CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片及其检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片及其检测方法。
背景技术
波立维(Plavix,又称氯吡格雷,Clopidogrel)是新一代血小板凝聚抑制剂,于1998年3月获FDA正式批准上市。它与阿司匹林的联合治疗在急性冠脉综合症和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)患者中得到广泛应用,可以有效预防心肌梗死,中风和血管性死亡。目前,全球有数以万计的患者在植入冠脉支架后长期服用波立维以预防血栓形成。
波立维是一种前体药物,需经过P450酶系代谢形成活性代谢产物。科学研究证明波立维的疗效存在显著的个体差异,主要是受患者特定的吸收和代谢酶基因多态性(单核苷酸多态性,SNP)的影响。对波立维药效反应较低的患者,服用该药预防心血管事件的作用将显著减弱。最近的临床研究进一步证实,波立维的疗效与患者体内两个基因的SNP关系密切,即CYP2C19和ABCB1。携有两个CYP2C19功能减弱等位基因位点的患者,以及携有一个或一个以上ABCB1基因变异位点(C3435T)的患者,他们与正常基因型患者相比,在接受相同治疗方案的情况下发生心血管事件(包括血管性死亡、急性心肌梗塞和中风)的概率增加近50%。因此,检测患者这两个基因的多态性情况能科学指导波立维的临床使用。
CYP2C19是波立维的主要代谢酶,能活化波立维使其产生药效。在中国人群中,CYP2C19常见的两种功能减弱等位基因型为CYP2C19*2和CYP2C19*3,它们的分布频率分别是29.7%和3.5%。而ABCB1主要影响波立维在肠道的吸收,ABCB1基因C3435T突变型(分布频率约为39.7%)会显著削弱波立维的吸收能力。
目前国内外尚未有同时检测波立维两个疗效相关基因——CYP2C19和ABCB1基因多态性的产品上市。目前国内外能检测CYP2C19基因SNPs的产品,如Amersham Bioscience(GEhealthcare)的CodeLink P450,Roche的AmpliChip P450等,主要建立在传统固相芯片的基础上,价格昂贵,而且敏感性不高,检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的检测SNPs的技术,如直接测序法,半定量PCR技术,PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测,这些技术存在灵敏度低,样品易污染、假阳性率高的缺点,普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测,耗时费力。
基于芯片的原理,美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度,并根据微球中不同色彩而编号分类,从而确定反应的类型;绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度,再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量,从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此,液相芯片技术既满足了高通量检测的要求,同时具备了快速准确,灵敏度高,特异性好,结果重复性好等优点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs,实现高通量快速简便化操作,大大提高了检测效率,在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2C19基因的正常基因型以及两种常见等位基因型CYP2C19*2和CYP2C19*3,以及ABCB1基因的正常基因型和C3435T等位基因的变异。
实现上述目的的技术方案如下:
一种CYP2C19和ABCB1基因SNP检测液相芯片,包括有:
(1).分别包被有特异的anti-tag序列的6种微球,每种微球具有不同颜色编码,anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.7~SEQ IDNO.12中的序列;
(2).针对每种型别的SNP位点分别设计的3对ASPE引物,每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成,所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag序列互补配对;所述针对目的基因SNP位点的特异性序列分别为:SEQID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、和SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6;
(3).扩增出分别具有CYP2C19和ABCB1基因SNP位点的目标序列的引物。
优选地,所述扩增引物为,针对CYP2C19 Exon5的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14;针对CYP2C19 Exon4的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16;针对ABCB1 Exon26的SEQ ID NO.17及SEQ IDNO.18。
优选地:所述3对由tag序列和特异性序列组成的特异ASPE引物为:由SEQ ID NO.19和SEQID NO.1组成的ASPE引物,及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.2组成的ASPE引物;由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.3组成的ASPE引物,及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.4组成的ASPE引物;由SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.5组成的ASPE引物,及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.6组成的ASPE引物。
本发明的另一目的是提供一种ABCB1基因SNP检测液相芯片。
一种ABCB1基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
(1).分别包被有特异的anti-tag序列的2种微球,每种微球具有不同颜色编码,anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.11~SEQ IDNO.12中的序列;
(2).针对SNP位点设计的ASPE引物,每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成,所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag序列互补配对;所述针对目的基因SNP位点的特异性序列为:SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6;
(3).扩增出具有ABCB1基因SNP位点的目标序列的引物。
优选地,所述扩增引物为SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18。
本发明的另一目的是提供一种CYP2C19基因SNP检测液相芯片。
一种CYP2C19基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
(1).分别包被有特异的anti-tag序列的4种微球,每种微球具有不同颜色编码,anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.7~SEQ IDNO.10中的序列;
(2).针对每种型别的SNP位点分别设计的2对ASPE引物,每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成,所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag序列互补配对;所述针对目的基因SNP位点的特异性序列分别为:SEQID NO.1及SEQ ID NO.2、和SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4;
(3).扩增出具有CYP2C19基因SNP位点的目标序列的引物。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2C19、ABCB1基因SNP进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对CYP2C19和ABCB1基因SNP检测的方法,主要包括以下步骤:
(1)PCR扩增待测样品DNA;
(2)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理;
(3)用所述ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记;
(4)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应;
(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应;
(6)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比,并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性,能准确区分各种型别的基因型。
3.本发明的检测方法步骤简单,三种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成三个具有SNP位点的目标序列的扩增,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高,检测结果的可重复性差的缺陷,同时对现有的液相芯片技术进行改进,使得所制备微球能适用于不同的检测项目,具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高,从而使得检测的灵敏度进一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-30个T。
实施例1
CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对CYP2C19的两种常见SNP位点和ABCB1基因C3435TSNP位点分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1ASPE引物序列
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示),3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
表2ASPE特异性引物右端的Tag序列
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构,选择的六种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表3所示:
表3微球上的anti-tag序列
选择的六种微球(FlexMAP微球)购自美国Luminex公司,也可自己合成anti-tag序列,购买Luminex公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下:
根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列,每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0),1mmol/L EDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物:
CYP2C19基因的两种常见的SNP位点为CYP2C19*2和CYP2C19*3,ABCB1基因与波立维药物吸收相关的多态性位点变异为C3435T。它们的多态性位点在不同的外显子上。CYP2C19*2为G681A突变,发生在外显子5;CYP2C19*3为G636A突变,发生在外显子4;而ABCB1基因C3435T突变发生在外显子26。利用Primer5.0设计三对引物(见表4),分别扩增出三条具有SNP位点的目标序列。
表4扩增出具有突变位点的目标序列的引物
实施例2运用CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) |
Sigma M-2933 |
0.05M |
2.44g |
5M NaOH |
Fisher SS256-500 |
--- |
5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 |
SigmaT3038 |
0.2M |
50ml |
5M NaCl |
Sigma S5150 |
0.4M |
20ml |
Triton X-100 |
Sigma T8787 |
0.16% |
0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明,详细步骤如下:
1.取患者抗凝静脉血300μl加到一个1.5ml干净无菌的离心管中;
2.向离心管中加入500μl AP1缓冲液,涡旋振荡充分混匀;
3.加入100μl AP2缓冲液,涡旋振荡充分混匀;
4.室温下12,000rpm离心10分钟;
5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中,盖上盖子,以6,000rpm离心1分钟;
6.倒掉废液收集管中的废液,用800μl缓冲液W1洗涤1次,以6,000rpm离心1分钟;
7.倒掉废液收集管中的废液,加入800μl缓冲液W2,以12,000rpm离心1分钟;倒掉废液收集管中的废液,加入500μl缓冲液W2,以12,000rpm离心1分钟,弃掉废液;
8.将吸附柱AxyPrep放回空收集管中,12,000rpm离心1分钟;
9.将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中,加入40μl TE缓冲液,室温下放置1分钟,12,000rpm离心1分钟洗脱DNA,电泳检测,-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计三对引物,多重PCR一步扩增出CYP2C19的外显子5和外显子4,以及ABCB1的外显子26共三条具有突变位点的目标序列,产物大小分别为308bp、261bp、268bp。引物序列(SEQ NO.13-18)见上述表4所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ NO.13-18的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 33.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃20s,56℃30s,72℃30s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明,详细步骤如下:
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入3ul ExoSAP-IT酶;
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min,使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别各取G681A-w、6681A-m、G636A-w、G636A-m、C3435T-w、C3435T-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L TrisBuffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10.ul
共 20ul
PCR程序为:96℃2min;94℃30s,58℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,选择相应的最优的六种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码,同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物3’端的tag序列特异结合;本实施例每组样品检测中都分别选择LUA42,LUA24,LUA27,LUA1,LUA46,LUA74共六种微球;
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,检测结果如表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP2C19和ABCB1基因多态性,实验数据符合上述要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2C19和ABCB1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2C19、ABCB1基因的SNP类型,且结果稳定可靠。
表5样本检测结果(MFI)
序号NO. |
G681A-w |
G681A-m |
G636A-w |
G636A-m |
C3435T-w |
C3435T-m |
阴性对照 |
24 |
14 |
20 |
20 |
5 |
16 |
1 |
487 |
3 |
552 |
26 |
531 |
459 |
2 |
376 |
381 |
469 |
13 |
568 |
20 |
3 |
596 |
23 |
488 |
526 |
731 |
38 |
4 |
572 |
19 |
473 |
32 |
955 |
34 |
5 |
543 |
21 |
432 |
0 |
314 |
489 |
6 |
19 |
913 |
851 |
30 |
865 |
593 |
7 |
556 |
24 |
596 |
11 |
542 |
421 |
8 |
609 |
16 |
827 |
30 |
1734 |
14 |
9 |
485 |
29 |
705 |
14 |
1713 |
10 |
10 |
12 |
368 |
361 |
8 |
457 |
305 |
11 |
583 |
28 |
400 |
21 |
593 |
371 |
12 |
428 |
426 |
449 |
22 |
29 |
453 |
13 |
18 |
516 |
575 |
3 |
1516 |
6 |
14 |
331 |
340 |
806 |
27 |
590 |
388 |
15 |
399 |
463 |
332 |
0 |
545 |
20 |
16 |
433 |
13 |
673 |
16 |
524 |
383 |
17 |
354 |
19 |
503 |
20 |
961 |
41 |
18 |
443 |
24 |
623 |
20 |
1405 |
0 |
19 |
333 |
7 |
579 |
16 |
558 |
332 |
20 |
594 |
19 |
530 |
0 |
919 |
22 |
表6样本CYP2C19和ABCB1突变类型分析结果
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>CYP2C19、ABCB1基因SNP检测液相芯片及其检测方法
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aagtaatttg ttatgggttc cc 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aagtaatttg ttatgggttc ct 22
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gattgtaagc accccctgg 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gattgtaagc accccctga 19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggtgtcacag gaagagatc 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ggtgtcacag gaagagatt 19
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gtttatagtg aaatatgaag atag 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gatttgtatt gattgagatt aaag 24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgtattgaat gaattgttga tgta 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tgaaattagt ttgtaagatg tgta 24
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
aaattacaac cagagcttgg c 21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
atcacaaata cgcaagcagt c 21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tccaatcatt tagcttcacc c 21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ttcagggctt ggtcaatata g 21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
tgctacattc aaagtgtgct g 21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
acttacatta ggcagtgact c 21
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ctatcttcat atttcactat aaac 24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tcaattacct tttcaataca atac 24
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cttttcaaat caatactcaa cttt 24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctttaatctc aatcaataca aatc 24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tacatcaaca attcattcaa taca 24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
tacacatctt acaaactaat ttca 24