及流行病學數據，HPV之亞組明確為子宮頸癌及其前驅形式之病原性因子。已在約90%之子宮頸腺癌及鱗狀細胞癌中檢測到HPV。多數HPV感染可自發清除，但已在由子宮頸腫瘤引起之轉移中發現HPV DNA之持久感染。然而，已知高危險(或致癌)HPV類型係子宮頸癌之重要危險因子且愈加認識到其於其他癌症中之作用。事實上，所有子宮頸癌(99%)均含有高危險HPV之基因，最常見類型為16、18、31、及45。其他高危險類型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68及73型。HPV31、33、35、51及52有時被認為係「中級危險」，此乃因其在輕度或嚴重發育不良病灶中較在癌症中更常見。。在高危險品系之間，HPV16及18與子宮頸癌關
聯最緊密。HPV16 DNA已於50%以上之鱗狀細胞癌中發現，而HPV18 DNA已於50%以上之腺癌中發現。然而，大多數肛門生殖器HPV具有致癌可能性。
迄今為止，與HPV感染及HPV檢測及分型方法之潛在應用領域關聯之臨床疾病包括尖形濕疣、硬化性苔蘚、鱗狀細胞增生、外陰上皮內瘤變、鱗狀細胞癌、子宮頸上皮內瘤變、子宮頸癌、子宮頸腺癌、肛門上皮內瘤變、陰莖上皮內瘤變、喉腺癌、復發性呼吸道乳頭狀瘤病及疣樣表皮發育異常。最近的證據表明HPV亦可在男性前列腺癌之發展中起作用。
子宮頸癌前驅病灶(上皮內病灶)或細胞學異常係使用柏氏染色(Papanicolaou Stain，其根據發明者George Papanicolaou稱為Pap抹片)來測試。該技術涉及將子宮頸刮取物塗抹於載玻片上，且使用核染色劑蘇木精將自肛門生殖道獲得之細胞染色。然而，Pap抹片缺乏重複性且其不足以預測即將發生的HPV誘導之瘤變。已顯示25%患有晚期原位癌之患者在診斷前數年可呈現正常Pap抹片或在子宮頸癌病例中在複檢時上次呈陰性之細胞學一致為陽性。愈加普遍之問題係在陰性Pap抹片3年內發生侵襲性癌症。
目前可接受的假陰性率(即根據病理學家之專家團檢查組織生檢而非抹片試樣確實患有發育異常，但在例行抹片篩選期間未經如此診斷之女性)係大約5-10%，但最近研究表明實際比率可顯著更高。此外，在約7-8%病例中，Pap抹片展示意義不明的非典型鱗狀細胞(ASCUS)。在其他20-30%病例中，Pap抹片可因炎性細胞之存在而不足以解釋。在子宮頸之病例中，扁平疣(藉由陰道鏡檢查可見)為可疑癌前病灶。已充分闡述扁平疣至原位癌及子宮頸癌之組織病理學進展。
在患有偶發HPV感染之女性之間上皮內病灶係常見早期事件，且
偶發HPV-16或HPV-18感染與生檢確認之2-3級CIN間之間隔似乎相對較短。然而，研究已證明經高危險HPV類型之感染通常係短暫的。HPV感染之持久性顯著增加進展為高等級上皮內病灶及侵襲性疾病之危險。
疾病之進展係可變的且其與HPV之減少或持久性相關。大量發育異常病灶自發消退，其他病灶未能進展，同時一些病灶迅速進展。
由於高危險基因型在子宮頸癌中之優先作用，且由於對於其他病況之不同、結果性及特徵性類型模式，故HPV之鑑別及分型二者皆非常重要。此外，高危險HPV之不同類型對經感染個體造成不同危險。舉例而言，相較於其他HPV類型，已在較高等級之子宮頸發育異常及癌中更一致地鑑別出HPV16及HPV18。HPV16亦在鱗狀癌病例中更普遍，且HPV18於腺癌病例中更普遍。
自1980年，若干病毒基因體已經選殖且在HPV之診斷中用作類型特異性探針。濾膜雜交技術已用於檢測與用於例行細胞學之試樣平行收集之子宮頸刮取物中之HPV DNA。HPV DNA探針已用於不同的基於雜交之分析(例如南方及雜交墨點/南方分析)中以檢測臨床獲得之組織試樣中之HPV DNA。此外，已展示經純化之生檢DNA及經保存組織樣本中之原位雜交，亦即彼等與核酸探針互補之序列於完整細胞內之直接定位。
已研發出多種使用類型特異性反應來檢測人類乳頭狀瘤病毒類型之方法，一次檢測一種HPV類型。聚合酶鏈式反應(PCR)已用於擴增且檢測HPV16及HPV18 DNA之存在，尤其檢測口腔及子宮頸生檢中之HPV16。已闡述引子混合物，其用於藉由PCR對1a、5、6a、8、11、16、18及33型中之HPV序列進行特異性擴增。美國專利第4,683,195號及第4,683,202號揭示PCR及使用PCR檢測試樣中核酸序列
之存在或不存在。
美國專利第5,447,839號(其以引用方式併入本文中)揭示用於HPV之檢測及分型之方法。在此方法中，使用擴增致癌及非致癌HPV類型二者之通用引子藉由PCR擴增試樣中之HPV DNA序列。因此，試樣中HPV之存在係藉由擴增產物之形成來指示。然後，使用與DNA之經擴增區域雜交之類型特異性DNA探針來將HPV分型。此專利中所揭示之類型特異性雜交探針能夠鑑別並區分5種已知HPV致癌類型，亦即HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18及HPV-33。
已設計多種用於檢測HPV之高危險類型之方法。許多該等方法依賴於檢測HPV基因體中之獨特序列。舉例而言，業內已報導與特定高危險HPV品系之基因之一部分互補的DNA或RNA探針，如用於篩選患者試樣中特定高危險HPV品系之存在(美國專利第4,849,332號，其以引用方式併入本文中)。美國專利第5,705,627號(以引用方式併入本文中)報導使用簡併或混合通用引子使用PCR來擴增且檢測HPV DNA，隨後使用基因型特異性DNA探針混合物來分型。使用通用引子之其他實例可參見美國專利第5,364,758號及Kleter,B.等人，Am.J.of Pathology，第153卷，第6期，1731-39(1998)。該等參考文獻亦以引用方式併入本文中。
可使用基於雜交及信號放大之商業方法。(Hybrid Capture II,Digene Corp.)。然而，據報導此方法由於HPV基因體中某一部分之高序列同源性而具有特異性問題。
基於放大之方法由負責靈敏度(放大)之一部分組成，該部分與彼等負責特異性(藉由雜交來檢測)之部分分開。該等技術之不同之處在於經擴增基因體部分、引子數目及檢測技術。最常用擴增方法係GP5+-GP6+(通用引子-GP)、MY9-MY11、PGMY、SPF、L1C及類型特異性PCR反應。最常用檢測技術係序列特異性雜交、限制片段長度
多形性(RFLP)及線性探針分析(LiPA)。有時，但極少地，應用定序或其他方法。擴增之分析性質在廣泛範圍內變化且藉由基因型數目(其可擴增)、分析靈敏度、基因型擴增/檢測之特異性亦及基因型靈敏度間差異來表徵。
人類乳頭狀瘤病毒-16(HPV-16)病毒負載可係預測高等級子宮頸病灶之存在之生物標記。已研發出若干即時PCR分析來精確量測HPV-16病毒負載(HPV-16 L1、HPV-16 E6及HPV-16 E6 PG)。該等方法即時實施HPV檢測，但一次僅檢測一種基因型。
使用SYBR® Green即時PCR來實施患有幼髮型復發性呼吸道乳頭狀瘤病之患者中之HPV DNA鑑別。該方法用於在即時PCR反應中檢測多種人類乳頭狀瘤病毒基因型。然而，該擴增方法不同於本發明中所述者。所產生擴增子(約450bp)長於業內基於探針之即時擴增方法可接受者。較佳長度係150bp或更短。該檢測方法係非特異性的且不能可靠地區分基因型，此使得隨後必須使用即時PCR及針對6、11、16、18、31及33型HPV之類型特異性引子進行病毒分型。此再次檢測分離物中人類乳頭狀瘤病毒之類型，但一次僅檢測一種基因型。
用於檢測僅一種人類乳頭狀瘤病毒核酸分子(例如編碼L1之一部分之核酸分子)之引子及探針，可使用(例如)諸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade,Colo.)或Primer3等電腦程式來設計。該等寡核苷酸之適當特徵已為熟習此項技術者所熟知。
存在關於PCR引子設計之一般原則之大量文獻，其已產生多種軟體應用，最值得注意的是Primer3及各種擴展。亦已研發用於測試引子之成對相容性之快速動態編程公式。在過去十年中，多重PCR之應用已穩步增加，需要更先進的引子選擇方案。不同算法可偏好特定目
標，或可經設計用於特定技術平臺。通常，已顯示鑑別引子對以最大化單一分析之多工等級之問題係NP完全的。已提出消除3'鹼基互補性同時對產物大小限制定址之近似算法。
需要HPV檢測之即時PCR方法，其便宜、快速、穩健、高通量，具有足夠特異性以鑑別個別HPV類型，同時亦具有高靈敏度。
該等目標係矛盾目標，此乃因即時PCR方法(例如Taqman系統)需要通用引子，其通常不容許針對不同HPV類型調整靈敏度。因此，必須設計HPV類型特異性引子，其作用類似於通用引子，即充分覆蓋(理想或理論的HPV基因體之)相同區域。若該等引子隨機放置或毗鄰放置，則諸如Taqman等即時PCR方法將不能工作。
此設計環境並不簡單。需要大量最佳化以確保類型特異性引子儘可能多地彼此覆蓋。使用便捷設計軟體無法達成此目標。
另外，考慮到引子及探針序列，必須考慮高性能、穩健即時PCR方法(例如Taqman反應)之所有常見設計要求。此包括確保擴增子長度小於150bp，引子之熔融溫度為約60℃且探針之熔融溫度為68℃。
此外，該測試法必需在不降低分析特異性之情形下仍具有高靈敏度。
先前要求HPV測試儘可能具有特異性以使得其不會發現過多不需要治療之HPV陽性女性(一般感染相對於需要治療之病灶之比率係10：1)。
然而，現可藉由使用特異性生物標記來使用分類測試，其可在許多HPV陽性女性中發現少量癌前病灶。現認為HPV係危險因子。因此，現在需要高靈敏度HPV測試且其更有用，此乃因瞭解哪些患者處於危險中係重要的。一旦患者經鑑別為患有HPV時，即可監測或派送該患者進行進一步篩選以鑑別處於早期之病灶發展。
本申請案提供便宜、快速、穩健、高通量方法，其能夠在保留
高靈敏度之同時檢測且鑑別所有HPV。本發明方法可用作高危險HPV感染之篩選測試。使用基因型特異性引子及探針提供用於篩選及基因型分型二者之同質系統。先前已知方法不能同時進行篩選及基因型分型。
本發明提供用於檢測HPV之存在之方法，其包含利用一或多種擴增混合物來擴增自試樣所獲得之核酸，其中該等擴增混合物選自：
(a)擴增混合物1，其包含：
5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：1)
5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3’(SEQ.ID NO：2)
5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3’(SEQ.ID NO：3)
(b)擴增混合物2，其包含
5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3’(SEQ.ID NO：4)
5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3’(SEQ.ID NO：5)
5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3’(SEQ.ID NO：6)
(c)擴增混合物3，其包含
5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3’(SEQ.ID NO：10)
5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3’(SEQ.ID NO：11)
5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3’(SEQ.ID NO：12)
(d)擴增混合物4，其包含
5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3’(SEQ.ID NO：13)
5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3’(SEQ.ID NO：14)
5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3’(SEQ.ID NO：15)
(e)擴增混合物5，其包含
5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3’(SEQ.ID NO：16)
5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3’(SEQ.ID NO：17)
5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3’(SEQ.ID NO：18)
(f)擴增混合物6，其包含
5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3’(SEQ.ID NO：19)
5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3’(SEQ.ID NO：20)
5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3’(SEQ.ID NO：21)
(g)擴增混合物7，其包含
5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3’(SEQ.ID NO：22)
5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：23)
5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3’(SEQ.ID NO：24)
(h)擴增混合物8，其包含
5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：25)
5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3’(SEQ.ID NO：26)
5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3’(SEQ.ID NO：27)；或
(i)擴增混合物9，其包含
5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3’(SEQ.ID NO：31)
5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：32)
5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3’(SEQ.ID NO：33)
(j)擴增混合物10，其包含
5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3’(SEQ.ID NO：34)
5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3’(SEQ.ID NO：35)
5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3’(SEQ.ID NO：36)
(k)擴增混合物11，其包含
5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3’(SEQ.ID NO：37)
5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3’(SEQ.ID NO：38)
5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3’(SEQ.ID NO：39)
(l)擴增混合物12，其包含
5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3’(SEQ.ID NO：40)
5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：41)
5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3’(SEQ.ID NO：42)
(m)擴增混合物13，其包含
5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3’(SEQ.ID NO：43)
5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3’(SEQ.ID NO：44)
CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3’(SEQ.ID NO：45)
(n)擴增混合物14，其包含
TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3’(SEQ.ID NO：46)
5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：47)
5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3’(SEQ.ID NO：48)；
其中SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。較佳地，SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
該方法可進一步包含量測染料所產生之信號。信號之存在指示所測試之HPV基因型存在。若未檢測到信號，則所測試之HPV基因型不存在，且試樣來自未感染所檢測基因型之HPV的患者。可藉由將試樣曝露至適宜波長之光以誘導染料發射螢光來檢測信號。
本發明亦提供用於檢測HPV之存在之方法，其包含利用一或多種擴增混合物來擴增自試樣所獲得之核酸，其中該等擴增混合物選自：
(a)擴增混合物15，其包含
5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：1)
5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3’(SEQ.ID NO：2)
5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3’(SEQ.ID NO：3)
5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3’(SEQ.ID NO：4)
5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3’(SEQ.ID NO：5)
5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3’(SEQ.ID NO：6)
(b)擴增混合物16，其包含
5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3’(SEQ.ID NO：10)
5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3’(SEQ.ID NO：11)
5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3’(SEQ.ID NO：12)
5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3’(SEQ.ID NO：13)
5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3’(SEQ.ID NO：14)
5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3’(SEQ.ID NO：15)
5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3’(SEQ.ID NO：16)
5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3’(SEQ.ID NO：17)
5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3’(SEQ.ID NO：18)
5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3’(SEQ.ID NO：19)
5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3’(SEQ.ID NO：20)
5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3’(SEQ.ID NO：21)
5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3’(SEQ.ID NO：22)
5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：23)
5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3’(SEQ.ID NO：24)
5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：25)
5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3’(SEQ.ID NO：26)
5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3’(SEQ.ID NO：27)；或
(c)擴增混合物17，其包含
5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3’(SEQ.ID NO：31)
5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：32)
5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3’(SEQ.ID NO：33)
5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3’(SEQ.ID NO：34)
5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3’(SEQ.ID NO：35)
5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3’(SEQ.ID NO：36)
5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3’(SEQ.ID NO：37)
5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3’(SEQ.ID NO：38)
5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3’(SEQ.ID NO：39)
5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3’(SEQ.ID NO：40)
5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：41)
5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3’(SEQ.ID NO：42)
5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3’(SEQ.ID NO：43)
5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3’(SEQ.ID NO：44)
CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3’(SEQ.ID NO：45)
TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3’(SEQ.ID NO：46)
5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：47)
5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3’(SEQ.ID NO：48)；
其中SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末
端處。較佳地，SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
較佳地，該方法進一步包含使用能夠擴增人類對照基因、較佳因子V來登基因(factor V leiden gene)之擴增混合物來擴增自試樣所獲得之核酸。
更佳地，能夠擴增人類對照基因之擴增混合物包含：擴增混合物18，其包含
5'-TCTGAAAGGTTACTTCAAGGACAA-3'(SEQ.ID NO：52)
5'-CATCGCCTCTGGGCTAATAG-3'(SEQ.ID NO：53)
5'-CTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC-3'(SEQ.ID NO：54)
其中SEQ ID No：54標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。較佳地，SEQ ID No：54在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
該方法包含一或多個反應。該方法可包含1個、2個、3個、4個或更多個使用擴增混合物1至18之任何組合之反應。較佳地，該方法可包含1個、2個、3個或4個使用擴增混合物15-18之任何組合之反應。較佳地，各反應係使用擴增混合物分開實施，即，使每一擴增混合物與核酸試樣反應。較佳地，在一個反應中，不將兩種或更多種擴增混合物混合在一起，且各擴增混合物之反應係在單獨容器中實施。或者，選自擴增混合物1-17之若干擴增混合物(例如至多3種擴增混合物)，視情況連同能夠擴增人類對照基因之擴增混合物(例如擴增混合物18)，及/或內部對照基因擴增混合物可一起用於一個反應中。可將1種、2種、3種或更多種混合物，視情況與人類對照基因混合物及/或內部對照基因混合物一起置於一個容器中。較佳地，至多3種選自擴增混合物1-17之擴增混合物用於一個反應中。如本文所用「容器」係
指反應室。此可係多孔板內之孔或單獨分離之容器，例如埃彭道夫管(eppendorf tube)。
每一擴增混合物均包含用於擴增及鑑別任何存在之HPV核酸序列之引子及探針。擴增混合物15號靶向HPV 16及18，擴增混合物16號靶向HPV 31、33、52、56、58、59；擴增混合物17號靶向HPV 35、39、45、51、66、68；且擴增混合物反應18號靶向人類對照基因，例如因子V來登基因。各反應較佳亦具有內部對照。
較佳地，擴增混合物進一步包含一或多種內部對照引子。舉例而言，擴增混合物1-18可進一步包含Seq.ID No 7、8及9，其中SEQ ID No：9標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。較佳地，SEQ ID No：9在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。舉例而言，擴增混合物15較佳進一步包含：
5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3’(SEQ.ID NO：7)
5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3’(SEQ.ID NO：8)
5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'；(SEQ.ID NO：9)；且/或擴增混合物16進一步包含
5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3(SEQ.ID NO：28)
5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3(SEQ.ID NO：29)
5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’；(SEQ.ID NO：30)；且/或擴增混合物17進一步包含
5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3’(SEQ.ID NO：49)
5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3’(SEQ.ID NO：50)
5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’(SEQ.ID NO：51)；且/或擴增混合物18進一步包含
5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3'(SEQ.ID NO：55)
5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3'(SEQ.ID NO：56)
5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'(SEQ.ID NO：57)
其中SEQ ID No：9、30、51及57標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。較佳地，SEQ ID No：9、30、51及57在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
較佳地，擴增混合物15由SEQ.ID No：1-6組成；且/或擴增混合物16由SEQ.ID No：10-27組成；且/或擴增混合物17由SEQ.ID No：31-48組成；且/或擴增混合物18由SEQ.ID No：52-54組成。
更佳地，擴增混合物15由SEQ.ID No：1-9組成；且/或擴增混合物16由SEQ.ID No：10-30組成；且/或擴增混合物17由SEQ.ID No：31-51組成；且/或擴增混合物18由SEQ.ID No：52-57組成。
寡核苷酸引子及探針可藉由多種方式來合成，例如Ozaki等人，Nuc.Acids Res. 20：5205-5214(1992)；Agrawal等人，Nuc.Acids Res.18：5419-5423(1990)或諸如此類。便利地，寡核苷酸引子及探針係於自動化DNA合成器(例如Applied Biosystems,Inc.(Foster City,California)之392或394型DNA/RNA合成器)上使用諸如亞磷醯胺化學等標準化學合成(Beaucage及Iyer，Tetrahedron 48：2223-2311(1992)；美國專利第4980460號、第4725677號、第4415732號、第4458066號及第4973679號)。
SEQ.ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54及57係探針。用於擴增混合物中之探針標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。因此，探針可在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑，或探針可在5’末端處標記有淬滅劑且在3’末端處標記有染料。較佳地，用於擴增混合物中之探針在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
較佳地，染料係螢光染料。淬滅劑及/或染料在擴增過程中藉由聚合酶(例如Taq聚合酶)自探針移除且因此可檢測到來自該染料之信號。「在5’末端處」及「在3’末端處」分別意指染料或淬滅劑附接至探針之5’末端處或3’末端處之核苷酸。
如本文所用，「淬滅劑」係減少螢光標記所發射之螢光的部分體。此包括完全及部分抑制螢光發射。抑制程度不重要，只要在淬滅劑移除後可檢測到螢光變化即可。
淬滅部分體較佳選自由以下組成之群：四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine,TAMRA)、視情況經取代之苯基、萘基、蒽基、苯并噻唑、苯并噁唑或苯并咪唑、芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚、苯并吲哚、噁唑、苯并噁唑、噻唑、苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑、青色素、羰花青、喹諾酮、卟啉、柳酸酯、鄰胺基苯甲酸酯、甘菊藍(azulene)、苝、吡啶、喹啉、香豆素、聚氮雜苯并二茚(polyazaindacene)、二苯并哌喃、噁嗪、苯并噁嗪、卡巴嗪(carbazine)、次聯苯甲酮、苯并次聯苯甲酮、卡巴嗪、噁嗪、4-硼雜-3a,4a-二氮雜-s-苯并二茚、螢光黃素(fluorophorescene)、羅丹明、對甲胺基酚、5-羧基螢光黃素、5-(2'-胺基乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰胺基苯甲醯胺、鋱螯合物、活性紅4、4-(對二甲胺基偶氮苯)苯甲酸(dabcyl)、硝基酪胺酸、孔雀石綠、德克薩斯紅(Texas red)、二硝基苯、ATTO染料、EVO染料、DYO染料、Alexa染料及BODIPY染料。較佳地，淬滅劑選自可自Life technologies獲得之QSY®。
較佳地，染料係螢光染料。代表性供體螢光染料包括6-羧基螢光黃素(FAM)、四氯螢光黃、(TET)、螢光黃、螢蝦黃(Lucifer Yellow)、B-藻紅素、9-吖啶異硫氰酸酯、螢蝦黃VS、4-乙醯胺基-4'-異硫-氰醯二苯乙烯-2,2'-二磺酸、7-二乙基胺基-3-(4'-異硫氰醯苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸羥基琥珀醯亞胺酯、4-乙醯胺基-4'-異硫氰醯
二苯乙烯-2,2'-二磺酸衍生物、視情況經取代之芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚、苯并吲哚、噁唑、苯并噁唑、噻唑、苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑、青色素、羰花青、喹諾酮、卟啉、柳酸酯、鄰胺基苯甲酸酯、甘菊藍、苝、吡啶、喹啉、香豆素、聚氮雜苯并二茚、二苯并哌喃、噁嗪、苯并噁嗪、卡巴嗪、次聯苯甲酮、苯并次聯苯甲酮、卡巴嗪、噁嗪、4-硼-3a,4a-二氮雜-s-苯并二茚、螢光黃素、羅丹明、對甲胺基酚、5-羧基螢光黃素(FAM)、5-(2'-胺基乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰胺基苯甲醯胺、鋱螯合物、活性紅4、德克薩斯紅、ATTO染料、EVO染料、DYO染料、Alexa染料及BODIPY染料。較佳地，染料選自可自Life technologies獲得之FAM®、VIC®、ABY®及JUN®。四甲基羅丹明(TAMRA)可用作染料以及淬滅劑，此端視染料/淬滅劑之組合而定。適宜染料/淬滅劑組合為熟習此項技術者所已知。
一種擴增混合物內之不同探針可標記有相同或不同染料。若不同有色染料用於混合物中之不同探針，則可檢測到不同HPV基因型之存在。舉例而言，若擴增混合物15中之探針標記有不同有色染料，則可鑑別HPV16、HPV18或兩種基因型是否存在於試樣中。
該方法可使用兩種或更多種擴增混合物來實施。較佳地，針對各擴增混合物實施單獨反應。舉例而言，倘若該方法使用兩種擴增混合物，則實施兩種反應，每一反應於單獨室中進行。或者，至多3種選自混合物1至17之擴增混合物視情況與內部對照擴增混合物(例如SEQ.ID No：7、8及9)及/或能夠擴增人類對照基因之混合物(例如擴增混合物18)可一起混合於單一反應室中之一個反應中。擴增反應可同時(即在相同時間)或依序(即一者在另一者之後)來實施。
較佳地，利用PCR來擴增核酸；更佳地，利用即時PCR。
較佳地，使用聚合酶鏈式反應(PCR)來實施擴增。擴增反應可係
PCR(例如，參見美國專利第4,683,195號及第4,683,202號及Innis等人，編輯，PCR Protocols,(Academic Press,New York,1989)；Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版，(Cold Spring Harbour Laboratory,New York 1989))。當RNA已經分離且(較佳藉由反轉錄)轉化為cDNA時亦可使用PCR。較佳地，PCR係使用Taq DNA聚合酶來實施，該聚合酶例如AmplitaqTM(Perkin-Elmer,Norwalk,Conn.)。亦可自MBI Fermentas、Perkin Elmer、Boehringer Mannheim及Beckman Instruments獲得Taq聚合酶。較佳熱穩定之等效DNA聚合酶亦可用於本發明方法中，例如Tfl(黃棲熱菌，Thermus flavus)聚合酶(Gut等人，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999))。
或者，擴增反應可係RT-PCR(Yajima等人，Clin.Chem, 44(12)：2441-2445(1998)；Martell等人，J.Clin.Microbiol., 37(2)：327-332(1999)；Gut等人，Virol.Methods 77(1)：37-46(1999)；Predhomme等人，Leukemia, 13(6)：957-964(1999))，其中RNA反轉錄為cDNA，然後該cDNA經受PCR擴增。
如眾所周知的，PCR涉及DNA(或RNA)試樣之提取及變性(較佳熱變性)。添加莫耳過量之寡核苷酸引子連同聚合酶(其可係熱穩定的)及dNTP用以形成擴增序列。寡核苷酸引子經設計以雜交至期望擴增序列之相對末端。在第一輪擴增中，聚合酶複製DNA以產生兩個始於各別引子之「長產物」。然後，使包括兩個長產物及兩條原始鏈之總DNA變性且實施第二輪聚合(例如藉由降低溫度)。第二輪得到兩條原始鏈、來自第一輪之兩個長產物、兩個新的長產物(自原始鏈產生)及兩個自該等長產物產生之「短產物」。該等短產物具有靶標序列(正義或反義)之序列，引子位於每一末端處。對於每一輪額外擴增，短產物之數目指數式增長，每一輪產生另外兩個長產物，且短產物之數目等於在前一輪結束時保留的長及短產物之總和。
較佳地，利用Taqman系統來擴增核酸。TAQMANTM技術檢測擴增產物之存在或不存在，且因此檢測人類乳頭狀瘤病毒之存在或不存在。TAQMANTM技術利用一個標記有兩個螢光部分體之單鏈雜交探針。當第一螢光部分體經適宜波長之光激發時，所吸收能量根據FRET原理傳遞至第二螢光部分體。第二螢光部分體通常為淬滅劑分子。在PCR反應之退火步驟期間，經標記雜交探針結合至靶標DNA且在隨後延長期期間藉由Taq聚合酶之5'至3'核酸外切酶活性降解。因此，經激發螢光部分體及第二螢光部分體變為彼此空間分離。因此，在不存在第二螢光之情形下激發第一螢光部分體後，來自第一螢光部分體之螢光發射可檢測地改變。舉例而言，若第二螢光部分體係淬滅劑，則來自第一螢光部分體之螢光發射增加且從而可檢測到。借助實例，ABI PRISMTM 7700序列檢測系統(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)使用TAQMANTM技術且適用於實施用於檢測人類乳頭狀瘤病毒之方法。關於PCR擴增及使用ABI PRISMTM 7700系統檢測之資訊可於Applied Biosystems之網站上找到。
對自生物試樣獲得之核酸實施本發明方法。代表性生物試樣包括子宮頸刮取物、生檢、抹片或石蠟組織切片、其他發生人類乳頭狀瘤病毒感染之解剖位點之刮取物及尿液。較佳地，試樣選自支氣管吸出物、尿液、前列腺按摩液(prostata massate)、精液(ejaculatum)、血液及子宮頸、外陰、肛門、生殖器、皮膚或喉細胞學試樣、刮取物或生檢。較佳地，試樣係子宮頸刮取物，例如在Pap抹片測試期間獲得者。可使用習用方法自試樣分離核酸。
如本文所用，「核酸」係指呈其各種形式之DNA及RNA，例如mRNA及hnRNA。核酸可為單鏈或雙鏈。
較佳擴增混合物包含以下或由其組成：
擴增混合物A
本發明亦提供用於HPV檢測中之擴增混合物，該擴增混合物包含：
(a)SEQ.ID No：1-3；及視情況SEQ.ID No：7-9
(b)SEQ.ID No：3-6；及視情況SEQ.ID No：7-9
(c)SEQ.ID No：10-12；及視情況SEQ.ID No：28-30
(d)SEQ.ID No：13-15；及視情況SEQ.ID No：28-30
(e)SEQ.ID No：16-18；及視情況SEQ.ID No：28-30
(f)SEQ.ID No：19-21；及視情況SEQ.ID No：28-30
(g)SEQ.ID No：22-24；及視情況SEQ.ID No：28-30
(h)SEQ.ID No：25-27；及視情況SEQ.ID No：28-30
(i)SEQ.ID No：31-33；及視情況SEQ.ID No：49-51
(j)SEQ.ID No：34-36；及視情況SEQ.ID No：49-51
(k)SEQ.ID No：37-39；及視情況SEQ.ID No：49-51
(l)SEQ.ID No：40-42；及視情況SEQ.ID No：49-51
(m)SEQ.ID No：43-45；及視情況SEQ.ID No：49-51
(n)SEQ.ID No：46-48；及視情況SEQ.ID No：49-51
其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一
者在3'末端處。較佳地，SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51在5'末端處標記有染料且在3'末端處標記有淬滅劑。
本發明亦提供用於HPV檢測中之擴增混合物，該擴增混合物包含：(a)SEQ.ID No：1-6；及視情況SEQ.ID No：7-9或(b)SEQ.ID No：10-27；及視情況SEQ.ID No：28-30或(c)SEQ.ID No：31-48；及視情況SEQ.ID No：49-51
其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。較佳地，SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51在5'末端處標記有染料且在3'末端處標記有淬滅劑。
本申請案亦提供用於HPV檢測中之套組，其包含一或多種選自以下之擴增混合物：
(a)SEQ.ID No：1-3；及視情況SEQ.ID No：7-9
(b)SEQ.ID No：3-6；及視情況SEQ.ID No：7-9
(c)SEQ.ID No：10-12；及視情況SEQ.ID No：28-30
(d)SEQ.ID No：13-15；及視情況SEQ.ID No：28-30
(e)SEQ.ID No：16-18；及視情況SEQ.ID No：28-30
(f)SEQ.ID No：19-21；及視情況SEQ.ID No：28-30
(g)SEQ.ID No：22-24；及視情況SEQ.ID No：28-30
(h)SEQ.ID No：25-27；及視情況SEQ.ID No：28-30
(i)SEQ.ID No：31-33；及視情況SEQ.ID No：49-51
(j)SEQ.ID No：34-36；及視情況SEQ.ID No：49-51
(k)SEQ.ID No：37-39；及視情況SEQ.ID No：49-51
(l)SEQ.ID No：40-42；及視情況SEQ.ID No：49-51
(m)SEQ.ID No：43-45；及視情況SEQ.ID No：49-51
(n)SEQ.ID No：46-48；及視情況SEQ.ID No：49-51
其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。較佳地，SEQ.ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51在5'末端處標記有染料且在3'末端處標記有淬滅劑。
本申請案亦提供用於HPV之檢測中之套組，其包含一或多種選自以下之擴增混合物：(a)SEQ.ID No：1-6；及視情況SEQ.ID No：7-9或(b)SEQ.ID No：10-27；及視情況SEQ.ID No：28-30或(c)SEQ.ID No：31-48；及視情況SEQ.ID No：49-51
其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。較佳地，SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51在5'末端處標記有染料且在3'末端處標記有淬滅劑。
較佳地，該套組進一步包含擴增混合物，其包含：(d)SEQ.ID No：52-54及視情況SEQ.ID No 55-57，其中SEQ ID No：54及57標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。較佳地，SEQ ID No：54及57在5’末端處標記有染料且在3’末端處標記有淬滅劑。
該套組亦可包括包裝標籤或包裝插頁，其上有使用引子混合物及探針對來檢測生物試樣中人類乳頭狀瘤病毒之存在或不存在之說明書。
套組可進一步包含其他組份，例如PCR所需試劑。此等試劑包括緩衝液、適宜DNA聚合酶及dNTP，例如dATP、dCTP、dGTP及dTTP。套組組份可存在於多個小瓶或其他容器中。該等試劑可經凍乾以供之後在使用前重構。或者，該等組份可提供於準備使用之適宜緩衝溶液中。此等溶液可含有適宜防腐劑。
現將參照以下非限制性實例來闡述本發明。
測試2,522名18-65歲之低危險女性(低危險意味著登記前24個月沒有已知的HPV感染或細胞學陽性)。
藉由基於利用離心之標準方法使用96孔二氧化矽結合板來實施DNA提取。此為低成本且高通量方法。
使用液體處置機器人以384孔模式實施PCR設置。
將6ul如下表中詳細說明之擴增混合物添加至各反應中之10ul經溶析DNA中
使用如所顯示標準Taqman熱分佈來實施TAQman PCR
將所獲得結果與使用Roche COBAS方法所獲得之彼等結果進行比較。
Roche COBAS HPV發現20.22%之試樣為陽性(95%信賴區間：18.67%至21.84%)
本發明方法鑑別24.23%試樣為陽性(95%信賴區間：22.57%至25.95%)
本發明方法發現顯著更多的陽性試樣且從而鑑別出更多處於發生病灶及癌症病況之危險中之女性。
<110> 匈牙利商桑爾卡公司
<120> HPV檢測方法
<130> P63515WO
<150> GB1511470.5
<151> 2015-06-30
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 引子
<400> 46
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 47
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 48
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 49
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 50
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 51
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 52
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 53
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 54
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 55
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 56
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 57
Claims (24)
- 一種用於檢測HPV之存在之方法，其包含利用一或多種擴增混合物擴增自試樣所獲得之核酸，其中該等擴增混合物選自：(a)擴增混合物1，其包含5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：1)5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3’(SEQ.ID NO：2)5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3’(SEQ.ID NO：3)(b)擴增混合物2，其包含5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3’(SEQ.ID NO：4)5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3’(SEQ.ID NO：5)5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3’(SEQ.ID NO：6)(c)擴增混合物3，其包含5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3’(SEQ.ID NO：10)5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3’(SEQ.ID NO：11)5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3’(SEQ.ID NO：12)(d)擴增混合物4，其包含5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3’(SEQ.ID NO：13)5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3’(SEQ.ID NO：14)5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3’(SEQ.ID NO：15)(e)擴增混合物5，其包含5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3’(SEQ.ID NO：16)5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3’(SEQ.ID NO：17) 5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3’(SEQ.ID NO：18)(f)擴增混合物6，其包含5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3’(SEQ.ID NO：19)5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3’(SEQ.ID NO：20)5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3’(SEQ.ID NO：21)(g)擴增混合物7，其包含5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3’(SEQ.ID NO：22)5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：23)5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3’(SEQ.ID NO：24)(h)擴增混合物8，其包含5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：25)5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3’(SEQ.ID NO：26)5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3’(SEQ.ID NO：27)；或(i)擴增混合物9，其包含5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3’(SEQ.ID NO：31)5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：32)5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3’(SEQ.ID NO：33)(j)擴增混合物10，其包含5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3’(SEQ.ID NO：34)5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3’(SEQ.ID NO：35) 5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3’(SEQ.ID NO：36)(k)擴增混合物11，其包含5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3’(SEQ.ID NO：37)5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3’(SEQ.ID NO：38)5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3’(SEQ.ID NO：39)(l)擴增混合物12，其包含5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3’(SEQ.ID NO：40)5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：41)5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3’(SEQ.ID NO：42)(m)擴增混合物13，其包含5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3’(SEQ.ID NO：43)5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3’(SEQ.ID NO：44)CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3’(SEQ.ID NO：45)(n)擴增混合物14，其包含TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3’(SEQ.ID NO：46)5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：47)5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3’(SEQ.ID NO：48)；其中SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
- 一種用於檢測HPV之存在之方法，其包含利用一或多種擴增混合 物擴增自試樣所獲得之核酸，其中該等擴增混合物選自：(a)擴增混合物15，其包含5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：1)5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3’(SEQ.ID NO：2)5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3’(SEQ.ID NO：3)5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3’(SEQ.ID NO：4)5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3’(SEQ.ID NO：5)5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3’(SEQ.ID NO：6)(b)擴增混合物16，其包含5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3’(SEQ.ID NO：10)5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3’(SEQ.ID NO：11)5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3’(SEQ.ID NO：12)5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3’(SEQ.ID NO：13)5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3’(SEQ.ID NO：14)5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3’(SEQ.ID NO：15)5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3’(SEQ.ID NO：16)5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3’(SEQ.ID NO：17)5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3’(SEQ.ID NO：18)5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3’(SEQ.ID NO：19)5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3’(SEQ.ID NO：20)5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3’(SEQ.ID NO：21)5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3’(SEQ.ID NO：22) 5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：23)5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3’(SEQ.ID NO：24)5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3’(SEQ.ID NO：25)5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3’(SEQ.ID NO：26)5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3’(SEQ.ID NO：27)；或(c)擴增混合物17，其包含5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3’(SEQ.ID NO：31)5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：32)5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3’(SEQ.ID NO：33)5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3’(SEQ.ID NO：34)5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3’(SEQ.ID NO：35)5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3’(SEQ.ID NO：36)5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3’(SEQ.ID NO：37)5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3’(SEQ.ID NO：38)5'-CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA-3’(SEQ.ID NO：39)5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3’(SEQ.ID NO：40)5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3’(SEQ.ID NO：41)5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3’(SEQ.ID NO：42)5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3’(SEQ.ID NO：43)5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3’(SEQ.ID NO：44)CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3’(SEQ.ID NO：45) TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3’(SEQ.ID NO：46)5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3’(SEQ.ID NO：47)5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3’(SEQ.ID NO：48)；其中SEQ ID No：3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45及48標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
- 如請求項1或請求項2之方法，其進一步包含使用能夠擴增人類對照基因之擴增混合物擴增自試樣所獲得之該核酸。
- 如請求項3之方法，其中該人類對照基因係因子V來登基因(factor V leiden gene)。
- 如請求項3或請求項4之方法，其中能夠擴增人類對照基因之該擴增混合物係擴增混合物18，其包含5'-TCTGAAAGGTTACTTCAAGGACAA-3'(SEQ.ID NO：52)5'-CATCGCCTCTGGGCTAATAG-3'(SEQ.ID NO：53)5'-CTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC-3'(SEQ.ID NO：54)其中SEQ ID No：54標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該擴增混合物進一步包含一或多種內部對照引子。
- 如請求項6之方法，其中該擴增混合物進一步包含5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3’(SEQ.ID NO：7)5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3’(SEQ.ID NO：8)及5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’；(SEQ.ID NO：9)。
- 如請求項6或請求項7之方法，其中(a)擴增混合物15進一步包含：5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3’(SEQ.ID NO：7)5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3’(SEQ.ID NO：8)5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’；(SEQ.ID NO：9)；且/或(b)擴增混合物16進一步包含5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3(SEQ.ID NO：28)5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3(SEQ.ID NO：29)5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’；(SEQ.ID NO：30)；且/或(c)擴增混合物17進一步包含5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3’(SEQ.ID NO：49)5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3’(SEQ.ID NO：50)5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3’(SEQ.ID NO：51)；且/或(d)擴增混合物18進一步包含5’-GTGGGGACGCCATCTATTC-3'(SEQ.ID NO：55)5’-TATGCGCGAGGCATATTCTA-3'(SEQ.ID NO：56)5'-CAGATACCGGTGCGCTGCGT-3'(SEQ.ID NO：57)其中SEQ ID No：9、30、51及57標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中a)擴增混合物15由SEQ.ID No：1-6組成；且/或b)擴增混合物16由SEQ.ID No：10-27組成；且/或c)擴增混合物17由SEQ.ID No：31-48組成；且/或d)擴增混合物18由SEQ.ID No：52-54組成。
- 如前述請求項中任一項之方法，其利用兩種或更多種擴增混合物，其中各擴增混合物之擴增反應同時或依序實施。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中利用PCR擴增該核酸。
- 如請求項11之方法，其中該方法利用即時PCR。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中利用Taqman系統擴增該核酸。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該淬滅劑係QSY且該染料選自VIC、ABY、VIC、FAM或JUN。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該試樣係細胞試樣。
- 如請求項15之方法，其中該試樣係Pap抹片試樣。
- 一種用於檢測HPV之擴增混合物，該擴增混合物包含(a)SEQ.ID N0：1-3；及視情況SEQ.ID No：7-9(b)SEQ.ID No：3-6；及視情況SEQ.ID No：7-9(c)SEQ.ID No：10-12；及視情況SEQ.ID No：28-30(d)SEQ.ID No：13-15；及視情況SEQ.ID No：28-30(e)SEQ.ID No：16-18；及視情況SEQ.ID No：28-30(f)SEQ.ID No：19-21；及視情況SEQ.ID No：28-30(g)SEQ.ID No：22-24；及視情況SEQ.ID No：28-30(h)SEQ.ID No：25-27；及視情況SEQ.ID No：28-30(i)SEQ.ID No：31-33；及視情況SEQ.ID No：49-51(j)SEQ.ID No：34-36；及視情況SEQ.ID No：49-51(k)SEQ.ID No：37-39；及視情況SEQ.ID No：49-51(l)SEQ.ID No：40-42；及視情況SEQ.ID No：49-51(m)SEQ.ID No：43-45；及視情況SEQ.ID No：49-51(n)SEQ.ID No：46-48；及視情況SEQ.ID No：49-51其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。
- 如請求項17使用之擴增混合物，該擴增混合物包含(a)SEQ.ID No：1-6；及視情況SEQ.ID No：7-9或(b)SEQ.ID No：10-27；及視情況SEQ.ID No：28-30或(c)SEQ.ID No：31-48；及視情況SEQ.ID No：49-51其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51在5'末端處標記有染料且在3'末端處標記有淬滅劑。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中各擴增混合物之該擴增反應係於單獨容器中實施。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在單一個容器中，使用至多三種選自擴增混合物1至17之擴增混合物、視情況連同一或多種內部對照引子及/或能夠擴增人類對照基因之擴增混合物進行單一反應。
- 一種用於檢測HPV之套組，其包含一或多種選自以下之擴增混合物：(a)SEQ.ID No：1-3；及視情況SEQ.ID No：7-9(b)SEQ.ID No：3-6；及視情況SEQ.ID No：7-9(c)SEQ.ID No：10-12；及視情況SEQ.ID No：28-30(d)SEQ.ID No：13-15；及視情況SEQ.ID No：28-30(e)SEQ.ID No：16-18；及視情況SEQ.ID No：28-30(f)SEQ.ID No：19-21；及視情況SEQ.ID No：28-30(g)SEQ.ID No：22-24；及視情況SEQ.ID No：28-30(h)SEQ.ID No：25-27；及視情況SEQ.ID No：28-30 (i)SEQ.ID No：31-33；及視情況SEQ.ID No：49-51(j)SEQ.ID No：34-36；及視情況SEQ.ID No：49-51(k)SEQ.ID No：37-39；及視情況SEQ.ID No’s：49-51(l)SEQ.ID No：40-42；及視情況SEQ.ID No：49-51(m)SEQ.ID No：43-45；及視情況SEQ.ID No：49-51(n)SEQ.ID No：46-48；及視情況SEQ.ID No：49-51其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5'末端處且一者在3'末端處。
- 如請求項22之用於檢測HPV之套組，其包含一或多種選自以下之擴增混合物：(a)SEQ.ID No：1-6；及視情況SEQ.ID No：7-9或(b)SEQ.ID No：10-27；及視情況SEQ.ID No：28-30或(c)SEQ.ID No：31-48；及視情況SEQ.ID No：49-51其中SEQ ID No：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48及51標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
- 如請求項22或請求項23之套組，其進一步包含擴增混合物，其包含(d)SEQ.ID No：52-54及視情況SEQ.ID No 55-57，其中SEQ ID No：54及57標記有淬滅劑及染料，一者在5’末端處且一者在3’末端處。
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