CN102251056B - 人类乳头瘤病毒核酸基因扩增和分型的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属诊断试剂技术领域，具体为一种人类乳头瘤病毒(HPV)核酸基因扩增和分型的方法、以及基于此方法的试剂盒。包括使用混合引物进行多重实时荧光定量基因扩增(QPCR)，使用定量探针对HPV高危亚型进行定量测定，同时使用分型探针对HPV 16、18亚型进行分型鉴定。根据HPV病毒编码E1基因的特定区域的两侧保守序列设计混合引物，根据该区域中央的型特异性序列设计分型探针。标准对照为含有16、18亚型E1区基因的重组质粒的梯度稀释物。试剂盒包含宫颈刷、样本保存管/液、引物、探针、Taq酶及反应缓冲液、以及对照标准品。该系统可以定量检测HPV的13种高危亚型(HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68)，并对其中的16、18两亚型进行分型鉴定。

Description

人类乳头瘤病毒核酸基因扩增和分型的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒核酸基因的扩增和分型方法，以及用于该方法的检测试剂盒。

背景技术

人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)能引发尖锐湿疣和宫颈癌，是目前除艾滋病外对患者的身心健康影响最大的性传播疾病。目前已发现了超过100种以上的HPV基因型，可分为皮肤型HPV和生殖道上皮型HPV。依据与生殖道肿瘤相关与否可将生殖道上皮HPV分为高危型HPV(例如HPV-16亚型和HPV-18亚型等)和低危型HPV(例如HPV-6亚型和HPV-11亚型等)，高危型HPV与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变(CIN2/3)的发生相关，低危型HPV常引起外生殖道湿疣等量性病变。

HPV的检测和分型方法主要有杂交法和以聚合酶链式反应

(Polymerase Chain Reaction，PCR)为基础的检测方法两大类。

美国Digene公司开发的杂交捕获法(Hybrid Capture，HC)HPV核酸检测技术，是将HPV DNA双链裂解为单链后与RNA探针结合成RNA-DNA杂交体，并被特异性抗体固定在试管壁或微孔壁上，结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交体结合，其标记物碱性磷酸酶使酶底物发光，光的强弱对应于碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量，进而确定样本中HPV病毒的拷贝数。目前商品化的杂交捕获法二代技术(HC-II)是第一个通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术，可检测18种HPV，其中包括13种高危型HPV(-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68)和5种低危型HPV(-6、-11、-42、-43、-44)。HC-II法是一种测定病毒负荷量的半定量方法，用实时荧光定量PCR测定其中的HPV-16的值与HC-II的值相吻合(J Clin Virol，2004，31(2)：140-147)。目前美国食品药品管理局(the Food and DrugAdministration，FDA)推荐的阳性结果的临界值是1.0RLU(相对光单位)，相当于每1ml样本缓冲液中有1pg HPV DNA(或100,000HPV拷贝/ml)。该技术敏感性较好，重复性高。但HC-II使用混合探针，不能对HPV进行分型，是这项检测技术的最大缺点。除此之外，HC-II作为杂交技术，存在交叉杂交的问题，即与不在混合探针中的其他HPV亚型起交叉反应引起假阳性结果而降低特异性(Am J ObstetGynecol，2004，191(3)：757-761)。

以PCR为基础的检测方法是先用PCR方法先进行病毒基因的扩增，然后再利用各种方法进行检测。对HPV的基因扩增主要可以分为型特异PCR和普通的通用引物PCR。型特异PCR是用型特异PCR引物，针对型间变异最大的区域(通常是HPV基因组的E5/E7区)设计成能特定扩增单个HPV基因型。用型特异性PCR后即可确定特定型别的HPV，但这种方法费力，为了检测一个临床样本中HPV DNA的存在，需要分别完成多个型特异的PCR反应。通用引物PCR是用通用引物，针对不同HPV型别之间的保守区域(通常是HPV基因组的L1区)来扩增广谱的HPV。用普通PCR进行扩增后对阳性的扩增产物就可以用各种方法进行HPV的分型检测。

PCR产物的分型检测主要有直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及基因芯片法。由于样本病毒DNA经过PCR扩增，其灵敏度较普通杂交法显著提高。直接测序法对检测少见型和发现新的型别有着重要的作用(J Med Microbiol，2004，53(Pt 2)：125-128)，但对于混合感染中同步检测不同序列的敏感性不高，而且费时、昂贵。PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR-restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP)通过选择内切酶的最佳组合可以检测HPV的具体型别，特别是可以检测出HC-II所不包含的罕见型别(J Med Virol，2003，71(1)：110-114)，但RFLP对PCR产物的特异性要求比较高，需要优化PCR反应条件，增加目的条带的特异性。PCR产物的杂交分析缺点是不能排除杂交固有的问题，即交叉杂交存在的可能性。基因芯片对HPV的敏感性(96.0％)高于细胞学的敏感性(83.6％)(Cancer，2003，97(7)：1672-1680)，对HPV的分型检测有广阔的发展前景，但目前的基因芯片技术成本昂贵，检测的可靠性、实用性还有待于验证。

总之，现有的HPV检测方法，无论是杂交法、PCR方法、基因芯片、还是最新的液态芯片、高分辨率质谱等技术，对样本中的HPV要么只能进行定量(或半定量)，要么只能进行分型，同时还存在交叉杂交风险、成本过高等等不利于临床应用的弊端。

发明内容

本发明的内容是提供一种人类乳头瘤病毒核酸基因的扩增和分型方法，以及用于该方法的检测试剂盒。该方法及试剂盒可以对样本中的HPV同时定量和分型(对HPV亚型中致癌性最高的两种亚型：16、18亚型作分型鉴定)，在降低成本的同时提供更加丰富的检测结果信息。

本发明是通过如下技术方案实现的。

一种人类乳头瘤病毒核酸基因扩增和分型的方法，使用混合引物对生物样本中的人类乳头瘤病毒核酸进行多重实时荧光定量基因扩增，同时使用定量荧光探针或荧光染料对人类乳头瘤病毒高危亚型进行定量测定，同时还使用分型荧光探针对HPV 16、18亚型进行分型鉴定。

其中的基因扩增方法为使用DNA聚合酶的方法。

其中的混合引物为序列SEQ.ID.NO：1-26的核酸的混和物。

其中的定量探针为序列SEQ.ID.NO：27-39的核酸，其末端使用荧光基团标记。

其中的分型探针为序列SEQ.ID.NO：40-41的核酸，其末端使用区别于定量探针的其它波长的荧光基团标记。

其中利用定量探针(或荧光染料)的荧光信号对样品的HPV载量进行定量，同时利用分型探针的荧光信号对HPV 16、18亚型进行分型鉴定；标记荧光基团如FAM(发射波长：522nm)、ROX(发射波长：608nm)或TAMRA(发射波长：582nm)；荧光染料如SYBRGreen或Eva Green；要求各波段的荧光信号之间的干扰不影响结果的判读。

其中，定量探针的5’端标记荧光发光基团FAM(发射波长：522nm)，3’端修饰BHQ-1、或BHQ-2、或DABCYL(酸琥珀酰亚胺酯)等荧光淬灭基团。

分型探针的5’端标记荧光发光基团ROX(发射波长：608nm)，和/或JOE(发射波长：548nm)，和/或VIC/HEX(发射波长：555nm)，和/或TAMRA(发射波长：582nm)，3’端修饰BHQ-1、或BHQ-2、或DABCYL等荧光淬灭基团。

根据定量探针水解后产生的荧光信号，测得样品的HPV病毒载量，判断是否为高危型HPV阳性；根据分型探针水解后产生的荧光信号，判断样品是否感染有16、和/或18亚型。

本发明还提供一种用于人类乳头瘤病毒核酸基因扩增和分型方法的检测试剂盒，包含宫颈刷、样本保存管、样本保存液、DNA提取试剂、引物、探针、Taq酶、反应缓冲液以及对照标准品，其中的引物为用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的引物、其中的探针为用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的探针和用于QPCR分型鉴定HPV 16、18亚型E1区的探针。

该试剂盒的用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的引物包括序列SEQ.ID.NO：1-26。

该试剂盒的用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的定量探针包括序列SEQ.ID.NO：27-39。

该试剂盒的用于QPCR分型鉴定HPV 16、18亚型E1区的探针包括序列SEQ.ID.NO：40-41。

该试剂盒的标准对照为含有16、18亚型E1区基因的重组质粒的梯度稀释物。

实现本发明所述的方法的具体过程如下。

(1)选择混合引物对，同时选择混合定量探针、分型探针(SEQ.ID.NO：1-26，SEQ.ID.NO：27-39，SEQ.ID.NO：40-41，详见序列表)。

(2)按照一定的比例混合上述引物和探针、实时荧光定量PCR反应缓冲液、Taq酶、荧光探针、UNG/dUTP(尿嘧啶-N-糖基化酶/异羟基洋地黄毒苷配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸)、ddH2O(双蒸水)、以及从待测样本中提取的HPV DNA溶液。混合溶液置于QPCR专用透明薄壁管中。每一份待测HPV DNA对应一管反应混合液。

(3)将上述薄壁管放入实时荧光定量PCR仪中，设置反应程序和各项参数。开始实时荧光定量PCR反应。

(4)QPCR结束后，根据在520-530nm波长处的样本DNA扩增曲线，得到各个样本的Ct值，即可计算出HPV的拷贝数。判断所测样本是否为HPV阳性。

(5)由于反应所用分型探针标记有不同的荧光基团(其发射的荧光波长分别是555nm、和/或564-583nm、和/或608-615nm、和/或668nm)，根据QPCR仪器记录的在这4个波长处的样本扩增曲线，分别分析其Ct值，即可判断所测样本是否感染有HPV 16、18亚型。

(6)根据熔解曲线，对定量试验结果进行验证，进一步判断样本是否为HPV阳性。

综合上述试验测定的结果，最终可以判断出样本是否为HPV阳性，若为阳性，则可进一步判定样本是否感染有HPV 16、18亚型。

根据本发明的方法和试剂盒，利用上述引物和探针，在经过优化的反应条件下，通过实时荧光定量PCR可以有效地定量检测13种高危HPV亚型(HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68)，并对其中的16、18两种亚型加以分型鉴定。

本发明的有益效果体现在：常规QPCR与HC-II相似，可检测一组型别的病毒感染，对其拷贝数定量，但不能确定具体型别。与常规PCR相比，本发明采用以荧光标记水解探针或分子信标为基础的实时荧光定量PCR的同时，还能检测多型HPV。实时荧光定量PCR闭管操作，可有效消除核酸交叉污染，具有实时、高灵敏度、自动化程度高的优点，具备精确定量功能。

附图说明

图1为对照的扩增曲线(Ct曲线)：图中A、B、C分别为对照质粒0.8pg/ml、0.4pg/ml、和0.2pg/ml，D为双蒸水(空白对照)；扩增曲线与阈值水平线相交处的循环数即为各样品的Ct值(阈值通常对应荧光强度1,00-10,0000，在此范围内选择，使标准对照的回归线性最佳，并使扩增曲线和阈值水平线相交点位于各扩增曲线的指数增长期中央部分，可手动设定阈值，亦可由软件自动设定)；

图2为标准曲线：根据上述对照的Ct测得其各自对应的质粒拷贝数，绘出标准曲线，R2≥0.99。(纵座标为Ct，横坐标为病毒载量对数)；

图3为对照的熔解曲线：图中A、B、C分别为对照质粒0.8pg/ml、0.4pg/ml、和0.2pg/ml，D为双蒸水(空白对照)。阳性对照和临界对照的Tm≥80℃；阴性对照的Tm＜80℃，但在80-85℃有微弱的熔解曲线峰；空白对照的Tm＜80℃，且在80-85℃无熔解曲线峰；

图4为样品的扩增曲线(Ct曲线)。图中A、B、C分别为对照质粒0.8pg/ml、0.4pg/ml、和0.2pg/ml，D为双蒸水(空白对照)。其余扩增曲线对应不同的检测样品；图中位于曲线A左侧即为HPV高危亚型阳性样品，位于曲线B右侧的即为HPV高危亚型阴性样品，位于曲线A、B之间的为临界样品，按照实施例6中所述的结果判读方法，临界样品需要重新检测；最后，软件将以表格的形式输出各样品的精确Ct值、相对应的病毒载量、以及是否为HPV高危亚型阳性；

图5为样品在HEX(灰色)和ROX(黑色)波段的分型扩增曲线：灰色扩增曲线为16亚型感染阳性样品；黑色扩增曲线为18亚型感染阳性样品；图5a为单独用HEX通道检测得到的信号；图5b为单独用ROX通道检测得到的信号；空白对照均未发现信号，因此，在上述2个通道检测到扩增信号即表明样品感染有16、和/或18亚型。

具体实施方式

下面通过优选实施例详细描述本发明，但不限制本发明的范围。本领域的普通专业人员根据本发明的内容，对本发明所作出的一些非本质的改进和调整，仍属本发明的保护范围。

实施例1    引物和探针的制备

引物(引物序列：SEQ.ID.NO：1-26)和探针(定量探针序列：SEQ.ID.NO：27-39；分型探针序列：SEQ.ID.NO：40-41)均通过核酸自动合成仪合成，本实施例中均由上海生工生物技术有限公司合成。

其中，定量探针的5’端标记荧光发光基团FAM(发射波长：522nm)，3’端修饰BHQ-2荧光淬灭基团。

分型探针的5’端标记荧光发光基团HEX(发射波长：555nm)，和ROX(发射波长：608nm)，3’端修饰BHQ-2荧光淬灭基团。

上述引物和探针均溶于双蒸水，配成4μM的溶液备用。

实施例2    样本采集

使用专用的宫颈刷采样，宫颈刷的中央刷毛部分轻轻的插入子宫颈管，使较短的刷毛能够完全接触到子宫颈口，柔和的向前抵住宫颈刷，并按同一个时钟方向转动宫颈刷3-5周，不留死角刮取宫颈细胞，停留10秒。取样范围包括整个移形带(Transformation Zone，即子宫颈鳞状上皮与子宫颈柱状上皮的交接区)。

将采好样本的宫颈刷放入样本保存管(内含1ml样本保存液，能使DNA完整，抑制细菌生长)，盖紧并做好标签(注明姓名、日期)。

样本保存液配方：磷酸盐缓冲溶液10mM、NaCl 138mM、KCl2.7mM、0.05％NaN3，pH＝7.

实施例3    病毒DNA的提取

采用磁珠法全自动核酸提取仪(或硅胶柱法)提取HPV病毒DNA。其工作原理和步骤包括裂解、吸附、清洗、洗脱、回收。

各缓冲液配方如下：

裂解缓冲液配方：0.5mg/ml蛋白酶K、0.01M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)、0.001M EDTA(乙二氨四乙酸)，pH＝8.0。

吸附缓冲液配方：5.5M GuSCN(异硫氰酸胍)、20mM EDTA、10mM Tris-HCl、65mM二硫苏糖醇、40g/L硅胶基磁珠，pH＝6.5。

漂洗液I配方：5.5M GuSCN(异硫氰酸胍)、20mM EDTA、10mMTris-HCl、65mM二硫苏糖醇，pH＝6.5。

漂洗液II配方：25％(v/v)异丙醇、25％(v/v)乙醇(96％)、50％双蒸水、0.1M NaCl。

洗脱液配方：10mM Tris-HCl，pH＝8.0，或双蒸水。最后得到30-50μl提纯的样品DNA，立即用实时荧光定量PCR测试，或-20℃贮存待测。

另有一些其他的磁珠法DNA提取液的配方不一定完全与上述配方相同，经由生化试剂公司可以购买到商品化的磁珠法DNA提取液。

实施例4    实时荧光定量PCR检测HPV病毒DNA

(1)HPV的定量扩增。QPCR反应的体系为20μl，包括：10μl的2×预混合Taq酶基因定量扩增反应缓冲液。

(2)2×预混合基因定量扩增反应缓冲液配方如下。

表1定量扩增反应缓冲液配方

(3)引物和探针的终浓度均为200nM(引物序列：SEQ.ID.NO：1-26，定量探针序列：SEQ.ID.NO：27-39，分型探针序列：SEQ.ID.NO：40-41)。

(4)取提取的2μl样品DNA，加入反应体系，如有需要，用双蒸水补足反应体积至20μl。

(5)QPCR扩增反应在ABI

7300、7500、7900型荧光定量PCR仪上进行(ABI)。

(6)QPCR反应程序为：

步骤I(1个循环)：50℃2分钟；

步骤II(1个循环)：95℃10分钟；

步骤III(45个循环)：95℃30秒；48℃1分钟(检测荧光信号)；68℃45秒。

实施例5    实时荧光定量PCR检测HPV的对照设置

(1)将HPV 16、18的E1区DNA克隆到pUC18质粒的多克隆位点(装入位点：HindIII+EcoRI)，分别得到对照克隆pUC18-HPV16E1和pUC18-HPV18E1。

表2HPV 16E1区DNA克隆序列(5’→3’)

ccattaatat aactgaccaa gctccttcat taattcctat agttccaggg    50

tctccacaat atacaattat tgctgatgca ggtgactttt atttacatcc    100

tagttattac atgttacgaa aacgacgtaa acgtttacca tatttttttt    150

cagatgtctc tttggctgcc tagtgaggcc actgtctact tgcctcctgt    200

cccagtatct aaggttgtaa gcacggatga atatgttgca cgcacaaaca    250

tatattatca tgcaggaaca tccagactac ttgcagttgg acatccctat    300

tttcctatta aaaaacctaa caataacaaa atattagttc ctaaagtatc    350

aggattacaa tacagggtat ttagaataca tttacctgac cccaataagt    400

ttggttttcc tgacacctca ttttataatc cagatacaca               440

表3HPV 18E1区DNA克隆序列(5’→3’)

cattaccatc tactacctct gtatggccca ttgtatcacc cacggcccct    50

gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt atttgtggcc    100

attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg    150

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc    200

ttctgtggca agagttgtaa ataccgatga ttatgtgact cccacaagca    250

tattttatca tgctggcagc tctagattat taactgttgg taatccatat    300

tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag caggatattc ctaaggtttc    350

tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac ccaaataaat    400

ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca               440

(2)将上述对照质粒分别转化大肠杆菌DH5α，以LB培养基于37℃培养过夜，收获菌体，以上文所述磁珠法提取对照质粒DNA。

(3)利用光吸收定量法(Spectrophotometer)定量对照质粒DNA：测定260nm吸光值，OD＝1.0代表ds DNA(双链DNA)＝50μg/ml；并控制OD260/OD280＝1.8-1.9(在该区间时表示DNA的纯度较高)。

(4)取上述制备的对照质粒pUC18-HPV16E1和pUC18-HPV18E1各1μg，混合后逐级稀释至0.8pg/ml，相当于200,000HPV拷贝/ml、或10,000HPV拷贝/assay、或HC-II值＝2.0。即为测试对照品。

(5)在进行QPCR检测之前，取部分该测试对照品，分别逐级稀释成0.4pg/ml、和0.2pg/ml，分别相当于HC-II值＝1.0、0.5，加上0.8pg/ml的对照，共3管对照品，分别作为QPCR的阳性、临界、和阴性对照。另外，以双蒸水作为空白对照。

表4

对照质粒	0.8pg/ml	0.4pg/ml	0.2pg/ml	ddH2O
					对应HC-II值	2.0	1.0	0.5	0
对应病毒拷贝数	10,000	5,000	2,500	0
					结果判断	阳性	临界	阴性	空白对照

实施例6    实时荧光定量PCR检测HPV的结果判读

(1)HPV定量：QPCR结束后，在FAM波段(520nm)，根据各样品扩增曲线的Ct值，由软件自动换算出各样品的病毒DNA载量、以及各样品的熔解曲线的熔解温度，对各样品作如下判断：

A.样品DNA载量≥2.0，判断为高危亚型HPV阳性；

B.2.0＞样品DNA载量≥1.0，结果不可信，样品需要重新检测；若重复后结果仍然在1.0-2.0之间，判断为阳性；

C.样品DNA载量＜1.0，判断为高危亚型HPV阴性；

D.若样品的熔解温度(Tm)＜80℃，则不论DNA载量多少，都判为阴性。

(2)HPV 16、18亚型的分型：对于定量结果为阳性的样品，在HEX和ROX波段分别检测样品的Ct值：

A.样品Ct值＜空白对照Ct值，判断为16或18亚型阳性；

B.样品Ct值≥空白对照Ct值、或样品无Ct值，判断为16或18亚型阴性。

(3)通过和实时定量荧光PCR仪相联的电脑，将上述HPV的定量和分型结果保存为表格，对照检测样品的姓名、日期等信息，整理后打印输出。

表5QPCR定量结果判断

表6QPCR分型结果判断

实施例7    HPV高危亚型定量和分型检测试剂盒配方

表7HPV高危亚型定量和分型检测试剂盒配方

序列表

表7引物序列表

表8定量探针序列表

表9分型探针序列表

注1：“5’FAM---3’BHQ-2”等表示探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ-2淬灭基团；

注2：“5’HEX---3’BHQ-2”等表示探针5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ-2淬灭基团；

注3：“5’ROX---3’BHQ-2”等表示探针5’端标记ROX荧光基团，3’端标记BHQ-2淬灭基团。

Claims (4)

1.一种人类乳头瘤病毒核酸基因的扩增和分型的试剂盒，包含宫颈刷、样本保存管、样本保存液、DNA提取试剂、引物、探针、Taq酶、反应缓冲液以及对照标准品，其特征在于：其中的引物为用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的引物序列SEQ.ID.NO：1-26；其中的探针为用于QPCR扩增HPV高危亚型E1区的探针序列SEQ.ID.NO：27-39和用于QPCR分型鉴定HPV 16、18亚型E1区的探针序列SEQ.ID.NO：40-41。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的用于QPCR扩增HPV高危亚型的定量探针序列SEQ.ID.NO：27-39，其末端使用荧光基团标记。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的用于QPCR分型鉴定HPV 16、18亚型E1的探针序列SEQ.ID.NO：40-41，其末端使用区别于定量探针的其它波长的荧光基团标记。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的标准对照为含有16、18亚型E1区基因的重组质粒的梯度稀释物。

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