CN101250593B

CN101250593B - 乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

Info

Publication number: CN101250593B
Application number: CN 200810026275
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 林一群; 杨惠夷
Original assignee: Guangzhou Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2008-02-03
Filing date: 2008-02-03
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2028-02-03
Also published as: CN101250593A

Abstract

本发明公开了一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片及其用于检测与分型乳头瘤病毒的方法。该液相芯片主要包括有：分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ IDNO.25～SEQ ID NO.47中的2种或2种以上的序列；针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；扩增出具有突变位点的目标序列的引物。本发明对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

Description

乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

技术领域

本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及一种用于人乳头瘤病毒检测与分型的方法及其液相芯片。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种小分子环状双链DNA病毒，通过性接触、直接或间接接触污染物品等途径在人群中广为传播，特异性地感染人体皮肤和粘膜的鳞状上皮细胞，引起多种良性或恶性病变，严重威胁着人类的健康。根据HPV基因的序列变异可将其分为多种类型。目前确定的HPV型别有100余种，其中约40种可以感染人生殖器官，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为高危型和低危型，低危型HPV如HPV6、11、40、42、43、44、53和54等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82及83等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。

大量流行病学和分子生物学研究资料表明HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关，HPV感染是宫颈癌的主要病因。大约80％的低度宫颈癌前病变的病人体内可以分离出HPV，高度宫颈癌前病变的病人中有90％可以分离出HPV，几乎所有患浸润性宫颈癌的妇女体内都能分离出HPV。而宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率高居女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年有45万的宫颈癌新发病例，导致死亡的接近25万例。因此，HPV DNA检测及分型对宫颈癌的早期诊断、判断预后以及指导治疗具有重要价值。

由于HPV体外增殖非常困难，到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测，如巴氏涂片法，薄层液基细胞学检查，阴道镜检查，组织病理学检查，电镜直接观察HPV病毒颗粒，放射免疫沉淀法检测患者血清HPV16抗体水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6，E7特异性抗体等。然而这些方法的检测灵敏度和特异性均不够理想，存在较高的假阳性率和假阴性率，同时无法做到早期诊断，更不能对HPV进行分型。HPV常用的分型方法有核酸杂交(包括斑点杂交法、荧光原位杂交法、southern杂交法以及杂交捕获法)，聚合酶链反应(PCR)技术(直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及目前很具影响力的基因芯片法)等。Southern杂交法是HPV基因分型的金标准，但此方法敏感性低、耗时、需要大量高度纯化的DNA，而且需要新鲜样本，不能用于DNA已降解的组织，故不适合于临床HPV分型的检测应用。荧光原位杂交法(ISH)能够在组织病理中估计目的核酸或基因的表达，但ISH测定HPV序列的敏感性很低。杂交捕获法(Digene公司HC II)是目前唯一通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术。该技术敏感性较好，重复性高，但不能确定具体的HPV亚型，且存在交叉反应，影响其检测的准确性。PCR技术检测灵敏度高，操作简单，但具有样品易污染、假阳性率高等缺点，同时，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。随着越来越多高危型HPV种类的确定，必须建立一种能同时检测至少15种高危型HPV的方法。基因芯片技术用于HPV分型检测，能一次检测多种常见类型的HPV，但传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。将液相芯片技术应用于人乳头瘤病毒HPV检测与分型将具有极大的优势。

公开号分别为CN1948503A及CN1814796A的中国专利申请分别公开了一种人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片。其主要步骤是：将针对不同HPV亚型核苷酸序列的特异性寡核苷酸探针包被在不同荧光编码的微球表面形成核酸探针微球集。同时，提取样本DNA，设计5’端生物素标记的HPV型特异的引物，进行多重PCR扩增。扩增产物与微球表面的特异性寡核苷酸探针进行杂交，反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白，最后通过Luminex仪器检测信号。由于需要把特异性的寡核苷酸探针包被到微球上，增加了包被步骤，同时所包被的微球仅能用于乳头瘤病毒HPV分型。此外，现有的HPV检测液相芯片技术在PCR扩增时采用5’端标记生物素的方式，因此荧光信号比较低，限制了检测的灵敏度。同时在PCR扩增以后没有对体系中多余的游离核苷酸(如生物素标记的引物及dNTP)进行处理，使得后续的杂交反应存在更多非特异性结合的可能，从而使检测结果的信噪比差。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片。

一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，包括有：

(1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQID NO.47中的2种或2种以上的序列；

(2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种或2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；

(3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。

优选地，扩增出具有突变位点的目标序列的引物为通用引物：

5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。

本发明的另一目的是使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法。

一种使用上述液相芯片对乳头瘤病毒检测与分型的方法，主要包括以下步骤：

1.提取样本中的DNA；

2.PCR扩增待测样品；

3.PCR反应产物用虾碱性磷酸酶及内切酶I进行酶切处理；

4.酶切处理后的PCR反应产物用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；

5.将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；

6.杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

7.通过荧光检测仪检测。

本发明所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能对HPV进行准确的分型，与测序法的吻合率高达100％。所选择的每种微球与相应的扩增产物杂交的信号基本上都大于5000，同时所制备的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别HPV的感染，并能够准确诊断HPV混合感染。

利用本发明所提供的HPV检测与分型液相芯片系统能一次检测22种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染漏检的缺陷，真正实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测。还可根据临床检测的实际需要，选择相应的ASPE型特异性引物进行所需型别的分型检测。本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的核酸探针微球集能适用于不同的检测项目，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

附图说明

图1是本发明检测分型的方法原理示意图。

具体实施方式

实施例1人乳头瘤病毒HPV检测与分型液相芯片试剂盒，主要包括有：

一、特异性引物序列(ASPE引物)

针对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70、73、82、06、11、42、43、44共22种型别分别设计特异性的引物序列(18-22bp)，引物5’端分别加上一段24bp的特异的tag标签序列，这些tag标签序列能分别与对应的微球上的anti-tag序列特异地互补配对。ASPE序列如下表所示：

表1ASPE引物序列

SEQ NO.

型别

NCBI序列号

Sequence(5’→3’)

1	HPV06	X00203	AATCTACAAATCCAATAATCTCATTCCGTAACTACATCTTCCA
				2	HPV11	M14119	CAATTCAAATCACAATAATCAATCTCTGTGTCTAAATCTGCTAC
3	HPV16	K02718	CAATTCATTTCATTCACAATCAATTACCTACGACATGGGGAG
				4	HPV18	X05015	TCAACAATCTTTTACAATCAAATCTGCTTCTACACAGTCTCCT
5	HPV31	J04353	TATATACACTTCTCAATAACTAACGCAATTGCAAACAGTGATAC
				6	HPV33	M12732	ATTATTCACTTCAAACTAATCTACTGCACACAAGTAACTAGTGA
7	HPV35	M74117	CAATTTCATCATTCATTCATTTCACTGCTGTGTCTTCTAGTGA
				8	HPV39	M62849	TAATCTTCTATATCAACATCTTACTACATTATCTACCTCTATAGA
9	HPV42	M73236	TTCAATCATTCAAATCTCAACTTTGCCACTGCAACATCTGGTG
				10	HPV43	AJ620205	CTTTTACAATACTTCAATACAATCTCTACTGACCCTACTGTG
11	HPV44	U31788	CTACAAACAAACAAACATTATCAATACTAGTGAACAATATAAGCA
				12	HPV45	X74479	TCAATTACCTTTTCAATACAATACTAATTTAACATTATGTGCCTC
13	HPV51	M62877	AATCCTTTTTACTCAATTCAATCATGCTGCGGTTTCCCCAA
				14	HPV52	X74481	TACATCAACAATTCATTCAATACAGAATACCTTCGTCATGGC
15	HPV56	X74483	TACACAATCTTTTCATTACATCATGATGCACGAAAAATTAATCAG
				16	HPV58	D90400	TACAAATCATCAATCACTTTAATCTATGCACTGAAGTAACTAAG
17	HPV59	X77858	CTACTAATTCATTAACATTACTACAGAATATGCCAGACATGTG
				18	HPV66	U31794	TACACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCGTGAAATCAATCAATACCTTC
19	HPV68	AJ831568	TTACTACACAATATACTCATCAATCTGAATCAGCTGTACCAAA
				20	HPV70	U22461	CTACTTCATATACTTTATACTACATTTACATTGTCTGCCTGCA
21	HPV73	NC_006165	CAATATACCAATATCATCATTTACGTATGCCAACTCTAATTTTAA
				22	HPV82	AB027021	CTTTATCAATACATACTACAATCAACTCCAACAAACTTTAAGCAGT
23	β-globin	——	TCATTTACTCAACAATTACAAATCCCCTGACTTTTATGCCCAG
				24	阴性对照		CGTTAGGTCGGAGCTTGATC

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，3’端为HPV型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用ddH₂O配制成100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag标签序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的23种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2ASPE特异性引物右端的Tag序列及微球上对应的anti-tag序列

HPV型别	微球编号	SEQ NO.	微球上对应的anti-tag序列
				HPV06	LUA60	25	ATGAGATTATTGGATTTGTAGATT
HPV11	LUA05	26	GATTGATTATTGTGATTTGAATTG
				HPV16	LUA36	27	ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
HPV18	LUA06	28	GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
				HPV31	LUA55	29	GTTAGTTATTGAGAAGTGTATATA
HPV33	LUA32	30	GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT
				HPV35	LUA35	31	TGAAATGAATGAATGATGAAATTG
HPV39	LUA09	32	GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA
				HPV42	LUA23	33	AAAGTTGAGATTTGAATGATTGAA
HPV43	LUA20	34	GATTGTATTGAAGTATTGTAAAAG
				HPV44	LUA28	35	TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
HPV45	LUA24	36	GTATTGTATTGAAAAGGTAATTGA
				HPV51	LUA22	37	TGATTGAATTGAGTAAAAAGGATT
HPV52	LUA46	38	TGTATTGAATGAATTGTTGATGTA
				HPV56	LUA39	39	ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA
HPV58	LUA11	40	GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA

HPV59	LUA58	41	GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
				HPV66	LUA12	42	AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGTGTA
HPV68	LUA41	43	ATTGATGAGTATATTGTGTAGTAA
				HPV70	LUA63	44	TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG
HPV73	LUA50	45	GTAAATGATGATATTGGTATATTG
				HPV82	LUA02	46	TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
β-globin	LUA67	47	GATTTGTAATTGTTGAGTAAATGA

选择的23种微球(FlexMAP微球)购白美国Luminex公司，也可自己合成tag序列，购买Luminex公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下：

根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列，每个anti-tag序列前加上一段10个T的“TTTTTTTTTT”的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，避光孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再避光孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA]中，2-8℃避光保存。

三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物(SEQ N0.48-49)：

GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。

也可针对每一型别分别使用一对特异的引物进行多重PCR扩增，扩增出具有突变位点的目标序列，扩增产物混合后备用。

实施例2运用HPV检测与分型液相芯片对临床样本的检测与分型

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

试剂

来源

终浓度

每250ml的用量

MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)	Sigma M-2933	0.05M	2.44g
				5MNaOH	Fisher SS256-500	---	5滴

2×Tm杂交缓冲液

试剂	来源	终浓度	每250ml的用量
				1MTris-HCl，pH8.0	SigmaT3038	0.2M	50ml
5M NaCl	Sigma S5150	0.4M	20ml
				Triton X-100	Sigma T8787	0.16％	0.4ml

过滤后贮存于4℃

生物素标记的dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的选择及样本的DNA提取

选择20份经测序法进行HPV检测与分型的宫颈样本。其中8份为低危型HPV单型感染，包括3份HPV06型感染和5份HPV11型感染。10份为高危型HPV单型感染，包括4份HPV16型感染，4份HPV18型感染以及1份HPV52型感染，1份HPV58型感染。另外2份为混合型感染，其中1份为HPV06型与HPV18型混合感染，另外一份为HPV11型，HPV16型以及HPV18型混合感染。待测组织样本的DNA提取方法如下：

1.将宫颈脱落细胞的组织样本用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；

2.洗涤后的宫颈脱落细胞重悬于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/L Na₂EDTA，0.5％Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K 200，pH 8.5)，55C水浴消化1小时，99℃水浴15min灭活蛋白酶K；

3.12000转/分钟离心10分钟；

4.取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。

二、待测样品的PCR扩增

利用通用型引物GP5+/GP6+用于扩增HPV L1片段的高度保守区，产物大小为150bp。通用引物序列(SEQ NO.50-51)如下：

GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’

反应体系如下：

10×缓冲液 2ul

MgCl₂ 3ul

dNTP 1.5ul

Taq酶 0.5ul

上游引物GP5+ 0.5ul

下游引物GP6+ 0.5ul

模板DNA 5ul

ddH₂O 12ul

共 25ul

PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环；72℃5min；4℃保存备用。

采用PC03/05通用引物对扩增β-globin基因，以验证DNA模板质量，并排除PCR反应体系中抑制因子的影响。引物序列如下：

PC03：5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’

PC05：5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’

人β-globin基因扩增的反应体系与扩增程序同HPV DNA的扩增，但引物分别替换为0.5uM的PC03和0.5uM的PC05。

三、PCR产物的酶切处理

1.取25ul PCR反应后的产物，加入2ul虾碱性磷酸酶(2u)和5ul的内切酶I(5U)

2.37℃孵育30min。99℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取HPV06，HPV11，HPV16，HPV18，HPV33，HPV35，HPV45，HPV52，HPV58型以及β-globin相应的ASPE引物贮存液2ul于1.5ml微量离心管中，加入182ul的ddH₂O补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：

10×缓冲液 2ul

MgCl2 3ul

Biotin-dCTP 5uM

dATP、dGTP、dTTP 各5uM

Tsp酶 0.5ul

混合的ASPE引物工作液 2ul

PCR扩增产物 5ul

ddH₂O 4ul

共 20ul

六、杂交反应

1.根据设计的HPV型特异的ASPE引物以及β-globin的ASPE引物，选择相应的最优的9种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检测中都分别选择LUA60，LUA05，LUA36，LUA18，LUA32，LUA35，LUA46，LUA11，LUA67共9种微球；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥8000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡漩震荡约20s，超声处理约20s；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，空白孔加25ul的dH₂O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，96℃90s，37℃30min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥2250g离心3min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥2250g离心3min；

11.重复步骤9-10一次；

12.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

13.37℃孵育15min；

七、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，Luminex仪器检测，红色激光检测微球的荧光编号，从而确定HPV的型别，绿色激光检测报告分子的荧光信号，从而确定各型别DNA片段的浓度。

检测结果如表3和表4所示。

实验结果表明，对于对应的HPV亚型，该样品的荧光值(MFI)都是最高的，要比其他型别ASPE特异性引物检测的MFI值高出250倍以上。以阴性对照的MFI值为标准，各种型别检测的MFI值除以阴性对照的MFI值得出一个比值R作为阳性判定值(cut-off值)。高于cut-off值就视为该型的感染。以测序法检测与分型结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率(除去两个混合感染的样本，即样本号5和13，因为测序法分型技术本身存在缺陷，对于混合型感染，在测序过程中将遇到杂峰图形，因此无法准确地进行HPV混合型感染的判断)。以R≥200作为cut-off值，本方法检测20份样本的HPV分型结果与测序结果吻合率达到100％；以R≥100作为cut-off值，本方法检测20份样本的HPV分型结果与测序结果的吻合率仍为100％，以R≥50作为cut-off值，检测结果的吻合率还是100％，可见本发明所提供的人乳头瘤病毒检测与分型液相芯片能够对HPV进行准确的分型，且结果稳定可靠。而现有的HPV检测与分型液相芯片由于采用探针末端标上一个生物素的方法，因此荧光信号值比较低(MFI值通常在1000左右)，信噪比相对较差；对于一些假阳性样本及混合感染型样本无法准确地进行判断，同时增加了分析结果判断过程中的主观因素。采用本发明的方法，则能够有效克服这些缺点，大大提高分型结果的可靠性。

表3样本检测结果(MFI值)

表4、样本分型结果

样本号	测序分型结果	液相芯片分型结果
			1	HPV06单型	HPV06单型
2	HPV16单型	HPV16单型
			3	HPV16单型	HPV16单型
4	HPV52单型	HPV52单型
			5	HPV06&？？混合型	HPV06&HPV18混合型
6	HPV18单型	HPV18单型
			7	HPV11单型	HPV11单型
8	HPV11单型	HPV11单型
			9	HPV06单型	HPV06单型
10	HPV18单型	HPV18单型
			11	HPV18单型	HPV18单型
12	HPV11单型	HPV11单型
			13	HPV11&？？混合型	HPV11&HPV16&HPV18混合型
14	HPV11单型	HPV11单型
			15	HPV16单型	HPV16单型
16	HPV06单型	HPV06单型
			17	HPV18单型	HPV18单型
18	HPV58单型	HPV58单型
			19	HPV16单型	HPV16单型
20	HPV11单型	HPV11单型

序列表

<110>广州益善生物技术有限公司

<120>乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片

<160>51

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aatctacaaa tccaataatc tcattccgta actacatctt cca 43

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caattcaaat cacaataatc aatctctgtg tctaaatctg ctac 44

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caattcattt cattcacaat caattaccta cgacatgggg ag 42

<210>4

<211>43<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcaacaatct tttacaatca aatctgcttc tacacagtct cct 43

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tatatacact tctcaataac taacgcaatt gcaaacagtg atac 44

<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

attattcact tcaaactaat ctactgcaca caagtaacta gtga 44

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

caatttcatc attcattcat ttcactgctg tgtcttctag tga 43

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

taatcttcta tatcaacatc ttactacatt atctacctct ataga 45

<210>9

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttcaatcatt caaatctcaa ctttgccact gcaacatctg gtg 43

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cttttacaat acttcaatac aatctctact gaccctactg tg 42

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ctacaaacaa acaaacatta tcaatactag tgaacaatat aagca 45

<210>12

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tcaattacct tttcaataca atactaattt aacattatgt gcctc 45

<210>13

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aatccttttt actcaattca atcatgctgc ggtttcccca a 41

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tacatcaaca attcattcaa tacagaatac cttcgtcatg gc 42

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tacacaatct tttcattaca tcatgatgca cgaaaaatta atcag 45

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tacaaatcat caatcacttt aatctatgca ctgaagtaac taag 44

<210>17

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ctactaattc attaacatta ctacagaata tgccagacat gtg 43

<210>18

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tacactttct ttctttcttt ctttcgtgaa atcaatcaat accttc 46

<210>19

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ttactacaca atatactcat caatctgaat cagctgtacc aaa 43

<210>20

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

ctacttcata tactttatac tacatttaca ttgtctgcct gca 43

<210>21

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

caatatacca atatcatcat ttacgtatgc caactctaat tttaa 45

<210>22

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ctttatcaat acatactaca atcaactcca acaaacttta agcagt 46

<210>23

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tcatttactc aacaattaca aatcccctga cttttatgcc cag 43

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cgttaggtcg gagcttgatc 20

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

atgagattat tggatttgta gatt 24

<210>26

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gattgattat tgtgatttga attg 24

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

attgattgtg aatgaaatga attg 24

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gatttgattg taaaagattg ttga 24

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

gttagttatt gagaagtgta tata 24

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gtagattagt ttgaagtgaa taat 24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

tgaaatgaat gaatgatgaa attg 24

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

gtaagatgtt gatatagaag atta 24

<210>33

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

gattgtattg aagtattgta aaag 24

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

ttgataatgt ttgtttgttt gtag 24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

tgattgaatt gagtaaaaag gatt 24

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

tgtattgaat gaattgttga tgta 24

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

atgatgtaat gaaaagattg tgta 24

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

gattaaagtg attgatgatt tgta 24

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

gtagtaatgt taatgaatta gtag 24

<210>42

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

aaagaaagaa agaaagaaag tgta 24

<210>43

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

attgatgagt atattgtgta gtaa 24

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

tgtagtataa agtatatgaa gtag 24

<210>45

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

gtaaatgatg atattggtat attg 24

<210>46

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>46

tgattgtagt atgtattgat aaag 24

<210>47

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>47

gatttgtaat tgttgagtaa atga 24

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>48

tttgttactg tggtagatac 20

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49

gaaaaataaa ctgtaaatca 20

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50

acacaactgt gttcactagc 20

<210>51

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51

gaaacccaag agtcttctct 20

Claims

1.一种乳头瘤病毒检测与分型的液相芯片，其特征是，主要包括有：

(1)分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7-10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.25～SEQID NO.47中的2种以上的序列；

(2)针对每种型别的HPV分别设计的特异ASPE引物，所述ASPE引物选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.23中的2种以上的序列；每种ASPE引物的3’端为针对检测的目的基因突变位点的特异序列，5’端为tag标签序列，该tag标签序列能与微球上相应的anti-tag标签序列互补配对；

(3)扩增出具有突变位点的目标序列的引物。

2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征是，所述扩增出具有突变位点的目标序列的引物为以下序列组成的通用引物：

5’-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3’

5’-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3’。