CN102010898B - Ephx1基因检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EPHX1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：针对EPHX1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，且所述anti-tag序列能相应地与所选的tag序列互补配对；以及用于扩增具有SNP位点的EPHX1基因目标序列的扩增引物。所述检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，能够避免交叉反应，且可以实现多个SNP位点的并行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及EPHX1基因检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
微粒体环氧化物水解酶(Microsomal epoxide hydrolase，mEH，EPHX1)是一种重要的生物转化II相代谢酶，该酶由定位于人类染色体1q42.1的EPHX1基因编码，具有高度保守性。它催化多种环氧化中间产物水解为更易溶于水的反式二氢二醇排出体外。研究表明，EPHX1基因编码区的多态性通过影响蛋白质的稳定性而改变酶的活性。外显子3的T→C转变使Tyr113被His取代(rs1051740，T337C)，导致酶活性下降39％；外显子4的A→G转变使His139被Arg取代(rs2234922，A416G)，导致酶活性升高25％，有研究表明，EPHX1酶活的下降有利于预防肺癌。
目前对EPHX1多态性的检测产品一般是基于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供EPHX1基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测EPHX1基因G357A、G19512990A、T337C和A416G突变的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下：
一种EPHX1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对EPHX1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对EPHX1基因G357A SNP位点的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、针对EPHX1基因T337C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C)以及用于扩增具有G357A、G19512990A、T337C、和/或A416G的SNP位点的EPHX1基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物是：针对EPHX1基因G357A SNP位点的SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、针对EPHX1基因T337C SNP位点的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO30、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。
优选地，所述ASPE引物对为：针对EPHX1基因G357A SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQID NO.9组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、针对EPHX1基因T337C SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.13组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.16组成的序列。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的另一目的是提供一种用于EPHX1基因检测的特异性引物。
具体技术方案如下：
用于EPHX1基因检测的特异性引物，主要包括有：针对EPHX1基因G357A SNP位点的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12、针对EPHX1基因T337C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测液相芯片与测序法的吻合率高达100％。所制备的EPHX1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
3.本发明的检测方法步骤简单，在EPHX1基因SNP检测液相芯片中，4种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成四条含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要；且多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1EPHX1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对EPHX1基因的SNP位点G357A(rs2292566)、G 19512990A(rs4653436)、T 337C(rs1051740)和A416G(rs2234922)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的8种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的8种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对EPHX1基因的四种常见SNP位点G357A(rs2292566)、G19512990A(rs4653436)、T337C(rs1051740)和A416G(rs2234922)，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出四条含有SNP位点的目标序列。
表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L TrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述EPHX1基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino] | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| ethanesulfonic acid) | |||
| 5MNaOH | Fisher SS256-500 | -- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计四对引物，多重PCR一步扩增出分别含有EPHX1基因的四种SNP位点(G357A、G19512990A、T337C和A416G)共四条的目标序列，产物大小分别为450bp、312bp、236bp、和287bp，引物序列见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.25-32的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测EPHX1基因的SNP位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NETMFI÷(突变型NETMFI+野生型NETMFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的EPHX1基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的EPHX1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的EPHX1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出EPHX1的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本EPHX1基因突变比值(％)
表6 样本EPHX1基因突变类型分析结果
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对EPHX1基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以EPHX1基因G357A位点突变检测液相芯片为例，分别针对G357A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.8，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.17-SEQID NO.24。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4不同间隔臂液相芯片对EPHX1基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以EPHX1基因T337C位点突变的检测液相芯片为例，探明不同的间隔臂液相芯片对EPHX1基因SNP检测的影响。针对T337C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。探明不同的间隔臂液相芯片对EPHX1基因SNP检测的影响，其中，不同的间隔臂为(CH2)12或5-10个T，具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表9 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表10 样本检测结果与基因多态性分析
实施例4的间隔臂为(CH2)12的液相芯片，其检测结果稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此，具体数据省略)，而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片，本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>EPHX1基因SNP检测特异性引物和液相芯片
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<170>PatentIn version 3.1
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Claims (3)
1.一种EPHX1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A)针对EPHX1基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对EPHX1基因G357A SNP位点的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、针对EPHX1基因T337C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)以及用于扩增具有G357A、G19512990A、T337C、和/或A416G的SNP位点的EPHX1基因目标序列的扩增引物，所述扩增引物是：针对EPHX1基因G357A SNP位点的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、针对EPHX1基因T337C SNP位点的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。
2.根据权利要求1所述的EPHX1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为：针对EPHX1基因G357A SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、针对EPHX1基因G19512990A SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、针对EPHX1基因T337C SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列以及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列、和/或针对EPHX1基因A416G SNP位点的由SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.15组成的序列以及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。
3.根据权利要求1-2任一所述的EPHX1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
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