CN102010907B - katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括有：ASPE引物，每种ASPE的特异性引物选自：针对katG基因codon 315位点的SEQ IDNO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ IDNO.22、针对inhA基因C(-15)T位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；微球；扩增引物。本发明所提供的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需的时间远远低于常用的测序技术。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟肼的耐药机制较为复杂，大部分的结核分枝杆菌耐药与katG、inhA和ndh等基因突变有关。
katG基因(过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因)，其N端编码作用范围广的过氧化物酶，C端编码过氧化氢酶。此酶在细菌的氧化应激反应中起作用，广泛存在于细菌中。在结核杆菌中，katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶能转化异烟肼成为毒性形式，这种活化的异烟肼形式能与分枝杆菌分枝菌酸生化合成途径中的编码烯酯酰载体蛋白还原酶-NADH复合体结合，抑制其活性，进而干扰分枝菌酸合成，发挥抗菌作用。katG基因突变常见第315位密码子AGC突变为ACC/ACA/AAC/ATC/CGC(Ser→Thr/Asn/Ile/Arg)，katG基因突变后，过氧化氢酶-过氧化物酶空间构型改变，活性降低或丧失，与异烟肼结合能力下降，阻止异烟肼转换成活性形式，进而导致耐药性表型。此外，katG基因第463密码子的突变(Arg→Leu)使MspI限制性内切酶酶切位点丢失，导致亲水性精氨酸被疏水性亮氨酸代替，使异烟肼和过氧化氢-过氧化物酶作用靶位发生改变，也会产生异烟肼耐药。
inhA基因是一种与分枝菌酸生物合成有关的烯酰基还原酶的编码基因。异烟肼进入菌体后，在分枝杆菌过氧化氢-过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式，这种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶-还原型烟酰胺二核苷酸复合体结合，干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。研究发现，inhA基因的突变率较高的主要在C(-15)T。
ndh基因编码NADH脱氢酶II，该基因发生突变将导致酶活性下降，继而导致NADH/NAD+比例增加，此时高浓度的NADH能竞争性抑制INH-NAD+结合到inhA活性位点，同时还可竞争性抑制katG对异烟肼的活化，导致菌株产生耐药。ndh最常见突变位点为突变位点A110G和G268A。
目前对katG、inhA和ndh基因突变的检测产品主要有实时荧光定量PCR、直接测序法、变性梯度凝胶电泳、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、不能确定突变位置、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测katG基因常见突变位点AGC315ACC/ACA/AAC/ATC/CGC和G463T、inhA基因突变位点C(-15)T以及ndh基因突变位点A110G和G268A的野生型和突变型。
实现上述目的技术方案如下：
一种katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.14；所述野生型和突变型的特异性引物选自：针对katG基因codon315位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、针对inhA基因C(-15)T位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；
(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDNO.29～SEQ ID NO.42，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
所述扩增引物优选为针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、针对inhA基因C(-15)T位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.49及SEQ ID NO.50、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.51及SEQ ID NO.52。
优选地，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.15组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.16组成的序列，由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.17组成的序列，由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列，由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.19组成的序列，由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列、和/或由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.28组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物。
具体技术方案下：一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物，包括有针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、针对inhA基因C(-15)T位点的SEQ ID NO.23及SEQ IDNO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所提供的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需的时间远远低于常用的测序技术。且所述检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
(2)本发明所提供的ASPE引物特异性引物，能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点。在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，除了能够单独检测katG、inhA或ndh基因突变情况，也能够同时并行检测多个基因突变位点的突变情况，检测效果一致。
(3)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型。
(4)本发明的检测方法步骤简单，5种基因突变检测可通过一步PCR即可完成含有目标突变位点的序列扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。
(5)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片激素和进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对katG基因的突变位点codon 315AGC→ACC/ACA/AAC/ATC/CGC和G463T、inhA基因突变位点C(-15)T以及ndh基因突变位点A110G和G268A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的14种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的14种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10uL合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配制10ng/mL的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5uL的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5uL的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100uL的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对katG基因的突变位点codon 315AGC→ACC/ACA/AAC/ATC/CGC和G463T、inhA基因突变位点C(-15)T以及ndh基因突变位点A110G和G268A，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出5条含有突变位点的目标序列。
表3 扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2 实施例1所述katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250mL)：
2×Tm杂交缓冲液：
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计五对引物，多重PCR一步扩增出分别含有katG基因突变位点(AGC315ACC/ACA/AAC/ATC/CGC)和G463T、inhA基因突变位点C(-15)T以及ndh基因两个突变位点A110G、G268A，共五条目标序列，产物大小分别为190bp、403bp、175bp、254bp和266bp，引物序列(SEQ ID NO.43-52)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.43-52的引物贮存液100uL于1.5mL微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25uL
dNTP(各2.5mmol/L) 4uL
Taq酶(5U/uL) 0.2uL
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6uL
模板DNA(10ng/uL) 2uL
ddH2O 12.8uL
共 50uL
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5uLPCR反应后的产物，加入1uL 10×SAP缓冲液、1uL SAP酶和0.5uLExo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测katG、inhA和ndh基因的突变位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10uL于1.5mL微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200uL，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。
ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2uL
MgCl2(50mmol/L) 0.5uL
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25uL
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1uL
Tsp酶(5U/uL) 0.25uL
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1uL
酶切处理的PCR扩增产物 5uL
ddH2O 10uL
共 20uL
反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的14种微球(微球浓度均为2.5×105个/mL)；
2.分别取1uL每种编号的微球于1.5mL的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100uL的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25uL上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25uL的ddH2O；
6.取5-25uL的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50uL；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75uL的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75uL的1×Tm杂交缓冲液中，加入15uL浓度为10ug/mL的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的katG、inhA和ndh基因突变位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的katG、inhA和ndh基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片能够准确地检测出katG、inhA和ndh基因的突变类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本katG、inhA和ndh基因突变比值(％)
表6 样本katG、inhA和ndh基因突变类型分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对katG、inhA和ndh基因突变位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以katG基因codon 315-M1、G463T、inhA基因的C(-15)T、ndh基因的A110G和G268A位点突变检测液相芯片为例，分别针对codon 315-M1、G463T、C(-15)T、A110G和G268A位点的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.42。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本katG基因codon 315突变检测结果与基因多态性分析
表9 样本katG基因突变检测结果与基因多态性分析
表10 样本inhA基因突变检测结果与基因多态性分析
表11 样本ndh基因突变检测结果与基因多态性分析
表12 样本ndh基因突变检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更高)，参见本实施例Group1、Group5、Group8、Group11和Group15。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (6)
1.一种katG、inhA和/或ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
（A）针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQID NO.14,且所选的tag序列互不相同；所述野生型和突变型的特异性引物选自：针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、针对inhA基因C（-15）T位点的SEQ IDNO.23及SEQ ID NO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；
（B）有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.42，并能相应地与（A）中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
（C）用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的katG、inhA和/或ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、针对inhA基因C（-15）T位点的SEQ ID NO.47及SEQ IDNO.48、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.49及SEQ ID NO.50、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.51及SEQ ID NO.52。
3.根据权利要求1或2所述的katG、inhA和/或ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.15组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.16组成的序列，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.17组成的序列，由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列，由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.19组成的序列和由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列、和/或由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.28组成的序列。
4.根据权利要求1所述的katG、inhA和/或ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
（A）ASPE引物：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.16组成的序列，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.17组成的序列，由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列，由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.19组成的序列，和由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列、和由SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.28组成的序列；
（B）有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDNO.29～SEQ ID NO.42，并能相应地与（A）中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
（C）扩增引物：针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、针对inhA基因C（-15）T位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.49及SEQ ID NO.50、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.51及SEQ ID NO.52。
5.根据权利要求1所述的katG、inhA和/或ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
6.一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物，其特征是，包括有：针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，以及选自针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对inhA基因C(-15）T位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28中的一对以上。
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