CN102140554B

CN102140554B - 检测人乳头状瘤病毒亚型的荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102140554B
Application number: CN201110087602.1A
Authority: CN
Inventors: 张旭; 刘中华; 孔祥宾; 张蓉
Original assignee: Jiangsu Perfectus Biotechnologies Co ltd
Current assignee: Jiangsu World Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: CN102140554A

Abstract

本发明公开了一种检测人乳头状瘤病毒21种亚型的荧光PCR试剂盒，包括以下各组分：PCR反应液，探针与特异性引物组成的混合液，细胞裂解液，阴性参考品和阳性参考品。特异性和灵敏性实验表明，本发明试剂盒能够准确的从待测样品中检测出人乳头状瘤病毒的21种亚型，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

Description

检测人乳头状瘤病毒亚型的荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测病毒亚型的试剂盒，尤其涉及一种检测人乳头状瘤病毒亚型的荧光PCR试剂盒，属于人乳头状瘤病毒亚型的检测领域。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)属于乳头瘤病毒属，和所有乳头瘤病毒属病毒一样，是一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。目前，HPV已被发现的亚型有接近两百种，其中大部分感染人类后并没有明显症状表现，少数部分有病理表现，有些会可引起人类疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣；一些高危亚型会引起人类的肿瘤，某些情况下会导致宫颈癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌等。

HPV是一种双链DNA病毒，属于乳多空病毒科，是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，种间不存在交叉感染，其基因组长度约为8000bp，主要由早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和长控制区((long control region，LCR)组成。E区有6个开放式阅读框(ORF)，即E1，E2，E4，E5，E6，E7。

HPV基因组高度变异，目前发现的HPV共有100余种基因型，按其感染部位可分为两种：皮肤型与粘膜型，其中约有40多种能够感染生殖腔。HPV感染人体后，会在宿主细胞内不断复制，并将病毒基因嵌合入人体基因中，改变细胞的功能。经过一段时间的演变，加上周围环境因素的影响，使细胞癌化。

在年轻女性中，多数HPV感染者持续时间较短，对身体不会造成严重危害，一年内70％的感染者转化为阴性，两年内90％的感染者转化为阴性。然而，仍有5％-10％的感染者持续感染，持续感染者高度危险，有很大可能发生宫颈癌癌前病变，进一步会演变成侵入性子宫颈癌。幸运的是，这个演变需要一定的时间，这段时间为诊断和治疗提供了良好的时机。

在1995年的IARC专题讨论会上确定了HPV某些亚型长期和反复地感染HPV是宫颈癌发生的主要原因。目前，人类把与宫颈癌发生有关的HPV亚型称为高危亚型，有HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，26，82，73等；与肿瘤不相关的称为低危亚型，最常见的为HPV 6，11和44等。

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5％，在中国每年约有8万左右的女性死于宫颈癌。

HPV感染是宫颈癌的直接病因，从感染到最终宫颈癌的发生就大多数患者而言有一个缓慢的潜伏期，为此，及时定期检测宫颈脱落细胞中HPV的有无在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。

HPV感染通常是没有症状的，HPV感染在人群中非常常见。据世卫组织研究统计，曾感染HPV的人数，在性活跃期男女中的比率为50％，到50岁该数字增加到80％，所以它是世界上第一大传染疾病。全世界每年有约10-15％的新发病例。虽然大部分妇女HPV感染期比较短，一般在8-10个月左右，但仍有大约10-15％的35岁以上的妇女有持续感染的情况。这些持续感染HPV的妇女，患子宫颈癌的风险更高。过去，因缺少高灵敏度和特异性的HPV诊断试剂，大约70％的感染者在最初的两年是无法检测到HPV的。大部分感染了HPV的妇女将会发展为轻度宫颈损伤，而大多数轻度损伤都是可以自动恢复的。有研究表明约有15％的HPV感染者将会在两年内发展为重度损伤，而重度宫颈损伤极有可能发展为恶性癌变，有统计认为大约1/3的重度宫颈损伤将在10年内(而最近在很多案例中发现转癌速度可以短至三年内)发展为癌症。在诊断及防治这方面仍然缺乏有效的措施。

对HPV病毒感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性，同时改善妇女宫颈癌的防治。宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。传统上，宫颈涂片检测是群体筛查的常规手段，属于细胞学检测方法。实验室的技术人员会于显微镜下观察不正常的细胞以诊断病人的病情，但由于这方法只以观察作为诊断基础，受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，其准确率低，假阴性高，重复性差，得到的结果及分析漏诊率可达30％。在检查和筛选HPV的基因型方法中，实时荧光PCR法及杂交捕获法是最为常用的，但是实时荧光PCR法所需要的设备比较昂贵，而且其对于不同种基因型HPV的诊断操作繁琐，不适合于对子宫颈癌的大规模筛查。商业化的杂交捕获法试剂盒无须PCR扩增即可检测出临床样品中的HPV DNA，并且可区别高危型和低危型两类，但是此类试剂盒无法鉴定出感染HPV的具体基因型。最近的分型与临床的结合研究已经证实不同的HPV亚型及其载量的不同在致癌性方面存在比较大的差别，这些数据用于诊断结合临床治疗至为重要，因此有必要对各个宫颈样本中存在的HPV进行分型定量检测，从而有助于更详细的分析各种HPV的致病性，以达到最佳的临床疗效。

人乳头状瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素，宫颈癌的筛查是降低宫颈癌发病率最经济有效的方法，HPV的检测已是宫颈癌早期筛查的一个重要方面。许多研究支持将HPV检测传统的巴氏涂片结合，HPV检测阳性可作为细胞学检查ASCUS结果行阴道镜检查的指征，在一定程度上减少重复细胞学检查，减少阴道镜检查，减少在随诊中高危人群的丢失。此外，HPVDNA检测可以预示治疗后病变残存和复发的高危患者，同时血清HPVDNA可能成为宫颈癌治疗后的病情监测的有效肿瘤标志物。因此，HPV检测的临床意义不容忽视。

HPV的检测作为宫颈癌的筛查已逐渐向临床推广，但是不同的HPV型别有不同的致病能力，所以发展HPV基因型的分型方法越来越重要。目前HC-II法是唯一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术，但他不能对HPV进行具体分型，而且存在交叉杂交的问题。多重荧光定量PCR技术不仅可以检测具体型别还可以检测所有型别，是一个有较大的发展前景的方法。针对现有方法的缺点和不足，通过不断的努力，将各种检测方法有机结合，取长补短，相信在不久的将来会产生简单、快速、方便、价廉，且敏感性、特异性很高的HPV检测方法应用于宫颈癌的筛查中。

以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。在探针法的实时荧光PCR反应体系中，根据所检测病原体的多少，还可以分为单重或多重实时荧光PCR技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

采用实时荧光PCR技术检测HPV各亚型的关键是需要设计出能够特异、灵敏的检测出各亚型的PCR引物及探针。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够准确的检测出人乳头状瘤病毒各种亚型的荧光PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高的优点。

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测人乳头状瘤病毒各种亚型的荧光PCR试剂盒，包括以下各组分：PCR反应液，探针或由探针与引物组成的混合液，细胞裂解液，双蒸水和阳性参考品；其中，所述的探针或由探针与引物组成的混合液包括以下8种反应液：用于检测人乳头状瘤病毒16/18/31亚型的A反应液；用于检测人乳头状瘤病毒59/66/53亚型的B反应液；用于检测人乳头状瘤病毒33/58/45亚型的C反应液；用于检测人乳头状瘤病毒亚型56/52/35的D反应液；用于检测人乳头状瘤病毒68/51/39亚型的E反应液；H反应液；用于检测人乳头状瘤病毒82/73/26亚型的F反应液；用于检测人乳头状瘤病毒6/11/81亚型的G反应液。

其中，A反应液由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸组成；其中，SEQ ID No.3的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.4的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.7的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；

C反应液由SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸组成；其中，SEQ ID No.10的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.11的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.14的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；

E反应液由SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的核苷酸组成；其中，SEQ ID No.17的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.18的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQ ID No.19的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQID No.23的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；

D反应液由SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.26的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.29的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.31的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；

B反应液由SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.34的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.37的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.40的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；

H反应液SEQ ID No.41、SEQ ID No.42和SEQ ID No.43所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.43的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；

F反应液由SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.44的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.49的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQ ID No.52的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；

G反应液由SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQID No.55、SEQ IDNo.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60和SEQ ID No.61所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.55的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.58的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.61的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；

所述的PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs和UNG酶；各成分均购自普洛麦格(promega)公司；

所述阳性参考品为HPV73亚型质粒；阳性参考品原浓度质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司；

所述细胞裂解液的主要组成成分为EDTA和Tris-HCl；购自西格玛(SIGMA)公司；

本发明试剂盒需采用各种市售的荧光定量PCR仪进行分析和检测，所述的荧光定量PCR仪可以是ABI系列荧光定量PCR仪、BIORADiCycler、Roche 4800、Qiagen Rotor Gene等。

本发明试剂盒对检测样本的要求：宫颈脱落细胞。样本采集后应及时检测，也可一20℃保存待测，保存期一般不超过4个月，长期保存请置于-70℃。样本避免反复冻融，采用干冰或冰袋低温运输。

作为一个具体的实施方案，本发明所述试剂盒的组成见表1和表2。

表1

备注：括号中阿拉伯数字代表相应亚型；阳性参考品为HPV73亚型质粒。其中PCR反应液由Taq DNA聚合酶、10×Buffer、Mg2+、dNTPs、UNG酶均购自普洛麦格(promega)公司；细胞裂解液中的EDTA、Tris-HCl购自西格玛(SIGMA)公司；阳性参考品原浓度质粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表2

作为参考，本发明试剂盒的使用方法包括：

1.试剂准备(试剂准备区)

反应液配制1(样本亚型及细胞数检测)：

表3

备注：每人份分别有A/B/C/D/E/F/G/H共8管。

表4反应液配制2(阴性对照)：

备注：每人份分别有A/B/C/D/E/F/G/H共8管。

表5反应液配制3(阳性对照)：

反应液组份	加量(μl)/每反应
		PCR反应液	5
C反应液(33/58/45)	5
		纯化水/阴性参考品	8
总体积	18

2.样本处理(样本处理区)

2.1取出样本，振荡混匀(如为冻存样本应先置室温化冻)。吸取1ml样本于带螺口的离心管中，12,000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，保留沉淀物。

2.2加入50ul细胞裂解液至样本沉淀物中，用枪头反复吹打、混匀，95-100℃沸水浴/干浴10分钟(避免爆管)。

2.3样品12,000rpm离心5分钟，保留上清，取2ul用于荧光定量PCR检测(如果样本裂解产物当天不使用，建议保存在-20℃)。

应采用灭菌的带滤芯枪头及离心管，所有样品的制备均在样本处理区进行。待测样本量(n+1)＝需检样本量(n)+1份阴性参考品。

3.加样

3.1在上述准备好的反应液配制1(样本亚型及细胞数检测)中分别加入处理好的待测样本(10pg-100ng)各2μl，每人份共8管(A-H)，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。

3.2在上述准备好的反应液配制2(阴性对照)中分别加入阴性参考品各2μl，每人份共8管(A-H)，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。

3.3在上述准备好的反应液配制3(阳性对照)中分别加入HPV亚型33阳性参考品2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。

4.PCR扩增检测

4.1将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。

4.2循环参数设定(请参照各类仪器的操作说明进行设置)

表6

*注：ABI系列荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

表7探针荧光标识表

检验结果的解释

1.在仪器正常，阴性参考品、阳性参考品标曲均正常的情况下

1.1在CT≤35，判断为人乳头状瘤病毒阳性。

1.2在35＜CT≤38，再重复一次实验，结果相同的情况下，判断为人乳头状瘤病毒阳性。

1.3在CT＞38或阴性，此次结果判断为阴性。

2.判断为人乳头状瘤病毒阳性的样本进行病毒定量分析：

将样本检出的相应亚型CT值及细胞数CT值(H反应液)分别输入软件《人乳头状瘤病毒亚型核酸分型定量分析系统》中，系统自动分析生成相应的亚型病毒感染量，从而对该亚型的感染进行定量。

标准曲线的建立(定量参考品)

1.试剂准备(试剂准备区)

表8反应液配制(标准曲线)

反应液组份	加量(μl)/10个反应
		PCR反应液	50
H反应液	50
		纯化水	80
总体积	180

将以上配制好的反应液分装成10管，每管18μl。

2.模板DNA准备(样本处理区)

从试剂盒中取出定量参考品(10⁸拷贝/uL)，室温下溶解，旋涡振荡混匀后，8000rpm点动离心。吸取5-10uL进行十倍系列稀释(五个稀释梯度，每个稀释梯度两个重复)。

3.加样

在上述准备好的反应液(标准曲线)中分别加入稀释好的不同浓度梯度的定量参考品各2μl，终体积为20μl/管，共10管，盖紧管盖，瞬时低速离心。

4.PCR扩增检测

同前

表9探针荧光标识表

反应液	检测物	探针上游	探针下游	通道
					H	Top	FAM	BHQ1	Green

5.设置HPV定量软件的标准曲线

将仪器中读取到的不同浓度梯度的CT值准确输入到软件《人乳头状瘤病毒亚型核酸分型定量分析系统》中。

检验结果的解释

在实验操作、仪器及软件《人乳头状瘤病毒亚型核酸分型定量分析系统》等正常情况下，系统自动生成标准曲线，其相关系数R²≥0.990。

本试剂盒采用实时荧光PCR技术对宫颈脱落细胞标本的人乳头状瘤病毒基因组DNA的特异性核酸序列扩增并检测，从而判断是否感染人乳头状瘤病毒对应的21种亚型，并通过看家基因与待测细胞的线性关系获得21种亚型在单位细胞中的载量；本试剂盒独有的采用了三重荧光定量PCR技术，分别设计人乳头状瘤病毒21亚型相应探针，分为八管可一次性检测检测21种亚型人乳头状瘤病毒，每管分为FAM、HEX、ROX三个通道区分三种亚型。

本发明采用商业公司提供的阳性参考品及医院提供的临床样本为模板进行PCR扩增。并以凯普同类产品检测试剂盒作双盲对照，检测产品的灵敏度、特异度和精密度。

实验结果显示，本发明试剂盒检测非HPV21种亚型(高危亚型：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，26，82和73；低危亚型：HPV 6，11和81)没有结果，相应引物探针检测HPV21种相应亚型均显示阳性，而且不同亚型检测互不干扰，证明其特异性良好；随机检测20个临床样本，与凯普同类产品检测试剂盒的结果进行对比，符合度达到98.5％，且与测序结果一致，敏感度达96.1％，证明其灵敏度良好；将同一样本(病毒载量为104拷贝/ML)进行10次PCR扩增，结果均为阳性，证明其精密度良好。

特异性和灵敏性实验表明，本发明试剂盒能够准确的从待测样品中检测出入乳头状瘤病毒的21种亚型，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

在各种参数均良好的条件下，考察了试剂盒的稳定性。对此进行了为期8个月的稳定性试验。结果显示，PCR试剂盒放置于4℃放置30天；PCR试剂盒于-20℃于4℃放置8个月，试剂盒的各项技术指标没有明显改变，仍能达到规定的要求。根据以上结果，将本发明PCR试剂盒储存于-20℃，储存的有效期定为6个月。

附图说明

图1本发明试剂盒对HPV16亚型的特异性检测结果。

图2本发明试剂盒对HPV18亚型的特异性检测结果。

图3本发明试剂盒对HPV31亚型的特异性检测结果。

图4本发明试剂盒对HPV33亚型的特异性检测结果。

图5本发明试剂盒对HPV58亚型的特异性检测结果。

图6本发明试剂盒对HPV45亚型的特异性检测结果。

图7本发明试剂盒对HPV68亚型的特异性检测结果。

图8本发明试剂盒对HPV39亚型的特异性检测结果。

图9本发明试剂盒对HPV51亚型的特异性检测结果。

图10本发明试剂盒对HPV56亚型的特异性检测结果。

图11本发明试剂盒对HPV52亚型的特异性检测结果。

图12本发明试剂盒对HPV35亚型的特异性检测结果。

图13本发明试剂盒对HPV59亚型的特异性检测结果。

图14本发明试剂盒对HPV66亚型的特异性检测结果。

图15本发明试剂盒对HPV53亚型的特异性检测结果。

图16本发明试剂盒对HPV26亚型的特异性检测结果。

图17本发明试剂盒对HPV73亚型的特异性检测结果。

图18本发明试剂盒对HPV82亚型的特异性检测结果。

图19本发明试剂盒对HPV6亚型的特异性检测结果。

图20本发明试剂盒对HPV11亚型的特异性检测结果。

图21本发明试剂盒对HPV81亚型的特异性检测结果。

图22本发明试剂盒对参照基因的特异性检测结果。

图23本发明试剂盒对HPV16亚型的灵敏性检测结果。

图24本发明试剂盒对HPV18亚型的灵敏性检测结果。

图25本发明试剂盒对HPV31亚型的灵敏性检测结果。

图26本发明试剂盒对HPV33亚型的灵敏性检测结果。

图27本发明试剂盒对HPV58亚型的灵敏性检测结果。

图28本发明试剂盒对HPV45亚型的灵敏性检测结果。

图29本发明试剂盒对HPV68亚型的灵敏性检测结果。

图30本发明试剂盒对HPV39亚型的灵敏性检测结果。

图31本发明试剂盒对HPV51亚型的灵敏性检测结果。

图32本发明试剂盒对HPV56亚型的灵敏性检测结果。

图33本发明试剂盒对HPV52亚型的灵敏性检测结果。

图34本发明试剂盒对HPV35亚型的灵敏性检测结果。

图35本发明试剂盒对HPV59亚型的灵敏性检测结果。

图36本发明试剂盒对HPV66亚型的灵敏性检测结果。

图37本发明试剂盒对HPV53亚型的灵敏性检测结果。

图38本发明试剂盒对HPV26亚型的灵敏性检测结果。

图39本发明试剂盒对HPV73亚型的灵敏性检测结果。

图40本发明试剂盒对HPV82亚型的灵敏性检测结果。

图41本发明试剂盒对HPV6亚型的灵敏性检测结果。

图42本发明试剂盒对HPV11亚型的灵敏性检测结果。

图43本发明试剂盒对HPV81亚型的灵敏性检测结果。

图44本发明试剂盒对参照基因的灵敏性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1本发明试剂盒的特异性实验

1)实验方法

用A反应液(16/18/31)，B反应液(59/66/53)，C反应液(33/58/45)，D反应液(56/52/35)，E反应液(68/51/39)，F反应液(73/26/82)，G反应液(6/11/81)分别进行荧光定量PCR检测。

样本设置：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、73、82、6、11、81以及阴道常见病菌：淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)的阳性临床样本各2μL。所用临床样本均有广东省妇幼保健院提供。

2)实验结果和结论

HPV特异性见图1-24。从这些荧光定量PCR结果判断，当分别以A反应液(16/18/31)，B反应液(59/66/53)，C反应液(33/58/45)，D反应液(56/52/35)，E反应液(68/51/39)，F反应液(73/26/82)，G反应液(6/11/81)分别进行检测时，只有其对应亚型的临床样本有良好的荧光扩增信号。因此设计的引物探针在21个亚型中具有特异性。并且不与阴道常见病菌：淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)。间存在交叉反应。

实验例2本发明试剂盒的灵敏度实验

1)实验方法

a)配制A反应液(16/18/31)，B反应液(59/66/53)，C反应液(33/58/45)，D反应液(56/52/35)，E反应液(68/51/39)，F反应液(73/26/82)，G反应液(6/11/81)分别进行荧光定量PCR检测。

b)样本设置：对测定病毒含量的HPV16亚型标准参考质粒(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)将高浓度的HPV16亚型标准参考质粒进行10倍倍比稀释(分别为2.5*10⁸copies/μl、2.5*10⁷copies/μl、2.5*10⁶copies/μl、2.5*10⁵copies/μl、2.5*10⁴copies/μl、2.5*10³copies/μl、2.5*10²copies/μl、2.5*10copies/μl)。对上述各浓度质粒各2μL用本试剂盒的方法进行检测。

注：因不同亚型的灵敏度试验不是同时完成，后来的实验结果应高浓度容易造成污染，所以没有使用较高浓度标准参考质粒，但本文提供的灵敏度数据中CT值最大的扩增曲线的样本浓度为2.5*10copies/μl。以此十倍可推出前面扩增曲线的浓度。

2)实验结果和结论

HPV亚型的灵敏性实验结果见图26-46。从上述实验结果可见，本试剂盒可检测低至5*10copies/μl的拷贝量HPV病毒16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、73、82、6、11、81亚型，并且其CT值随浓度减少呈梯度的改变。

Claims

1.一种检测人乳头状瘤病毒21种亚型的荧光PCR试剂盒，包括以下各组分：PCR反应液，由探针与引物组成的混合液，细胞裂解液，阴性参考品和阳性参考品；其中，所述的探针或由探针与引物组成的混合液包括以下8种反应液：用于检测人乳头状瘤病毒16/18/31亚型的A反应液；用于检测人乳头状瘤病毒59/66/53亚型的B反应液；用于检测人乳头状瘤病毒33/58/45亚型的C反应液；用于检测人乳头状瘤病毒亚型56/52/35的D反应液；用于检测人乳头状瘤病毒68/51/39亚型的E反应液；H反应液；用于检测人乳头状瘤病毒82/73/26亚型的F反应液；用于检测人乳头状瘤病毒6/11/81亚型的G反应液，所述反应液包含人乳头状瘤病毒亚型的相应探针，所述探针用于扩增并检测人乳头状瘤病毒基因组DNA的特异性核酸序列，其中所述A反应液由SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQIDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸组成；其中，SEQ ID No.3的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.4的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.7的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；所述C反应液由SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸组成；其中，SEQ IDNo.10的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.11的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，SEQ ID No.14的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；所述E反应液由SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQIDNo.21、SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的核苷酸组成；其中，SEQID No.17的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.18的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQ ID No.19的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQ ID No.23的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；所述D反应液由SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQIDNo.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的核苷酸组成，其中，SEQID No.26的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.29的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.31的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；所述B反应液由SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQID No.38、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的核苷酸组成，其中，SEQID No.34的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.37的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.40的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；所述H反应液SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42和SEQ ID No.43所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.43的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；所述F反应液由SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.44的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.49的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团；SEQ ID No.52的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；所述G反应液由SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ IDNo.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60和SEQ ID No.61所示的核苷酸组成，其中，SEQ ID No.55的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID No.58的5′端标记有HEX荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQID No.61的5′端标记有ROX荧光报告基团，3′端标记有BHQ2荧光淬灭基团。